IT202200000314A1 - Composto e composizione per il ripristino metabolico e funzionale dei linfociti nk nell’epatocarcinoma e relativo metodo - Google Patents

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

"COMPOSTO E COMPOSIZIONE PER IL RIPRISTINO METABOLICO E FUNZIONALE DEI LINFOCITI NK NELL?EPATOCARCINOMA E RELATIVO METODO"

CAMPO DI APPLICAZIONE

Forme di realizzazione qui descritte si riferiscono ad un composto farmacologicamente accettabile, una composizione ed un metodo per il ripristino metabolico e funzionale dei linfociti NK.

Il composto farmacologicamente accettabile e la composizione possono essere utilizzati nel trattamento del carcinoma epatocellulare.

STATO DELLA TECNICA

Il carcinoma epatocellulare (HCC) ? il quinto tumore pi? frequente negli uomini e la terza causa di morte per cancro nel mondo, dopo il cancro del polmone e del colon-retto, con un?elevata incidenza, pari in Italia ogni anno a 30 nuovi casi ogni 100000 abitanti. I dati epidemiologici indicano, oltretutto, un?incidenza della malattia in progressivo aumento anche in Europa e in Nord America.

Nelle fasi iniziali della malattia, le strategie terapeutiche disponibili basate su trapianto di fegato, resezione chirurgica e terapie loco-regionali possono influenzare positivamente l?esito clinico in alcuni pazienti, ma nella maggior parte dei casi si verifica una recidiva aggressiva del tumore con rapida progressione della malattia. Da queste premesse ? evidente una necessit? urgente di nuovi approcci terapeutici da aggiungere e combinare con i recenti progressi nei trattamenti mirati e nell?immunoterapia.

L?immunoterapia ? diventata il trattamento principale per diversi tumori negli ultimi anni, tuttavia la prima terapia immunomodulante per l?HCC, basata su anti PD-L1 in associazione con anti VEGF, ? stata approvata solo quest?anno. La risposta immunitaria antitumorale rimane un fattore determinante nell?esito clinico della malattia neoplastica e le cellule, o linfociti, Natural Killer (in breve anche cellule, o linfociti, NK nel seguito) rappresentano la prima linea di difesa del sistema immunitario contro lo sviluppo del cancro.

Le funzioni delle cellule NK sono modulate dall?equilibrio tra segnali inibitori e attivatori, che determinano se una cellula NK uccider? o meno un determinato bersaglio cellulare. Inoltre, la cellula NK ? fortemente influenzata dall?ambiente circostante, sia per le citochine rilasciate sia per l?interazione con altre cellule immunitarie, come le cellule mieloidi soppressive, le cellule T regolatoie e i monociti/macrofagi, specialmente nel microambiente dei tumori solidi.

Nello stato della tecnica, i dati disponibili supportano la rilevanza delle cellule NK nel controllo della progressione dell?HCC, tuttavia, ? stata osservata una loro disfunzione, che consiste in un basso potenziale citotossico ed una bassa produzione di citochine, correlata ad una bassa possibilit? di prognosi favorevole.

L?attivazione delle cellule NK ? associata ad un?elevata attivit? metabolica, principalmente glicolisi e fosforilazione ossidativa, ed alla sovra espressione dei trasportatori di nutrienti, al fine di supportare le funzioni effettrici antitumorali. Sfortunatamente, nel microambiente tumorale, si verifica la riprogrammazione metabolica nelle cellule NK, in particolare a causa dell?ipossia, dei bassi nutrienti e del rilascio locale di mediatori solubili immunosoppressivi.

L?opportunit? di utilizzare come target le funzioni immunometaboliche nelle cellule NK, potenzialmente con implicazioni cliniche impattanti, ? diventata un?area di ricerca molto attiva nel campo dell?oncoimmunologia. In altri tumori solidi, come quello del polmone, ci sono evidenze della progressiva disfunzione delle cellule NK infiltranti il tumore, caratterizzata da glicolisi alterata, associato ad un aumento nell?espressione dell?enzima fruttosio-1,6-bisfosfatasi che inibisce la glicolisi (FBP1).

Allo stesso modo, il metabolismo delle cellule NK in pazienti con carcinoma mammario metastatico ha mostrato una profonda disfunzione segnata da una ridotta glicolisi e respirazione ossidativa, influenzata dalla presenza del TGF-?.

Ad oggi, per?, i meccanismi molecolari implicati nella mancanza del controllo immunitario da parte delle cellule NK in questo contesto, non sono ancora del tutto definiti.

Esiste pertanto la necessit? di perfezionare nuovi composti e composizioni che possano superare almeno uno degli inconvenienti della tecnica.

Per questo motivo i Richiedenti hanno cercato di sviluppare composti e composizioni, nonch? metodi, basati sul ripristino mirato di specifici percorsi (pathways ) intracellulari alterati e, conseguentemente, della funzione proteggente linfocitaria.

Per fare ci? ? necessario risolvere il problema tecnico della bassa efficacia delle terapie convenzionali.

In particolare, uno scopo del presente trovato ? quello di ripristinare la funzione immunitaria dei linfociti NK contro il tumore epatocellulare. Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, i Richiedenti hanno studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato ? espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell?idea di soluzione principale.

In accordo con il suddetto scopo e per risolvere il suddetto problema tecnico in modo nuovo ed originale, ottenendo anche notevoli vantaggi rispetto allo stato della tecnica anteriore, un composto farmacologicamente accettabile secondo il presente trovato per un uso nel trattamento del carcinoma epatocellulare (HCC) ? scelto all?interno di un vasto gruppo di composti consistente negli inibitori della proteina p38.

Sulla base di studi di trascrittomica dei linfociti NK in pazienti con HCC, i Richiedenti hanno ipotizzato il ruolo centrale delle subunit? della proteina p38 nel modulare le principali funzioni linfocitarie. I linfociti NK di pazienti affetti da HCC si trovano in uno stato di esaurimento funzionale, che contribuisce alla persistenza della malattia. ? stato scoperto che, in modo sorprendente, manipolando l?attivit? del complesso della proteina p38/MAPK ? possibile ottenere un miglioramento dell?attivit? metabolica e antitumorale delle cellule NK nel tumore. In particolare l?attivit? metabolica e antitumorale delle cellule NK nel tumore ? almeno parzialmente ripristinata inibendo l?attivit? della proteina p38. In modo preferenziale, il composto farmacologicamente accettabile ? scelto tra gli inibitori di p38MAPK e/o gli inibitori p38a e/o gli inibitori ?38?, pi? preferenzialmente tra gli imidazoli, gli imidazoli piridinilici, i pirazoli, i tiazoli, le piperidine, i flavonoidi, gli indoli, gli zeranoli, i derivati della nicotinammide e le piridazini.

Gli imidazoli possono essere scelti tra SB 220025 e SB 239063.

Gli imidazoli piridinilici sono scelti in un gruppo costituito da: SB202190, SB203580, Ralimetinib dimesylate, p38 MAP kinase inhibitor III, PD 169316 e RWJ 67657, preferibilmente SB203580.

I pirazoli sono scelti in un gruppo costituito da BIRB-796, p38 MAP Kinase inhibitor V, p38 MAP Kinase inhibitor IX.

I tiazoli possono essere selezionati tra TAK 715 e CGH 2466.

La piperidina pu? essere JX-401.

I flavonoidi possono comprendere la Genesteina e il Kaempferolo. Gli indoli possono essere scelti nel gruppo costituito da SCIO 469 hydrochloride, SD 169 e SX 011.

Lo zenarolo pu? comprendere il (5Z)-7-oxozeaenolo.

Il derivato della nicotinammide pu? essere VX 702.

La piridazina pu? essere VX 745.

Secondo un aspetto, ? anche prevista una composizione per il ripristino metabolico e funzionale dei linfociti NK, comprendente almeno un composto inibitore della proteina p38.

Vantaggiosamente la composizione comprende, quale composto inibitore di p38, almeno un imidazolo piridinilico, almeno un imidazolo, almeno un pirazolo, almeno un tiazolo, almeno una piperidina, almeno un flavonoide, almeno un indole, almeno uno zenarolo, almeno un derivato della nicotinammide e/o almeno una piridazina. Pi? vantaggiosamente la composizione comprende, quale composto inibitore di p38, almeno un imidazolo piridinilico e/o almeno un pirazolo. L? imidazolo piridinilico pu? essere scelto tra SB202190, SB203580, Ralimetinib dimesylate, p38 MAP kinase inhibitor III, PD 169316 e RWJ 67657, preferibilmente ? SB203580. Il pirazolo pu? essere selezionato tra BIRB-796, p38 MAP Kinase inhibitor V, p38 MAP Kinase inhibitor IX; preferibilmente ? BIRB-796. Il flavonoide pu? essere selezionato tra la Genesteina e il Kaempferolo.

Ancora pi? vantaggiosamente, la composizione comprende, quale inibitore di p38, SB203580 e/o BIRB-796.

Secondo un altro aspetto ? anche previsto un prodotto farmaceutico comprendente un composto farmacologicamente accettabile oppure una composizione come descritto sopra.

Secondo un altro aspetto ? previsto un metodo per ripristinare la funzione di linfociti Naturai Killer NK. Tale metodo ? eseguito in vitro e comprende una fase di inibizione delle proteine p38.

L?inibizione delle proteine p38 pu? essere ottenuta mediante l?uso di un composto farmacologicamente accettabile scelto tra gli inibitori della proteina p38, oppure mediante l?uso di una composizione comprendente una o pi? citochine specifiche ed almeno un inibitore della proteina p38.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Questi ed altri aspetti, caratteristiche e vantaggi del presente trovato appariranno chiari dalla seguente descrizione di forme di realizzazione, fomite a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:

- la fig. 1A ? un pannello heat-map di un raggruppamento gerarchico di geni espressi in modo differenziale tra tre gruppi di studio;

- la fig. 1B ? un elenco dei set di geni arricchiti nelle cellule NK infiltranti il tessuto degli stessi tre gruppi di studio (TINK nel tumore HCC, LINK nel fegato sano adiacente il tumore e NLINK nel fegato sano);

- la fig. 1C ? una serie di pannelli heat-map relativi alla funzione mitocondriale e glicolitica, al ciclo cellulare e al danno/riparazione del DNA;

- le fig. 2A-2C sono grafici che illustrano la disfunzione metabolica nei linfociti NK attraverso la misurazione del potenziale di membrana mitocondriale (fig. 2A), l?analisi dell? assorbimento del glucosio (fig. 2B) e l?espressione della proteina p38 attivata (p38 fosforilata, fosfo-p38) (fig.

- le fig. 3A-3D sono grafici che illustrano la capacit? autofagica nelle cellule TINK, LINK e NLINK;

- le fig. 4A-4D sono grafici che illustrano l?analisi funzionale di NLINK, LINK e TINK;

- le fig. 5A-5D sono grafici che illustrano il ripristino della funzione antitumorale delle cellule NK infiltranti l?HCC; e

- le fig. 6A-6C sono grafici che illustrano il ripristino metabolico di cellule LINK e TINK misurando il potenziale di membrana mitocondriale (fig.

6A), la capacit? autofagica (fig. 6B) e l?assorbimento di glucosio (fig. 6C).

DESCRIZIONE DI ALCUNE FORME DI REALIZZAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad un composto farmacologicamente accettabile selezionato in un gruppo costituito dagli inibitori delle proteine p38. Infatti, come si vedr? nel seguito, i Richiedenti hanno scoperto che tale proteina ha un ruolo centrale nella perdita o abbassamento della funzione linfocitaria delle cellule NK.

Tra i potenziali composti inibitori della proteina p38 si possono menzionare, ad esempio, JX-401, SD- 169, (5Z)-7-oxozeaenolo, SB 22190, SB 203580, SB 220025, p38 MAP Kinase inhibitor III, p38 MAP Kinase inhibitor V, PD 169316, Ralimetinib dimesylate, RWJ 675657, SB 239063, P38 MAP Kinase inhibitor IX, CGH 2466, BIRB-796, genesteina, Kampferolo, SX 011, SCIO 469 hydrochloride, VX 702, VX 745 e TAK 715.

In una variante realizzativa il composto inibitore di p38 ? scelto tra gli imidazoli pridinilici ed i pirazoli, preferibilmente ? scelto tra SB 203580 e BIRB-796.

I Richiedenti fanno presente che questi due composti, in particolare, sono gi? noti di per s? e per il loro uso nel trattamento di altre malattie quali, ad esempio, l?asma e l?artrite reumatoide, ma per queste malattie sono stati usati sui linfociti per ottenere un effetto opposto a quanto previsto nel presente trovato. L?utilizzo dei composti inibitori di p38 sopramenzionati, in particolare di SB 203580 e BIRB-796, per ripristinare le funzioni linfocitarie delle cellule NK nei tumori, specificamente nei tumori epatocellulari, e di conseguenza per trattare questi tumori, non ? noto nello stato della tecnica.

Il composto farmacologicamente accettabile secondo il presente trovato pu? essere somministrato al paziente in una o pi? delle seguenti vie di somministrazione variamente combinate, come orale, intravenosa, transmucosale, polmonare, transdermale, oculare, buccale, sottolinguale, intraperitoneale, intratecale o intramuscolare.

Si pu? prevedere il composto farmacologicamente accettabile in composizione solida, per esempio, pastiglie, compresse, tavolette o polveri. Opzionalmente, la forma solida per somministrazione orale pu? contenere idonei carrier o eccipienti o ingredienti per il rilascio controllato del composto farmacologicamente accettabile.

In alternativa il composto farmacologicamente accettabile pu? essere in forma liquida, ad esempio preparato come soluzione acquosa o emulsione. Tale forma liquida pu? essere, per esempio, una soluzione iniettabile o una soluzione somministrabile per via orale.

Il composto farmacologicamente accettabile pu? essere incluso in un prodotto farmaceutico, da somministrare a pazienti, in particolare a pazienti affetti da HCC, per contrastarne la progressione.

Il presente trovato riguarda anche una composizione che pu? essere usata per ripristinare la funzione linfocitarie delle cellule NK, in particolare nei tumori, pi? specificamente nei tumori epatocellulari. Di conseguenza la composizione pu? essere usata nel trattamento di queste malattie.

La composizione comprende almeno un composto inibitore della proteina p38.

Un composto inibitore della proteina p38 pu? essere uno o pi? dei composti sopra citati, ossia uno o pi? tra JX-401, SD- 169, (5Z)-7-oxozeaenolo, SB 22190, SB 203580, SB 220025, p38 MAP Kinase inhibitor III, p38 MAP Kinase inhibitor V, PD 169316, Ralimetinib dimesylate, RWJ 675657, SB 239063, Genesteina, Kaempferolo, P38 MAP Kinase inhibitor IX, CGH 2466, BIRB-796, SX 011, SCIO 469 hydrochloride, VX 702, VX 745 e TAK 715. In modo particolarmente vantaggioso la composizione comprende SB 203580 e BIRB-796.

La concentrazione dell?uno o pi? composti inibitori di p38, nella composizione per un uso in vitro, pu? essere minore di 20??, pi? preferibilmente ? compresa tra 0,01 e 10??, pi? preferibilmente ? compresa tra 0,02 e 5??, ancora pi? preferibilmente ? compresa tra 0,05 e ???. Queste concentrazioni sono preferibili perch? si ? osservato che gli inibitori di proteine p38, se presenti in tali concentrazioni, agiscono in modo efficace sui loro bersagli (p38 MAPK, p38a e/o ?38?) senza per? agire su altri bersagli, non mirati neH?ambito della presente domanda. Il presente trovato riguarda un metodo per ripristinare la funzione linfocitaria di cellule NK, in particolare in tumori, pi? in particolare in tumori epatocellulari.

Tale metodo comprende una fase di inibizione della proteina p38 in tali tumori.

L?inibizione della proteina p38 pu? essere eseguita mediante l?uso di uno o pi? composti inibitori di p38 come sopra recitati, oppure mediante l?uso della composizione precedentemente descritta.

Sono stati eseguiti diversi test per identificare il ruolo delle proteine p38 nella persistenza dell?HCC e per verificare l?effetto dei composti inibitori di p38 nel ripristino delle funzioni delle cellule NK.

1-Test per l?espressione genica nelle cellule NK infiltranti l?HCC Dodici campioni bioptici di fegato affetti da Epatocarcinoma (HCC) e relativo tumore, nonch? 7 campioni bioptici di fegato non affetti da HCC (controlli di fegato ?normale?), sono stati processati per ottenere le cellule linfomononucleate infiltranti il tessuto, al fine di analizzare cellule NK derivanti dal tumore, chiamati TINK, cellule NK che infiltrano il fegato adiacente al tumore, chiamati LINK, e cellule NK derivanti da resezione epatica per metastasi colon rettali, chiamati NLINK. Le cellule NLINK derivano quindi da fegato normale.

Le cellule NK dei diversi gruppi di studio sono state isolate mediante FACSAria III Celi Sorter (BD) e purificate, per eseguire un?analisi di profili di espressione genica. I risultati sono mostrati in fig. 1 A-C.

In particolare, la fig. 1A mostra un Raggruppamento gerarchico che mostra 18 1 geni espressi in modo differenziale (ANOVA, p <0,05) tra i gruppi di studio. La fig. 1B mostra un elenco dei set di geni arricchiti nelle cellule NK infiltranti il tessuto dei tre gruppi di studio, identificati dall'analisi Gene set enrichment (GSEA) (MSigDB, C2 canonical pathways set). La fig. 1C mostra Heat-map di geni differenzialmente espressi derivati da GSEA in TINK e LINK, relativi alla funzione mitocondriale e glicolitica, al ciclo cellulare e al danno / riparazione del DNA. Nelle fig. 1 A e 1C i geni sovraespressi sono rappresentati in toni di grigio pi? scuri e i geni sottoregolati sono mostrati in toni di grigio pi? chiari.

Dall?analisi dei profili trascrizionali dei gruppi di studio si ? dimostrata una generale attivazione nelle cellule NK derivate dal tumore di diverse funzioni cellulari associate alla capacit? di detossiflcare le specie reattive dell?ossigeno, a vie metaboliche, come glicolisi e fosforilazione ossidativa, al sistema di degradazione mediata dall'ubiquitina-proteasoma, al ciclo cellulare e alla risposta al danno al DNA e a pathways di risposta allo stress cellulare come MAPK e p38, rispetto a NLINK e LINK.

In particolare, tra i geni che sono risultati attivati nelle cellule NK infiltranti il tumore sono emersi geni che codificano per i componenti della catena di trasporto degli elettroni (ETC), comprese molte subunit? del complesso I (NADH deidrogenasi), II (succinato deidrogenasi), III (citocromo c reduttasi), IV (citocromo c ossidasi) e V (ATP sintasi); geni correlati al metabolismo del glucosio, in particolare la famiglia dell'aldeide deidrogenasi, complesso aldolasi, fosfoglicerato chinasi 1 (Fig. 1B). Un altro gruppo di geni sovraespressi nelle cellule NK di pazienti con tumore riguarda la segnalazione intracellulare e il controllo del ciclo cellulare, come MAPK 14 e MAPK 11 (subunit? del complesso proteico p38), TP53, p73 e p21 (Fig. 1C).

Sulla base dei risultati sopracitati e di dati simili riportati per il microambiente tumorale, si ? ipotizzato che le cellule NK infiltranti l'HCC si trovino in una condizione di privazione di nutrienti, necessari per espletare in maniera corretta le funzioni antitumorali. Per valutare una possibile disregolazione delle funzioni metaboliche delle cellule NK intratumorali, ? stata valutata con specifiche sonde in citofluorimetria la funzione mitocondriale e il metabolismo del glucosio.

2-Disfunzione metabolica delle cellule NK nell?HCC

La funzione mitocondriale ? stata valutata mediante l analisi della depolarizzazione della membrana mitocondriale. Il potenziale di membrana mitocondriale ? stato misurato mediante sonda potenziometrica JC-1. Come mostrato nella Fig. 2A, ? stato rilevato un livello pi? alto di mitocondri depolarizzati, quantificato dalla percentuale di cellule FLlhigh/FL21ow (a sinistra) e dall'intensit? fluorescente media (a destra), in TINK rispetto agli altri gruppi

Le cellule NK infiltranti il tumore hanno mostrato una funzionalit? mitocondriale difettosa, indicata da un aumento dei mitocondri depolarizzati rispetto alla controparte non tumorale e ai controlli sani. Al fine di valutare anche la funzione glicolitica ? stata analizzata la capacit? di assorbimento del glucosio, che ? risultata ridotta nelle cellule NK di pazienti TINK rispetto a NLINK e LINK (Fig. 2B). L'analisi dell'assorbimento del glucosio, misurata tramite l?analogo fluorescente del glucosio 2NBDG, ha mostrato un consumo difettoso di glucosio da parte di TINK rispetto a LINK e NLINK sia a livello di percentuale di cellule positive (a sinistra) sia quantificando il segnale di intensit? fluorescente totale.

Con l?intento di chiarire i meccanismi responsabili della compromissione glicolitica e della OXPHOS, ? stato estratto dalle liste della GSEA un elenco di geni come possibili candidati. In particolare, la maggior parte dei pathways ha evidenziato una sovraregolazione di MAPK1 1 e MAPK14 (subunit? a e ? del complesso p38).

In effetti, la proteina p38 ? una chinasi sensore dello stress cellulare, dalla famiglia delle protein chinasi attivate da mitogeni (MAPK), che pu? essere attivata in seguito a stress nutrizionale nel microambiente. Sulla base di questa osservazione, ? stato analizzato lo stato di fosforilazione della proteina p38-MAPK nei tre gruppi di studio. Si osserva un livello pi? alto di p38 fosforilato nelle cellule NK appartenenti a campioni di tumore rispetto a LINK e NLINK (Fig. 2C), confermando un'attivazione di questa via cellulare, come precedentemente indicato anche dall'analisi trascrittomica. Infatti, l'espressione di fosfo-p38 ha mostrato un aumento della fosforilazione di p38 in TINK rispetto a LINK sia sul totale NK che nel sottoinsieme CD56<BRIGHT>.

Per comprendere meglio la condizione metabolica delle cellule NK che infiltrano il tumore epatico, ? stato analizzato anche il loro potenziale autofagico.

I risultati dell'analisi trascrittomica avevano suggerito un meccanismo deficitario della clearance delle specie reattive dell?ossigeno, confermato anche dall'accumulo di mitocondri danneggiati (Fig. 1B-C e Fig. 2A). Inoltre, p38 ? noto essere implicato nella repressione dell'autofagia in diversi tipi di cellule, comprese le cellule T, durante condizioni di deprivazione di nutrienti come quelle che si verificano nel microambiente tumorale.

Sulla base di questo background, ? stata studiata la via di degradazione mediata dai lisosomi attraverso la valutazione dell'incorporazione cationica di una specifica sonda (Cyto-ID) nelle vescicole autofagiche (pre-autofagosomi, autofagosomi e autofagolisosomi) con o senza trattamento con clorochina.

3-Capacit? autofagica nelle cellule TINK, LINK e NLINK.

Le fig. 3A-3D mostrano l?intensit? di fluorescenza mediana (MFI) dell?espressione della sonda Cyto-ID (che misura l?attivit? autofagica dei linfociti) in TINK, LINK e NLINK in campioni non trattati (fig. 3 A) e trattati con clorochina (fig. 3C). Esempi rappresentativi sono mostrati a destra di ogni pannello. Si illustra anche la correlazione tra i valori di Cyto-ID nei campioni non trattati (fig. 3B) e trattati con clorochina (fig. 3D) e fosfo-p3 8 in cellule NK totali tumorali.

Come mostrato nella Fig. 3 A, le cellule NK del tumore (TINK) hanno manifestato un'espressione di Cyto-ID basale significativamente pi? bassa rispetto a LINK e a NLINK. Dopo il trattamento con clorochina, il ridotto accumulo di vescicole autofagiche risultava ancora pi? esacerbato nelle cellule NK infiltranti l'HCC rispetto a NLINK e LINK (Fig. 3C). La relazione negativa tra l?upregolazione del p38, prima descritta, e i livelli di autofagia, confermava il ruolo di p38 nell?inibizione dell?autofagia (Fig. 3B e D).

4-Analisi funzionale di NLINK, LINK e TINK.

Al fine di definire la capacit? funzionale anti-tumorale delle cellule NK infiltranti il tumore, sono state valutate la produzione di citochine e la capacit? di avere attivit? citotossica sulle cellule bersaglio ( o capacit? di degranulazione mediante analisi di espressione di CD107a). Le cellule NK infiltranti il tumore o la controparte non tumorale delle tre categorie di pazienti sono state stimolate per 4 ore con dei composti specifici (PMA e ionomicina) al fine di ottenere una risposta massimale.

La produzione di IFN-? e TNF-? ? stata valutata con o senza PMA (forbolo 12-miristato 13 -acetato) (50 ng/ml) e ionomicina (1 ?g/ml) per 4 h, in cellule NK infiltranti (fig. 4A e 4B). Dopo l'aggiunta di Brefeldin-A (BFA, 10 ?g/ml), le determinazioni della produzione di citochine sono state eseguite mediante citofluor?metria.

Il potenziale citotossico delle cellule NK ? stato valutato mediante il marker di degranulazione CD107a (fig. 4C). Nelle fig. 4A-4C, i dati sono espressi come differenza tra la percentuale di citochine o cellule NK positive per CD107a nei campioni stimolati e non stimolati. Le linee orizzontali rappresentano le mediane dei valori.

La fig. 4D mostra Dot plot rappresentativi che mostrano l'espressione di IFN-?, TNF-? e CD107a nelle cellule NK infiltranti il tumore e il fegato derivati da NLINK, LINK e TINK dopo stimolazione con PMA/ionomicina.

La produzione di IFN-? non ? risultata ridotta in TINK rispetto a LINK e NLINK (Fig. 4A). Al contrario, l'espressione di TNF-? (Fig. 4B) e CD107a (Fig. 4C) ? risultata significativamente deficitaria nelle cellule NK tumorali rispetto a LINK e NLINK.

Lo stato metabolico delle cellule NK intratumorali ha mostrato una forte associazione con la produzione di citochine e la capacit? di degranulazione. In particolare, la frequenza delle cellule NK con mitocondri depolarizzati ha mostrato una correlazione negativa con l?espressione di IFN-?, TNF-? e CD107a suggerendo che la funzionalit? mitocondriale nelle cellule NK che infiltrano il tumore abbia un impatto sulla produzione di citochine e sulla funzione citotossica. Anche il consumo di glucosio e il potenziale di autofagia sono strettamente legati alle funzioni immunitarie delle cellule NK infiltranti l'HCC.

Considerando l?alto numero di geni sovraespressi relativi a meccanismi di stress cellulare, si ? ipotizzato il ruolo centrale delle subunit? del p38 nel modulare le principali funzioni linfocitarie. In linea con questa ipotesi, si ? osservato che manipolando l?attivit? del complesso della proteina p38/MAPK ? possibile ottenere un miglioramento dell?attivit? metabolica e antitumorale delle cellule NK nel tumore.

Per definire in maniera diretta il ruolo dell?alterazione di p38 nelle cellule NK tumorali, sono stati impiegati due inibitori di p38/MAPK (SB203580 e BIRB-796) nel trattamento delle cellule NK derivate dai vari gruppi di studio precedentemente elencati.

5-Saggi di ripristino della funzione delle cellule NK infiltranti l?HCC ? stata valutata la capacit? di questi inibitori di migliorare le funzioni antitumorali, misurate come produzione di citochine e capacit? degranulativa (citotossica), dei linfociti NK appartenenti a campioni tumorali e non tumorali.

Sono stati isolati i linfociti NK isolati da 1 1 pazienti con tumore del fegato (HCC) e infezione da virus HCV, 6 pazienti con HCC correlato ad abuso di alcool, 1 paziente con HCC e steato-epatite non alcolica (NASH) e infine da 7 pazienti sottoposti a resezione epatica per metastasi da carcinoma colon rettali come controlli.

Le cellule sono state stimolate overnight (18h) con IL- 12 e IL- 18, in presenza o in assenza di SB 203580 (dalla ditta ) e BIRB-796 (dalla ditta Selleckchem) entrambi a concentrazioni finali nell? intervallo di 0,05- 1??.

In seguito, ? stata determinata mediante citometria a flusso la produzione delle citochine anti-tumorali quali IFN-? (fig. 5 A, 5B), TNF-a (fig. 5C) e del marcatore di attivit? citotossica CD107a (fig. 5D) nei gruppi di studio e in tutti i sottoinsiemi di cellule NK (Total, CD56<DIM >e CD56<BRIGHT>). I dati sono riportati come il rapporto tra la percentuale di citochine e cellule NK CD107a-positive rilevate nelle colture trattate con gli inibitori rispetto a quelle non trattate (fold change). In fig. 5B ? rappresentato un grafico a barre che mostra la produzione di IFN-? in seguito alla stimolazione di PMA/ionomicina da singoli campioni TINK (pannello in alto a sinistra). Nei pannelli centrali e in basso a sinistra i corrispondenti valori di Fold Change nei campioni TINK trattati con i due inibitori di p38. Nei pannelli di destra ? mostrata la correlazione tra produzione di IFN-? e risposta all?inibizione di p38.

Si nota che, sebbene la produzione di IFN-? sia stata meno influenzata rispetto ad altre funzioni, i campioni TINK con produzione di IFN-? pi? bassa risultano i pi? propensi a rispondere in seguito all'inibizione di p38 (Fig. 5A e B). Tale risultato conferma l?efficacia degli inibitori nell? incrementare la funzionalit? antitumorale dei linfociti NK nel tumore.

In aggiunta, valutando l?azione di questi composti sull?attivit? dei linfociti correttamente funzionanti (LINK e NLINK), si pu? plausibilmente escludere un?azione aspecifica di attivazione della risposta immunitaria che potrebbe portare a fenomeni di autoimmunit? dal momento che non si osserva un incremento significativo della produzione di citochine da parte dei linfociti appartenenti alla categoria di controllo.

6-Ripristino metabolico di cellule NK infiltranti HCC e fegato non tumorale.

Sono state inoltre condotte prove volte a verificare se il ripristino dell?attivit? antitumorale dei linfociti NK, dopo trattamento con gli inibitori, comportasse anche un ripristino metabolico.

Le cellule NK sono state stimolate overn?ght con IL-12+IL-18 in presenza o assenza degli specifici inibitori di p38, ed in seguito ? stata valutata la depolarizzazione della membrana mitocondriale (f?g. 6A), assorbimento del glucosio (fig. 6B) e potenziale autofagico (con e senza clorochina, fig. 6C). I dati sono presentati come il rapporto tra i valori nelle cellule NK trattate con inibitori rispetto a quelle non trattate.

Il blocco di p38 pare aver ridotto fortemente le cellule NK con mitocondri depolarizzati nel tumore, mentre l'inibizione di p38 non ha mostrato alcun effetto nel modulare il potenziale di membrana mitocondriale nella controparte non tumorale (Fig. 6A). Inoltre, il potenziale autofagico delle cellule NK ? stato significativamente potenziato dall' inibizione di p38, specialmente nel tumore (Fig. 6). Diversamente, l'importazione di glucosio non ? stata influenzata dal trattamento sia nel fegato che nelle cellule NK infiltranti il tumore (Fig.

6C).

E chiaro che al composto farmacologicamente accettabile, alla composizione ed al metodo per il ripristino metabolico e funzionale delle cellule NK fin qui descritti possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti o fasi, senza per questo uscire daH?ambito del presente trovato come definito dalle rivendicazioni.

? anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad esempi specifici, un esperto del ramo potr? realizzare altre forme equivalenti di composto farmacologicamente accettabile, di composizione e di metodo di ripristino metabolico e funzionale dei linfociti NK, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell?ambito di protezione da esse definito.

Claims (12)

RIVENDICAZIONI

1. Composto farmacologicamente accettabile scelto tra gli inibitori della proteina p38 per il ripristino metabolico e funzionale dei linfociti Naturai Killer (NK).

2. Composto farmacologicamente accettabile come nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto composto farmacologicamente accettabile ? scelto tra gli imidazoli piridinilici e i pirazoli.

3. Composto farmacologicamente accettabile come nella rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che ? SB203580 quale composto imidazolo piridinilico.

4. Composto farmacologicamente accettabile come nella rivendicazione 2 o 3, caratterizzato dal fatto che ? BIRB-796 quale composto pirazolo.

5. Composizione per il il ripristino metabolico e funzionale dei linfociti NK, caratterizzata dal fatto che comprende almeno un composto inibitore della proteina p38.

6. Composizione come nella rivendicazione 5, caratterizzata dal fatto che comprende, quale composto inibitore della proteina p38, uno o pi? imidazoli piridinilici e/o uno o pi? pirazoli.

7. Composizione come nella rivendicazione 5 o 6, caratterizzato dal fatto che comprende SB203580 e/o BIRB-796 quale composto inibitore della proteina p38.

8. Composizione come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 7, caratterizzata dal fatto che detto almeno un composto inibitore della proteina p38 ? presente ad una concentrazione compresa tra 0,01 e 10??.

9. Composto farmacologicamente accettabile come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 oppure composizione come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8 per un uso nel trattamento del carcinoma epatocellulare.

10. Prodotto farmaceutico comprendente un composto farmacologicamente accettabile come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 oppure una composizione come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8, comprendente, inoltre, eccipienti e/o adiuvanti.

11. Metodo per ripristinare la funzione di linfociti Natural Killer (NK) in tumori epatocellulari, mediante inibizione in vitro delle proteine p38.

12. Metodo come nella rivendicazione 11 , in cui l' inibizione delle proteine p38 ? eseguita mediante l?uso di un composto farmacologicamente accettabile come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 oppure una composizione come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 9.