IT202100030629A1 - Composizione antitumorale - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
Description
Descrizione di un brevetto d?invenzione
DESCRIZIONE
Stato della tecnica
Nell?epoca attuale, il cancro, insieme ad altre patologie cronico-degenerative (come il diabete e la neurodegenerazione), costituisce uno dei principali problemi sanitari per la societ?; si tratta di una malattia legata, tra gli altri fattori, all?allungamento della vita media ed ad una progressiva modificazione degli stili di vita.
Fino a poco tempo fa, si riteneva che i tumori fossero cellule con un danno irreversibile al DNA e che l?unico modo per curarlo fosse eliminare le cellule cancerogene:
- rimuovendole chirurgicamente, o
- avvelenandole con la chemioterapia, o
- bruciandole con la radioterapia.
Oggi la ricerca ha scoperto che ? possibile correggere e riprogrammare questi danni al DNA e far ritornare sane le cellule tumorali.
Questo grazie all?epigenetica (branca della scienza che studia i meccanismi e le interazioni con cui i vari geni possono essere regolati, attivandoli o disattivandoli) che sottende al fenomeno della reversione tumorale (o Tumor Reversion).
La reversione tumorale prevede una strategia alternativa di cura dei tumori, non uccidendo le cellule malate, ma trasformandole in cellule sane. Il fenomeno della reversione tumorale trova primi fondamenti negli studi di organogenesi.
L?organogenesi ? il meccanismo di costruzione e crescita delle varie parti dell?embrione che rispetta parametri quantitativi e qualitativi tali da far riconoscere un individuo come appartenente ad una determinata specie. Si parla di organogenesi quando l?embrione ha raggiunto lo stadio di gastrula.
In questo particolare fase, sono stati individuati particolari peptidi in grado di agire a livello epigenetico per la differenziazione cellulare; questi meccanismi sono cos? precisi che sono in grado di identificare e riparare un errore, non appena intercettato. Nel caso in cui l?errore sia troppo grave, sono in grado di indurre l?apoptosi cellulare, eliminando quindi la cellula con errore. In questo modo gli errori indotti dai prodotti cancerogeni vengono corretti, impedendo la formazione tumorale.
Vantaggiosamente la presente invenzione fa riferimento ad una composizione di microRNa (miRNA) che svolge un?azione sorprendentemente sinergica nell?azione antitumorale in senso lato. A seguire, i dettagli della stessa.
Definizioni
Ai fini della presente invenzione con il termine epigenetica si intende quella ?branca della biologia che studia le interazioni causali fra i geni e il loro prodotto cellulare e pone in essere il fenotipo", o come "lo studio dei cambiamenti mitotici e meiotici ereditabili che non possono essere spiegati tramite modifiche della sequenza di DNA". Fenomeni epigenetici sono ad esempio alla base della maggior parte dei processi di differenziamento cellulare (e loro alterazione, quindi anche nel cancro), e concorrono ad una certa plasticit? fenotipica ereditabile in relazione a cambiamenti ambientali.
Ai fini della presente invenzione con l?espressione ?reversione tumorale (o ?tumor reversion)? si intende la ?reversione del fenotipo del comportamento tumorale. Si tratta di un processo attraverso il quale la cellula tumorale ? riprogrammata a livello epigenetico sotto l?influenza di diversi fattori, che possono essere farmacologici o nutrizionali, in modo tale che la cellula non si comporti pi? come una cellula maligna ma riacquisti le funzionalit? e le caratteristiche di una cellula normale?.
Ai fini della presente invenzione con il termine microRNA (miRNA) si intendono molecole endogene di RNA non codificante a singolo filamento riscontrate nel trascrittoma di piante, animali e alcuni virus a DNA. Si tratta di polimeri codificati dal DNA nucleare eucariotico lunghi circa 20-25 nucleotidi e principalmente attivi nella regolazione dell'espressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale. I miRNA vengono inglobati nel complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) e inducono il silenziamento genico tramite sovrapposizione con sequenze complementari presenti su molecole di RNA messaggero (mRNA) bersaglio. Tale legame comporta una repressione della traduzione o la degradazione della molecola bersaglio. Il silenziamento pu? avvenire secondo i seguenti meccanismi:
1. taglio della molecola di mRNA;
2. destabilizzazione della molecola di mRNA tramite accorciamento della coda di poli(A); 3. diminuzione dell'efficienza di traduzione del messaggero;
Il genoma umano codifica centinaia di miRNA i quali risultano abbondanti in tutti i tipi cellulari dei mammiferi. Svolgono la loro attivit? di silenziamento su un'ampia gamma di trascritti derivanti dall'espressione di migliaia di geni. L'espressione aberrante dei miRNA ? implicata nell'insorgenza di numerose patologie. Essi possono essere utilizzati a scopi terapeutici.
Ai fini della presente invenzione, e secondo il Regolamento (UE) 2015/2283, entrato in vigore il 1 gennaio 2018, con ?nuovi alimenti? (o novel food) si intendono tutti quei prodotti e sostanze alimentari privi di storia di consumo ?significativo? al 15 maggio 1997 in UE, e che, quindi, devono sottostare ad un'autorizzazione, per valutarne la loro sicurezza, prima della loro immissione in commercio.
Ai fini della presente invenzione le sequenze di miRNA qui indicate sono descritte nel database https://mirbase.org.
In particolare, le sequenze di miRNA vengono qui indicate con:
- il nome assegnato (es: dre-miR-16a ); e
- codice accesso (es: MIMAT0001774).
Descrizione Dettagliata dell?Invenzione
La presente invenzione fa riferimento ad una composizione comprendente uno o pi? miRNA, dove detti miRNA sono selezionati dal gruppo costituito da:
dre-miR-16a MIMAT0001774:
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGUG;
dre-miR-205-5p MIMAT0001280:
UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG;
dre-miR-205-3p MIMAT0031925:
GAUUUCAGUGGUGUGAAGUGUA;
dre-miR-146a MIMAT0001843:
UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG;
dre-miR-182-5p MIMAT0001271:
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACA;
dre-miR-182-3p MIMAT0001272:
UGGUUCUAGACUUGCCAACUA;
dre-miR-29a MIMAT0001802:
UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA;
dre-miR-183-5p MIMAT0001273: UAUGGCACUGGUAGAAUUCACUG;
dre-miR-183-3p MIMAT0031921: UGAAUUACCAAAGGGCCAUAA;
dre-miR-155 MIMAT0001851:
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG;
dre-miR-363-5p MIMAT0031992: CGGGUGGAUGACUCUGCAAUUUU;
dre-miR-363-3p MIMAT0001874: AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA;
dre-miR-192 MIMAT0001275:
AUGACCUAUGAAUUGACAGCC;
dre-miR-101b MIMAT0001815: UACAGUACUAUGAUAACUGAAG;
dre-miR-15c MIMAT0003764:
AAGCAGCGCGUCAUGGUUUUC;
dre-miR-103 MIMAT0001816:
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA;
dre-miR-210-5p MIMAT0003392: AGCCACUGACUAACGCACAUUG;
dre-miR-210-3p MIMAT0001281: CUGUGCGUGUGACAGCGGCUAA;
dre-miR-196b MIMAT0001860:
UAGGUAGUUUCAAGUUGUUGGG;
dre-let-7i MIMAT0001767 UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU
dre-miR-451 MIMAT0001634:
AAACCGUUACCAUUACUGAGUU;
dre-miR-18c MIMAT0001781:
UAAGGUGCAUCUUGUGUAGUUA;
dre-miR-16b MIMAT0001775:
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGAG;
dre-miR-10a-5p MIMAT0001267: UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;
dre-miR-10a-3p MIMAT0003391: CAAAUUCGUGUCUUGGGGAAUA;
dre-miR-429a MIMAT0001624:
UAAUACUGUCUGGUAAUGCCGU;
dre-miR-140-5p MIMAT0001836: CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG;
dre-miR-140-3p MIMAT0003159: UACCACAGGGUAGAACCACGGAC;
dre-miR-200a-5p MIMAT0031984: CAUCUUACCGGACAGUGCUGGA; dre-miR-200a-3p MIMAT0001861: UAACACUGUCUGGUAACGAUGU;
dre-miR-146b MIMAT0001844:
UGAGAACUGAAUUCCAAGGGUG;
dre-miR-206-5p MIMAT0031988: ACAUGCUUCCUUAUAUGCCCAUA;
dre-miR-206-3p MIMAT0001866: UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG;
dre-miR-20b-5p MIMAT0001778: CAAAGUGCUCACAGUGCAGGUAG;
dre-miR-20b-3p MIMAT0031939: ACUGCAAUGUCUGCACUUCAAGU;
dre-miR-454b MIMAT0001878:
UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGG;
dre-miR-15b-5p MIMAT0001773: UAGCAGCACAUCAUGGUUUGUA;
dre-miR-15b-3p MIMAT0031936: CGAAUCAUGAUGUGCUGUCACU;
dre-miR-10d-5p MIMAT0001771: UACCCUGUAGAACCGAAUGUGUG;
dre-miR-10d-3p MIMAT0003394: CAGAUUCGGUUUUAGGGGAGUA;
dre-miR-10c-5p MIMAT0001770: UACCCUGUAGAUCCGGAUUUGU;
dre-miR-10c-3p MIMAT0031935: AAAUUCGUAUCUAGGGGAGUA;
dre-miR-203a-5p MIMAT0031923: AGUGGUUCUUAACAGUUCAACAGU;
dre-miR-203a-3p MIMAT0001278: GUGAAAUGUUUAGGACCACUUG;
dre-miR-122 MIMAT0001818:
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG;
dre-miR-101a MIMAT0001814:
UACAGUACUGUGAUAACUGAAG;
dre-miR-130b MIMAT0001827:
CAGUGCAAUAAUGAAAGGGCAU;
dre-miR-223 MIMAT0001290:
UGUCAGUUUGUCAAAUACCCC;
dre-miR-26b MIMAT0001795:
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGUU;
dre-miR-130a MIMAT0001826:
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU;
dre-miR-30e-5p MIMAT0001807: UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG;
dre-miR-30e-3p MIMAT0003402: CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC; dre-miR-203b-5p MIMAT0003407: AGUGGUUCUCAACAGUUCAACA;
dre-miR-203b-3p MIMAT0001865: GUGAAAUGUUCAGGACCACUUG;
dre-miR-7b MIMAT0001265:
UGGAAGACUUGUGAUUUUGUU;
dre-miR-221-5p MIMAT0031926: ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUUCUGU;
dre-miR-221-3p MIMAT0001288: AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC;
dre-miR-222a-5p MIMAT0031927: UGCUCAGUAGUCAGUGUAGAUCC;
dre-miR-222a-3p MIMAT0001289: AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC;
dre-miR-25-5p MIMAT0031946: AGGCGGAGACUUGGGCAGCUGCC;
dre-miR-25-3p MIMAT0001793: CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA;
dre-miR-19b-5p MIMAT0003399: AGUUUUGCUGGUUUGCAUUCAG;
dre-miR-19b-3p MIMAT0001783: UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA; dre-miR-93 MIMAT0001810:
AAAAGUGCUGUUUGUGCAGGUA;
dre-miR-18a MIMAT0001779:
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUA;
dre-miR-92a-5p MIMAT0031953:
AGGUUGGGAUUGGUAGCAAUGCU;
dre-miR-92a-3p MIMAT0001808:
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU;
dre-miR-20a-5p MIMAT0001786:
UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG;
dre-miR-20a-3p MIMAT0003400:
ACUGCAGUGUGAGCACUUGAAG;
dre-miR-196c MIMAT0011298:
UAGGUAGUUUGAUGUUGUUGGG;
dre-miR-725-5p MIMAT0032010:
UGCUAGGAAUGGUGGCUGAGAU;
dre-miR-725-3p MIMAT0003753:
UUCAGUCAUUGUUUCUAGUAGU;
dre-miR-733 MIMAT0003763:
UGCGUUGGUUUAGCUCAGUGGUU;
e loro miscele.
Preferibilmente, in detta composizione comprendente uno o pi? miRNA, detti miRNA sono selezionati dal gruppo costituito da:
dre-miR-146a MIMAT0001843:
UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG;
dre-miR-192 MIMAT0001275:
AUGACCUAUGAAUUGACAGCC;
dre-miR-451 MIMAT0001634:
AAACCGUUACCAUUACUGAGUU;
dre-miR-203b-5p MIMAT0003407: AGUGGUUCUCAACAGUUCAACA;
dre-miR-203b-3p MIMAT0001865: GUGAAAUGUUCAGGACCACUUG;
dre-miR-203a-5p MIMAT0031923: AGUGGUUCUUAACAGUUCAACAGU;
dre-miR-203a-3p MIMAT0001278: GUGAAAUGUUUAGGACCACUUG;
dre-miR-7b MIMAT0001265:
UGGAAGACUUGUGAUUUUGUU;
dre-miR-19b-5p MIMAT0003399: AGUUUUGCUGGUUUGCAUUCAG;
dre-miR-19b-3p MIMAT0001783: UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA; dre-miR-725-5p MIMAT0032010: UGCUAGGAAUGGUGGCUGAGAU;
dre-miR-725-3p MIMAT0003753: UUCAGUCAUUGUUUCUAGUAGU; e loro miscele.
La presente invenzione fa riferimento alla composizione della presente invenzione per l?uso nel trattamento di cancro.
Preferibilmente, detto cancro ? selezionato dal gruppo costituito da: cancro della mammella, del colon, del pancreas e del fegato.
Ancor pi? preferibilmente, detto cancro ? cancro della mammella.
Vantaggiosamente, e come mostrato nella parte sperimentale, la composizione di miRNA della presente invenzione pu? essere selezionata ed estratta da Zebrafish; ancor pi? preferibilmente, detta composizione estratta e selezionata da Zebrafish ? stata selezionata nella fase F6 di gastrulazione.
Gli estratti di Zebrafish (EF) hanno mostrato su diversi tipi di cellule tumorali in coltura di inibire la motilit? e l?invasivit? del tumore, innescando processi apoptotici in alcune frazioni cellulari e promuovendo la riprogrammazione della cellula nei campioni residui.
Preferibilmente, detta composizione della presente invenzione pu? essere somministrata da sola o in combinazione con agenti chemoterapici. Se somministrata in combinazione con agenti chemoterapici, i pazienti dimostrano meno effetti collaterali, portando ad un miglioramento nei trattamenti oncologici. L?associazione ad agenti chemioterapici porta infatti ad una riduzione degli effetti collaterali ed aumenta la tollerabilit? dei trattamenti; inoltre detta composizione contribuisce in modo diretto alla regressione tumorale e migliora il benessere generale dei pazienti e la loro sopravvivenza.
Vantaggiosamente, l?attivit? antitumorale della composizione della presente invenzione mostra un?azione superiore e sinergica rispetto a quella dei singoli miRNA.
Vantaggiosamente, e come riportato nella parte sperimentale, studi in vitro hanno dimostrato che la composizione di miRNAs della presente invenzione ? in grado di promuovere una reversione delle cellule tumorali che recuperano un fenotipo normale, perdendo alcuni dei pi? importanti tratti delle cellule neoplastiche tra cui la capacit? di metastatizzazione.
La specifica configurazione funzionale dei miRNA della presente invenzione consente di innescare nelle cellule tumorali testate un effetto complessivo di differenziamento con perdita della malignit?. Quest?azione va ben oltre la promozione dell?apoptosi e il rallentamento della proliferazione.
Vantaggiosamente, e come riportato nella parte sperimentale, la composizione della presente invenzione promuove la riconversione fenotipica delle cellule tumorali. I processi innescati e controllati da tale composizione comprendono i seguenti meccanismi:
- Rimodulazione della configurazione del citoscheletro con conseguente modifica nelle relazioni funzionali e biofisiche tra cellule e microambiente;
- Recupero delle connessioni tra cellule come premessa per la ricostituzione di un?ordinata geometria tissutale (ri-espressione della E-caderina e delle cell junction ed in particolare delle connessioni transmembrana E-caderina/?-catenina).
- Modulazione selettiva di numerosi geni coinvolti nel differenziamento ed in particolare inibizione dell?espressione del TCTP, uno dei principali geni coinvolti nel de-differenziamento tumorale. ? di grande rilievo che tali cambiamenti comportino la riespressione della p53, considerata essere una tappa essenziale nel recupero del controllo sui meccanismi di proliferazione della cellula.
- Unitamente all?attivazione dei processi differenziativi, il trattamento con i fattori embrionali porta ad una specifica inibizione della transizione epitelio-mesenchimale, con il recupero del fenotipo epiteliale e inibizione dei meccanismi che presiedono all?innesco della migrazione ed invasivit? (metastatizzazione).
In un'altra forma di realizzazione la presente invenzione fa riferimento ad integratori alimentari e/o nuovi alimenti e/o farmaci comprendente la composizione della presente invenzione.
A seguire alcuni esempi, descrittivi e non limitativi, volti a supportare gli aspetti inventivi e vantaggiosi della presente invenzione.
Le tecniche riportate nella parte sperimentale sono generalmente usate dal tecnico del ramo in maniera routinaria e pertanto, ove non indicato, le informazioni tecniche necessarie per riprodurre gli esperimenti si ritengono nella conoscenza del tecnico del ramo.
ESEMPI
1. ESTRAZIONE DI miRNA DA ZEBRAFISH
L'analisi del contenuto di miRNA ? stata eseguita su sei diversi campioni di embrioni di Zebrafish (fasi 1-6), corrispondenti a diversi stadi dei tempi di pre-gastrulazione dello sviluppo embrionale.
In dettaglio, per ogni fase sono state conservate 516 cellule embrionali di Zebrafish:
- periodo di blastula (F1);
- 80% epibolo (F2),
- codino (F3),
- durante il periodo della Gastrula;
- Stadio di 10 somiti (F4),
- stadio di 18 somiti (F5) e
- stadio di 20 somiti (F6),
corrispondenti al periodo di segmentazione, secondo le fasi di sviluppo dell'embrione di Zebrafish.
Principio e procedura
I miRNA maturi sono RNA non codificanti a circa 22 nucleotidi presenti in natura che mediano la regolazione genica post-trascrizionale.
A differenza della maggior parte degli RNA cellulari, i miRNA maturi possiedono sia un gruppo idrossile 3' che un gruppo fosfato 5'. Ci? consente agli adattatori di essere specificamente legati sia all'estremit? 3' che all'estremit? 5' dei miRNA consentendo la trascrizione inversa universale e la preparazione della libreria di miRNA maturi, riducendo al minimo lo sfondo di altre specie di RNA. Inoltre, il kit della libreria QIAseq miRNA (QUIAGEN) consente la preparazione della libreria e il multiplexing di:
- un massimo di dodici campioni utilizzando QIAseq miRNA NGS 12 Index IL,
- fino a 48 campioni in combinazione con QIAseq miRNA NGS 48 Index IL o
- fino a 96 campioni con QIAseq miRNA NGS 96 Index I L.
Sintesi universale del cDNA e preparazione della libreria di miRNA
In una reazione imparziale, gli adattatori sono legati in sequenza alle estremit? 3' e 5' dei miRNA. Successivamente, vengono eseguite la sintesi universale del cDNA (complementary DNA) con assegnazione UMI, pulizia del cDNA, amplificazione della libreria e pulizia della libreria.
La metodologia utilizza oligonucleotidi modificati ed elimina virtualmente la presenza di dimeri adattatori nella libreria di sequenziamento, rimuovendo efficacemente un?importante contaminante, spesso osservato durant e il sequenziamento .
Inoltre, il kit riduce al minimo la prese nza di hY4 Y-RNA (hY4, piccoli segmenti di RNA non codificanti), che ? spesso osservata ad alti livelli nei cam pioni di siero e plasma. Le seguenti reazioni fanno parte del flusso di lavoro:
Legatura 3': Un adattatore di DNA pre-aden ilato ? legato alle estremit? 3' di tutti i miRNA. Il QIAseq miRNA NGS 3' Ligase ? altamente otti mizzato per una lega tura efficiente e prevenzi one di prodotti collat erali indesiderati.
Legatura 5': Un adattatore RNA ? legato all'estremit? 5' dei miRNA maturi.
Preparazione della libreria per il sequenz iamento di miRNA utili zzando il kit QIAseq miRNA Lib rary.
Gli adattatori 3' e 5' appositamente progettati sono legati ai miRNA maturi. I miRNA ligati vengono quindi retrotrascritti a cDNA utilizzando un primer di trascrizione inversa (RT) con un UMI. Nessuna libreria viene preparata dai dimeri dell'adattatore.
Dopo la pulizia del cDNA seguendo un protocollo standard noto al tecnino del ramo, l'amplificazione della libreria avviene con un primer forward universale e primer reverse indexing.
Dopo una pulizia finale della libreria, la libreria di miRNA ? quindi pronta per il controllo qualit? e il successivo NGS (Next-Generation Sequencing).
Sintesi del cDNA
Il primer della trascrizione inversa (RT) contiene un UMI integrato.
Il primer RT si lega a una regione dell'adattatore 3' e facilita la conversione dei miRNA ligati 3'/5' in cDNA assegnando un UMI a ogni molecola di miRNA. Durante la trascrizione inversa, viene aggiunta anche una sequenza universale che viene riconosciuta dai primer di indicizzazione del campione durante l'amplificazione della libreria
Pulizia del cDNA
Dopo la trascrizione inversa, viene eseguita una pulizia del cDNA utilizzando un metodo semplificato basato su sfere magnetiche, seguendo un protocollo standard noto al tecnico del ramo.
Amplificazione della libreria
L'amplificazione della libreria viene eseguita utilizzando uno dei due formati.
Nel formato 1, un primer forward universale bagnato da una provetta ? accoppiato con 1 dei 48 primer reverse wet da provette (cat. n. 331592 e 331595) per assegnare a ciascun campione un indice univoco.
Nel formato 2, un primer forward universale essiccato da una piastra viene accoppiato con 1 dei 96 reverse primer essiccati nella stessa piastra (cat. n. 331565) per assegnare a ciascun campione un indice personalizzato univoco.
Nel formato 2, le reazioni di amplificazione della libreria avvengono direttamente nella piastra indice, fornendo una comoda soluzione di indicizzazione HT. L'amplificazione imparziale di tutti i miRNA in una singola reazione assicura che sia presente un target sufficiente per il sequenziamento di nuova generazione.
Pulizia della libreria
Dopo l'amplificazione della libreria, viene eseguita una pulizia della libreria di miRNA utilizzando un metodo semplificato basato su sfere magnetiche, seguendo un protocollo standard noto al tecnico del ramo.
Input: 100ng RNA
Piattaforma di sequenziamento: HiSeq 3000 1x75 (SE)
Risultati
Analisi contaminazione
Distribuzione delle sequenze in base all e loro lunghezze. Focus sulle sequenze di 17-37 nucleotidi.
Analisi della complessit? della sequenza (M = milioni di sequ enze)
Analisi della qualit? delle sequenze
Le sequenze identificate sono state suddivi se come miRNA, RNA e sconosciuta.
Le sequenze di microRNA sono state quindi al lineate per creare la matrice di conteggio: sono state effettuate sia un'analisi ristretta che un' analisi pi? ampia. L'analisi ristretta ha perme sso di evidenziare le sequenze che hanno il miglior allineamento con il genoma di Zebrafish. Son o state evidenziate sequenze corrispondenti a mi croRNA, come mostrato di seguito
Distribuzione di miRNAs nelle diverse fasi di sviluppo di embrioni di Zebrafish
Attivit? biologica
L'attivit? antitumorale biologica degli estratti dall'embrione di Zebrafish ? principalmente espressa dai componenti (miRNA) nella fase 5 e 6, anche se gli effetti pi? significativi sono stati osservati testando la Fase 6.
I miRNA isolati allo stadio di sviluppo di 20 somiti possono invertire diverse caratteristiche maligne del fenotipo canceroso in un modello di cancro al seno umano.
Gli estratti di embrioni appartenenti alla fase 6 riducono la proliferazione cellulare, migliorano l'apoptosi e inibiscono drasticamente sia l'invasivit? che la capacit? di migrazione delle cellule tumorali.
L'inibizione delle propriet? migratorie e invasive non ? limitata alle cellule del cancro al seno, poich? gli estratti embrionali sono stati efficaci anche nell'inibire il fenotipo migratorio adottato dalle normali cellule del seno in fase di transizione epiteliale-mesenchimale dopo stimolazione con TGF-?1.
Nelle cellule cancerose la reversione del tumore indotta dall'embrione comporta la via E-caderina/?catenina, il rimodellamento del citoscheletro, nonch? la sottoregolazione del TCTP e il concomitante aumento dei livelli di p53. Questi risultati suggeriscono che la trasformazione neoplastica non pu? essere vista come un impegno irreversibile e pu? essere "invertita" - anche parzialmente - in risposta alla corretta stimolazione dei miRNA.
Claims (7)
1)Composizione comprendente uno o pi? miRNA, dove detti uno o pi? miRNA sono selezionati dal gruppo costituito da:
dre-miR-16a MIMAT0001774:
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGUG;
dre-miR-205-5p MIMAT0001280:
UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG;
dre-miR-205-3p MIMAT0031925:
GAUUUCAGUGGUGUGAAGUGUA;
dre-miR-182-5p MIMAT0001271:
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACA;
dre-miR-182-3p MIMAT0001272:
UGGUUCUAGACUUGCCAACUA;
dre-miR-29a MIMAT0001802:
UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA;
dre-miR-183-5p MIMAT0001273:
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACUG;
dre-miR-183-3p MIMAT0031921:
UGAAUUACCAAAGGGCCAUAA;
dre-miR-155 MIMAT0001851:
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG;
dre-miR-363-5p MIMAT0031992: CGGGUGGAUGACUCUGCAAUUUU;
dre-miR-363-3p MIMAT0001874: AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA;
dre-miR-192 MIMAT0001275:
AUGACCUAUGAAUUGACAGCC;
dre-miR-101b MIMAT0001815: UACAGUACUAUGAUAACUGAAG;
dre-miR-15c MIMAT0003764:
AAGCAGCGCGUCAUGGUUUUC;
dre-miR-103 MIMAT0001816:
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA;
dre-miR-210-5p MIMAT0003392: AGCCACUGACUAACGCACAUUG;
dre-miR-210-3p MIMAT0001281: CUGUGCGUGUGACAGCGGCUAA;
dre-miR-196b MIMAT0001860: UAGGUAGUUUCAAGUUGUUGGG;
dre-let-7i MIMAT0001767 UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU
dre-miR-451 MIMAT0001634:
AAACCGUUACCAUUACUGAGUU;
dre-miR-18c MIMAT0001781: UAAGGUGCAUCUUGUGUAGUUA;
dre-miR-16b MIMAT0001775:
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGAG;
dre-miR-10a-5p MIMAT0001267: UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;
dre-miR-10a-3p MIMAT0003391: CAAAUUCGUGUCUUGGGGAAUA;
dre-miR-429a MIMAT0001624:
UAAUACUGUCUGGUAAUGCCGU;
dre-miR-140-5p MIMAT0001836: CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG;
dre-miR-140-3p MIMAT0003159: UACCACAGGGUAGAACCACGGAC;
dre-miR-200a-5p MIMAT0031984: CAUCUUACCGGACAGUGCUGGA;
dre-miR-200a-3p MIMAT0001861: UAACACUGUCUGGUAACGAUGU;
dre-miR-146b MIMAT0001844:
UGAGAACUGAAUUCCAAGGGUG;
dre-miR-206-5p MIMAT0031988: ACAUGCUUCCUUAUAUGCCCAUA;
dre-miR-206-3p MIMAT0001866: UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG; dre-miR-20b-5p MIMAT0001778: CAAAGUGCUCACAGUGCAGGUAG;
dre-miR-20b-3p MIMAT0031939: ACUGCAAUGUCUGCACUUCAAGU;
dre-miR-454b MIMAT0001878:
UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGG;
dre-miR-15b-5p MIMAT0001773: UAGCAGCACAUCAUGGUUUGUA;
dre-miR-15b-3p MIMAT0031936: CGAAUCAUGAUGUGCUGUCACU;
dre-miR-10d-5p MIMAT0001771: UACCCUGUAGAACCGAAUGUGUG;
dre-miR-10d-3p MIMAT0003394: CAGAUUCGGUUUUAGGGGAGUA;
dre-miR-10c-5p MIMAT0001770: UACCCUGUAGAUCCGGAUUUGU;
dre-miR-10c-3p MIMAT0031935: AAAUUCGUAUCUAGGGGAGUA;
dre-miR-203a-5p MIMAT0031923: AGUGGUUCUUAACAGUUCAACAGU;
dre-miR-203a-3p MIMAT0001278: GUGAAAUGUUUAGGACCACUUG; dre-miR-122 MIMAT0001818:
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG;
dre-miR-101a MIMAT0001814:
UACAGUACUGUGAUAACUGAAG;
dre-miR-130b MIMAT0001827:
CAGUGCAAUAAUGAAAGGGCAU;
dre-miR-223 MIMAT0001290:
UGUCAGUUUGUCAAAUACCCC;
dre-miR-26b MIMAT0001795:
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGUU;
dre-miR-130a MIMAT0001826:
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU;
dre-miR-30e-5p MIMAT0001807: UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG;
dre-miR-30e-3p MIMAT0003402: CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC;
dre-miR-203b-5p MIMAT0003407: AGUGGUUCUCAACAGUUCAACA;
dre-miR-203b-3p MIMAT0001865: GUGAAAUGUUCAGGACCACUUG;
dre-miR-7b MIMAT0001265:
UGGAAGACUUGUGAUUUUGUU;
dre-miR-221-5p MIMAT0031926: ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUUCUGU;
dre-miR-221-3p MIMAT0001288: AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC;
dre-miR-222a-5p MIMAT0031927: UGCUCAGUAGUCAGUGUAGAUCC;
dre-miR-222a-3p MIMAT0001289: AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC;
dre-miR-25-5p MIMAT0031946: AGGCGGAGACUUGGGCAGCUGCC;
dre-miR-25-3p MIMAT0001793: CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA;
dre-miR-19b-5p MIMAT0003399: AGUUUUGCUGGUUUGCAUUCAG;
dre-miR-19b-3p MIMAT0001783: UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA;
dre-miR-93 MIMAT0001810:
AAAAGUGCUGUUUGUGCAGGUA;
dre-miR-18a MIMAT0001779:
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUA;
dre-miR-92a-5p MIMAT0031953: AGGUUGGGAUUGGUAGCAAUGCU;
dre-miR-92a-3p MIMAT0001808: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU; dre-miR-20a-5p MIMAT0001786:
UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG;
dre-miR-20a-3p MIMAT0003400:
ACUGCAGUGUGAGCACUUGAAG;
dre-miR-196c MIMAT0011298:
UAGGUAGUUUGAUGUUGUUGGG;
dre-miR-725-5p MIMAT0032010:
UGCUAGGAAUGGUGGCUGAGAU;
dre-miR-725-3p MIMAT0003753:
UUCAGUCAUUGUUUCUAGUAGU;
dre-miR-733 MIMAT0003763:
UGCGUUGGUUUAGCUCAGUGGUU;
e loro miscele.
2) La composizione secondo la rivendicazione 1, dove detti uno o pi? miRNA sono selezionati dal gruppo costituito da:
dre-miR-146a MIMAT0001843:
UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG;
dre-miR-192 MIMAT0001275:
AUGACCUAUGAAUUGACAGCC;
dre-miR-451 MIMAT0001634:
AAACCGUUACCAUUACUGAGUU;
dre-miR-203b-5p MIMAT0003407:
AGUGGUUCUCAACAGUUCAACA;
dre-miR-203b-3p MIMAT0001865:
GUGAAAUGUUCAGGACCACUUG;
dre-miR-203a-5p MIMAT0031923:
AGUGGUUCUUAACAGUUCAACAGU;
dre-miR-203a-3p MIMAT0001278:
GUGAAAUGUUUAGGACCACUUG;
dre-miR-7b MIMAT0001265:
UGGAAGACUUGUGAUUUUGUU;
dre-miR-19b-5p MIMAT0003399:
AGUUUUGCUGGUUUGCAUUCAG;
dre-miR-19b-3p MIMAT0001783:
UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA;
dre-miR-725-5p MIMAT0032010:
UGCUAGGAAUGGUGGCUGAGAU;
dre-miR-725-3p MIMAT0003753:
UUCAGUCAUUGUUUCUAGUAGU;
e loro miscele.
3) La composizione secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti per l?uso nel trattamento di cancro.
4) La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 3, dove detto cancro ? selezionato da gruppo costituito da: cancro alla mammella, del colon, del pancreas, del fegato.
5) La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 4, dove detto cancro ? cancro alla mammella.
6) La composizione per l?uso secondo una o pi? delle rivendicazioni 3-5, dove detta composizione ? somministrata da sola o in combinazione con agenti chemioterapici.
7) Integratore alimentare e/o nuovo alimento e/o farmaco comprendente la composizione secondo una o pi? delle rivendicazioni 1-2.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023100066A1 (en) | 2023-06-08 |
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