IT202100026639A1 - Metodologia di sistema di ingegneria genetica a base di diatomee per la produzione ecosostenibile di ovotioli - Google Patents

Description

Metodologia di sistema di ingegneria genetica a base di diatomee per la produzione ecosostenibile di ovotioli

DESCRIZIONE

Campo tecnico

La presente invenzione riguarda il campo delle biotecnologie, in particolare riguarda la messa a punto di un protocollo di ingegneria enzimatica della specie di diatomee Phaeodactylum tricornutum per sovraesprimere l'enzima biosintetico che porta alla produzione di ovotiolo.

Questo protocollo ? ecosostenibile perch? utilizza cellule e nutrienti per la biosintesi e non produce composti collaterali tossici. La biomassa microalgale inoltre pu? essere sfruttata per usi aggiuntivi dopo l'estrazione dell'ovotiolo, rendendo il processo produttivo pi? conveniente. La produzione di ovotioli ? rilevante per i settori farmaceutico, nutraceutico e cosmeceutico.

Stato dell?arte

Di notevole interesse nel settore chimico e farmaceutico sono i composti di origine naturale da utilizzare per la progettazione di nuovi farmaci al fine di superare gli effetti collaterali o la mancata efficacia dei prodotti di sintesi chimica.

Gli ovotioli (derivati della 5-tiohistidina) di origine marina hanno recentemente attirato l'interesse della comunit? di ricerca per il loro potenziale nel trattamento di una pletora di patologie, ad esempio per prevenire e curare l'infiammazione sistemica cronica di basso grado (ISC) e le malattie correlate all'ISC che includono: malattie infiammatorie croniche, malattie autoimmuni, malattie croniche degenerative, tumori correlati all'ISC, obesit?, diabete, ipertensione arteriosa, ipercolesterolemia, malattie cardiovascolari, osteoporosi, malattie respiratorie e sindrome dell'ovaio policistico (Brevetto PCT N. PCT/IB2018/057098). Gli ovotioli sono stati proposti anche per la prevenzione e il trattamento delle malattie correlate alla gamma-glutamil-transpeptidasi (GGT) in cui le patologie correlate alla GGT sono selezionate dal gruppo costituito da: ischemia renale/danno da riperfusione, malattie associate a ostruzione inversa delle vie aeree, patologie legate all'aumento dei livelli di attivit? della GGT nel sangue (Brevetto EP19210282). ? stato anche dimostrato che l'ovotiolo A ha attivit? antiproliferativa nell'epatocarcinoma umano e nelle linee cellulari leucemiche. (

2019 , Sulfur-containing histidine compounds inhibit ?-glutamyl transpeptidase activity in human cancer cells. J. Biol. Chem., 294, 14603-14614).

Le tioistidine sono una classe di amminoacidi contenenti zolfo con propriet? chiave nella rimozione dei perossidi (Holler, TP e Hopkins, PB, 1988, Ovothiols as biological antioxidants. The thiol groups of ovothiol and glutathione are chemically distinct. J. Am. Chem Soc., 110, 4837-4838; , JL, 2000, 4-Mercaptoimidazoles derived from the naturally occurring antioxidant ovothiols 1. Antioxidant properties, Free Radic Res., 32, 515-524).

Tra questi, le 2-tioistidine chiamate ergotioneina sono presenti principalmente in alcuni funghi e batteri mentre le 5-tiohistidine sono presenti principalmente negli invertebrati marini, batteri e microalghe. Questi prodotti naturali contenenti zolfo si presentano sia come aminoacidi liberi che come costituenti di un pigmento chelante del ferro o di un alcaloide (recensito in Palumbo, A., Castellano, I., Napolitano, A., 2018, Ovothiol: a potent natural antioxidant from marine organisms. In Blue Biotechnology. Production and use of marine molecules; Castellano, I, e Seebeck, F, P., 2018, On ovothiol biosynthesis and biological roles: from life in the ocean to therapeutic potential. Nat. Prod. Rep.35, 1241?1250). Le 5-tioistidine, grazie alla peculiare posizione del gruppo tiolico sull'anello imidazolico dell'istidina, sono probabilmente i tioli pi? acidi tra i prodotti naturali e sono inoltre dotati di propriet? redox uniche. Ovotioli,?-metilate 5-tioistidine, possono svolgere un ruolo chiave nel controllo dell'equilibrio redox cellulare, grazie alla loro capacit? di svolgere scambio redox con il glutatione. L'ovotiolo A (1) ? una?-metil-5-tioistidina, isolata e caratterizzata dalle uova del riccio di mare Paracentrotus lividus e di altri invertebrati marini. L'ovotiolo A ? stato recentemente identificato anche nella microalga verde Euglena gracilis , nota per le sue potenzialit? nelle applicazioni biotecnologiche, grazie alla facilit? di coltivazione e all'elevata diversit? del profilo metabolico. L'ovotiolo B (2), metilato anche alla catena laterale laterale ? stato recentemente scoperto nella diatomea Skeletonema marinoi (Milito, A., Castellano, I., Burn, R., Seebeck, FP, Brunet, C., Palumbo, A ., 2020, First evidence of ovothiol biosynthesis in marine diatoms. Biol. Med.152, 680-688). L'ovotiolo C (3), dimetilato al gruppo amminico aminoacidico, ? stato isolato da altre specie di ricci di mare.

Gli ovotioli sono biosintetizzati da tre reazioni enzimatiche. La produzione enzimatica inizia con la formazione del legame ossidativo carbonio-zolfo (CS) tra la cisteina e la posizione C5 sull'istidina imidazolo (EC 1.14.99.52). La successiva rimozione della porzione cisteinica e la metilazione dell'anello imidazolico portano al prodotto finale ovotiolo. L'enzima chiave coinvolto nella biosintesi dell'ovotiolo ? un enzima bifunzionale, che catalizza la formazione del legame ossidativo CS, che determina il trasferimento netto di zolfo dalla cisteina alla posizione 5 dell'istidina. In dettaglio, l'enzima 5-istidilcisteina solfossido sintasi (OvoA) catalizza la formazione del coniugato 5-istidil-cisteina solfossido da cisteina e istidina (Braunshausen, A. e Seebeck, FP, 2011, Identification and Characterization of the First Ovothiol Biosynthetic Enzyme. J. Am. Chem. Soc.133, 1757-1759). Successivamente, una liasi dipendente dal piridossal fosfato (PLP) (OvoB) scinde questo prodotto intermedio per generare 5-tioistidina. Quindi, OvoA catalizza la metilazione sull'anello imidazolico per produrre ovotiolo A.

Tuttavia, attualmente nessuna azienda produce e vende ovotioli perch? i protocolli di sintesi chimica fin qui descritti sono troppo ingombranti e costosi per una comoda produzione commerciale di queste molecole.

Il precursore degli ovotioli, invece, la 5-tioistidina non metilata, pu? essere preparato mediante una sintesi chimica pi? fattibile secondo il protocollo descritto da Daunay et al. (2016) " Short protecting-group-free synthesis of 5-acetylsulfanyl-histidines in water: novel precursors of 5-sulfanyl-histidine and its analogues". Org. Biomol. chimica 14, 10473-10480.

I derivati ? -metilati, gli ovotioli, invece, possono essere purificati dalle uova di riccio di mare. In particolare, l'ovotiolo A pu? essere estratto e purificato dalle uova di riccio di mare Paracentrotus lividus secondo il protocollo descritto da Russo et al. (2014) " Ovothiol isolated from sea urchin oocytes induces autophagy in the Hep-G2 cell line". Marzo Droga, 12, 4069?4085. La quantit? di 2,5 mg di ovotiolo A puro pu? essere ottenuta da 10 g di uova fresche. Tuttavia, i ricci di mare non sono una fonte ecosostenibile per questi composti e non possono fornire quantit? sufficienti di ovotioli per studi approfonditi, considerando anche la necessit? di preservare le popolazioni naturali in mare.

Il brevetto statunitense US 4898878 descrive derivati attivi dell'ovotiolo in cui i sostituenti sono scelti individualmente da idrogeno, metile o altri atomi e gruppi che non influenzano negativamente lo spettro di attivit? redox complessivo della molecola. Inoltre, ? riportata anche la sintesi chimica degli ovotioli che coinvolge numerosi passaggi (10-12) che portano alla formazione iniziale del precursore dell'anello 4-tioimidazolo e alla successiva generazione della catena laterale dell'amminoacido. Tuttavia, la procedura richiede tempo e denaro.

Il brevetto statunitense US 9.926.300B2 descrive la sintesi chimica di composti 5-acilsulfanilistidina mediante introduzione diretta di un gruppo acilsulfanile in posizione 5 dell'istidina o di un suo derivato. Questi composti sono in grado di essere precursori delle corrispondenti 5-sulfanilistidine e dei loro disolfuri. Con questa procedura non ? possibile la sintesi di ovotioli caratterizzati dal gruppo metilico in posizione dell'anello imidazolico. Al contrario, vengono sintetizzati iso-ovotioli, che sono metilati in posizione dell'anello imidazolico.

Il brevetto statunitense 2020/0017479 A1 ? in parte una continuazione del brevetto statunitense 9.926.300B2. Descrive la sintesi dei composti 5-acilsulfanil-istidina e il loro uso come precursori delle corrispondenti 5-sulfanilistidine e dei loro disolfuri. Inoltre, l'attivit? antiossidante dei derivati 5-sulfanilistidine viene testata misurando l'attivit? del GSH-Px. Con questa procedura, gli ovotioli non vengono sintetizzati. Vengono sintetizzati solo iso-ovotioli che sono metilati in posizione dell'anello imidazolico.

La domanda di brevetto statunitense n.20100168198 descrive un farmaco pro-antiossidante mirato ai mitocondri, utile per la prevenzione o il trattamento di malattie o condizioni associate a disfunzione mitocondriale derivanti da cambiamenti nell'ambiente redox mitocondriale. I profarmaci sono prodotti modificando un antiossidante in un acido grasso in modo che il pro-farmaco risultante sia mirato e attivato da un enzima responsabile della beta-ossidazione degli acidi grassi mitocondriali. Gli esempi descrivono l'attivazione della beta-ossidazione degli acidi grassi dei profarmaci antiossidanti a base di 4-mercaptoimidazolo (ovotiolo).

Una fonte naturale alternativa per la biosintesi dell'ovotiolo possono essere le microalghe, e in particolare le diatomee.

La microalga Phaeodactylum tricornutum, una delle specie microalgali modello pi? studiate, con un genoma completamente sequenziato e una serie di strumenti per l'ingegneria genetica, appartiene al gruppo delle diatomee, eucarioti unicellulari fotosintetici con una complessa origine evolutiva che conferisce loro caratteristiche di piante come bene come animali. Grazie alla facilit? di coltivazione e all'elevata resa in biomassa, P. tricornutum ? un sistema promettente nelle applicazioni industriali dove pu? essere coltivato per diverse applicazioni (Butler, T., Kapoore, RV, Vaidyanathan, S., 2020, A Diatom Cell Factory. Trends Biotechnol.38, 606-622). Negli ultimi due decenni, sono stati dedicati sforzi significativi allo sviluppo di strumenti molecolari per studiare la biologia delle diatomee, nonch? per stabilire queste alghe come una risorsa significativa, rinnovabile e sostenibile di biomassa per mangimi, alimenti, energia e altri valori. prodotti aggiunti. Lo sviluppo di strumenti per la manipolazione genetica delle diatomee sta aprendo la strada a un crescente sfruttamento di questi organismi nella biotecnologia, come materia prima per biocarburanti e applicazioni per alimenti, salute umana o chimica verde.

Le diatomee possono essere trasformate geneticamente per produrre elevate quantit? di un prodotto endogeno oppure possono essere utilizzate come fabbrica cellulare finalizzata alla produzione di molecole esogene di interesse. I geni esogeni possono essere inseriti in P. tricornutum con diversi metodi: il metodo pi? comune ? il bombardamento biolistico del DNA plasmidico che entra nelle cellule su particelle metalliche e si integra nel genoma ospite; l'elettroporazione ha trovato un uso limitato e non si ? mai dimostrato efficiente, mentre si sta diffondendo un metodo pi? recente basato sulla coniugazione batterica (

2015 Designer diatom episomes delivered by bacterial conjugation. Nat Commun 6, 6925; , Refinement of the Diatom Episome Maintenance Sequence and Improvement of Conjugation-Based DNA Delivery Methods. Front. Bioeng Biotecnologie 4, 65). Con quest'ultimo metodo si sfrutta la capacit? dei batteri di coniugarsi con le diatomee: il DNA esogeno viene clonato in un vettore specifico e viene introdotto in un ceppo di Escherichia coli in grado di trasferirlo alla diatomea tramite coniugazione. Il vettore ha sequenze specifiche che gli permettono di essere mantenuto nella diatomea come episoma, un DNA circolare extracromosomico che non si integra nel genoma endogeno ma pu? essere duplicato ed ereditato dalle cellule figlie.

Esistono diversi brevetti per specie modello di P. tricornutum, principalmente con l'obiettivo di aumentare il tasso di crescita a fini di produttivit? modificando i terreni o le propriet? di incubazione della luce. Distinguendosi per l'arricchimento di acidi grassi polinsaturi a catena molto lunga e l'alto contenuto di lipidi neutri, questa specie ? molto sfruttata per la modifica di enzimi coinvolti nel metabolismo lipidico per aumentare il contenuto lipidico. Funzionali alla modulazione dell'espressione genica, esistono diversi brevetti riguardanti l'isolamento di forti promotori costitutivi o inducibili che sono convenientemente utilizzati per la creazione di costrutti di sovraespressione.

Tuttavia, fino ad oggi, non sono stati descritti protocolli per una sintesi sufficiente di composti di ovotiolo da parte delle microalghe.

Riassunto dell'invenzione

La presente invenzione riguarda la messa a punto di un protocollo di ingegneria enzimatica della specie di diatomee Phaeodactylum tricornutum per sovraesprimere l'enzima biosintetico che porta alla produzione di ovotiolo. Gli autori della presente invenzione hanno verificato che le cellule dei ceppi modificati producono quantit? maggiori di ovotiolo B rispetto alla wild type. L'uso delle colture di P. tricornutum presenta molti vantaggi rispetto ad altre fonti non convenzionali; realizzano un'elevata produttivit? e consentono una facile scalabilit? dei processi a monte ea valle e sono poco influenzati dai cambiamenti stagionali. La biomassa pu? essere facilmente ottenuta in laboratorio e le colture di P. tricornutum possono essere coltivate in bioreattori per la produzione di composti di alto valore.

Questo protocollo ? ecosostenibile perch? utilizza cellule e nutrienti per la biosintesi e non produce composti collaterali tossici. La biomassa microalgale inoltre pu? essere sfruttata per usi aggiuntivi dopo l'estrazione dell'ovotiolo, rendendo il processo produttivo pi? conveniente. La produzione di ovotioli ? rilevante per i settori farmaceutico, nutraceutico e cosmeceutico.

Il sistema scoperto dagli Autori dell'invenzione ? competitivo perch? permette di produrre ovotioli ( derivati??metilati) in modo ecosostenibile senza produzione di composti tossici e procedure costose. Infatti, mentre ? descritta e fattibile una sintesi chimica per la produzione della forma non metilata 5-tiohistidina (Daunay et al.2016), la vecchia procedura descritta per la sintesi delle forme?-metilate (ovotioli) richiede tempo e non rispettoso dell'ambiente (Holler, TP, Ruan, , PB, 1989, Total synthesis of marine mercaptohistidines: ovothiols A, B, and C J Org. Chem. 54, 4570-4575). Inoltre, l'ovotiolo A pu? essere estratto e purificato dalle uova di riccio di mare P. lividus secondo il protocollo descritto da Russo et al.2014. Tuttavia, i ricci di mare non possono fornire quantit? sufficienti di ovotioli per studi approfonditi (2,5 mg di ovotiolo A puro ottenuto da 10 g di uova fresche), considerando anche la necessit? di preservare le popolazioni naturali di specie di invertebrati marini. In realt?, nessuna azienda produce e vende ovotioli.

Pertanto, oggetti della presente invenzione sono:

una microalga geneticamente modificata, in particolare P. tricornutum , caratterizzata dal fatto che detta microalga comprende una o pi? copie di una cassetta di sovraespressione codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA;

un metodo per la preparazione di una microalga geneticamente modificata, in particolare P. tricornutum, comprendente un passaggio di trasformazione di dette microalghe con una sequenza esogena codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA;

un vettore di espressione adatto alla trasformazione di microalghe, in particolare P. tricornutum, comprendente una sequenza di acido nucleico codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA, e un metodo per l'identificazione e/o quantificazione di ovotiolo(i) comprendente le fasi di:

i) coltivare una microalga geneticamente modificata, in particolare P. tricornutum, ii) raccolta di dette microalghe geneticamente modificate e

iii) identificazione e analisi dell'ovotiolo(i) da dette microalghe geneticamente modificate ottenute nel passaggio ii).

Breve descrizione dei disegni

La presente invenzione e la seguente descrizione dettagliata delle sue forme di realizzazione preferite possono essere meglio comprese con riferimento alle seguenti figure:

Figura 1. Costrutto di espressione per la coniugazione batterica. Il vettore cargo (p Pt Puc3ovoYFP) includeva una cassetta di espressione per la selezione dell'antibiotico ( Sh -ble), una cassetta per la sovraespressione di P. tricornutum Pt OvoA fusa con YFP. PtLhcf11 p, promotore di P. tricornutum Lhcf11 ; PtLhcf1 t, P. tricornutum Lhcf1 terminatore; PtLhcf2 p, promotore di P. tricornutum Lhcf2 ; Pt OvoA, sequenza codificante P. tricornutum OvoA; KanR, resistenza alla Kanamicina; oriT, origine del trasferimento; traJ, oriT che riconosce la proteina.

Figura 2. Digestione del costrutto di coniugazione batterica. Analisi elettroforetica della digestione di restrizione di un plasmide clone resistente a E. coli che mostra bande di 5026, 3316 e 3064 bp. corsia 1, plasmide non digerito; corsia 2, Cla ho digerito plasmide; 1kb, scala del peso molecolare.

Figura 3. Costrutto di espressione per la trasformazione biolistica. Il costrutto pPtLhcf2povoYFP includeva una cassetta per la sovraespressione di P. tricornutum PtOvoA fusa con YFP. PtLhcf2p, promotore di P. tricornutum Lhcf2; PtLhcf1t, P. tricornutum Lhcf1 terminatore; PtOvoA, sequenza codificante P. tricornutum OvoA.

Figura 4 Colonia PCR di cloni ottenuti per coniugazione batterica. L'elettroforesi dei cloni resistenti (corsie 1-11), i cloni positivi hanno mostrato una banda di 1205 bp. peso, wild-type; B, vuoto (nessun modello); 100 bp, scala del peso molecolare.

Figura 5. Localizzazione cellulare dei cloni ottenuti per coniugazione batterica. Cellule che sovraesprimono OvoA di P. tricornutum che mostrano un segnale corrispondente alla clorofilla autofluorescente e alla proteina di fusione PtOvoA-YFP (AB), campo chiaro della cellula in B (C). Nel pannello inferiore i segnali sono separati nella clorofilla autofluorescente (D), nel marker di colorazione dei mitocondri (E) e nella proteina di fusione PtOvoA-YFP (F). I diversi segnali sono fusi in G.

Figura 6. Analisi HPLC dei tioli cellulari nelle cellule di P. tricornutum . In alto a sinistra: tracce HPLC di campioni autentici di ovotiolo B e glutatione. In alto a destra: co-iniezione del campione di glutatione autentico con il lisato. Il riquadro evidenzia i picchi corrispondenti al glutatione. In basso a sinistra: co-iniezione del campione di ovotiolo B autentico con il lisato. Il riquadro evidenzia i picchi corrispondenti all'ovotiolo B.

Figura 7. Colonia PCR di cloni ottenuti mediante trasformazione biolistica. Elettroforesi di cloni resistenti (corsie 1-14) I cloni positivi hanno mostrato le bande previste di 1237 bp (pannello superiore, corsie 1, 3-12) e 2619 bp (pannello inferiore, corsie 1, 3, 5, 8-11). Ulteriori bande pi? piccole nel pannello inferiore indicano la possibile presenza di versioni troncate del costrutto. peso, wild-type; B, vuoto (nessun modello); 1kb, scala del peso molecolare.

Figura 8. Localizzazione cellulare dei cloni ottenuti mediante trasformazione biolistica. Immagini di microscopia confocale a scansione laser di cellule che sovraesprimono P. tricornutum OvoA che mostrano un segnale corrispondente alla clorofilla autofluorescente (grigio diffuso) e un segnale corrispondente alla proteina di fusione Pt OvoA-YFP (macchie luminose e fili grigi luminosi).

Descrizione dettagliata

Nel seguito verranno descritte diverse forme di realizzazione dell'invenzione. Si intende che le caratteristiche delle varie forme di realizzazione possono essere combinate, ove compatibili. In generale, forme di realizzazione successive verranno descritte solo rispetto alle differenze con quelle precedentemente descritte.

Primo oggetto della presente invenzione ? una microalga geneticamente modificata, caratterizzata dal fatto che detta microalga comprende una o pi? copie di una cassetta di espressione codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

Secondo l'invenzione, per "geneticamente modificato" si intende qualsiasi modifica del genoma delle microalghe ottenuta per intervento umano o sotto il controllo umano consistente nell'introduzione nell'alga di una sequenza eterologa/esogena di acido nucleico, nel genoma o mantenuta come DNA circolare extracromosomico nel citoplasma delle microalghe. Il risultato di questa modifica ? di arricchire il genoma della microalga geneticamente modificata con l'aggiunta di nuove sequenze.

I termini "polinucleotide" e "acido nucleico" sono qui usati in modo intercambiabile e si riferiscono generalmente a un polimero di qualsiasi lunghezza composto essenzialmente da nucleotidi, ad esempio desossiribonucleotidi e/o ribonucleotidi. Gli acidi nucleici possono comprendere basi puriniche e/o pirimidiniche e/o altre basi nucleotidiche naturali, chimicamente o biochimicamente modificate (ad esempio metilate), non naturali o derivatizzate. La struttura portante degli acidi nucleici pu? comprendere zuccheri e gruppi fosfato, come si trovano tipicamente nell'RNA o nel DNA, e/o uno o pi? modificati o sostituiti (come 2'-0-alchilati, ad esempio 2-0- metilati o zuccheri 2'-0-etilati o 2'-0,4'-C-alchilati, ad esempio 2'-0,4'-C-etilati) o uno o pi? gruppi fosfato modificati o sostituiti. Ad esempio, gli analoghi della spina dorsale negli acidi nucleici possono includere fosfodiestere, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alchilfosfotriestere, solfammato, 3'-tioacetale, metilene (metilimmino), 3'-N-carbammato, morfolino carbammato e acidi nucleici peptidici ( PNA). Il termine acido nucleico comprende inoltre specificamente molecole ibride di DNA, RNA e DNA RNA, includendo specificamente hnRNA, pre-mRNA, mRNA, cDNA, DNA genomico, gene, prodotti di amplificazione, oligonucleotidi e DNA, RNA o DNA sintetici (ad esempio sintetizzati chimicamente). Ibridi di RNA. I termini "acido ribonucleico" e "RNA" come qui usati significano un polimero di qualsiasi lunghezza composto da ribonucleotidi. I termini "acido desossiribonucleico" e "DNA" come qui usati significano un polimero di qualsiasi lunghezza composto da desossiribonucleotidi. Il termine "ibrido DNA/RNA" come qui utilizzato significa un polimero di qualsiasi lunghezza composto da uno o pi? desossiribonucleotidi e uno o pi? ribonucleotidi. Un acido nucleico pu? essere presente in natura, ad esempio, presente o isolato dalla natura, pu? essere ricombinante, cio? prodotto mediante la tecnologia del DNA ricombinante, e/o pu? essere, parzialmente o interamente, sintetizzato chimicamente o biochimicamente. Un acido nucleico pu? essere a doppio filamento, parzialmente a doppio filamento o a filamento singolo. Se a filamento singolo, l'acido nucleico pu? essere il filamento senso o il filamento antisenso. Inoltre, l'acido nucleico pu? essere circolare o lineare.

Come usato qui, il termine "cassetta di espressione di acido nucleico" si riferisce a molecole di acido nucleico che includono uno o pi? elementi di controllo trascrizionale (come, ma non limitato a promotori, potenziatori, sequenze di poliadenilazione e introni) che dirigono l'espressione di un (trans )gene(i) a cui sono operativamente collegati.

Il termine "collegato operativamente" come qui utilizzato si riferisce alla disposizione di vari elementi molecolari di acido nucleico rispetto a ciascuno in modo tale che gli elementi siano collegati funzionalmente e siano in grado di interagire tra loro nel contesto dell'espressione genica. Tali elementi possono includere, senza limitazione, un promotore, un potenziatore, una sequenza di poliadenilazione, uno o pi? introni e una sequenza codificante di un gene di interesse da esprimere (ad esempio, il gene (trans)). Gli elementi della sequenza dell'acido nucleico, quando correttamente orientati o collegati operativamente, agiscono insieme per assicurare o modulare l'espressione della sequenza codificante. Per modulare si intende aumentare, diminuire o mantenere il livello di attivit? di un particolare elemento. La posizione di ciascun elemento rispetto ad altri elementi pu? essere espressa in termini di terminale 5' e terminale 3' di ciascun elemento, e la distanza tra elementi particolari pu? essere referenziata dal numero di nucleotidi interposti, o coppie di basi, tra gli elementi.

Il termine "microalghe" come qui usato si riferisce ad alghe microscopiche. Le "microalghe" comprendono, senza limitazioni, organismi all'interno di (i) diversi phyla eucarioti, inclusi Rhodophyta (alghe rosse), Chlorophyta (alghe verdi), Dinoflagellata, Haptophyta , (ii) diverse classi del phylum eucariotico Heterokontophyta che include, senza limitazione , le classi Bacillariophycea (diatomee), Eustigmatophycea , Phaeophyceae (alghe

brune), Xanthophyceae (alghe giallo-verde) e chrysophyceae (chrysophyceae), e (iii) il phylum procariote cianobatteri (alghe blu-verdi). Il termine "microalghe" comprende ad esempio generi scelti tra: Achnanthes, Amphora, Anabaena, Anikstrodesmis, Arachnoidiscusm, Aster, Botryococcus, Chaetoceros, Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Chorethron, Cocconeis, Coscinodiscus, Crypthecotella, Duncan, Crypthecodinium, Emiliana, Euglena, Fistulifera, Fragilariopsis, Gyrosigma, Hematococcus, Isochrysis, Lampriscus, Monochrysis, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Nodularia, Nocillastoc, Odontella, Odontella, Oocistola Playtmonas, Pleurochrysis, Porhyra, Pseudoanabaena, Pyramimonas, Scenedesmus, Schyzochitrium, Stichococcus, Synechococcus, Synechocystis, Tetraselmis, Thalassiosira e Trichodesmium . La solfossido sintasi OvoA (EC 1.14.99.52) ? un enzima che partecipa alla biosintesi dell'ovotiolo, catalizzando la reazione chimica sottostante

Il termine "esogena" si riferisce all'introduzione di una molecola di riferimento (ad esempio, acido nucleico come DNA o mRNA, ma anche la proteina) o attivit? di riferimento in una cellula ospite. In particolare, un acido nucleico pu? essere introdotto esogeno in un ospite in qualsiasi modo adatto. Ad esempio, un acido nucleico pu? essere introdotto in una cellula ospite e inserito in un cromosoma ospite, oppure l'acido nucleico pu? essere introdotto nell'ospite come materiale genetico non cromosomico, come un vettore (ad esempio un plasmide) che non integrarsi nel cromosoma ospite. Un acido nucleico che codifica per una proteina pu? essere introdotto in una forma esprimibile (cio?, in modo che l'acido nucleico possa essere trascritto e tradotto). Un'"attivit?" esogena (ad esempio, attivit? di biosintesi) si riferisce a un'attivit? introdotta in una cellula ospite, ad esempio introducendo uno o pi? acidi nucleici nell'ospite che sono espressi per fornire l'attivit?.

In una forma di realizzazione, detta microalga ? una diatomea.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, detta diatomea ? della specie Phaeodactylum tricornutum.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, detta diatomea ? il ceppo Axenic CCMP632 di P. tricornutum.

In una forma di realizzazione della presente invenzione, detta microalga mostra un'espressione migliorata dell'enzima solfossido sintasi OvoA rispetto al wild-type di detta microalga.

L'espressione wild-type (WT) si riferisce al fenotipo della forma tipica di una specie cos? come si presenta in natura.

Il termine "espressione migliorata" si riferisce a un aumento rilevabile nell'espressione di una proteina o di un enzima. Il termine "espressione migliorata" qui utilizzato pu? significare che una proteina o un enzima modificato (per esempio, geneticamente modificato) mostra un'espressione maggiore rispetto a una proteina o un enzima comparabile dello stesso tipo, come una proteina o un enzima che non ha un particolare modificazione genetica (ad esempio, una proteina o un enzima originale o di wild-type, o il livello di espressione di una proteina o di un enzima di una cellula ospite che ? servito come punto di partenza per la modificazione genetica). Ad esempio, l'espressione di una proteina o di un enzima modificato o ingegnerizzato pu? essere maggiore dell'espressione di una proteina o di un enzima non ingegnerizzato dello stesso tipo (ad esempio una proteina di wild-type o un enzima, o l'espressione esibita da una proteina o da un enzima di una cellula ospite) di circa il 5% o pi?, circa il 10% o pi?, circa il 15% o pi?, circa il 20% o pi?, circa il 30% o pi?, circa il 50% o pi?, circa il 60% o pi?, circa il 70% o pi?, o circa il 100% o pi?. Una cellula ospite avente una proteina o un enzima avente un'espressione enzimatica migliorata pu? essere verificata con qualsiasi metodo noto nell'arte.

In un'ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione, detta microalga presenta una produzione migliorata di ovotioli rispetto al wild-type di detta microalga.

L'espressione "produzione migliorata" si riferisce ad un aumento rilevabile nella produzione di una molecola. Il termine "produzione migliorata" qui utilizzato pu? significare che un organismo modificato (ad esempio geneticamente modificato) mostra una produzione maggiore rispetto a un organismo comparabile dello stesso tipo, come una microalga che non ha una particolare modificazione genetica (ad es. o microalga wild-type). In una forma di realizzazione tale produzione migliorata ? di almeno due volte rispetto al wild-type utilizzando il metodo di coniugazione, e varia da tre a cinque volte in cloni prodotti utilizzando il metodo biolistico.

In un'altra forma di realizzazione, secondo la presente invenzione, detto ovotiolo ? Ovotiolo A, Ovotiolo B o Ovotiolo C, preferibilmente Ovotiolo B.

Inoltre, in una forma di realizzazione dell'invenzione, detto enzima solfossido sintasi OvoA ha SEQ ID NO:17 o una sequenza sostanzialmente omologa ad esso, ad esempio isoforme o sequenze mutanti con un'identit? di sequenza con l'enzima wild type compresa tra 90-99% e la stessa o attivit? enzimatica simile, ad esempio tra il 90-99% di attivit? rispetto all'enzima di wildtype.

L'omologia di sequenza ? l'omologia biologica tra sequenze di DNA, RNA o proteine, definita in termini di ascendenza condivisa nella storia evolutiva della vita. Due segmenti di DNA possono avere un'ascendenza condivisa a causa di tre fenomeni: o un evento di speciazione (ortologhi), o un evento di duplicazione (paraloghi), oppure un evento di trasferimento genico orizzontale (o laterale) (xenologo). L'omologia tra DNA, RNA o proteine ? tipicamente dedotta dalla loro somiglianza di sequenza nucleotidica o amminoacidica. Una somiglianza significativa ? una forte evidenza che due sequenze sono collegate da cambiamenti evolutivi da una sequenza ancestrale comune. Gli allineamenti di sequenze multiple vengono utilizzati per indicare quali regioni di ciascuna sequenza sono omologhe. L'esperto sar? in grado di identificare altre sequenze omologhe alla SEQ ID NO 17 da sequenze note o ottenute dal genoma di microalghe e mediante metodi convenzionali di allineamento singolo o multiplo come i metodi Clustal (Sievers, F., Wilm, A. , Dineen, D., et al., 2011, Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol.7, 539) o basata sul metodo Smith-Waterman con confronto Blossum 62 matrice (Rice et al., 2000). Le sequenze omologhe adatte all'invenzione sono sequenze che hanno la stessa attivit? enzimatica. Preferibilmente il termine "sostanzialmente omologa" si riferisce a due sequenze che sono almeno il 90%, 95%, 99% identiche in sequenza, come misurato dal programma BestFit qui descritto (Versione 10; Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wis. ), utilizzando i parametri predefiniti.

In un'altra forma di realizzazione, in cui detta sequenza esogena o una sequenza sostanzialmente omologa con essa ha SEQ ID NO: 18.

In una forma di realizzazione della presente invenzione, detta microalga geneticamente modificata ? ottenibile mediante uno qualsiasi dei metodi descritti di seguito.

Come precedentemente anticipato, ulteriore oggetto della presente invenzione ? un metodo per la preparazione di una microalga geneticamente modificata, comprendente un passaggio di trasformazione di detta microalga con una sequenza esogena codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

La parola "trasformazione" si riferisce al processo di alterazione del codice genetico di una cellula attraverso l'assorbimento di DNA estraneo dall'ambiente. La trasformazione genetica ? il processo mediante il quale il DNA esogeno viene trasferito nella cellula ospite. La trasformazione di solito implica l'assorbimento del DNA in cellule batteriche, di lievito o vegetali.

In una forma di realizzazione dell'invenzione, il metodo comprende un passaggio di trasformazione di dette microalghe con un vettore di espressione comprendente sequenza nucleotidica codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

La parola "vettore" si riferisce a qualsiasi veicolo, spesso un virus o un plasmide, utilizzato per trasportare una sequenza di DNA desiderata in una cellula ospite come parte di una procedura di clonazione molecolare. A seconda dello scopo della procedura di clonazione, il vettore pu? aiutare a moltiplicare, isolare o esprimere l'inserto di DNA estraneo.

In una forma di realizzazione, il vettore di espressione pu? essere scelto tra i seguenti: un plasmide, un vettore di lievito, un vettore di mammifero, un vettore virale, un fago a singolo filamento, un fago a doppio filamento, un cromosoma artificiale e/o una combinazione della stessa.

In una forma di realizzazione preferita, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui divulgate, il vettore di espressione ? un plasmide, in particolare plasmidi pPtPuc3 e pPtLhcf2pLAHYFP.

In un'altra forma di realizzazione secondo la descrizione, detto enzima solfossido sintasi OvoA codificato dalla sequenza nucleotidica, ha SEQ ID NO:17 o una sequenza sostanzialmente omologa ad essa.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, detto vettore di espressione viene introdotto in dette microalghe mediante metodo biolistico o coniugazione batterica.

Il metodo biolistico, noto anche come "pistola genetica", prevede di sparare piccole particelle metalliche ricoperte con il DNA costrutto nelle cellule vegetali. Le particelle metalliche, solitamente oro o tungsteno, vengono accelerate ad alta velocit? dal rapido rilascio di elio ad alta pressione nella pistola genetica nelle cellule bersaglio. Il bersaglio sono cellule totipotenti, solitamente costituite da una coltura in sospensione embriogenica o da un callo embriogenico derivato dalla pianta ricevente. Alcune delle particelle metalliche entrano nei nuclei delle cellule senza causare danni letali e rilasciano il costrutto in modo che possa integrarsi per ricombinazione con i cromosomi. Le cellule bersaglio vengono quindi indotte a formare piante sotto selezione che consente solo al materiale che esprime il marcatore selezionabile (e solitamente il GOI) di sopravvivere. Il principale vantaggio del metodo biolistico di trasformazione genica ? che ? indipendente dal genotipo perch? utilizza la forza fisica per inserire il DNA nei tessuti vegetali. Un altro vantaggio per la consegna biolistica ? che il gene di interesse non ha bisogno di essere clonato in un vettore di trasformazione specializzato per essere integrato nelle cellule vegetali e successivamente ereditato.

La soluzione proposta dagli autori della presente invenzione, per produrre una maggiore quantit? di ovotiolo da colture di P. tricornutum axenic , ? lo sfruttamento del metodo biolistico.

Pertanto, in una forma di realizzazione della presente invenzione, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, detto vettore di espressione viene introdotto in dette microalghe mediante metodo biolistico. Questo approccio induce un'integrazione casuale di un numero variabile di transgeni nel genoma di P. tricornutum . I cloni che esprimono pi? forti, contenenti un numero elevato di transgeni nel genoma, possono essere facilmente selezionati. D'altra parte, l'integrazione del transgene nel genoma, che avviene quando si applica il metodo biolistico, diventa un vantaggio perch? i cloni sono stabili e non necessitano di una continua selezione antibiotica nel mezzo. Inoltre, l'opportunit? di avere pi? inserimenti di transgene permette di isolare un clone esprimente molto forte e quindi di ottenere una maggiore quantit? di prodotto finale.

In una forma di realizzazione dell'invenzione, detto metodo biolistico viene eseguito utilizzando un sistema di somministrazione di particelle biolistiche (Bio-Rad)

In una forma di realizzazione, detto metodo biolistico viene eseguito come descritto in ( , 1999, Transformation of Nonselectable Reporter Genes in Marine Diatoms. Mar. Biotecnologie 1, 239-251).

La coniugazione batterica ? il trasferimento di materiale genetico tra cellule batteriche per contatto diretto cellula-cellula o tramite una connessione a ponte tra due cellule. Questo avviene attraverso un pilus. ? una modalit? di riproduzione parasessuale nei batteri.

? un meccanismo di trasferimento genico orizzontale come lo sono la trasformazione e la trasduzione sebbene questi due altri meccanismi non implichino il contatto cellula-cellula.

La coniugazione batterica classica di E. coli ? spesso considerata l'equivalente batterico della riproduzione sessuale o dell'accoppiamento poich? implica lo scambio di materiale genetico. Tuttavia, non si tratta di riproduzione sessuale, poich? non avviene alcuno scambio di gameti, e anzi nessuna generazione di un nuovo organismo: si trasforma invece un organismo esistente. Durante la coniugazione classica di E. coli , la cellula donatrice fornisce un elemento genetico coniugativo o mobilizzabile che ? pi? spesso un plasmide o un trasposone. La maggior parte dei plasmidi coniugativi ha sistemi che assicurano che la cellula ricevente non contenga gi? un elemento simile.

L'informazione genetica trasferita ? spesso vantaggiosa per il ricevente. I vantaggi possono includere la resistenza agli antibiotici, la tolleranza agli xenobiotici o la capacit? di utilizzare nuovi metaboliti. Altri elementi possono essere dannosi e possono essere visti come parassiti batterici.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, detto vettore di espressione ? un vettore episoma in detta cellula algale. Gli episomi, negli eucarioti, sono molecole di DNA circolari extracromosomiche, di origine plasmidica o virale, che si replicano autonomamente nella cellula ospite e, pertanto, hanno un potenziale vettore significativo per il trasferimento degli acidi nucleici nelle cellule. L'utilizzo degli episomi risulta quindi ?pi? pulito? rispetto ad altri metodi tradizionali poich? evita l'integrazione casuale nel genoma ed i conseguenti rischi di disgregazione dei geni endogeni.

La soluzione proposta dagli autori della presente invenzione, al fine di produrre una maggiore quantit? di ovotiolo da colture di P. tricornutum axenic , ? quindi lo sfruttamento della coniugazione batterica per ottenere la sovraespressione della solfossido sintasi OvoA da un vettore episomale.

Pertanto, in una forma di realizzazione particolarmente preferita secondo la presente descrizione, detto vettore di espressione viene introdotto in detto ceppo mediante coniugazione batterica.

In una forma di realizzazione, le cellule batteriche utilizzate per la coniugazione batterica sono selezionate tra le seguenti: cellule Escherichia coli DH10B.

Inoltre, in una forma di realizzazione dell'invenzione, il metodo comprende un passaggio in cui detto vettore di espressione viene trasformato in dette cellule batteriche, preferibilmente cellule DH10B.

In un'altra forma di realizzazione dell'invenzione, il metodo comprende inoltre un passaggio in cui dette cellule batteriche, preferibilmente cellule DH10B, vengono inoculate un giorno prima della coniugazione per la crescita notturna.

In una forma di realizzazione preferita, la coniugazione batterica tra dette cellule batteriche, preferibilmente cellule DH10B, e P. tricornutum viene eseguita come in Karas B., Diner R., Lefebvre S. et al.2015 Episomi di diatomee di design forniti dalla coniugazione batterica. Nat Comune 6, 6925. Doi: 10.1038/ncomms7925.

Mediante il metodo basato sulla coniugazione batterica, la cassetta sovraesprimente OvoA viene clonata in un vettore specifico e viene introdotta in un ceppo di Escherichia coli in grado di trasferirla alla diatomea tramite coniugazione. Il vettore ha sequenze specifiche che gli permettono di essere mantenuto nella diatomea come episoma, un DNA circolare extracromosomico che non si integra nel genoma endogeno ma pu? essere duplicato ed ereditato dalle cellule figlie. Il metodo ? quindi ?pi? pulito? rispetto ad altri metodi tradizionali poich? evita l'integrazione casuale nel genoma e i conseguenti rischi di disgregazione dei geni endogeni.

In un'altra forma di realizzazione dell'invenzione, detto vettore di espressione ? cotrasformato con un vettore che esprime un gene che conferisce resistenza ad un antibiotico.

In una forma di realizzazione, detto gene ? il gene Sh Ble.

In un'ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione, detto antibiotico ? scelto tra fleomicina.

In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto vettore di espressione ? co-trasformato con un vettore che esprime il gene Sh Ble che conferisce resistenza all'antibiotico fleomicina.

Forma parte della presente invenzione un vettore di espressione adatto alla trasformazione di microalghe, comprendente in particolare una sequenza di acido nucleico codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

In una forma di realizzazione, detto vettore di espressione ? selezionato da un plasmide, un vettore di lievito, un vettore di mammifero, un vettore virale, un fago a singolo filamento, un fago a doppio filamento, cromosoma artificiale e/o una loro combinazione.

In una forma di realizzazione preferita, detto vettore di espressione ? un plasmide. Una forma di realizzazione della presente invenzione consiste in detto vettore di espressione legato operativamente ad un gene codificante una proteina fluorescente.

In una forma di realizzazione, detta proteina fluorescente ? la proteina fluorescente gialla (YFP) o la proteina fluorescente verde (GFP).

In un'altra forma di realizzazione, in cui detta proteina fluorescente ? la proteina fluorescente gialla (YFP).

Inoltre, in una forma di realizzazione detta sequenza di acido nucleico che codifica per l'enzima solfossido sintasi OvoA ha SEQ ID NO: 17.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, il vettore di espressione ? un vettore di espressione episomale.

In un'altra forma di realizzazione dell'invenzione, secondo tutte le forme di realizzazione qui divulgate, detto vettore di espressione comprende una cassetta che esprime l'antibiotico e la sequenza codificante di una proteina fluorescente, e il cDNA di P. tricornutum per l'espressione dell'enzima solfossido sintasi OvoA senza l'arresto codone.

In una forma di realizzazione, dette almeno una cassetta che esprime l'antibiotico sono selezionate tra kanamicina e bleomicina.

In un'altra forma di realizzazione dell'invenzione, detto vettore di espressione comprende il plasmide pPtPuc3 comprendente una cassetta che esprime kanamicina e bleomicina, la cassetta di espressione per la proteina fluorescente gialla (YFP) e il cDNA di P. tricornutum per l'espressione dell'enzima solfossido sintasi OvoA senza il codone di stop. Infine, oggetto della presente invenzione ? rappresentato da un metodo per l'identificazione e/o quantificazione di ovotiolo(i) comprendente le fasi di:

i) coltivare una microalga geneticamente modificata secondo la presente invenzione, ii) raccolta di dette microalghe geneticamente modificate e

iii) identificazione e/o quantificazione dell'ovotiolo(i) da dette microalghe geneticamente modificate ottenute nel passaggio ii).

I metodi di coltura delle microalghe sono ben noti alla persona esperta. Una menzione particolare pu? essere fatta ai metodi di coltura descritti in Guillard et al (1975). Naturalmente, la persona esperta sar? in grado di adattare le condizioni di coltura, in particolare la composizione del mezzo, le condizioni per l'aggiunta di nutrienti durante la coltura, la temperatura e le condizioni di illuminazione, al fine di promuovere la produzione di biomassa.

La raccolta delle alghe si riferisce alla separazione o al distacco delle alghe dal suo mezzo di crescita. Il metodo di raccolta dipende fortemente dalla fisiologia delle microalghe scelte, dalla densit? e dalle dimensioni della cellula microalgale, dalle specifiche del prodotto finale e dalla possibilit? di riutilizzo del terreno di coltura. La raccolta delle alghe prevede metodi meccanici, chimici, biologici ed elettrici, ad esempio coagulazione/flocculazione, flottazione, processi elettrici, filtrazione e centrifugazione. ? possibile combinare due o pi? di questi metodi per ottenere una maggiore velocit? di separazione a costi inferiori.

Una opportuna purificazione dell'ovotiolo(i) da detta microalga geneticamente modificata pu? essere effettuata con metodi noti all'esperto del ramo quali metodi di lisi, estrazione, cromatografia a scambio ionico, evaporazione rotante sotto vuoto, liofilizzazione.

In una forma di realizzazione, detta fase di raccolta ii) viene eseguita ad esempio mediante centrifugazione.

In un'altra forma di realizzazione, detto metodo comprende inoltre un passaggio dopo il passaggio ii) e prima del passaggio iii) in cui la coltura raccolta viene congelata in azoto liquido. In ottemperanza all'art.170bis del diritto brevettuale italiano si dichiara che:

Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto cellule sono stati condotti su cellule disponibili in commercio con riferimento al MGOM utilizzato negli esperimenti descritti, sono stati adempiuti gli obblighi derivanti dalla normativa nazionale o comunitaria, in particolare ai sensi del dl 12 aprile 2001 n.206 e 8 giugno 2003 nf.224.

In qualsiasi parte della presente descrizione e delle rivendicazioni, il termine comprendente pu? essere sostituito dal termine "costituito da".

Di seguito vengono riportati esempi che hanno lo scopo di illustrare meglio le metodologie divulgate nella presente descrizione, tali esempi non sono in alcun modo da considerarsi limitativi della precedente descrizione e delle successive rivendicazioni.

Esempi

METODI

Preparazione del costrutto sovraesprimente per la coniugazione batterica

Per preparare il p Pt Puc3ovoYFP ( Fig.1 ) sono stati utilizzati la metodologia di assemblaggio Gibson e lo strumento di assemblaggio NEBuilder (http://nebuilder.neb.com/) come suggerito dalle istruzioni del produttore. Il p Pt Puc3 contenente le cassette che esprimono kanamicina e bleomicina ( Sh -Ble) sono stati utilizzati come modelli, per il vettore dorsale, il vettore PmH4 pMRP3YFP per la sequenza codificante dell'YFP e il cDNA di P. tricornutum per la sequenza codificante di Pt OvoA senza il codone di stop. L'RNA totale ? stato estratto da colture axeniche di P. tricornutum wild type ed ? stata eseguita la retrotrascrizione del cDNA come in (Russo, MT, Annunziata, R., Sanges, R., Ferrante, MI, Falciatore, A., 2015, The upstream regulatory sequence of the light harvesting complex Lhcf2 gene of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum enhances transcription in an orientation- and distance-independent fashion (Mar. Biol.24, 69-79). Le sequenze dei primer utilizzati sono presentate nella Tabella 1 . Il costrutto assemblato ? stato trasformato in cellule competenti MAX Efficiency? Stbl2? (Invitrogen) utilizzando kanamicina come antibiotico selettivo. I cloni resistenti sono stati analizzati mediante digestione di restrizione con Cla I ed elettroforesi su gel di agarosio ( Fig.2 ).

P. tricornutum coniugazione con Escherichia coli

Il ceppo Axenic CCMP632 di P. tricornutum Bohlin ? stato ottenuto dal Centro Nazionale Provasoli-Guillard per la Cultura del Fitoplancton Marino. Le colture sono state coltivate in terreno f/2 (Guillard RRL 1975 Culture of Phytoplankton for Feeding Marine Invertebrates. In: Smith, ML and Chanley, MH, Eds., Culture of Marine Invertebrates Animals, Plenum Press, New York, 29-60. Doi : http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4615-8714-9_3) a 18 ?C sotto luci fluorescenti bianche (70 ?mol m-2 s-1.), 12 h:12 h al buio? ciclo di luce. Il plasmide p Pt Puc3ovoYFP (vettore cargo) ottenuto ? stato trasformato chimicamente in cellule DH10B contenenti il vettore di coniugazione pTA-Mob (vettore di coniugazione), recante la resistenza alla gentamicina (Strand TA, Lale R, Degnes KF, Lando M, Valla S.2014 A New and Improved Host-Independent Plasmid System for RK2-Based Conjugal Transfer 9 : e90372. Doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0090372). E. coli DH10B, resistente a gentamicina e kanamicina, contenente coniugazione e vettori cargo sono stati inoculati il giorno prima della coniugazione per la crescita notturna e utilizzati per la coniugazione di P. tricornutum eseguita come in Karas, B., Diner, R., Lefebvre, S. et al.2015 Episomi di diatomee di design forniti dalla coniugazione batterica. Nat Comune 6, 6925.

Preparazione del costrutto biolistico sovraesprimente

Per ottenere l'espressione pPtLhcf2povoYFP ( Fig.3 ), costruire la metodologia di assemblaggio Gibson e lo strumento di assemblaggio NEBuilder, seguendo le istruzioni del produttore. Sono stati utilizzati i seguenti modelli: pPtLhcf2pLAHYFP per il vettore dorsale contenente il promotore Lhcf2 e la sequenza codificante YFP con i primer GA_Lhcf2_fwd e GA_Lhcf2_rv (Tabella 1) e il cDNA di P. tricornutum per la sequenza codificante di Pt OvoA senza il codone di stop i primer: Ovo GA fwd e OvorvAt (Tabella 1) .

Trasformazione biolistica P. tricornutum

Il costrutto pPtLhcf2povoYFP ? stato introdotto in cellule di P. tricornutum mediante bombardamento di microparticelle utilizzando un Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System (Bio-Rad) come descritto in (

1999, Trasformazione di geni reporter non selezionabili nelle diatomee marine.Mar. Biotech. 1, 239-251). Il costrutto pPtLhcf2povoYFP ? stato co-trasformato con il vettore pFCPBp-Sh ble (Falciatore, A., Casotti, R., Leblanc, C., Abrescia, C., Bowler, C. 1999, Trasformazione di geni reporter non selezionabili nelle diatomee marine Mar Biotech 1, 239-251), che esprime il gene Sh Ble che conferisce resistenza all'antibiotico fleomicina (Invitrogen).

Selezione di cloni resistenti

I cloni resistenti alla coniugazione batterica sono stati selezionati su piastre preparate con terreno f/2 diluito con acqua distillata al 50%, agarosio 1%, fleomicina 20 ?g/ml.

I cloni resistenti alla trasformazione biolistica sono stati selezionati su piastre preparate con terreno f/2-Si diluito con 50% di acqua distillata, 1% di agar e piastre contenenti fleomicina (50 ?g/ml).

Colony PCR ? stata eseguita come in ( . 2014. Genome engineering empowers the diatom Phaeodactylum tricornutum for biotechnology. Nat. Commun.5,3831) su lisati cellulari con Lhcf2pfw2 e Coppia di primer Ovorv1 ( Tabella 1 ) per accertare la presenza dell'episoma (p Pt Puc3ovoYFP) nelle cellule ottenute per coniugazione batterica, oppure con coppie di primer Lhcf2pfw ? Ovo1rv e Ovo1fw ? GFP dw (Tabella 1) per accertare la presenza del transgene nelle cellule trasformate con il metodo biolistico.

I prodotti della PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio ( Fig.4 ).

Localizzazione subcellulare di OvoA

La sequenza della proteina OvoA ? stata scansionata utilizzando lo strumento online per la previsione della localizzazione subcellulare WoLF PSORT. Dopo la conversione delle sequenze di amminoacidi proteici in caratteristiche di localizzazione numerica, WoLF PSORT utilizza un semplice classificatore k-nearest neighbor per la previsione e fornisce una riga di riepilogo in cui i numeri indicano il numero di vicini pi? vicini alla query che si localizzano in ciascun sito (

2007, WoLF PSORT: protein localization predictor Nucleic Acids Res 35, W585-7) . Per l'analisi microscopica ? stata utilizzata la scansione laser confocale TCS SP8 Leica. L'autofluorescenza della clorofilla e la fluorescenza YFP sono state eccitate a 510 nm e rilevate rispettivamente a 650-740 nm e 540-560 nm. MitoTracker Orange con eccitazione a 554 nm ed emissione a 576 nm (Molecular Probes) ? stato utilizzato per la colorazione dei mitocondri.

Produzione di pellet cellulari

10 litri di colture di cellule wild type (Pt1) e Pt OvoA con sovraesprimono ( Pt OvoA-oe) P. tricornutum dal passaggio di crescita esponenziale tardiva (4-6x10E6) sono state raccolte mediante centrifugazione a 2500 xg per 15 minuti e congelate in azoto liquido.

Identificazione chimica dell?ovotiolo

100 mg di cellule liofilizzate sono state reidratate con 300 ?L di acqua.10 mg delle cellule reidratate sono stati addizionati con 10 ?L di 1 mM di N-acetil cisteina.90 ?L di tampone di estrazione (acetonitrile: acido perclorico 0,75 M, 1:2) sono stati aggiunti ai campioni che sono stati poi vortexati (3 x 20 sec.). I campioni sono stati centrifugati per 5 minuti a 14000 rpm per rimuovere i detriti cellulari. Il lisato eliminato ? stato neutralizzato mediante l'aggiunta di 15 ?L di carbonato di potassio 2 M. La miscela ? stata centrifugata per 2 minuti a 1400 rpm per rimuovere il perclorato di potassio insolubile. Il surnatante ? stato basificato con 10 ?L di carbonato di litio (50 mM, pH 10). Le miscele sono state incubate per 5 minuti con 3 ?L 100 mM DTT e quindi incubate per 30 minuti con 25 ?L di 20 mM 4-bromometil-7-metossicumarina (BMC) in DMSO. La miscela ? stata poi acidificata mediante l'aggiunta di 10 ?L di acido formico al 10%. I campioni sono stati vortexati per rimuovere la CO2 e quindi centrifugati per 10 minuti. I campioni sono stati analizzati mediante HPLC in fase inversa utilizzando una colonna Gemini-NX C18 (5 ?m, 250 x 4,6 mm) su un apparato della serie Shimadzu Prominence. I coniugati tiolo-BMC sono stati rilevati con un rivelatore DA a 330 nm. Il metodo HPLC era il seguente: il solvente A ? H2O/ACN/TFA 100:1:0.1, il solvente B ? ACN/TFA 100:0.085. La portata ? stata di 1 ml x min-1. Per la separazione sono stati utilizzati gradienti lineari (0 min, 2% B; 1,5 min, 2% B; 22,5 min, 70% B; 24,5 min, 95% B; 29,5 min, 95% B; in 31,5 min, 2% B; 34,5 minuti, 2% B). Le aree dei picchi sono state confrontate con quelle della N-acetil cisteina utilizzata come standard interno per quantificare la quantit? di ovotiolo B. Le concentrazioni di glutatione sono state analizzate come controllo. HRMS ? stato ottenuto da UPLC HRMS (m calcolato per [C19H22N3O5S]+ = 404.1275, m misurato = 404.1258, = -4,2 ppm). I contenuti di ovotiolo B sono stati calcolati come ?g/mg di cellule di peso secco.

Esempio 1:

Localizzazione cellulare della proteina OvoA

Dieci su 11 cloni resistenti dalla coniugazione batterica hanno rivelato un prodotto amplificato PCR atteso di 1205 bp corrispondente a un frammento della regione che comprende il promotore di P. tricornutum Lhcf2 e la sequenza codificante Pt OvoA ( Fig.4 ). Il costrutto p Pt Puc3ovoYFP contiene la sequenza codificante YFP in frame con Pt OvoA che genera linee transgeniche che esprimono OvoA fusa a un tag YFP al terminale C sotto la regolazione del promotore Lhcf 2p ( Fig. 1 ), consentendo l'esame di Pt OvoA localizzazione cellulare mediante microscopia confocale a scansione laser. Le cellule hanno mostrato un segnale nel mitocondrio ( Fig. 5 ), confermando la prevista localizzazione in silico di P. tricornutum OvoA ( Tabella 2 ).

Tabella 1 Elenco dei primer

Tabella 2. Output WoLF PSORT che indica la localizzazione prevista. I numeri indicano il numero di vicini pi? prossimi alla query che si localizzano in ciascun sito, adeguati per tenere conto della possibilit? di doppia localizzazione. mito, mitocondri; plas, membrana plasmatica; cysk, citoscheletrico; extra, extracellulare; nucl, nucleare; pero, perossisoma; liso, lisosoma; clo, cloroplasto.

Esempio 2

Analisi dei composti tiolici in P. tricornutum e identificazione dell'ovotiolo B

La localizzazione di OvoA in P. tricornutum ha indicato che Pt OvoA ? tradotto nelle cellule della diatomea e mirato ai mitocondri ( Fig.5 ). Per verificare che le cellule di Pt OvoA producessero ovotiolo, abbiamo esaminato il contenuto di tiolo delle cellule di P. tricornutum coltivate in condizioni fisiologiche e raccolte durante la loro fase esponenziale. I tioli estratti sono stati alchilati con il colorante elettrofilo tiolo-specifico 4-bromometil-7-metossicumarina (BMC) e analizzati mediante HPLC in fase inversa. Il glutatione ? stato identificato come tiolo principale con una concentrazione di 1,5 ?g/mg peso secco . Al contrario, non sono state rilevate tracce di tioli alternativi noti come l'ovotiolo A o l'ergotioneina. Tuttavia, un segnale ? stato identificato come i derivati alchilati BCM dell'ovotiolo B mediante HR-ESI-MS (m/z_calc.= 404.1275, misurato m/z = 404.1258, ? < 5 ppm) e mediante coeluizione con un campione autentico ( Fig. 6 ). Il livello di ovotiolo B era 0,5 ?g/mg di peso secco in PtWT. Le linee transgeniche che esprimono OvoA PtOvoA mediante coniugazione batterica, pur esibendo la stessa concentrazione di livelli di glutatione come in PtWT, hanno prodotto almeno una quantit? doppia di ovotiolo B. PtOvoA ottenuto con il metodo biolistico ha prodotto una quantit? da tre a cinque volte maggiore di ovotiolo B rispetto a PtWT.

Esempio 3

Sovraespressione di PtOvoA mediante il metodo biolistico

Abbiamo analizzato le cellule dei cloni resistenti dal metodo biolistico che mostrava una singola banda delle dimensioni previste nel pannello inferiore della Figura 7 attraverso la microscopia a scansione laser confocale e tutte hanno confermato la localizzazione cellulare di PtOvoA nel mitocondrio ( Fig.8 ).

Lista delle sequenze parte della descrizione

SEQ ID NO 1 - pPtPuc3_rev primer

TCTAGAGGTCAAGTCCAGACTC

SEQ ID NO 2 - Primer Lhcf2p_fwd

CAGGAGTCTGGACTTGACTCTAGAGGTACCCCGCTTTGGTTTC

SEQ ID NO 3 - Primer Lhcf2p_rev

GTGGAGAGAGCATCATCTTGACTTCTGGCAACCG

SEQ ID NO 4 - Ovo_fwd primer

GCCAGAAGTCAAGATGATGCTCTCTCCACAAG

SEQ ID NO 5 - Ovo_rev primer

CCTTGCTCACCATTCCTGTCTTACGCCAACC

SEQ ID NO 6 - YFP-Lhcf1t _fwd primer

GCGTAAGACAGGAATGGTGAGCAAGGGCGAG

SEQ ID NO 7 - YFP- Lhcf1t _rev primer

CAAGCTTGCATGCTCGCAGGTCGACGCTGAAGACGAGCTAGTGTTATTC

SEQ ID NO 8 - pPtPuc3_fwd primer

GTCGCCTGCAGGCATGC

SEQ ID NO 9 - Primer Lhcf2pfw2

CGCCGTAAACAGCAAATCCT

SEQ ID NO 10 - Primer Ovorv1

AAGGAAGGAAAAGTCGGCAGG

SEQ ID NO 11 - Primer GA_Lhcf2_fwd

GAATTCATGGTGAGCAAGGGCG

SEQ ID NO 12 - Primer GA_Lhcf2_rv

GAATTCGATATCAAGCTTATCGAT

SEQ ID NO 13 - Ovo GA fwd primer AAGTCAAGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCATGATGC TCTCTCCACAAGC

SEQ ID NO 14 ? Primer OvorvAt CCAAAGTTCGAGGTAGTTGTTTCATCCTGTCTTACGCCAAC

SEQ ID NO 15 - Primer Lhcf2pfw

CGCCGTAAACAGCAAATCCT

SEQ ID NO 16 - Primer GFP dw

AACTCCAGCAGGACCATGTG

SEQ ID NO 17 ? Sequenza peptidica di PtovoA MMLSPQAARMGTVCTTLRKIVSTARQRSLSHSAFASVRSETAFGARAFSTRAKSTLAALEDSD DEDLTFRSQGHAAAAAALSKAGLNKSHDEAWMINVNRNDDNEWLNGPRSAEWFTGIHPSQC PGADQAGTIRSLSLPNLSAVTREAAKEYFDNSWTLYETLFAGLKGEEGFYRPPVHGLRHPQIFY YGHTACLYINKLRVSKVLPKPVNAYFESIFEVGVDEMLWDDMNKNDMLWPTVSEVHEYRQQV YKTVVDAILNHPSLDQRNGPVKVDQDHPMWALFMGFEHERIHMETSSVLFRETPYHLVQTPQ HWPPIHPSAFNDASPTSNPIETLDYPANRMIAVDNGTVDLGKPADFPSFGWDNEYGERNMDV PPFFASEHMITNGEYWQFVDNGGYRNREYWCDDGWAWRSHRNLKWPFFWEPAGPAGSNK FSLRTIFKIVPMPWSWPVDVNYYEAQAFCRWKTEKEGSPTSKPYRILTEAEHHIIRNHDHNLEA ARRDVSADKVMVTSGQAFPKGSAGSNLNLAFSSQNPVDFFEPSQTGHRDTTGSAWEWTEDH FNPLKGFEVHHVYDDFSTPCFDGKHSIIVGGSFISTGDEASVFARFHFRPHFLQHSGFRLVASD HDAPATHLFAGNFDGQVAARDAAVAQEESKPRQSSLGSGSGSGNVYETDDSLHMYLGLHYP NSGEKEGVAPILPHDNSPNHGTGFPQRVAGLLSSLKPEFNNNRALDIGCAVGGASFELAKTFD HVDAFDFSGSFVSAAKRMQSAENIKFRVPVEAELYEDLQAIHEHGVTDSVRSKVQFFTGDACR LIDMKEDGILGSYDGVVMSNLLCRLPDPMACLAGLPEIINPGGVVVMVTPFSWLTEFTPRGKWL GGFYDPVTNEAIYSKDILRQIMASNGFEKIHEVQMPLVIREHQRKYQYIVSEATGWRKTG

SEQ ID NO 18 ? Sequenza nucleotidica PtovoA atgatgctctctccacaagccgcccgtatgggtaccgtgtgcacgacactccgcaagatagtttcgacggcgcgtcagcggtctctctc gcattcggcgttcgcgtcggtccgtagcgagaccgcgtttggagcccgggcgttttcgacgcgtgcgaaatctactctagcggcactcg aagactcggatgacgaggatctcacctttcgtagtcagggacacgccgcagccgccgcggctttgagcaaggcaggattgaacaa gtctcacgatgaggcctggatgatcaacgtcaatcgcaacgacgacaacgaatggctgaacgggccgcgcagtgccgaatggttta cgggcattcaccctagtcaatgtcctggagccgaccaagcgggcaccatccgctcgctttcacttccgaatctgtcggccgttacccgt gaagctgcaaaagaatactttgacaactcatggacgctctacgagacattgtttgccggtctcaaaggagaagaaggattttatcgcc cgccagtccacggtctccgccacccccagatattctactacggacacactgcttgtctctacatcaacaagctccgcgtcagtaaagtc ttacccaaacctgtgaacgcctatttcgagtccatcttcgaagtcggtgtagacgaaatgctctgggatgacatgaacaagaatgatat gctttggcccacagtttcggaggtgcacgagtatcgacagcaagtatacaaaacggttgtggacgctattttgaatcatcctagtcttgat caaaggaacggtccagtgaaagtcgatcaggatcatccaatgtgggcattgttcatgggcttcgaacacgagcggatccatatggaa acgagttcagtcttgttccgtgagacgccgtaccatttggtccaaacaccccagcattggcctccgattcatccgtcggctttcaacgatg cctcgcccacaagcaatccgatagaaactttggattaccccgcgaaccgcatgattgccgtggacaatggaaccgtcgatctcggaa agcctgccgactttccttcctttggatgggacaatgagtacggtgaacgcaatatggatgtgcctccattcttcgctagtgaacacatgat cacaaatggagaatactggcagtttgtcgacaatggtggctatcgaaatcgagagtattggtgcgacgacggctgggcgtggcgcag tcatcgcaatcttaagtggccttttttttgggagcccgcaggacccgctgggtccaataagttttcgttgcgaaccattttcaagatcgttcc catgccgtggagttggcctgttgatgtaaattactacgaagcgcaagccttctgtcgatggaagaccgagaaagaaggatctccgact tcaaaaccgtatagaattctcaccgaagcggagcatcacatcattcgaaaccacgatcacaacttggaggctgctcgtagagacgttt cggcggataaggtgatggtgacttcagggcaagcgtttcccaaaggatcggctggatcaaatttgaacctggcattctctagccaaaa ccccgtcgatttctttgagccgtcccaaactggccaccgtgataccaccggaagtgcctgggaatggacggaagaccacttcaaccc tttaaagggatttgaagtccaccacgtgtacgatgatttttccactccatgttttgatggcaagcactctatcattgtggggggatcttttataa gtactggcgacgaggcatcagtttttgcacgattccatttccgaccccatttcctacaacattctggtttccgtctggttgcatcagatcacg atgctcctgctacgcacctttttgccggaaatttcgatggtcaagttgccgcacgcgatgccgcggtcgcgcaggaagaatccaagcc gagacagtcttcattaggaagcggcagtggcagcggcaatgtttacgagacggatgacagcttgcatatgtatcttggccttcattacc ctaattctggcgagaaggaaggcgttgccccgatccttcctcacgacaactctccaaaccatggaactggcttcccgcaacgagtgg caggtcttctgtcctcactgaaacccgagttcaataacaatcgcgcattggatattggctgtgctgttggaggggcgtcttttgaacttgcta agactttcgatcacgtggacgcctttgatttcagtggatctttcgtgagcgctgccaagcgaatgcaatcggcagaaaatatcaagtttc gggttcccgtggaggctgaactatatgaagaccttcaggctatccacgaacatggtgtgacggattcggtgcgctccaaagtgcagttc tttacaggggacgcctgccgactcatcgatatgaaagaagacggaattcttggctcatatgatggcgtggtcatgtcgaatttactctgc cgcctcccagatccaatggcatgcctcgccggacttccagagattataaatcccggtggagtggtcgtgatggtgacgccattttcgtg gttgactgagttcaccccccggggcaaatggctaggaggattttacgaccccgtaacaaacgaagctatctattcgaaggacatcctg cgccaaattatggcctcgaatgggttcgagaagattcatgaggttcagatgccgctcgtcattcgggagcaccaacgtaaataccagt atattgtcagcgaagctacaggttggcgtaagacaggatga

Claims (33)

RIVENDICAZIONI

1. Una microalga geneticamente modificata, caratterizzata dal fatto che detta microalga comprende una o pi? copie di una cassetta di sovraespressione codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

2. La microalga geneticamente modificata secondo la rivendicazione 1, in cui detta microalga ? una diatomea.

3. La microalga geneticamente modificata secondo la rivendicazione 2, in cui detta diatomea ? della specie Phaeodactylum tricornutum .

4. La microalga geneticamente modificata secondo la rivendicazione 3, in cui detta diatomea ? il ceppo Axenic CCMP632 di P. tricornutum.

5. La microalga geneticamente modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detta microalga mostra una migliore espressione dell'enzima solfossido sintasi OvoA rispetto al wild-type di detta microalga.

6. La microalga geneticamente modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui dette microalghe mostrano una migliore produzione di ovotioli rispetto al wild-type di dette microalghe.

7. Le microalghe geneticamente modificate secondo la rivendicazione 6, in cui detto ovotiolo ? Ovotiolo A, Ovotiolo B o Ovotiolo C.

8. La microalga geneticamente modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui detto enzima solfossido sintasi OvoA ha SEQ ID NO:17 o una sequenza sostanzialmente omologa ad essa.

9. La microalga geneticamente modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detta sequenza esogena avente SEQ ID NO: 18 o una sequenza sostanzialmente omologa ad essa.

10. La microalga geneticamente modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 ottenibile con un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 25.

11. Un metodo per la preparazione di una microalga geneticamente modificata, comprendente un passaggio di trasformazione di detta microalga con una sequenza esogena codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

12. Il metodo secondo la rivendicazione 11, comprendente un passaggio di trasformazione di detta microalga con un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

13. Il metodo secondo le rivendicazioni 11 e 12, in cui detto enzima solfossido sintasi OvoA ha SEQ ID NO:17 o una sequenza sostanzialmente omologa ad essa.

14. Il metodo secondo le rivendicazioni da 11 a 13 in cui detto vettore di espressione viene introdotto in detta microalga mediante metodo biolistico o coniugazione batterica.

15. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 14, in cui detto vettore di espressione ? un vettore episoma in detta cellula algale.

16. Il metodo secondo le rivendicazioni da 11 a 15, in cui detto vettore di espressione viene introdotto in detta microalga per coniugazione batterica.

17. Il metodo secondo la rivendicazione 16, in cui le cellule batteriche utilizzate per la coniugazione batterica sono scelte tra le seguenti: cellule di Escherichia coli DH10B.

18. Il metodo secondo le rivendicazioni da 16 a 17, comprendente un passaggio in cui detto vettore di espressione viene trasformato in dette cellule batteriche.

19. Il metodo secondo le rivendicazioni da 16 a 18, comprendente un passaggio in cui dette cellule batteriche vengono inoculate un giorno prima della coniugazione per la crescita durante la notte.

20. Il metodo secondo le rivendicazioni da 16 a 19, in cui dette cellule batteriche sono le cellule di Escherichia coli DH10B.

21. Il metodo secondo le rivendicazioni da 11 a 15, in cui detto vettore di espressione viene introdotto in detta microalga mediante metodo biolistico.

22. Il metodo secondo la rivendicazione 21, in cui detto metodo biolistico viene eseguito utilizzando un Biolistic Particle Delivery System.

23. Il metodo secondo le rivendicazioni 21 e 22, comprendente un passaggio in cui detto vettore di espressione ? co-trasformato con un vettore che esprime un gene conferente resistenza ad un antibiotico.

24. Il metodo secondo la rivendicazione 23, in cui detto gene ? il gene Sh Ble.

25. Il metodo secondo le rivendicazioni 23 e 24, in cui detto antibiotico ? scelto tra fleomicina.

26. Un vettore di espressione adatto alla trasformazione di microalghe, comprendente in particolare una sequenza di acido nucleico codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA.

27. Il vettore di espressione secondo la rivendicazione 26, in cui detto vettore di espressione ? scelto tra un plasmide, un vettore di lievito, un vettore di mammifero, un vettore virale, un fago a singolo filamento, un fago a doppio filamento, cromosoma artificiale.

28. Il vettore di espressione secondo le rivendicazioni 26 e 27, in cui detto vettore di espressione ? un plasmide episomale.

29. Il vettore di espressione secondo le rivendicazioni da 26 a 28, in cui detto vettore di espressione ? legato operativamente ad un gene codificante una proteina fluorescente.

30. Il vettore di espressione secondo le rivendicazioni da 26 a 30, in cui detta proteina fluorescente ? la proteina fluorescente gialla (YFP) o la proteina fluorescente verde (GFP).

31. Il vettore di espressione secondo le rivendicazioni da 26 a 30, in cui detta proteina fluorescente ? la proteina fluorescente gialla (YFP).

32. Il vettore di espressione secondo le rivendicazioni da 26 a 31, in cui detta sequenza di acido nucleico codificante per l'enzima solfossido sintasi OvoA ha SEQ ID NO: 17.

33. Un metodo per la produzione di ovotiolo(i) comprendente i passaggi di:

i) coltivare una microalga geneticamente modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7,

ii) raccolta di dette microalghe geneticamente modificate e

iii) identificazione e/o quantificazione dell'ovotiolo(i) da dette microalghe geneticamente modificate ottenute nel passaggio ii).