IT202100017054A1 - Associazione di cinnamaldeide ed eugenolo ad attività antimicotica - Google Patents
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Description
Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
?Associazione di cinnamaldeide ed eugenolo ad attivit? antimicotica?
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda una associazione di ingredienti attivi di origine vegetale, in particolare una associazione di ingredienti attivi di origine vegetale o analoghi sintetici o estratti di origine vegetale che contengono cinnamaldeide insieme ad eugenolo o a loro derivati, utile come antimicotico per uso terapeutico sia umano sia veterinario, soprattutto contro infezioni fungine causate da Candida.
Candida spp ? un lievito che pu? causare infezioni fungine nell?uomo e nell?animale. La specie pi? importante ? la Candida albicans che ? presente nelle membrane mucose di circa l?80% della popolazione umana e fa parte della normale flora microbica di pelle, bocca, tratto gastrointestinale e vagina.
Anche se normalmente non ? patogeno, questo lievito pu? tuttavia causare infezioni in organismi debilitati. Tali infezioni vengono comunemente indicate come candidosi quando colpiscono l?area vaginale o mughetto quando colpiscono la bocca.
Gli oli essenziali e i loro principi attivi hanno attivit? biologiche che, se utilizzate in modo corretto ed opportunamente dosate, possono fungere da germicidi, fungicidi, antibatterici, antiinfiammatori, antiparassitari e antibiotici.
La cinnamaldeide o aldeide cinnamica ? una sostanza presente nell?olio essenziale estratto dalla cannella. Ha mostrato in diversi studi un?ottima azione antimicotica, in particolare contro diversi ceppi del genere Candida.
L?eugenolo ? una sostanza presente nell?olio essenziale estratto dai chiodi di garofano, che ha dimostrato di avere effetti come antimicotico, oltre a molteplici effetti antimicrobici.
Abbiamo ora trovato che l?associazione di cinnamaldeide ed eugenolo ha vantaggiosi effetti antimicotici che la rendono particolarmente utile nel trattamento di infezioni fungine, in particolare causate da Candida spp., sia nell?uomo sia nell?animale.
Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione una associazione di cinnamaldeide ed eugenolo per uso come antimicotico nell?uomo e nell?animale. Nel presente contesto, i termini ?cinnamaldeide? ed ?eugenolo? vengono utilizzati sia per indicare le singole sostanze isolate e/o purificate sia per indicare estratti e oli essenziali di origine vegetale che li contengono. Analogamente, i termini ?cinnamaldeide? ed ?eugenolo?, se non diversamente specificato, includono anche derivati di cinnamaldeide e derivati di eugenolo che mantengono la stessa attivit? terapeutica.
In letteratura sono state descritte alcune composizioni contenenti miscele di oli essenziali di origine vegetale, inclusi oli essenziali contenenti cinnamaldeide ed eugenolo.
Ad esempio, WO2012/114201 descrive composizioni a base di carvacrolo (contenuto nell?olio essenziale estratto dall?origano) con attivit? antibatterica ad ampio spettro, antiparassitaria ed antifungina. Le composizioni possono contenere anche altri oli essenziali tra i quali vengono menzionati oli essenziali che contengono eugenolo ed oli essenziali che contengono cinnamaldeide.
WO2004/076680 descrive un agente antimicrobico di origine vegetale che pu? contenere vari oli essenziali tra i quali anche oli essenziali contenenti cinnamaldeide e/o eugenolo.
Nella tecnica nota non vengono tuttavia descritte composizioni antimicotiche che contengono come principio attivo la sola associazione di cinnamaldeide ed eugenolo. Va per altro evidenziato che solo l?associazione di cinnamaldeide ed eugenolo mostra vantaggi nella somministrazione della combinazione dei due principi attivi rispetto alla somministrazione dei singoli principi attivi.
Altri oli essenziali noti per la loro attivit? antimicotica quali, ad esempio, ?-pinene, non hanno determinato alcun vantaggio quando somministrati in associazione con cinnamaldeide o eugenolo.
L?associazione di cinnamaldeide ed eugenolo, oggetto della presente invenzione, pu? essere somministrata sotto forma di formulazioni convenzionali adatte alla somministrazione orale o topica. Il tecnico del ramo ? in grado di individuare gli eccipienti pi? adatti per la formulazione, la cui scelta dipender? dal tipo di somministrazione e dal tipo di infezione che si intende trattare.
L?associazione di cinnamaldeide ed eugenolo esercita infatti la propria attivit? terapeutica sia per via topica sia per via sistemica.
In caso sia preferibile o auspicabile un?azione sistemica, la formulazione contenente l?associazione di cinnamaldeide ed eugenolo sar? preferibilmente una formulazione orale, quali compresse, capsule e granulati, che possono anche essere somministrati sotto forma di integratori alimentari.
In caso sia preferibile o auspicabile un?azione topica, la formulazione contenente l?associazione di cinnamaldeide ed eugenolo sar? una formulazione orale idonea per una permanenza prolungata nel cavo orale (ad es. caramelle o chewing-gum) in caso di infezione fungina nel cavo orale (ad es. mughetto) oppure una formulazione per applicazione topica vaginale (ad es. ovuli o creme) in caso di infezione fungina a livello vaginale.
La scelta degli eccipienti/additivi da utilizzare per la formulazione rientra nelle normali conoscenze del tecnico del ramo.
Costituisce pertanto un ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione per somministrazione topica o sistemica contenente una associazione di cinnamaldeide ed eugenolo in miscela con un veicolante adatto.
La quantit? di cinnamaldeide ed eugenolo contenuta nelle composizioni oggetto della presente invenzione varia in funzione della forma di somministrazione utilizzata e preferibilmente corrisponde ad un rapporto cinnamaldeide:eugenolo che va da 1:1 a 1:10 parti in peso, ancor pi? preferibilmente cinnamaldeide:eugenolo 1:2.
Il dosaggio giornaliero varia da un minimo di 0,03 mg/kg ad un massimo di 300 mg/kg per la cinnamaldeide e da un minimo di 0,03 mg/kg ad un massimo di 300 mg/kg per l?eugenolo.
Per la formulazione possono essere utilizzati eugenolo e cinnamaldeide contenuti in oli essenziali come l?Olio Essenziale di Cannella con titolo in eugenolo che pu? variare da 1 a 90%, oppure l?Olio Essenziale di Cannella con titolo di cinnamaldeide che pu? variare da 1 a 90%, oppure l?Olio essenziale di Chiodi Garofano con titolo in eugenolo che pu? variare da 1 a 90% oppure l?Olio essenziale di Chiodi Garofano con titolo in cinnamaldeide che pu? variare da 1 a 90%. Possono essere utilizzati anche cinnamaldeide ed eugenolo isolati e purificati a partire da oli essenziali, o prodotti di sintesi. Le formulazioni orali possono comprendere capsule, granuli o compresse standard o a rilascio modificato, i composti potranno essere liberi, adsorbiti su fibra di origine vegetale o sintetica, microincapsulati o nanoincapsulati.
I vantaggi terapeutici della somministrazione dell?associazione di cinnamaldeide ed eugenolo oggetto della presente invenzione sono stati evidenziati con prove sperimentali descritte in dettaglio nella parte sperimentale che segue.
Gli esperimenti hanno in particolare confermato l?attivit? antimicotica di cinnamaldeide ed eugenolo separatamente e l?effetto sorprendentemente molto pi? marcato quando somministrati in associazione.
Infatti, dall?esperimento su piastra, i dischetti imbevuti separatamente di eugenolo e cinnamaldeide hanno inibito la crescita di tutti i ceppi di Candida testati, creando aloni di inibizione decisamente maggiori di quelli creati dall?amfotericina B (10?g). Cinnamaldeide ed eugenolo hanno mostrato un?ottima attivit? inibente sulla crescita fungina con valori medi di MIC rispettivamente di 0,0048% (v/v) e 0,043% (v/v). L?attivit? fungicida risulta pi? forte per la cinnamaldeide (0,01% v/v) che per l?eugenolo (0,067% v/v). Alla rispettiva concentrazione fungicida, l?eugenolo uccide la totalit? delle cellule fungine in 1 ora, la cinnamaldeide impiega un tempo maggiore di 2 ore ma minore di 4 ore per eliminare completamente le cellule fungine.
La loro associazione ha un effetto antimicotico molto pi? marcato diminuendo la MIC di eugenolo ad ? e la MIC di cinnamaldeide a ? rispetto a quelle degli oli singoli. Infine la cinnamaldeide e l?eugenolo, oggetto della presente invenzione hanno mostrato di non avere alcun effetto su Lactobacillus alle concentrazioni utili ad inibire le Candida spp, permettendo di lasciare inalterata la normale flora batterica.
Breve descrizione delle figure
FIG.1 illustra lo schema di lettura del metodo disk diffusion.
FIG. 2 illustra lo schema di lettura del metodo microdilution ? am=amfotericina B (UdM: ?g/ml), e.o.= olio essenziale (UdM: %v/v), controllo negativo: DMSO 1%v/v. FIG.3 illustra lo schema di incubazione del metodo time-kill curve.
FIG.4 mostra gli aloni di inibizione ottenuti con il metodo disk diffusion.
FIG.5 mostra la piastra microtiter per C. albicans 14.
FIG. 6 mostra la lettura della MFC (la semina numero 6 non ha alcuna colonia, MFC=0,125%v/v).
FIG. 7 riporta la time-kill curve per C. albicans ceppo 15. Oli usati alla loro MFC (corrispondente a 2XMIC per il ceppo C. albicans 15.
FIG.8 mostra la checkerboard cinnamaldeide/eugenolo (FICI 0,625).
PARTE SPERIMENTALE
Attivit? antifungina di cinnamaldeide ed eugenolo vs Candida spp.
Materiali e metodi
Un totale di diciotto ceppi appartenenti alle Candida spp. (15 C. albicans, 2 C. glabrata e 1 C. lusitaniae) derivati da una collezione di ceppi vaginali isolati in CHROMAgar Candida (BD Italia SpA, Milano, Italia) sono stati tenuti in coltura su Potato Dextrose Agar (Oxoid Thermofisher SpA, Milano Italia) a 35?C per 24 ore.
Attivit? antifungina: Metodo ?disk diffusion?
Le colonie sono state risospese in soluzione salina sterile a una densit? corrispondente a #0,5 McFarland (standard di opacit?). #0,5 McF corrispondono a 1,4x10^6 unit? formanti colonie (CFU)/ml per C. albicans, 4,3x10^6 CFU/ml per C. glabrata e 3x10^6 CFU/ml per C. lusitaniae [Guinea J. et al., Rapid antifungal susceptibility determination for yeast isolates by use of Etest performed directly on blood samples from patients with fungemia, J Clin Microbiol. 2010 Jun, 48(6):2205-12]. ? stato quindi effettuato il test di sensibilit? vs i due oli. Il metodo disk diffusion ? stato effettuato come segue: per ogni ceppo testato, 4 piastre di Potato Dextrose Agar (PDA) sono state seminate in 3 direzioni per produrre una crescita confluente, tramite tampone sterile imbevuto nella sospensione cellulare. Dischetti di carta assorbente di 6,0 mm di diametro sono stati posati sulla superficie dell?agar e addizionati con 10 ?l di ogni olio essenziale. Dischetti imbevuti con 10 ?g di amfotericina B sono stati usati come controllo positivo. Sono stati utilizzati anche dischetti di clotrimazolo (da 10 ?g a 40 ?g), ma gli aloni di inibizione non erano chiaramente leggibili per la formazione di un alone di ricrescita. Dischetti imbevuti di 10 ?l di dimetilsolfossido puro (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sono stati usati come controllo negativo. Le piastre sono state incubate a 35?C per 24 ore. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in duplicato. L?effetto inibente degli oli ? stato considerato efficace quando l?alone di inibizione risultava maggiore o uguale a quello creato dall?amfotericina B. Per l?amfotericina B, una zona di inibizione (IZ) ? 15 mm ? stata interpretata come ?sensibilit??, da 10 a 14 mm come ?sensibilit? intermedia? e <10 mm come ?resistenza? [Kauser et al., Agreement of Direct Antifungal Susceptibility Testing from Positive Blood Culture Bottles with Conventional Method for Candida Species, J Clin Microbiol.2016 Feb, 54(2):343-34]. Lo schema di lettura della disk diffusion ? mostrato in Fig.1.
Attivit? antifungina: metodo in ?microdilution?
L?attivit? antifungina dell?amfotericina B e di cinnamaldeide ed eugenolo ? stata esaminata con il metodo della microdilution come riportato da Bona et al. [Bona et al., Sensitivity of Candida albicans to essential oils: are they an alternative to antifungal agents? J Appl Microbiol.2016 Dec, 121(6):1530-1545] con piccole modifiche. Sono stati testati tutti i 18 ceppi di Candida spp. Per ogni isolato, le colonie provenienti da colture (24 ore) in PDA sono state diluite in soluzione salina fino a una concentrazione di 2x10^3 CFU/ml (in modo da ottenere una concentrazione finale di 10^3CFU/ml). Cinnamaldeide ed eugenolo sono stati disciolti in DMSO (80% olio, 20% DMSO), quindi diluiti in brodo Sabouraud fino a una concentrazione di 8% v/v (in modo da ottenere una concentrazione finale di 4%v/v). In una piastra microtiter a 96 pozzetti sono state quindi effettuate diluizioni seriali ? dell?amfotericina B (range 32-0,032 ?g/ml, per un range finale di 16-0,016 ?g/ml) e degli oli essenziali (range 8-0,004% v/v, per un range finale di 4-0,002%v/v). Ogni pozzetto ? stato quindi inoculato con 100 ?l della sospensione cellulare. Il controllo negativo conteneva DMSO diluito in brodo Sabouraud (al 2% v/v, per una concentrazione finale di 1% v/v). Le piastre sono state incubate a 35?C per 48 ore. Ogni esperimento ? stato effettuato in duplicato. La minima concentrazione inibente (MIC) ? stata determinata come la concentrazione degli oli nel primo pozzetto non torbido. La minima concentrazione fungicida (MFC) ? stata determinata come la minore concentrazione degli oli, la cui coltura in agar ha dimostrato la completa assenza di crescita fungina. La determinazione della MIC dell?amfotericina B ? stata effettuata anche secondo le linee guida EUCAST (cutoff 1 ?g/ml) [https://eucast.org/astoffungi/clinicalbreakpointsforantifungals], tutti i risultati erano concordanti. Lo schema di lettura del metodo microdilution ? riportato in Fig.2. Attivit? fungicida: Time-Kill Curve
Un ceppo di C. albicans (C.a. 15) ? stato incubato con cinnamaldeide ed eugenolo alla loro MFC. Le colonie di C. albicans sono state sospese in brodo Sabouraud a una densit? corrispondente a #1,4 McFarland (4x10^6 CFU/ml), quindi diluite 1/10 (4x10^5 CFU/ml, per una concentrazione finale di 2x10^5 CFU/ml). La sospensione ? stata divisa in aliquote, due aliquote sono state incubate con gli oli (1/2 v/v) preparati ad una concentrazione doppia della loro MFC (per una concentrazione finale pari alla MFC); la terza aliquota ? stata diluita 1/2 con brodo Sabouraud ed ? stata usata come controllo negativo. Le miscele sono state incubate a 35?C su piastra basculante. A T0, T1ora, T2ore, T4ore, T6ore, T8ore, T12 ore e T24ore, sono state effettuate diluizioni seriali 1/10, per determinare la conta vitale totale (TVC). Da ogni diluizione, 100 ?l sono stati seminati in PDA e incubati a 35?C per 24 ore, sono state quindi contate le colonie, il loro numero ? stato espresso come CFU/ml. Il metodo time-kill curve ? stato condotto secondo lo schema riportato in Fig.3. Il test ? stato effettuato in duplicato.
Effetto sinergico: checkerboard
Per valutare l?eventuale effetto sinergico degli oli in combinazione ? stato utilizzato il metodo della checkerboard su piastra microtiter a 96 pozzetti, come rappresentato nella tabella 1 seguente:
Tabella 1 ?Checkerboard
A: cinnamaldeide
B: eugenolo
100 ?l di brodo Sabouraud sono stati inseriti in tutti i pozzetti tranne H12. 200 ?l di cinnamaldeide sono stati aggiunti al pozzetto H12 e 100 ?l dello stesso olio (a una concentrazione pari a 32 volte la MIC, per una concentrazione finale pari a 8xMIC) sono stati aggiunti nei pozzetti da A12 a G12; si ? quindi effettuata una diluizione ? in senso orizzontale, fino alla colonna 2. 100 ?l di eugenolo (a una concentrazione pari a 16 volte la MIC, per una concentrazione finale di 4xMIC) sono stati inseriti nei pozzetti da H1 a H12, ? stata quindi effettuata la seconda diluizione, in senso verticale, fino alla riga B. Colonie di C. albicans (ceppo C.a.15) derivate da una coltura di 24 ore in PDA, sono state sospese in brodo Sabouraud alla concentrazione di 2x10^3 CFU/ml (per una concentrazione finale di 10^3 CFU/ml). 100 ?l della sospensione sono stati inseriti in tutti i pozzetti. Le piastre sono state incubate a 35?C per 48 ore. Le MIC sono state determinate come per il metodo microdilution. Il pozzetto A1 ? stato usato come controllo negativo. Il test ? stato effettuato in duplicato.
Il FICI (Fractional Inhibitory Concentration Index) ? stato determinato come segue: FICI = MIC (cinnamaldeide in combinazione)/MIC (cinnamaldeide) MIC (eugenolo in combinazione)/MIC (eugenolo)
Un effetto sinergico si riscontra quando il valore di FICI ? ?0,5; un effetto additivo quando 0,5<FICI?1; un effetto indifferente quando <1FICI?4 e un effetto antagonista quando FICI>4 [Vuuren et al., Antimicrobial activity of limonene enantiomers and 1,8-cineole alone and in combination, Flavour and Fragrance Journal, 2007, 22(6):540-544; Stanojevic et al., In vitro synergistic antibacterial activity of Salvia officinalis L. and some preservatives, Archives of Biological Sciences Belgrade, 2010, 62(1):175-83].
Effetti su Lactobacillus acidophilus
L?attivit? antibatterica di cinnamaldeide ed eugenolo vs L. acidophilus ? stata studiata utilizzando il metodo disk diffusion (schema di lettura come in Fig. 1) e il metodo microdilution (schema di lettura come in Fig. 2). ? stato testato un ceppo di L. acidophilus denominato La-14
Disk diffusion
Colonie provenienti da una coltura di 24 ore in agar DeManRogosaSharpe sono state sospese in soluzione salina fino a una concentrazione pari a #0,5 McFarland. Un totale di 3 piastre di agar MRS sono state seminate in 3 direzioni tramite tampone sterile imbevuto della sospensione batterica, per produrre una crescita confluente. Dischetti di carta assorbente del diametro di 6,0 mm sono stati posizionati su ogni piastra e imbevuti con 10 ?l di ogni olio. Dischetti imbevuti con 10 ?l di DMSO puro sono stati usati come controllo negativo. Le piastre sono state incubate a 37?C per 24 ore in anaerobiosi (anaerogen gaspack,
. L?esperimento ? stato effettuato in duplicato.
Microdilution
Gli oli essenziali (80% olio, 20% DMSO) sono stati diluiti in brodo MRS fino a una concentrazione di 8% v/v (per ottenere una concentrazione finale di 4% v/v). In una piastra microtiter da 96 pozzetti sono state effettuate diluizioni seriali ? degli oli (volume: 100 ?l. Range 8-0,004% v/v, per un range finale di 4-0,002% v/v). Ogni pozzetto ? stato quindi inoculato con 100 ?l della sospensione cellulare. Le piastre microtiter sono state incubate a 37?C per 48 ore in anaerobiosi. La MIC ? stata determinata come la concentrazione degli oli nel primo pozzetto con torbido. L?esperimento ? stato effettuato in duplicato.
Risultati
Disk diffusion
Diciotto ceppi appartenenti a Candida spp (15 C. albicans, 2 C. glabrata e 1 C. lusitaniae) sono stati testati con il metodo disk diffusion. L?effetto inibente degli oli ? stato considerato efficace quando l?alone di inibizione risultava maggiore o uguale a quello creato dall?amfotericina B. Cinnamaldeide ed eugenolo hanno inibito tutti i ceppi testati. I risultati sono riassunti nelle tabelle 2 e 3 seguenti e in Fig.4.
Tabella 2 ? Distribuzione degli aloni di inibizione (inclusi i 6,0 mm del dischetto)
diametro (mm) % di ceppi inibiti Amfotericina B
media 15,4
range 10 ? 20,5
deviazione standard 2,7
Cinnamaldeide 100% (18/18) media 69
range 55 ? 75
deviazione standard 6
Eugenolo 100% (18/18) media 35,2
range 30,5 ? 41
deviazione standard 3,5
Controllo neg (DMSO) //
Tabella 3 ? Diametri (mm) degli aloni di inibizione (inclusi i 6,0 mm del dischetto)
Microdilution
L?attivit? antifungina di cinnamaldeide ed eugenolo ? stata ulteriormente analizzata utilizzando il metodo della microdilution. Gli aloni di inibizione della amfotericina B rilevati col metodo della disk diffusion rientravano tutti nella categoria ?sensibilit?? o ?sensibilit? intermedia?, questi risultati sono stati confermati anche con la microdilution. Il DMSO 1% (controllo negativo) non ha mai inibito la crescita cellulare. La cinnamaldeide ha dimostrato le MIC e MFC minori, le MIC e MFC dell?eugenolo sono comunque molto basse. I risultati del test in microdilution sono riportati nelle tabelle 4 e 5. Nelle Figg. 5 e 6 sono riportati esempi delle letture delle MIC e delle MFC.
Tabella 4 ? distribuzione delle MIC e delle MFC
Time-Kill Curve
2x10^5 CFU/ml del ceppo C.a. 15 sono stati co-incubati con cinnamaldeide ed eugenolo. A T0, T1ora, T2ore, T4ore, T6ore, T8ore, T12ore e T24ore ? stata determinata la conta vitale totale. L?eugenolo ha ucciso tutte le cellule fungine entro la prima ora di co-incubazione. Quando le cellule di C. albicans sono state incubate con cinnamaldeide, la conta vitale ? rimasta stabile per 2 ore, a 4 ore non erano pi? presenti cellule vitali. I risultati sono riportati in Fig.7.
Effetto sinergico
Saggiando cinnamaldeide in combinazione con eugenolo, il primo pozzetto non torbido risulta essere C8, in cui la MIC della cinnamaldeide ? ? della MIC di partenza e la MIC dell?eugenolo ? ? della MIC di partenza. Il valore di FICI risulta essere 0,625, corrispondente ad un effetto additivo, molto vicino ad un effetto sinergico (FIG.8). Effetti su Lactobacillus acidophilus
Il Lactobacillus acidophilus ? il maggior componente (90%) del complesso vaginale di Doderlein, che forma un biofilm protettivo sulla mucosa e inibisce la sovracrescita di altri microorganismi dannosi [J.P. Lepargneur, V. Rousseau, Protective role of Doderlein flora, Journal de Gyn?cologie Obst?trique et Biologie de la Reproduction 31(5):485-94]. ? di fondamentale importanza che le sostanze antimicrobiche utilizzate a livello vaginale non compromettano la crescita della normale microflora vaginale.
Con il metodo disk diffusion l?eugenolo non ha prodotto alcun alone di inibizione, l?aldeide cinnamica ha prodotto un piccolo alone di 10mm di diametro. Andando a valutare l?attivit? dell?aldeide cinnamica in brodo, la MIC vsL. acidophilus ? risultata di 0,032% v/v, tale MIC ? il doppio della MIC massima osservata (solo in 2 ceppi su 18) vs Candida spp e circa 6,7 volte maggiore della MIC media. Andando a valutare l?attivit? dell?eugenolo in brodo, la MIC vs L. acidophilus ? risultata di 0,25% v/v, tale MIC ? il doppio della MIC massima osservata (solo in 2 ceppi su 18) vs Candida spp e circa 6 volte maggiore della MIC media. Da queste osservazioni ? evidente come l?utilizzo di tali oli alle concentrazioni necessarie a combattere le candidosi vaginali, permetta di lasciare inalterata la normale flora batterica.
Claims (8)
1) Una associazione di cinnamaldeide ed eugenolo per uso come antimicotico nell?uomo e nell?animale.
2) Una composizione contenente l?associazione secondo la rivendicazione 1 in miscela con un veicolante adatto per somministrazione topica o sistemica.
3) Associazione secondo la rivendicazione 1 in cui la dose giornaliera varia da 0,03 mg/kg a 300 mg/kg per cinnamaldeide e da 0,03 mg/kg a 300 mg/kg per eugenolo.
4) Associazione secondo la rivendicazione 1 in cui cinnamaldeide ed eugenolo sono in un rapporto che va da 1:1 a 1:10 parti in peso, preferibilmente 1:2.
5) Associazione secondo la rivendicazione 1 in cui cinnamaldeide ed eugenolo sono utilizzati sotto forma di oli essenziali.
6) Associazione secondo la rivendicazione 5 in cui gli oli essenziali sono scelti tra olio essenziale di cannella e olio essenziale di chiodi di garofano.
7) Associazione secondo la rivendicazione 1 in cui cinnamaldeide ed eugenolo sono utilizzati in forma purificata.
8) Associazione secondo la rivendicazione 1 per uso contro infezioni fungine causate da Candida.
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