IT202100011861A1 - Metodo di rilevamento e uso di un composto nel trattamento di Nefropatia da IgA - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: ?Metodo di rilevamento e uso di un composto nel trattamento di Nefropatia da IgA?
La presente invenzione ? relativa all?uso di un composto nel trattamento della Nefropatia da IgA (o malattia di Berger ) basato sulla modulazione di Interleuchina 6 (IL-6) influenzata dal microbioma e dal Viroma.
La presente invenzione ? inoltre relativa ad un metodo di rilevamento della Nefropatia da IgA.
La nefropatia da immunoglobulina A (IgAN), conosciuta anche come malattia di Berger, ? la pi? frequente glomerulonefrite primaria caratterizzata dalla presenza di immunocomplessi di IgA nei glomeruli [1]. Essa compare generalmente nella seconda e terza decade di vita, ha incidenza maggiore nel sesso maschile ed ? pi? comune nei bianchi rispetto ai neri con una maggiore prevalenza negli asiatici rispetto ai caucasici. La malattia all?esordio si manifesta con episodi di macroematuria in circa il 40-45% dei pazienti, spesso in concomitanza con malattie febbrili delle mucose, come nel caso delle tonsilliti ricorrenti, microematuria e/o proteinuria. Generalmente, la malattia progredisce lentamente con lo sviluppo di insufficienza renale ed ipertensione dopo circa 10 anni nel 20-225% dei casi, e perdita della funzionalit? renale entro 20 anni nel 25% dei casi. Ad oggi, non vi sono biomarkers per una diagnosi precoce e non invasiva di questa patologia ed il gold standard per la diagnosi IgAN si basa sull?esecuzione della biopsia renale, una procedura invasiva per il paziente, che va eseguita in sala operatoria, che non ? esente da effetti avversi e complicazioni e che necessita di ospedalizzazione, con un forte impatto sul SSN.
L?eziologia dell?IgAN non ? ancora del tutto nota. L?IgAN ? considerata una malattia sistemica autoimmune in quanto ? causata dalla produzione di IgA deglicosilate da parte delle plasmacellule a livello delle principali mucose. Recentemente, ? stato proposto un modello definito multihit per descrivere la patogenesi dell?IgAN. In questo modello, il primo hit ? dato dalla ipersecrezione di IgA deglicosililate (Gd-IgA1). In circolo, queste Gd-IgA1 vengono riconosciute ed attaccate da autoanticorpi (secondo hit) e questo processo porta alla formazione di immunocomplessi circolanti (terzo hit), alcuni dei quali si depositano a livello mesangiale nei glomeruli. Il danno renale derivante dalla deposizione degli ? caratterizzato dall?infiammazione locale, l?attivazione del complemento, la proliferazione cellulare ed infine fibrosi.
Questo modello spiega la patogenesi della IgAN causata dalla produzione di IgA aberranti, ma si ritiene che vi siano a monte altri fattori suscettibili, tra cui fattori immunologici, genetici, ambientali o nutrizionali in grado di influenzare la patogenesi e che potrebbero essere utili per lo sviluppo della nefrologia di precisione e terapia personalizzata.
Negli ultimi anni, ? stata prodotta una considerevole mole di dati derivanti da studi di associazione su loci candidati, studi di Genome-Wide linkage, ma anche studi di trascrittomica, epigenomica, proteomica che hanno portato all?identificazione di diversi fattori associati alla malattia.
Tra gli altri, questi dati riportano che la metilazione del DNA sembra rivestire un ruolo nella patogenesi della IgAN.
In un recente studio di Sallustio et. al., ? stato effettuato uno screening dell'intero genoma per la metilazione del DNA nelle cellule T CD4 da pazienti IgAN, individuando tre regioni con metilazione alterata in grado di influenzare l?espressione genica di geni coinvolti nella risposta e nella proliferazione delle cellule T CD4 . In particolare, ? stata individuata una regione ipermetilata comprendente il vault RNA 2-1 (VTRNA2-1), un RNA non codificante noto anche come precursore di miR-886 (Pre-mi-RNA). Per la prima volta ? stato dimostrato che alcune regioni specifiche del DNA, metilate in modo anomalo, possono causare, nei pazienti con IgAN, una ridotta forza del segnale TCR delle cellule T CD4 e ad una loro risposta e attivazione anomale che potrebbero spiegare lo squilibrio delle cellule T-helper.
Come riportato in letteratura, VTRNA2-1 ? noto in quanto specifico inibitore di PKR (Protein Kinase RNA-enabled), una chinasi dipendente da RNA a doppio filamento inducibile dall'interferone. La soppressione di VTRNA2-1 attiva PKR e tutte le pathways a valle di questa, come la fosforilazione di eIF2a e la via NF-kB, portando a una alterata proliferazione cellulare. Come anche indicato in uno studio condotto da Shi et al su modello murino, l'espressione di IL-6 indotta da deossinivalenolo (DON) ? mediata da cAMP-response element binding protein (CREB) e dipendente da PKR. L?attivit? chinasica richiesta per l?attivazione di queste vie ? inibita nei macrofagi di topi nutriti con Acido docosaesanoico (DHA) per un periodo di tempo prolungato. Dunque, VTRNA2-1, inibendo la via di PKR, va ad inibire di conseguenza anche il signalling di CREB e l?espressione della citochina infiammatoria IL-6.
In letteratura, ? noto l?aumento sierico dell?IL6 nei pazienti con IgAN. Studi recenti hanno mostrato il coinvolgimento della via di IL-6 nel mediare la produzione di IgA glicosilate in modo aberrante. Inoltre, nello studio di Rops et al., ? stato visto che l?espressione della proteina CD37 sulle cellule B dei pazienti IgAN ? ridotta rispetto ai donotori sani. Con topi knock out per Cd37, si ? visto che i livelli di IL6 erano elevati insieme ad aumento di complessi depositati e peggiore funzionalit? renale. Contrariamente, topi con doppio knock out per IL6 e CD37 non hanno mostrato depositi di IgA glomerulari e sono stati protetti dall'insufficienza renale esacerbata dopo il trattamento con lipopolisaccaridi. Questo ha dimostrato che l?IL-6 media la patologia renale nei topi knockout per CD37, e che il CD37 pu? proteggere dalla nefropatia IgA mediante l'inibizione proprio della pathway dell'IL-6.
Tuttavia i sistemi e metodi attualmente noti, presentano il limite di non chiarire il meccanismo ed il ruolo di VTRNA2-1 nella pathway del IL-6, e di non consentire la modulazione di IL-6 nelle Nefropatie da IgA.
Scopo della presente invenzione ? fornire un metodo di rilevamento non invasivo di Nefropatia da IgA e l?uso di un composto nel trattamento tale da sfruttare e chiarire il ruolo di VTRNA2-1 nel bloccare la pathway dell?IL-6, ed aventi, pertanto, caratteristiche tali da superare i limiti degli attuali sistemi e metodi noti.
Il ruolo del VTRNA2-1, in base ai risultati sperimentali discussi nel seguito, ? quelli di bloccare la pathway dell?IL-6, in quanto a valle di PKR, di cui ? specifico inibitore, e che la sua down-regolazione consenta un aumento di IL-6, causando quindi l?accumulo di depositi di IgA e tutte le caratteristiche dell? IgAN.
Secondo la presente invenzione viene rivendicato l?uso di un composto nel trattamento della Nefropatia da IgA, come definito nella rivendicazione 1.
Secondo la presente invenzione viene realizzato inoltre un metodo di rilevamento non invasivo di Nefropatia da IgA, come definito dalla rivendicazione 3.
Per una migliore comprensione della presente invenzione viene ora descritta una forma di realizzazione preferita, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:
- le figure 1a-1b mostrano grafici relativi rispettivamente all?analisi di espressione genica eseguita tramite Real Time PCR in pazienti IgAN e controlli sani ed in pazienti trapiantati IgAN e soggetti trapiantati non affetti da IgAN, secondo l?invenzione;
- le figure 2a-2c mostrano i risultati sperimentali di esperimenti di ELISA condotti dal Richiedente ed in particolare mostrano un aumento statisticamente significativo di pPKR (Fig.2A), pCREB (Fig. 2B) e IL-6 (Fig.2C) nei pazienti affetti da IgAN, sia trapiantati sia con rene nativo, rispetto ai soggetti sani o ai trapiantati non IgAN, secondo l?invenzione;
- la figura 3 mostra un grafico di risultati sperimentali condotti dal Richiedente in cui il C16 somministrato ai PBMC dei pazienti IgAN induce una drastica diminuzione dei livelli di IL-6 alle concentrazioni di 0.5, 1, 2 e 5 ?M., con un effetto massimo alla concentrazione di 1 ?M in cui la diminuzione di IL-6 rispetto ai PBMC degli stessi pazienti senza somministrazione del farmaco era superiore all? 80%.
Il Richiedente ha effettuato prove sperimentali tramite Real Time PCR, tali da valutare i livelli di espressione genica di VTRNA-2 in cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di 8 pazienti affetti da IgAN rispetto a 4 soggetti sani. I risultati ottenuti dimostrano che l?espressione di VTRNA2-1 in soggetti IgAN ? fortemente ridotta rispetto ai sani.
Il Richiedente ha inoltre indagato l?espressione di VTRNA2-1 nei PBMC di 18 soggetti IgAN con trapianto di rene rispetto a 8 soggetti trapiantati per cause diverse dall?IgAN ed il confronto tra le due classi di soggetti ha mostrato una drastica riduzione di VTRNA2-1 nei soggetti trapiantati IgAN rispetto ai non-IgAN (Figura 1).
Per poter quindi valutare il coinvolgimento del signalling PKR-CREB che porta alla iperespressione di IL6 nei soggetti affetti da IgAN, sugli stessi soggetti sono stati eseguiti esperimenti di ELISA (saggi immunoenzimatici) in grado di valutare il livello di fosforilazione della proteina pPKR e della proteina pCREB ed infine un ELISA per valutare la secrezione di IL6 nel surnatante di colture cellulari dei PBMC dei soggetti in analisi. I risultati hanno mostrato un forte aumento, statisticamente significativo, di pPKR, pCREB ed anche di IL6 nei soggetti IgAN rispetto ai soggetti sani, confermando quindi il forte coinvolgimento di questa pathway nella patologia (Figura 2).
Diversi studi hanno mostrato che il microbiota e il metaboloma sono due fattori fortemente predisponenti per l?IgAN.
In un recente studio, Gesualdo et al. hanno confrontato il microbioma intestinale di pazienti con IgAN rispetto a soggetti sani, evidenziando la presenza di una disbiosi microbica nei soggetti affetti da IgAN, con un aumento del rapporto Firmicutes / Bacteroidetes, oltre ad un alto livello di Firmicutes. Questi soggetti sono inoltre caratterizzati da alte percentuali di alcuni generi / specie di Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Eubacteriaceae e Streptococcaeae. Di contro, i soggetti sani presentavano un livello pi? alto di ceppi di Clostridium, Enterococcus e Lactobacillus.
Studi seguenti hanno valutato come microbioma e viroma influenzino l?IgAN. Diversi lavori hanno mostrato che PKR ? attivato dall?RNA batterico e virale e che l'RNA derivato dai batteri si lega direttamente e attiva PKR . Inoltre ? stato visto che PKR ? prevalentemente attivata da RNA a doppio filamento, sebbene possa essere attivata anche da RNA a singolo filamento che presentino piccole porzioni con struttura secondaria.
Per quanto riguarda IgAN e virus, ? noto che questi ultimi siano coinvolti nella patologia ed in altre glomerulonefriti come nel caso del virus dell?epatite B, del virus respiratorio sincinziale umano, dell? HIV e del virus di Epstein-Barr (EBV).
PKR ha dunque tutte le caratteristiche per rappresentare un target terapeutico efficace per il trattamento della IgAN. In particolare, un farmaco inibitore di PKR ? l?Imoxina, nota anche come C16 o imidazolo, che ha mostrato vantaggiosi effetti terapeutici in vitro su colture cellulari e in vivo in modelli animali per numerose condizioni, quali il miglioramento dell?infiammazione, dello stress ossidativo, del diabete, della soppressione della proliferazione tumorale e angiogenesi nel carcinoma epatocellulare e nel controllo dell?ipertensione ma non ? stato mai considerato per l?IgA nefropatia perch? non era nota la down regolazione di VTRNA2-1 e la iperespressione della pathway PKR-CREB in pazienti IgAN.
La presente invenzione riguarda l?uso di imidazolo per il trattamendo dell?IgAN in quanto inibitore specifico di PKR. In particolare, la presente invenzione ? relativa all?uso imidazolo nelle concentrazioni da 0,5 ?M a 5 ?M nel trattamento di nefropatia da IgA.
Per dimostrare la sua funzione, il Richiedente ha somministrato il C16 ai PBMC dei pazienti IgAN e abbiamo misurato i livelli di IL-6 secreti. Il C16 ? stato aggiunto ad una concentrazione di 0.5, 1, 2 e 5 ?M. Abbiamo ottenuto una drastica diminuzione dei livelli di IL-6 a tutte le concentrazioni utilizzate, con un effetto massimo alla concentrazione di 1 ?M in cui la diminuzione di IL-6 rispetto ai PBMC degli stessi pazienti senza somministrazione del farmaco era superiore all? 80% (Figura 3).
Questo dimostra che il C16 , o imidazolo, pu? essere vantaggiosamente usato nel trattamento terapeutico dell? IgA nefropatia.
Inoltre, ad oggi l?IgAN pu? essere diagnosticata certamente solo mediante la biopsia renale, una procedura invasiva e perci? non facilmente utilizzabile come analisi di routine. Nei pazienti con microematuria o nei familiari dei pazienti non ? facile effettuarla perch? tale procedura ? spesso rifiutata. Perci? sono necessari nuovi marker biologici che possono migliorare le possibilit? diagnostiche per l?identificazione della patologia senza effettuare la biopsia renale.
La presente invenzione, ? inoltre relativa ad un metodo non invasivo di rilevamento di Nefropatia da IgA, basato su un semplice prelievo di sangue periferico del soggetto con sospetta diagnosi di IgAN. Il metodo si basa sulla contemporanea valutazione dei livelli di metilazione e di espressione genica di VTRNA 1-2 tramite Real Time PCR e la valutazione dei livelli di fosforilazione di pPKR e/o pCREB mediante saggio ELISA sui PMBC del soggetto in analisi. I livelli di espressione genica sono normalizzati sulla beta-actina o sul GAPDH, mentre i livelli di fosforilazione sono normalizzati rispetto alle proteine PKR totale o CREB totale.
Il metodo secondo l?invenzione ? in grado di discriminare soggetti affetti da IgAN rispetto a soggetti non affetti da questa patologia, e di supportare dunque il clinico nella decisione da intraprendere per giungere ad una diagnosi clinica certa.
In particolare, la fase di determinare in base ai livelli valutati se l?utente esaminato ? affetto da IgAN o no avviene considerando che utente, o un soggetto, NON TRAPIANTATO ? identificato come paziente IgAN quando valgono almeno due delle seguenti condizioni:
- il valore di espressione del VTRNA2-1 ? minore di 0.0014 o valore similare corrispondente al 25?percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di metilazione del VTRNA2-1 ? maggiore del 10% rispetto ai soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di fosforilazione di pPKR ? maggiore di 0.62 o valore similare corrispondente al 75? percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di fosforilazione di pCREB ? maggiore di 0.31 o valore similare corrispondente al 75?percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati.
Inoltre, la fase di determinare in base ai livelli valutati se l?utente esaminato ? affetto da IgAN o no avviene considerando che un soggetto TRAPIANTATO ? identificato come paziente IgAN se ? verificata almeno una delle seguenti condizioni:
- il valore di espressione del VTRNA2-1 ? minore di 0.001635 o valore similare corrispondente al 25? percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di metilazione del VTRNA2-1 sono maggiori del 10% rispetto ai soggetti sani/controllo non trapiantati
- il valore di fosforilazione di pPKR ? maggiore di 0.73 o valore similare corrispondente al 75? percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati.
- il valore di fosforilazione di pCREB ? maggiore di 0.37 o valore similare corrispondente al 75?percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati.
Come gi? riportato, la patogenesi della Nefropatia da IgA ? complessa e la patologia ? influenzata dall?interazione tra il background genetico e fattori ambientali e comportamentali, che potrebbero essere utili per lo sviluppo della nefrologia di precisione e la terapia personalizzata.
Pertanto, il metodo secondo l?invenzione consente di rilevare la IgAN senza esami invasivi.
Inoltre, l?uso del Imoxin nel trattamento dell?IgAN risulta nuovo ed efficace.
Risulta, infine, chiaro che al sistema e al metodo secondo l?invenzione qui descritti e illustrati possono essere apportate modifiche e varianti senza per questo uscire dall?ambito protettivo della presente invenzione, come definito nelle rivendicazioni allegate.
Claims (5)
1. Uso di un composto nel trattamento di nefropatia da IgA in cui detto composto ? un composto inibitore specifico di PKR.
2. Uso di un composto nel trattamento di nefropatia da IgA secondo la rivendicazione 1, in cui detto composto ? imidazolo nelle concentrazioni da 0,5 ?M a 5 ?M.
3. Metodo di rilevamento non invasivo di Nefropatia da IgA caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi:
- Prelevare un campione di sangue periferico da un utente con sospetta diagnosi di IgAN;
- valutare livelli di metilazione e di espressione genica di VTRNA1-2;
- valutare, contemporaneamente alla fase precedente, livelli di fosforilazione di pPKR e/o pCREB mediante saggio ELISA sui PMBC;
- determinare in base ai livelli valutati se l?utente esaminato ? affetto da IgAN o no.
4. Metodo di rilevamento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che la fase di determinare se l?utente esaminato ? affetto da IgAN o no, comprende identificare come utente affetto da IgAN un utente NON TRAPIANTATO quando valgono almeno due delle seguenti condizioni:
- il valore di espressione del VTRNA2-1 ? minore di 0.0014 o valore corrispondente al 25?percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di metilazione del VTRNA2-1 ? maggiore del 10% rispetto ai soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di fosforilazione di pPKR ? maggiore di 0.62 o valore corrispondente al 75? percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di fosforilazione di pCREB ? maggiore di 0.31 o valore corrispondente al 75?percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati.
5. Metodo di rilevamento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che la fase di determinare se l?utente esaminato ? affetto da IgAN o no, comprende identificare come utente affetto da IgAN un utente TRAPIANTATO quando ? verificata almeno una delle seguenti condizioni:
- il valore di espressione del VTRNA2-1 ? minore di 0.001635 o valore corrispondente al 25? percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati;
- il valore di metilazione del VTRNA2-1 ? maggiore del 10% rispetto ai soggetti sani/controllo non trapiantati
- il valore di fosforilazione di pPKR ? maggiore di 0.73 o valore corrispondente al 75? percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati.
- il valore di fosforilazione di pCREB ? maggiore di 0.37 o valore corrispondente al 75?percentile dei soggetti sani/controllo non trapiantati.
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| WO2010033626A1 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Institute For Oneworld Health | Compounds, compositions and methods comprising imidazole and triazole derivatives |
| WO2020021035A1 (en) * | 2018-07-26 | 2020-01-30 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Use of antibiotics for the treatment of immunoglobulin a nephropathy |
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