IT202000029498A1 - Nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall’occhio prive di materiale genetico per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta. - Google Patents
Nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall’occhio prive di materiale genetico per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta. Download PDFInfo
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Description
Nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta
La presente invenzione riguarda nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta. Pi? dettagliatamente la presente invenzione riguarda nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico, come tali o caricate con agrofarmaci, per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta, come ad esempio la foglia, detta malattia essendo causata da un microrganismo fitopatogeno che attacca detta parte aerea, come ad esempio un fungo, un batterio o un virus.
L?aumento della produttivit? agricola ? indispensabile per far fronte alla progressiva e costante crescita della popolazione mondiale. Il raggiungimento di questo obbiettivo ? per? ostacolato da fattori di natura abiotica (stress idrico, cambiamenti climatici, carenza di nutrienti) e biotica (microrganismi, insetti, piante infestanti, animali terricoli) che influenzano negativamente la resa agricola. In particolare, le malattie causate da funghi, virus e batteri, determinano una perdita rilevante della produzione agricola, che pu? essere di natura quantitativa, se si parla di una diminuzione della resa in campo, o qualitativa se si verifica una riduzione del contenuto in sostanze nutritive o della qualit? del prodotto, dovute ad alterazioni estetiche (es. pigmentazione) o a contaminazioni dell?alimento da parte di microrganismi e/o sostanze tossiche di natura microbica (es. micotossine).
In tutto il mondo, le colture agrarie sono quindi fortemente trattate con prodotti fitosanitari per il controllo delle malattie, con conseguente grave impatto economico e ambientale. Recentemente, molti gruppi di ricerca e aziende, anche a livello internazionale, hanno sviluppato strategie alternative per la lotta contro le malattie, che possono essere utilizzate sia come integrazione alle pratiche di controllo tradizionali sia come punto di partenza per lo sviluppo di nuove strategie di protezione delle piante in agricoltura. Infatti, le azioni di sviluppo nell'ambito di un approccio di agricoltura sostenibile includono il miglioramento della lotta integrata per ridurre l?uso intensivo di prodotti chimici, fitofarmaci di sintesi, al fine di garantire la sostenibilit? dei sistemi produttivi. La ricerca nell?ambito della patologia vegetale si ? quindi concentrata, negli ultimi anni, sullo sviluppo di prodotti alternativi ai pesticidi. A questo proposito l?European Union regulation (EEC), nella direttiva no 2092/91, elenca le sostanze che possono essere utilizzate per il trattamento delle piante; tra queste la pi? efficace risulta essere il rame, il quale ? per? soggetto a limitazioni d?uso (ECC no 889/2008), dato il suo potenziale accumulo nei suoli e il conseguente effetto a lungo termine sul microbioma del suolo (Dagostin et al., 2011). Prendendo in considerazione le direttive sopra riportate, molti Paesi hanno messo al bando diversi pesticidi, rendendo pi? complessa la gestione delle malattie delle piante e portando cos? allo sviluppo di strategie di lotta integrata. Un importante aspetto della difesa ecosostenibile ? il ?biocontrollo?, classicamente riferito all?utilizzo di organismi viventi nella lotta contro parassiti e patogeni ma successivamente esteso all?uso di biomolecole a basso impatto ambientale per il controllo delle malattie. Negli ultimi tempi, in questo settore si ? verificato un incremento del numero di pubblicazioni e un aumento del 230% del mercato globale (Naranjo et al., 2015). Di conseguenza, l?Unione Europea ha stabilito una politica d?iniziativa, sin dal 2014, per l?adozione di strategie di lotta integrata, fornendo cos? per gli anni a venire, una maggiore spinta al mercato dei prodotti di biocontrollo (Lefebvre et al., 2015).
L?impiego di molecole naturali nella lotta contro le malattie delle piante risente, tuttavia, della loro scarsa persistenza in campo o penetrazione nel tessuto vegetale. In questo contesto, le nanobiotecnologie, gi? ampiamente sfruttate nell?ambito medico e in alcune recenti applicazioni nel campo alimentare, rappresentano una vera chiave di innovazione per lo sviluppo di soluzioni alternative ai pesticidi per la protezione delle colture. Le nanotecnologie si basano sullo sviluppo di particelle di piccole dimensioni, definite nanoparticelle, caratterizzate da un diametro variabile da 1 a 100 nm. Negli ultimi anni le nanotecnologie sono state applicate in molteplici campi di ricerca, come la medicina, l?ingegneria dei materiali e l?elettronica ma, solo recentemente, si ? iniziato a valutare il loro potenziale in ambito agricolo (P?rez-de-Luque e Rubiales, 2009), dove possono essere applicate per sviluppare sistemi di rilascio (delivery systems) di sostanze come pesticidi, fertilizzanti o ormoni di crescita, aumentando la loro efficacia e rendendo il sistema di rilascio ?smart?, ovvero sistemi che consentono un rilascio controllato e mirato. A questo scopo, sono stati valutati nanopesticidi basati su polimeri sintetici o naturali, composti metallici o liposomi, che tendono a persistere nell?ambiente (Nuruzzaman et al., 2016).
I nanomateriali possono potenzialmente aumentare la biodisponibilit?, la diffusione e la durata di un composto chimico e di conseguenza potrebbero aumentarne l?efficacia e diminuire il costo di applicazione. Tuttavia, le nanoparticelle utilizzate in agricoltura di natura polimerica, metallica o lipidica, per quanto efficaci, tendono ad accumularsi nel suolo. Un?alternativa biodegradabile di nanoparticelle ? rappresentata dai virus vegetali che, inoltre, possiedono l?interessante caratteristica di essere particelle uniformi tra loro e naturalmente monodisperse (Chariou et al., 2019). L?applicazione verso la difesa delle colture dai patogeni ? potenzialmente molto interessante poich? i composti fitosanitari sono generalmente efficaci a concentrazioni molto basse ma richiedono allo stesso tempo applicazioni ripetute per essere efficaci (Chariou et al., 2020). L?utilizzo di nanoparticelle virali come ?carrier? di agro-farmaci convenzionali o nuove sostanze antimicrobiche naturali ha il potenziale di fornire un prodotto biodegradabile e di aumentare l?efficacia delle sostanze stesse.
E? noto che il CPMV (virus del mosaico del fagiolo dall?occhio) ? un virus appartenente al genere Comovirus e alla famiglia Comoviridae. Il CPMV infetta principalmente le Leguminose, in particolare il suo ospite naturale ? il fagiolo dall?occhio (Vigna unguiculata) da cui prende il nome. La possibilit? di essere modificato geneticamente e chimicamente, la resistenza alle alte temperature (fino a 60?C per 1 ora) e a diversi valori di pH (valori compresi tra 4-9) e la disponibilit? di protocolli di purificazione che garantiscono rese elevate (Montague et al., 2011), fanno del CPMV un candidato ideale come sistema di ?delivery?. Inoltre, grazie all?ingegneria genetica, vi ? la possibilit? di ottenere delle CPMV empty Virus-Like Particles (eVLPs), ovvero particelle capsidiche prive di materiale genetico e di conseguenza non infettive, stabili e strutturalmente identiche alle particelle virali del CPMV (Huynh et al., 2016). Il capside del CPMV presenta anche una straordinaria resistenza a condizioni chimico fisiche estreme come quelle dei fluidi gastro-intestinali (Berardi et al., 2018), allo stesso tempo ? innocuo per le cellule umane (Wang et al., 2019). L?incapsulamento, o alternativamente il caricamento, di molecole all?interno del capside del CPMV ? reso possibile grazie alla struttura del capside stesso, in quanto nella zona di giunzione delle proteine capsidiche minori (Small CP) si forma un poro di piccole dimensioni, ma sufficienti per permettere il passaggio di composti al suo interno. Il meccanismo prevede che le molecole riescano a diffondere passivamente all?interno del capside e a rimanere allo stesso tempo debolmente trattenute dalle forze ioniche che si instaurano. Tale processo di incapsulamento ? stato riportato in letteratura sia con il virus intero sia con le particelle virali prive di materiale genetico per veicolare fluorofori (prove di fattibilit?), molecole applicate all?ambito medico (di imaging o terapeutiche) o per veicolare nematocidi che agiscono a livello del suolo
In particolare, con l?obiettivo di produrre nanopesticidi biodegradabili, sono stati valutati nuovi nanopesticidi prodotti da virus vegetali, come il TMGMV (Tobacco Mild Green Mosaic Virus), il CPMV (Cowpea Mosaic Virus), il PhMV (Physalis Mosaic Virus) o il RCNMV (Red Clover Necrotic Mosaic Virus) per il trasporto e rilascio di nematocidi nel suolo (Cao et al., 2015; Chariou et al., 2017; Chariou et al., 2019). E? anche nota la domanda di brevetto WO2020154739 che concerne l?impiego di nanopesticidi prodotti da virus vegetali, come il TMGMV e CPMV, per il trasporto e il rilascio di agenti agrochimici nel suolo, in particolare in determinate profondit? del suolo. Gli agenti agrochimici possono quindi agire nel suolo contro microrganismi o organismi nocivi, come i nematodi, o contro le erbe infestanti oppure possono essere agenti fertilizzanti il suolo.
Tuttavia, nessuno studio ad oggi suggerisce o mostra la possibilit? di applicare le nanoparticelle virali CPMV (prive di materiale genetico) per trattare malattie causate da microrganismi fitopatogeni che colpiscono le parti aeree della pianta, o fillosfera, e che necessitano della diffusione del principio attivo al livello dell?apoplasto. Infatti, gli esperimenti di rilascio riportati in letteratura o nella domanda di brevetto WO2020154739, sono stati condotti a pH neutro (tra 7.0 e 7.8), ben differente dal pH subacido dell?apoplasto.
Alla luce di quanto sopra, appare evidente la necessit? di poter disporre di nuovi metodi di trattamento e di prevenzione delle malattie della fillosfera delle piante che superino gli svantaggi dei prodotti noti.
In questo contesto viene a inserirsi la soluzione secondo la presente invenzione, che si propone di fornire nuovi prodotto o metodo, che agisce a livello della fillosfera, per il trattamento e la prevenzione delle malattie delle piante.
Secondo la presente invenzione ? stato ora trovato che CPMV-eVLPs come tali o caricate con molecole naturali, di varie strutture, con attivit? antimicrobica o di inibizione della virulenza dei microrganismi, come ad esempio dei batteri, sono efficaci nel controllo di malattie delle piante causate da microorganismi che colpiscono a livello della fillosfera.
In particolare, l?invenzione mostra per la prima volta che i) molecole di natura diversa (ad esempio un antibiotico della famiglia degli amminoglicosidi, un colorante organico, stilbene, flavone, derivato della cumarina) possono essere incapsulate in modo efficace nelle CPMV-eVLPs, e ii) le CPMV-eVLPs sono applicabili come sistema nanocarrier per il rilascio di sostanze attive a livello dell?apoplasto, dove si trovano molti microorganismi fitopatogeni, che ? caratterizzato da un pH sub-acido. Inoltre, ? stato sorprendentemente trovato che le CPMV-eVLPs come tali, ossia non caricate con molecole attive, hanno effetto antifungino (pi? specificatamente di deregolazione della crescita fungina), contro i funghi che attaccano la fillosfera.
Le nanoparticelle secondo la presente invenzione possono essere vantaggiosamente applicate sulla foglia al fine di agire contro lo sviluppo di patogeni sia esternamente sia internamente alla foglia stessa, richiedendo in questo ultimo caso che il principio attivo venga rilasciato nell?apoplasto.
I risultati sperimentali riportati di seguito mostrano come le nanoparticelle di CPMV-eVLP possano veicolare e rilasciare composti chimici in condizioni che mimano le condizioni naturali, ovvero in un ambiente a pH sub-acido come riscontrato nell?apoplasto. Allo stesso tempo il processo di incapsulamento delle molecole all?interno delle nanoparticelle virali ? stato migliorato tramite alcuni semplici ed economici accorgimenti, quali il taglio della porzione C-terminale della sub-unit? minore, come descritto nella letteratura scientifica (Sainsbury et al., 2011). Le nanoparticelle secondo la presente invenzione, quindi rese pi? omogenee dal taglio enzimatico, rispetto alle nanoparticelle oggetto della domanda di brevetto WO2020154739, possono essere applicate a, o meglio caricate con, qualsiasi tipo di molecola rendendo le nanoparticelle CPMV-eVLP uno strumento molto versatile per diversi fini. Queste considerazioni aprono la strada per uno sviluppo applicativo di tali nanoparticelle in ambito agrario, con particolare riguardo allo sviluppo di strumenti specifici per i diversi patosistemi. Inoltre, l?elevata capacit? del capside del CPMV, e quindi delle nanoparticelle CPMV-eVLP, di resistere a condizioni chimico fisiche avverse rende la combinazione CPMV-agro-farmaco particolarmente interessante per l?applicazione in ambito agrario.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione l?uso di nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico appartenente a detto virus, come tali o caricate con uno o pi? agrofarmaci, per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta, come ad esempio la foglia, detta malattia essendo causata da un microrganismo fitopatogeno che attacca detta parte aerea. Per il trattamento di questo tipo di malattia ? richiesta una diffusione dell?agrofarmaco nell?apoplasto. Secondo la presente invenzione le particelle sono applicate direttamente sulla parte aerea della pianta, in particolare sulla foglia, dove avviene la penetrazione dell?agrofarmaco o della particella all?interno del tessuto fogliare. Pertanto, la presente invenzione non riguarda prodotti o agrofarmaci che sono somministrati al suolo per agire contro organismi del suolo, come nematodi, o contro microrganismi della rizosfera o ancora contro piante infestanti, n? per agire come fertilizzanti che possono essere assorbiti dalla pianta tramite le radici.
Secondo una forma di realizzazione dell?invenzione, le nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico sono anche prive della porzione C-terminale della sub-unit? minore della proteina capsidica del virus. Tale parte si identifica approssimativamente con la porzione compresa tra Leu189 e Ala213, o pi? specificamente dal residuo K191 a Ala213 e/o dal residuo R193 al residuo Ala213 e/o dal residuo R195 al residuo Ala 213 di detta sub-unit? (Sainsbury, 2011, https://www.rcsb.org/structure/5FMO Entity ID:2).
Secondo la presente invenzione, detto microrganismo pu? essere scelto tra un fungo, un oomicete, un batterio, un fitoplasma o un virus.
Secondo la presente invenzione, quando dette nanoparticelle sono impiegate come tali, detto microrganismo pu? essere un fungo, ossia la malattia pu? essere una malattia fungina. Pertanto, le nanoparticelle secondo la presente invenzione possono essere impiegate come tali contro malattie fungine della parte aerea della pianta, ad esempio contro Botrytis cinerea.
Secondo la presente invenzione, detti uno o pi? agrofarmaci possono essere molecole di origine naturale con attivit? antimicrobica o di inibizione della virulenza dei microrganismi. Ad esempio una molecola che inibisce la virulenza dei microrganismi fitopatogeni pu? essere una qualsiasi molecola in grado di bloccare il processo infettivo del microrganismo attraverso la compromissione della virulenza microbica e/o l?induzione di resistenza nelle piante. Queste molecole bloccano la crescita del microrganismo senza ucciderlo o agiscano sulla capacit? del microrganismo di infettare la pianta e sull?aggressivit? del microrganismo o inducono meccanismi di difesa attiva della pianta.
Secondo la presente invenzione, quindi, detti uno o pi? agrofarmaci possono essere scelti tra un fungistatico, un batteriostatico e/o un virustatico.
A titolo di esempio, detti uno o pi? agrofarmaci utilizzabili secondo la presente invenzione possono essere scelti tra inibitori della virulenza batterica come dicumarolo, luteolina, quercetinaantifungini come resveratrolo, e/o molecole ad azione antimicrobica ad ampio spettro come solfato di rame.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta, come ad esempio la foglia, causata da un microrganismo fitopatogeno che attacca detta parte aerea, detto metodo comprendendo o essendo consistente nel mettere in contatto detta parte aerea della pianta con nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico appartenente a detto virus, come tali o caricate con uno o pi? agrofarmaci.
Come menzionato sopra, secondo il metodo della presente invenzione detto microrganismo pu? essere scelto tra un fungo, un oomicete, un batterio, un fitoplasma o un virus.
Secondo il metodo della presente invenzione, quando dette nanoparticelle sono impiegate come tali, detto microrganismo pu? essere un fungo, ossia la malattia pu? essere una malattia fungina. Pertanto, il metodo secondo la presente invenzione pu? prevedere l?impiego delle nanoparticelle secondo la presente invenzione come tali contro malattie fungine della parte aerea della pianta, ad esempio contro Botrytis cinerea.
Secondo il metodo della presente invenzione detti uno o pi? agrofarmaci possono essere molecole di origine naturale con attivit? antimicrobica o di inibizione della virulenza dei microrganismi, come indicato sopra. Ad esempio detti uno o pi? agrofarmaci possono essere scelti tra un fungistatico, un batteriostatico e/o un virustatico.
Secondo alcune forme di realizzazione, detti uno o pi? agrofarmaci possono essere scelti tra dicumarolo, luteolina, resveratrolo, quercetina e/o solfato di rame.
La presente invenzione concerne inoltre nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico appartenente a detto virus caricate con uno o pi? prodotti fitosanitari scelti tra dicumarolo, luteolina, quercetina, resveratrolo e/o solfato di rame o composizione agraria comprendente dette nanoparticelle. Come menzionato sopra le nanoparticelle possono essere prive della porzione C-terminale della sub-unit? minore della proteina capsidica del virus, ad esempio detta porzione pu? consistere nella sequenza amminoacidica dal residuo K191 al residuo Ala213 e/o dal residuo R193 al residuo Ala213 e/o dal residuo R195 al residuo Ala 213 di detta sub-unit?.
La presente invenzione verr? ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, con particolare riferimento ad alcuni esempi illustrativi e alle figure dei disegni allegati, in cui:
- Figura 1 mostra che la distinzione tra le forme di CPMV tramite elettroforesi su gel di agarosio permette di visualizzare le particelle che presentano la parte C-terminale della proteina capsidica minore come una banda che migra pi? lentamente rispetto a quella delle particelle in cui il C-term ? stato rimosso (sinistra). L?analisi di integrit? delle particelle viene eseguita attraverso lo scattering dinamico della luce (destra) e mostra come le particelle stesse appaiano con un diametro medio di circa 30 nm analogamente alla dimensione del capside del CPMV.
- Figura 2 mostra che l?elettroforesi su gel di agarosio permette in alcuni casi di visualizzare il ritardo di migrazione dovuto alla presenza del cargo all?interno del CPMV. DAPI, 4',6-diamidin-2-fenilindolo, surn., surnatante.
- Figura 3 mostra l?interferenza nella lettura dell?assorbanza a 420nm in presenza di resveratrolo puro (a t0 e t24) o di eCPMV-resveratrolo (a t24).
- Figura 4 mostra che il rilascio della kanamicina dal CPMV viene visualizzato come inibizione della crescita batterica. Nel pannello in alto ? mostrato il risultato dell?esperimento eseguito in un terreno ottimale (KB) e si pu? apprezzare come il rilascio dell?antibiotico dal CPMV avvenga fin dalle prime ore. Nel pannello in basso invece, il grafico riporta l?inibizione della crescita batterica nel terreno che riproduce le condizioni dell?apoplasto (HIM). Anche in questo caso si osserva una riduzione della crescita batterica in presenza del CPMV caricato con la kanamicina, che indica il rilascio della stessa nel mezzo di coltura. eCPMV, nanoparticella non caricata, eCPMV-Kan, nanoparticella caricata con kanamicina, 1/10, nanoparticelle utilizzate ad una concentrazione 1/10
- Figura 5 mostra l?alterazione della crescita di Botrytis cinerea in vitro in presenza di nanoparticelle CPMV-eVLP (non caricate)
ESEMPIO 1: Preparazione delle nanoparticelle secondo la presente invenzione, caricamento delle stesse con principi attivi e studio del rilascio dei principi attivi all?apoplasto
Ai fini dell?articolo 170 bis (4) CPI, si dichiara che l?impiego dell?impianto in cui sono stati condotti gli esperimenti con microrganismi geneticamente modificati ? stato autorizzato dal Ministero della Salute, ai sensi dell?art.9 del D.Lgs 12 Aprile 2001, n. 206 - Attuazione della Direttiva 9/81/CE del Consiglio che modifica la direttiva 90/219/CEE concernente l?impiego confinato di microrganismi geneticamente modificati
MATERIALE E METODI
1. Produzione e purificazione delle particelle 1.1 Trasformazione transiente Nicotiana benthamiana
I due ceppi di Agrobacterium tumefaciens LBA4404 trasformati rispettivamente con il vettore pEAQ-HT-24K e con il vettore pEAQ-HT-VP60(Peyret, 2013) sono stati cresciuti in 4 mL di YEB (Yeast Extract Beef) contenente rifampicina 50 ?g/mL, streptomicina 300 ?g/mL e kanamicina 50 ?g/mL, per 24 ore a 28 ?C in agitazione. 200 ?L di ogni coltura batterica e 50 mL di terreno fresco (LB) sono stati trasferiti in beute precedentemente autoclavate, e sono stati cresciuti per 24 ore a 28?C in agitazione. Il giorno successivo le colture batteriche sono state trasferite in tubi da centrifuga da 50 mL e sottoposte a centrifugazione a 4000 g per 20 minuti a temperatura ambiente. Il surnatante ? stato scartato e il pellet ? stato risospeso nel MMA buffer (MgCl2 sterile 10 mM, MES 10 mM, Acetosiringone 100 ?M) per ottenere un OD600 nm di 0,4 per ogni coltura. Dopo una incubazione di 2 ore, uguali volumi delle due colture batteriche sono stati mixati e utilizzati per infiltrare, con una siringa priva di ago, 24 piante di Nicotiana benthamiana (Italia) di 4-5 settimane (4 foglie superiori espanse per pianta) cresciute in condizioni controllate (24?C costanti, 10 h di luce /14 h di buio). Le foglie infiltrate sono state campionate in azoto liquido 6 giorni dopo l?infezione (dpi).
1.2 Estrazione delle proteine
Le foglie campionate sono state macinate in azoto liquido fino ad ottenere una polvere sottile. In una provetta sono stati trasferiti 100 mg del campione, a cui sono stati aggiunti 3 volumi del tampone sodio fosfato 0,1 M pH 7.0. Il campione ? stato miscelato per 1 minuto con il vortex e sottoposto a centrifugazione a 10.000 x g a 4?C per 30 minuti. Gli estratti proteici cos? ottenuti sono stati analizzati tramite SDS-PAGE e successiva colorazione con blu di Coomassie o analisi tramite western blot. I campioni in eccesso sono stati conservati a -80?C.
1.3 Purificazione delle particelle eVLPs-CPMV Almeno 30 g di foglie infiltrate sono state omogeneizzate in un becker, tenuto in ghiaccio, con 3 volumi di buffer sodio fosfato 0,1 M pH 7.0 addizionato del 2% w/v di polivinilpolipirrolidone e una pastiglia di inibitore di proteasi EDTA-free (Roche). L?estratto ? stato filtrato tramite 3 strati di membrana Miracloth (Merck Millipore) e centrifugato a 4?C per 20 minuti a 13.000 g (rotore JA-14). Al surnatante ? stato aggiunto PEG 6000 alla concentrazione del 4% e sodio cloruo (NaCl) alla concentrazione di 0,2 M. Il supernatante ? stato quindi messo in agitazione a 4?C per tutta la notte. Il giorno seguente, tramite una centrifugazione a 13000 g per 20 minuti a 4?C ? stato possibile recuperare quanto precipitato assieme al PEG. Il pellet ? stato quindi risospeso in un volume, pari a 0,5 ml/g di tessuto fresco, di buffer sodio fosfato 0,01 M a pH 7.0 per almeno un?ora a 4?C. Il pellet risospeso ? stato sottoposto a una centrifugazione a 27.000 g per 20 minuti a 4?C e, successivamente il surnatante ? stato sottoposto ad una ultracentrifugazione a 118.700 g per 2 ore e 30 minuti a 4?C. Il pellet ottenuto ? stato infine risospeso in sodio fosfato 0,01 M pH 7.0 per tutta la notte. Il giorno seguente tramite una centrifugazione a 10.000 g per 15 minuti a 4?C sono stati rimossi i contaminanti vegetali rimanenti. Il surnatante ? stato infine sottoposto a cromatografia a scambio anionico tramite la resina DEAE Sephadex A-50 (GE Healthcare) con un rapporto campione-resina di 4:1. ? stato raccolto il flow-through e la concentrazione di particelle purificate ? stata misurata attraverso lo strumento NanoDrop One spectophotometer (Thermo Scientific) misurando l?A280 e A260 nm.
2. Analisi delle particelle
2.1. Visualizzazione delle nanoparticelle su gel di agarosio
Per la visualizzazione delle forme del CPMV, 10 ?g di particelle sono stati caricati in un gel di agarosio allo 0,7% (p/v). La separazione ? stata eseguita mediante un?elettroforesi a 70 V per 90 minuti. Le particelle sono state poi visualizzate tramite la soluzione di colorazione (Coomassie G-250 0,007%) e decolorate in acido acetico al 10%.
2.2 Dynamic Light Scattering (DLS)
L?analisi al Dynamic light scattering (DLS) ? stata effettuata utilizzando lo strumento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Le particelle di CPMV (0,5 mg/mL) sono state lasciate a temperatura ambiente 5 minuti prima dell?analisi. Le misure sono state fatte ogni 10 secondi a 25?C per un totale di 5 misure.
3. Taglio enzimatico delle nanoparticelle
La rimozione della porzione terminale della subunit? piccola della proteina capsidica ? avvenuta tramite un taglio enzimatico mediato dalla chimotripsina (EC 3.4.21.1) eseguito a temperatura ambiente in buffer ammonio bicarbonato 50 mM pH 8.0 per tutta la notte con un rapporto CPMV:enzima di 1:50.
4. Caricamento delle nanoparticelle eVLP
Il caricamento delle particelle avviene ponendo in buffer sodio fosfato (0,1 M, pH 7.8) il CPMV e la molecola da caricare con un rapporto molare CPMV:molecola di 1:10000 ove possibile, altrimenti 1:5000. La reazione ? protratta per tutta la notte a temperatura ambiente in leggera agitazione.
5. Curve di crescita batterica
Pseudomonas syringae pv. actinidiae CRAFRU 10.22, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 sono stati cresciuti in 4 mL di terreno King?s B (KB; glicerolo 10 mL, peptone 20 g/L, MgSO4 0,725 g/L, K2HPO4 1,5 g/L pH 7.2) (Pseudomonas) contenenti rifampicina 50 ?g/mL (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000) per 24 ore a 28?C in agitazione. Il pre-inoculo ? stato lavato con terreno KB o terreno HIM (hrp-inducing medium, Rico and Preston, 2008) e per ogni ceppo l?OD600 ? stata portata al valore di 0,01. Le cellule batteriche nei diversi terreni sono state inoculate (180 ?L) in micro-piastra da 96 pozzetti (Sarsted 96 Flat Bottom Transparent Polystyrene) e sono stati aggiunti 20 ?L di nanoparticelle caricate o vuote (controllo negativo), o soluzione di kanamicina (50 ?g/mL finali, controllo positivo). La crescita batterica ? stata monitorata per 24 ore seguendo l?OD600 nm con Tecan Infine 200 Pro.
RISULTATI
1. Taglio enzimatico delle nanoparticelle e caricamento con molecole di interesse
Il caricamento del CPMV ? stato realizzato seguendo le indicazioni riportate in letteratura (Yildiz, 2013) e adattato secondo le caratteristiche delle molecole selezionate. La dimostrazione di fattibilit? ? stata eseguita con un antibiotico, nella fattispecie la kanamicina, poich? il rilevamento della sua attivit? ? facile monitorando la crescita delle cellule batteriche trattate. Le particelle sono state caricate con kanamicina per 16 ore a temperatura ambiente in tampone sodio fosfato (0,1 M, pH 7.8).
Tuttavia, il caricamento non sempre ? stato riproducibile, questo ? con tutta probabilit? dovuto alla presenza di una corta sequenza amminoacidica presente nella parte terminale della proteina capsidica minore. Pare infatti, che tale porzione ?regoli? l?accesso di molecole all?interno del CPMV; per ovviare a questo problema, ? possibile rimuovere tale porzione tramite l?utilizzo di un enzima proteolitico (Sainsbury et al. 2010). Questa reazione enzimatica non altera la struttura del capside, che rimane quindi integro, ed ? possibile rilevarlo tramite elettroforesi sul gel nativo di agarosio e tramite la tecnica spettroscopica dello scattering dinamico della luce (Figura 1).
Rendere la superficie interna del CPMV pi? accessibile alle molecole rende l?incapsulamento pi? riproducibile e permette ulteriormente, di rendere uniformi i capsidi estratti durante differenti processi di purificazione, e per estensione l?intero processo dalla pianta alla particella caricata.
Le nanoparticelle tagliate sono state poi caricate con diverse molecole, nella fattispecie kanamicina e DAPI, utilizzate per la dimostrazione di fattibilit? dell?applicazione, nonch? dicumarolo e luteolina, molecole di interesse applicativo in quanto inibitori della virulenza batterica (dimostrata per Pseudomonas syringae pv. actinidiae, brevetto nr. 102017000119674 del 11/02/2020) e resveratrolo, con comprovata attivit? antifungina L?avvenuto caricamento delle varie molecole ? stato quindi controllato mediante gel di agarosio (Figura 2).
La presenza di uno shift di migrazione indica una migrazione pi? lenta delle particelle caricate con kanamicina, DAPI e dicumarolo (pannello sinistra), dimostrando quindi il caricamento con le molecole di interesse. Tale ritardo di migrazione non ? altrettanto evidente per le altre molecole (resveratrolo e luteolina), probabilmente a causa della loro diversa natura chimica, ma risulta comunque significativa. Questo risultato dimostra la possibilit? di caricare molecole di varia natura, in particolare metaboliti secondari di piante (dicumarolo, luteolina, resveratrolo), ampiamente valutate per la loro attivit? antimicrobica e possibile applicazione nell?ambito agrario per il controllo sostenibile delle malattie delle piante.
2. Valutazione del rilascio delle molecole di interesse
Per valutare il rilascio del resveratrolo dalle nanoparticelle e la sua efficacia sulla crescita fungina, come riportato in letteratura (Vestergaard and Hanne, 2019), le particelle CPMV-eVLP-resveratrol sono state utilizzate per trattare conidi di Botrytis cinerea in vitro. La germinazione dei conidi e conseguente crescita del micelio sono state valutate dopo 24h di incubazione, misurando l?assorbanza a 420nm. Le particelle non caricate sono state utilizzate come controllo negativo mentre per il controllo positivo, i conidi fungini sono stati trattati con resveratrolo puro.
Purtroppo, il metodo non ? risultato idoneo a tale scopo in quanto, gi? al tempo 0, i pozzetti contenenti il resveratrolo puro mostravano un?assorbanza pi? elevata rispetto agli altri pozzetti trattati con particelle caricate e non oppure non trattati, dimostrando quindi un?interferenza con la tecnica utilizzata. Tuttavia, ? stato osservato come dopo 24 ore di trattamento, i pozzetti trattati con le CPMV-eVLP-resveratrolo mostravano a loro volta un livello di assorbanza paragonabile al resveratrolo puro, dimostrando cos? il rilascio del metabolita secondario dalle particelle a pH sub-acido (pH 6 in questo esperimento).
La kanamicina invece, utilizzata per la dimostrazione di fattibilit? dell?approccio, uccide i ceppi batterici presi in esame, pertanto il rilascio dello stesso dal capside pu? essere stimato tramite la valutazione dell?inibizione della crescita batterica in condizioni controllate. Di rilievo in questo contesto, ? la capacit? di rilascio di molecole ad un pH diverso da quello neutro, utilizzato finora negli esperimenti riportati in letteratura. In particolare, l?applicazione delle CPMV-eVLP caricate per la protezione delle piante prevede che le particelle possano raggiungere l?apoplasto delle cellule vegetali per entrare a contatto con i microorganismi patogeni e quindi rilasciare le sostanze caricate in questo ambiente, caratterizzato da un pH sub-acido (circa 5.5). Pertanto, al fine di valutare il rilascio di molecole in condizioni naturali, la capacit? di inibizione della crescita batterica ? stata testata anche in un terreno di coltura che riproduce le condizioni dell?apoplasto (terreno HIM) (Figura 4). L?esperimento controllo ? stato eseguito in terreno KB che presenta un pH ottimale per il rilascio delle molecole (pH 7.2).
Come atteso, a pH neutro si osserva una completa inibizione della crescita dei batteri, paragonabile al controllo positivo (i.e. kanamicina pura), dimostrando quindi il rilascio ottimale delle sostanze in queste condizioni. Inoltre, dalle prime prove di fattibilit? emerge la capacit? di rilascio delle molecole anche a pH sub-acido con un?inibizione completa della crescita batterica in HIM con le particelle caricate con Kan. Allo stesso tempo, si evidenzia un rilascio pi? lento rispetto alle condizioni di pH neutro, che pu? essere spiegato con la variazione della dimensione del capside virale rispetto alle forze chimico fisiche in cui si trova. Infatti, ? noto che i capsidi virali possano rigonfiarsi o restringersi come conseguenza delle forze ioniche a cui rispondono e quindi del pH in cui si trovano.
ESEMPIO 2: Studio dell?efficacia antifungina delle nanoparticelle secondo la presente invenzione impiegate come tali
MATERIALE E METODI
1. Produzione e purificazione delle particelle Le particelle secondo la presente invenzione sono state preparate con la metodica descritta nell?esempio 1.
2. Monitoraggio della crescita fungina in vitro Da una piastra recentemente sporulata di Botrytis cinerea sono stati prelevati i conidi in acqua MilliQ a cui ? stato aggiunto Tween-20 alla concentrazione finale di 0,05%. I conidi sono stati contati per mezzo di una camera di conta FastRead102? (Biosigma) e diluiti alla concentrazione di 1x10<6 >conidi/ml nel mezzo di coltura liquido PDB (Potato Dextrose Broth). Centoottanta ?l della sospensione sono stati aliquotati in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 15 ?g di CPMV-eVLP o come controllo acqua MilliQ e sodio fosfato 10 mM a pH 7.0 utilizzato per risospendere le nanoparticelle. Le piastre sono state fotografate dopo una settimana dall?inoculazione dei conidi.
RISULTATI
Alterazione della crescita di Botrytis cinerea in vitro
In presenza di sodio fosfato (controllo negativo), si osserva una crescita normale del micelio di Botrytis cinerea con lo sviluppo di una muffa grigia al centro, dove sono stati inoculati i conidi, e una crescita discontinua verso le pareti del pozzetto (Figura 5). L?aggiunta di nanoparticelle CPMV-eVLPs, invece, modifica significativamente la crescita del fungo che risulta pi? omogenea, con la formazione di un tappeto continuo che ricopre il pozzetto, perdendo l?aspetto atteso di muffa grigia. Questo risultato suggerisce una deregolazione dei meccanismi che governano la formazione e lo sviluppo delle strutture di crescita del fungo, elementi fondamentali per il suo processo infettivo in planta.
Claims (14)
1) Uso di nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico, come tali o caricate con uno o pi? agrofarmaci, per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta, come ad esempio la foglia, detta malattia essendo causata da un microrganismo che attacca detta parte aerea.
2) Uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette nanoparticelle sono prive della porzione C-terminale della sub-unit? minore della proteina capsidica del virus, ad esempio detta porzione consistendo nella sequenza amminoacidica dal residuo K191 al residuo Ala213 e/o dal residuo R193 al residuo Ala213 e/o dal residuo R195 al residuo Ala 213 di detta sub-unit?.
3) Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui detto microrganismo ? scelto tra un fungo, un oomicete, un batterio, un fitoplasma, un virus.
4) Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui quando dette nanoparticelle sono impiegate come tali, detto microrganismo ? un fungo.
5) Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detti uno o pi? agrofarmaci sono molecole di origine naturale con attivit? antimicrobica, ad esempio antibatterica, antifungina o antivirale, o di inibizione della virulenza dei microrganismi.
6) Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detti uno o pi? agrofarmaci sono scelti tra un fungistatico, un batteriostatico e/o un virustatico.
7) Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui detti uno o pi? agrofarmaci sono scelti tra dicumarolo, luteolina, quercetina, resveratrolo, e/o solfato di rame.
8) Metodo per il trattamento di una malattia della parte aerea di una pianta, come ad esempio la foglia, causata da un microrganismo che attacca detta parte aerea, detto metodo comprendendo o essendo consistente nel mettere in contatto detta parte aerea della pianta con nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico, come tali o caricate con uno o pi? agrofarmaci.
9) Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui detto microrganismo ? scelto tra un fungo, un oomicete, un batterio, un fitoplasma, un virus.
10) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8-9, in cui quando dette nanoparticelle sono impiegate come tali, detto microrganismo ? un fungo.
11) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8-10, in cui detti uno o pi? agrofarmaci sono molecole di origine naturale con attivit? antimicrobica, ad esempio antibatterica, antifungina o antivirale, o di inibizione della virulenza dei microrganismi.
12) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8-11, in cui detti uno o pi? agrofarmaci sono scelti tra un fungistatico, un batteriostatico e/o un virustatico.
13) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8-12, in cui detti uno o pi? agrofarmaci sono scelti tra dicumarolo, luteolina, quercetina, resveratrolo, e/o solfato di rame.
14) Nanoparticelle capsidiche di virus del mosaico del fagiolo dall?occhio prive di materiale genetico caricate con uno o pi? agenti fitosanitari scelti tra dicumarolo, luteolina, quercetina, resveratrolo, e/o solfato di rame, o composizione agraria comprendente dette nanoparticelle.
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