IT202000028628A1 - Metodo per prevedere la formazione di metastasi in pazienti tumorali - Google Patents

Metodo per prevedere la formazione di metastasi in pazienti tumorali Download PDF

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IT202000028628A1
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Veronica Ferrucci
Massimo Zollo
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Ceinge Biotecnologie Avanzate S C A R L
Massimo Zollo
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Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
?METODO PER PREVEDERE LA FORMAZIONE DI METASTASI IN PAZIENTI TUMORALI?
La presente invenzione riguarda un metodo per prevedere la comparsa di metastasi in pazienti affetti da carcinoma mammario triplo negativo (TNBC). Il metodo dell'invenzione ? eseguito in vitro su un campione di tessuto di carcinoma. Oggetto dell'invenzione ? inoltre un kit contenente reagenti per effettuare l'analisi predittiva dello sviluppo di metastasi in pazienti TNBC.
INTRODUZIONE
Il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) rappresenta il 20% dei carcinomi mammari (BC) [1]. Le cellule di TNBC non esprimono il recettore degli estrogeni (ER), il recettore del progesterone (PgR) ed il recettore di tipo 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) [2].
Il TNBC ? il sottotipo pi? aggressivo di BC a causa delle sue caratteristiche clinico-patologiche aggressive, tra cui la giovane et? all'esordio, le grandi dimensioni del tumore [2] e la maggiore propensione a sviluppare metastasi viscerali a siti distanti (es. polmone) [3]. Tra i pazienti con TNBC metastatico, il 49,3% sviluppa metastasi polmonari [4]. A causa dell'assenza di bersagli molecolari riconosciuti per la terapia, i pazienti affetti da TNBC con metastasi polmonari hanno prognosi peggiore rispetto a quelli diagnosticati con altri sottotipi di BC metastatici [4, 5].
Per le sue caratteristiche molecolari, il TNBC pu? essere considerato uno dei carcinomi pi? complessi nell'uomo. L'applicazione delle tecnologie ?omiche" ? importante per monitorare l'evoluzione genomica del TNBC, che ? caratterizzato principalmente da mutazioni somatiche nei geni TP53, PIK3CA e PTEN [6]. Sono state descritte sei distinti gruppi molecolari per il TNBC: due sottogruppi basali (tipo basale 1 [BL1], 2 [BL2]), due sottogruppi mesenchimali (mesenchimale [M], staminale mesenchimale [MSL]), un sottogruppo luminale del recettore degli androgeni (LAR) ed un sottogruppo immunomodulatorio (IM). Quest?ultimo sottogruppo ? suddiviso in due sottotipi (MSL e IM) che si distinguono in base alla presenza di cellule stromali associate al tumore o di linfociti infiltranti il tumore (TIL), rispettivamente, nel microambiente tumorale (TME) [7, 8].
Le cellule immunitarie infiltranti il TME hanno una duplice funzione nello sviluppo del tumore e nella progressione metastatica. Nelle prime fasi della tumorigenesi, le cellule immunitarie identificano ed eliminano le cellule tumorali (che esprimono antigeni tumorali specifici) attraverso un meccanismo noto come "sorveglianza immunitaria del tumore". Successivamente, in seguito a processi di evoluzione clonale, si selezionano le varianti tumorali con ridotta immunogenicit? che riescono quindi a sfuggire alla rilevazione (e successiva eliminazione) da parte delle cellule immunitarie [9].
La maggiore instabilit? genomica e il maggiore carico mutazionale del TNBC determinano una maggiore propensione delle cellule tumorali di TNBC a generare neo-antigeni [9, 10], generando cos? nuovi cloni tumorali che vengono selezionati all'interno del TME e che influenzano notevolmente la risposta alla chemioterapia ed il rischio di recidiva nei pazienti affetti da TNBC [11].
Recentemente, nuovi sottotipi distinti di TNBC sono stati definiti in base ai tipi di cellule immunitarie infiltranti all'interno del TME: i macrofagi associati al tumore (TAMs) pro-tumorali polarizzati con fenotipo M2 (M2-TAMs) e le cellule T regolatorie immunosoppressive (Tregs) [12]. I sottotipi di TNBC con prognosi pi? sfavorevole sono caratterizzati da livelli elevati di M2-TAMs (CD163+) e Tregs (FOXP3+) ed un TME caratterizzato da pochi TILs e da elevati livelli di espressione del ligando di morte programmato immunosoppressore 1 (PD-L1) e del marker monocarbossilato glicolitico del trasportatore 4 (MCT4) [12]. Studi clinici indicano che i TAMs-M2 infiltranti il TME possono essere considerati indicatori di prognosi sfavorevole nei pazienti con TNBC poich? sono correlati ad un rischio pi? elevato di sviluppare metastasi [13, 14, 15].
La comunicazione tra le cellule tumorali e quelle immunitarie nel TME ? principalmente mediata dalle citochine solubili. Tra queste, il fattore di crescita trasformante-? (TGF-?, prodotto sia dalle cellule tumorali che da quelle immunitarie) pu? essere considerato il regolatore principale dell?azione immunosoppressiva poich? modula i processi di polarizzazione delle cellule del sistema immunitario da un fenotipo anti-tumorale ad un fenotipo pro-tumorale, e di conseguenza promuove la progressione tumorale e metastatica in diversi tipi di tumori, incluso il TNBC [16].
Anche le vescicole extracellulari (EVs, inclusi gli esosomi) secrete nel TME dalle cellule tumorali possono modulare il reclutamento delle cellule immunitarie e la loro immuno-modulazione [17]. Le EVs hanno un ruolo cruciale nel promuovere la formazione della nicchia pre-metastatica organo-tropica in diversi tipi di tumori, incluso il TNBC [18, 19].
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE
Si ? ora trovato che il gene Prune-1 ? iper-espresso nei pazienti affetti da TNBC ed ? correlato positivamente alle metastasi a distanza ed alla presenza di M2-TAMs infiltranti il TME (tumor microenvironment).
Si ? osservato inoltre che la iper-espressione di Prune-1 (insieme a quella di Wnt1) nella ghiandola mammaria di un modello murino geneticamente modificato (GEMM) di TNBC metastatico (Mouse mammary tumor virus-[MMTV]-Prune-1/ Wnt1) ? correlata (i) all?iper-espressione dei geni del fenotipo M2 nei macrofagi (IL1R1 e COL4A1) e (ii) alla presenza di varianti genetiche deleterie in geni coinvolti nei processi di attivazione della risposta immunitaria innata ed adesione cellulare. Alcune varianti genetiche identificate nelle cellule tumorali ottenute dal modello GEMM iper-esprimente Prune-1 (nei geni CD244 e PDE9A), sono state anche identificate in campioni umani di TNBC e correlate a prognosi peggiore in termini di ridotta sopravvivenza complessiva.
L'invenzione rende pertanto disponibile un metodo in vitro per prevedere lo sviluppo di metastasi a distanza in un paziente affetto da carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) attraverso la determinazione dei livelli di espressione dei geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 e la determinazione della presenza di mutazioni nei geni CD244 e PDE9A. Le metastasi possono interessare diversi organi o tessuti distanti dal sito di localizzazione del tumore primario, in particolare i polmoni e/o il cervello.
Preferibilmente, il metodo dell'invenzione comprende i seguenti passaggi:
(a) determinazione del livello di espressione dei geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 in un campione bioptico di TNBC del paziente in esame;
e
(b) determinazione della presenza di mutazioni nei geni CD244 e PDE9A in un campione bioptico di TNBC del paziente in esame;
dove un'aumentata espressione di almeno due, preferibilmente di tutti e tre i geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 rispetto ai valori di espressione rilevati in tessuto non tumorale di ghiandola mammaria, e la concomitante presenza di mutazioni in almeno uno, preferibilmente in entrambi i geni CD244 e/o PDE9A, indicano un'elevata probabilit? di sviluppare metastasi a distanza.
Secondo una realizzazione preferita, il livello di espressione dei geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 in un campione bioptico di TNBC ? determinato con la tecnica Real-Time PCR con sonde TaqMan, attraverso i seguenti passaggi:
(1) estrazione di RNA dal campione bioptico di TNBC;
(2) retrotrascrizione di cDNA
(3) amplificazione del cDNA mediante Real-Time PCR con sonde TaqMan.
In una modalit? preferita di realizzazione dell'invenzione, la reazione di amplificazione dei geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 ? condotta come segue:
(a) amplificazione del cDNA di PRUNE1 con la coppia di primer SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 e la sonda SEQ ID NO:3;
(b) amplificazione del cDNA di COL4A1 con la coppia di primer SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 e la sonda SEQ ID NO:6;
(c) amplificazione del cDNA di IL-1R1 con la coppia di primer SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8 e la sonda SEQ ID NO:9.
Per determinare i livelli di espressione, viene valutata l'amplificazione differenziale tra i geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 ed un gene housekeeper di riferimento, misurando la variazione del parametro "cycle threshold" o Ct (?Ct). Preferibilmente, il gene housekeeper di riferimento ? il gene della beta actina, che viene amplificato insieme ai geni target utilizzando la coppia di primer SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:11 e la sonda SEQ ID NO:12.
Le condizioni ottimali di amplificazione dei tre geni target e del gene housekeeper prevedono le seguenti fasi, da eseguire in termociclatore: (a) 95? per 10 min, seguito da (b) 95? per 15 sec, seguito da (c) 60?C per 60 sec, dove le fasi (b) e (c) sono ripetute per un totale di 40 cicli.
Per determinare l'aumento di espressione di un gene target nel campione bioptico del paziente in esame, si determinano i valori di espressione differenziale del gene target e della beta actina (?Ct) nel campione bioptico. I valori ?Ct cos? ottenuti vengono confrontati con quelli ottenuti da campioni di tessuto estratto da ghiandola mammaria umana sana (non tumorale) in modo da ottenere il valore "Log2", corrispondente alla differenza di ?Ct nel campione biotpico rispetto al campione di ghiandola mammaria umana sana, dove "Log2" ? definito convenzionalmente dalla relazione Log2 = -? ?Ct. Il valore Log 2 cos? determinato viene confrontato con valori Log2 standard ottenuti dall'analisi di datasets pubblici contenenti dati di espressione genica in campioni umani di carcinoma mammario.
Operando in questo modo, cio? attraverso l?analisi dai datasets pubblici di carcinoma mammario, sono stati determinati i valori soglia del parametro Log2 che, confrontati con i valori Log2 determinati nel campione bioptico in esame, consentono di stabilire l'aumento di espressione dei geni target. In particolare si ? osservato che:
- un valore di Log2 > 8,03, preferibilmente > 8,55 e ancora pi? preferibilmente >10,12 indica un'aumentata espressione di PRUNE1;
- un valore Log2 > 8,42, preferibilmente >10,195 e ancora pi? preferibilmente >11,8 indica un'aumentata espressione di COL4A1;
- un valore Log2 > 6,41, preferibilmente >9,43 e ancora pi? preferibilmente >10,97 indica un'aumentata espressione di IL1R1.
Pertanto, se sono soddisfatte le suddette condizioni, si ha un aumento dell'espressione dei geni target, che, combinato con la presenza di una o pi? mutazioni nei geni CD244 e PDE9A, ? indicativo di aumentata probabilit? di sviluppo di metastasi a distanza e in particolare di metastasi polmonari in pazienti TNBC.
Le mutazioni che interessano CD244 e PDE9A e che sono predittive di metastasi possono essere localizzate in diverse regioni codificanti dei rispettivi geni o nelle corrispondente proteine, le cui sequenze di riferimento sono:
1) gene CD244: SEQ ID NO:13 (NCBI: NM_016382.4); proteina corrispondente: SEQ ID NO:14 (UniProtKB - Q9BZW8)
2) gene PDE9A: SEQ ID NO:15 (NCBI Gene 5152); proteina corrispondente: SEQ ID NO:16 (UniProtKB - O76083)
Preferibilmente, le mutazioni a carico del gene CD244 o della corrispondente proteina sono scelte tra: 839G>A o R280K; 383C>A o S128Y; 383C>G o S128C; 756G>C o R252S; 671-1G>T o X224 (variante nel sito accettore di splicing); 1099G>A o D367N;
Preferibilmente, le mutazioni a carico del gene PDE9A o della corrispondente proteina sono scelte tra: 976A>C o S326R; 140G>A o R47Q; 498-1G>A o X166 (variante nel sito accettore di splicing); 1127A>G o N376S; 787G>A o V263I; 240del o V81Wfs*26; 353G>A o R118Q; 1219G>A o D407N, dove "fs" indica una mutazione da scivolamento della cornice di lettura; * indica un codone di stop; "del" indica una delezione.
In un modalit? preferita di realizzazione dell'invenzione, le mutazioni nei geni CD244 e PDE9A sono determinate mediante la tecnica di Whole Exome Sequencing (WES) con approccio Targeted Gene Panel (TPG) o mediante la tecnica SNP array o mediante discriminazione allelica in real time PCR con sonde Taqman (Taqman allelic discrimination, con diversi fluorofori: fam, vic e cy5). Una descrizione completa delle tecniche WES e SNP array per l'identificazione di mutazioni geniche ? disponibile nelle seguenti pubblicazioni: (i) Fancello et al., Tumor mutational burden quantification from targeted gene panels: major advancements and challenges, J Immunother Cancer. 2019 Jul 15;7(1):183; (ii) Yi et al., Performance comparison of SNP detection tools with illumina exome sequencing data an assessment using both family pedigree information and sample-matched SNP array data, Nucleic Acids Res. 2014 Aug 1, 42(12): e101; (iii) Heissl et al., High-Throughput Genotyping with TaqMan Allelic Discrimination and Allele-Specific Genotyping Assays Methods Mol Biol. 2017;1492:29-57.
In un'altra modalit? preferita di realizzazione dell'invenzione, i dati relativi ai livelli di espressione dei geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 sono combinati con i dati relativi alle mutazioni nei geni CD244 e PDE9A allo scopo di prevedere i diversi gradi di attivazione del processo metastatico. In particolare si procede come segue:
a) se un campione di tumore primario ? caratterizzato da aumentata espressione di due geni - per esempio PRUNE e COL4A1 o PRUNE e IL1R1 -senza che siano rilevate mutazioni nei geni PDE9A e CD244, allora si prevede uno stadio iniziale di attivazione del processo metastatico;
b) se un campione di tumore primario ? caratterizzato da aumentata espressione di due geni - per esempio PRUNE e COL4A1 o PRUNE e IL1R1 -e dalla presenza di mutazioni in uno dei due geni PDE9A o CD244, allora si prevede uno stadio medio di attivazione del processo metastatico;
c) se un campione di tumore primario ? caratterizzato da aumentata espressione di due geni - per esempio PRUNE e COL4A1 o PRUNE e IL1R1 -e dalla presenza di mutazioni in entrambi i geni PDE9A e CD244, allora si prevede uno stadio avanzato di attivazione del processo metastatico.
Un altro aspetto dell'invenzione riguarda un kit per attuare il metodo di previsione di sviluppo di metastasi in pazienti TNBC, come qui descritto. Il kit comprende, in contenitori separati, reagenti per determinare l'aumento di espressione di PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 in un campione bioptico di TNBC e reagenti per identificare le mutazioni nei geni CD244 e PDE9A. Preferibilmente, il kit contiene primers, sonde e reagenti per effettuare una RT-PCR come qui descritta e, separatamente, primers, sonde e reagenti per identificare le mutazioni mediante la tecnica di Whole Exome Sequencing (WES) con approccio targeted gene panel TPG, o mediante la tecnica SNP array, o mediante la tecnica di discriminazione allelica in real time PCR con sonde Taqman (Taqman allelic discrimination).
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1
(A) Analisi dell'espressione dell'RNA (log2) dei livelli di Prune-1, ER (ESR1), PgR e HER2 (ERBB2) in campioni di BC primari in diversi dataset pubblici, rispetto all'epitelio normale (N Epithelium; dataset di Shelharmer). I dati di 10 dataset pubblici di BC mostrano la iperespressione di Prune-1 in tutti i campioni di BC rispetto all'epitelio normale. Livelli di espressione di Prune-1 pi? elevati sono stati osservati nei campioni di TNBC (dataset di Brown; linea tratteggiata) (n = 1779; P = 3.0e-169). (B) Analisi dell'espressione dell'RNA (log2) dei livelli di Prune-1 nei campioni di BC raggruppati in base al loro stato ER, PgR e HER2 (punteggio stratificato da 0 a 3+, come valutato da analisi di immunoistochimica) del dataset pubblico di carcinoma invasivo mammario, con i dati di espressione genica acquisiti da The Cancer Genome Atlas (n = 1097). Livelli di espressione di Prune-1 pi? elevati si osservano per i campioni di BC con punteggi negativi sia per ER che per PgR e in quelli con punteggi compresi tra 0 e 1+ per lo stato HER2 (linee tratteggiate). ER, recettore degli estrogeni; PgR, recettore del progesterone; HER2, recettore del fattore di crescita epidermico umano 2.
Figura 2
(A) Diagramma schematico del plasmide pMSG-MMTV-LTR-Prune-1-FLAG utilizzato per la generazione del modello murino transgenico MMTV-Prune-1. Il cDNA umano di Prune-1, contenente la regione codificante della proteina completa con il tag FLAG fuso nel frame al dominio carbossilico-terminale ? stato clonato in siti polylinker del vettore pMSG. Il costrutto risultante ? stato designato pMSG-MMTV-Prune-1-FLAG. Viene anche riassunto l'incrocio tra topi MMTV ? Prune-1 e MMTV ? Wnt1 per ottenere il modello MMTV-Prune-1 / Wnt1 doppio transgenico. Le cellule primarie sono state ottenute dai tumori generati da topi MMTV ? Prune-1 / Wnt1 e MMTV ? Wnt1 a 2 mesi dall'insorgenza del tumore. Il DNA delle cellule MMTV ? Prune-1 / Wnt1 e MMTV ? Wnt1 ? stato utilizzato per analisi di sequenziamento dell?esoma (WES). (B) Grafico a torta che illustra l'analisi di Gene Ontology (GO) di varianti deleterie che si trovano esclusivamente nelle cellule MMTV ? Prune-1 / Wnt1 (rispetto alle cellule MMTV ? Wnt1). (C) Grafico a torta che illustra l'analisi dei termini di Gene Ontology (GO) dei 39 geni mutati nelle cellule MMTV ? Prune-1 / Wnt1 (rispetto alle cellule MMTV ? Wnt1) identificati anche nel database pubblico di TNBC basale umano (COSMIC, v91). (D) Analisi dei dati di sopravvivenza ottenuti dataset pubblico di Breast Invasive Carcinoma (n = 1075) da The Cancer Genome Atlas (TCGA). La bassa espressione dei geni PDE9A, ERCC5, Iqca, Sirpb1b, CD244, SP140 e PIP5k1b ? associata a una ridotta sopravvivenza a 5 anni nei pazienti con BC.
Figura 3
(A-B) Frequenza delle alterazioni genetiche (A) nei geni PDE9A, ERCC5, Iqca, Sirpb1b, CD244, SP140 e PIP5k1b ed analisi dei dati di sopravvivenza (B) nei dataset pubblici di BC invasivo (Cbioportal for cancer genomics; https://www.cbioportal.org).
Figura 4
(A) Schema rappresentativo del disegno sperimentale. Il DNA delle cellule MMTV ? Prune-1 / Wnt1 e MMTV ? Wnt1 ? stato utilizzato per analisi di sequenziamento dell'esoma (WES). I macrofagi murini J774A.1 e Raw264.7 sono stati cresciuti in mezzi condizionati raccolti da cellule MMTV ? Prune-1 / Wnt1 e MMTV ? Wnt1 per 48 ore. L'RNA totale ? stato estratto da questi macrofagi e sono state eseguite le analisi di RNAseq. (B) La rete neurale di interazione tra proteine generata tramite il database di Search Tool for Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) utilizzando i ?geni core'' definiti come i geni comuni che sono sovraespressi nei macrofagi J774A.1 e RAW264.7 cresciuti nei mezzi condizionati ottenuti dalle cellule MMTV ? Prune-1 / Wnt1 (rispetto alle cellule MMTV ? Wnt1) presenti in almeno quattro su cinque dataset di pathways canonici (Biocarta, Kegg, Pid, Reactome, Naba). La rete neurale ? stata generata utilizzando il database STRING (confidenza: 0.4; https://string-db.org/cgi/network.pl?taskId=41jaTsLzWNqT). (C) Analisi dei dati di sopravvivenza ottenuti dataset pubblico di Breast Invasive Carcinoma (n = 1075) da The Cancer Genome Atlas (TCGA). Di interesse, l?elevata espressione dei geni IL-10, COL4A1, ILR1 e PDGFB ? associata a una ridotta sopravvivenza a 5 anni nei pazienti con BC. (D) Analisi dell'espressione dell'RNA (log2) dei livelli di COL4A1 e ILR1 in campioni di BC primari in diversi dataset pubblici, rispetto all'epitelio normale (N Epitelio; Shelharmer). Livelli di espressione di COL4A1 e IL1R1 pi? elevati si osservano per i campioni TNBC (cio?, marrone; linea tratteggiata).
PARTE SPERIMENTALE METODI
Preparazione e analisi del campione
? Pesare il campione bioptico e iniziare con l?estrazione dell?RNA secondo le indicazioni del KIT ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System. ? Per un peso minore o uguale di 5 mg ? richiesto una lisi in 330 ?l (250 ?l di LBA+ TGBuffer e 85 ?l isopropanolo). Per un peso superiore ai 5 mg di tessuto ? richiesto una lisi in 670 ?l (500?l di LBA+ TGBuffer e 170 ?l isopropanolo).
? Omogeneizzare il campione per favorire la lisi dello stesso.
? Centrifugare il lisato per 3? a 14000 x g e successivamente trasferire la fase superiore in un tubo pulito.
? Aggiungere la quantit? richiesta di isopropanolo come indicato al punto 2.
? Trasferire il lisato su minicolonna, centrifugare a 12000-14000 x g alla temperatura di 20- 25?C. Scartare il liquido dal tubo di collezione. ? Aggiungere 500 ?l di RNA Wash Solution alla minicolonna. Centrifugare per 30?? a 12000-14000 x g alla temperatura di 20-25?C. Svuotare il tubo di collezione.
? Preparare la soluzione DNase I incubation mix combinando i seguenti reagenti: Yellow Core Buffer 24 ?l MnCl2 0.09M 3 ?l DNase I.
? Applicare 30 ?l di DNase I incubation mix alla membrana della minicolonna ed incubare per 15? a 20?-25?C.
? Aggiungere 200 ?l di Column Wash Solution (con aggiunta di etanolo) alla minicolonna. Centrifugare a 12000- 14000 x g per 15??. ? Aggiungere 500?l di RNA Wash Solution (con aggiunta di etanolo) alla minicolonna. Centrifugare a 12000- 14000 x g per 30??. Scartare il liquido dal tubo di raccolta.
? Posizionare la minicolonna in un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 300 ?l di RNA Wash Solution e centrifugare alla velocit? massima per 2?.
? Trasferire la minicolonna dal tubo di collezione al tubo di eluizione. Aggiungere Nuclease-Free Water alla membrana della minicolonna (15 ?l per 5mg o meno, 30 ?l per campioni superiore ai 5 mg). Centrifuga a 12000- 14000 x g per 1?.
? Conservare l?RNA eluito a -80?C.
Controllo di qualit? dell?RNA estratto:
Il controllo di qualit? per l?RNA estratto viene effettuato al Nanodrop per stimare (i) la quantit? di RNA ottenuto (maggiore di 1 microgrammo di RNA), (ii) l?eventuale presenza di proteine mediante la lettura del rapporto 260/ 280 il cui valore ottimale ? compreso tra 1,8 e 2,2.
Protocollo retrotrascrizione 5X All-In-One RT MasterMix
? Scongelare i templati di RNA e il 5X All-In-One RT MasterMix su ghiaccio. Mescolare le soluzioni delicatamente ma a fondo. ? Preparare la seguente mix di reazione:
- 4 ?l 5X All-In-One RT MasterMix
- Quantit? variabile di RNA totale
- Fino a 20 ?l di Nuclease-Free H2O
? Effettuare la reazione di retrotrascrizione utilizzando il seguente Programma con il termociclatore GENE AMP PCR SYSTEM 2700:
- Mescolare la seguente mix di reazione, incubare per 10? a 25?C.
- Sintesi di cDNA incubando il campione per 50? a 42?C. - Stoppare la reazione di retrotrascrizione riscaldando la mix a 85?C per 5 ?e successivamente terminare il processo a 4?C.
- Il campione di cDNA se non ? utilizzato subito per le applicazioni successive, deve essere rapidamente conservato a -20?C. Protocollo Real Time PCR 2X qPCR MasterMix
? Scongelare la mix BrightGreen 2X qPCR MasterMix, i templati di cDNA, I primers e la Nuclease-Free H2O su ghiaccio.
? Preparare la seguente mix di reazione per singola coppia di primer:
- 10 ?l 2X qPCR MasterMix
- 0,3 ?l Forward Primer (10 ?M)
- 0,3 ?l Reverse Primer (10 ?M)
- 0,3 ?l PROBE (10 ?M)
- Quantit? variabile del Templato di cDNA
- Fino a 20 ?l di Nuclease-Free H2O
Il ?valore critico? (cut-off) minimo ? un Ct di Actina compreso tra 16 e 25.
? Dispensare la mix nella MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode.
? Performare la Real Time PCR utilizzando il seguente Programma con il termociclatore 7900HT FAST REAL-TIME PCR SYSTEM:
- Incubare la mix per l?attivazione enzimatica a 95?C per 10?. - Incubare per promuovere la denaturazione del template a 95?C per 15??.
- Incubare per la fase di annealing per 60?C per 60??.
- Ripetere la fase di denaturazione e annealing per un totale di 40 cicli.
Geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 di riferimento, relative sequenze codificanti e proteiche:
PRUNE1: prune exopolyphosphatase 1; ENSG00000143363;
[Source:HGNC Symbol; Acc:HGNC:13420]. Location: Chromosome 1, 151,008,420-151,035,713 forward strand. GRCh38: CM000663.2. ENST00000271620.8 PRUNE1-201 cdna:protein_coding: SEQ ID NO:20; PRUNE1-201 protein : SEQ ID NO:21
IL1R1 ENSG00000115594; interleukin 1 receptor type 1 [Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:5993]. Location: Chromosome 2: 102,064,544-102,179,874 forward strand. GRCh38:CM000664.2. >ENST00000410023.6 IL1R1-205 cdna:protein_coding: SEQ ID NO:22; proteina: SEQ ID NO:23 COL4A1 ENST00000375820.10; collagen type IV alpha 1 chain [Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:2202]
Location. Chromosome 13: 110,148,963-110,307,157 reverse strand. >ENST00000375820.10 COL4A1-201 cdna:protein_coding: SEQ ID NO:24; proteina: SEQ ID NO:25
Le sonde (probes) utilizzate per il saggio di real-time RT- con approccio Taqman appartengono al set di sonde utilizzate (con metodica Affymetrix U133 Plus 2.0 gene expression array) nel dataset pubblico di TNBC (Burstein et al., Clin Cancer Res. 2015) che riconoscono la sequenza 3?UTR non tradotta del trascritto mRNA del gene PRUNE1 (ENST00000271620.8), IL1R1 (ENST00000410023.6 ) e COL4A1 (ENST00000375820.10)
PRUNE1 Probe set: 209586_s_at
AMPLICONE PRUNE1:
GCTCTGTTCCATGTAAGTTGCCAACAGTTTCACTGAACAGTGGG
GTATGTGATGGTTTTGGCATGACATCTTCAGTATGAGGGGGACAGTTT GACTTCACTTTGAGGGTGTGATGTCTGTAGCTATGT (SEQ ID NO:17) Lunghezza: 128, Contenuto GC: 45%, Tm: 78.2
Oligo Forward PRUNE: GCTCTGTTCCATGTAAGTTGCCAAC (SEQ ID NO:1)
Lunghezza: 25, Contenuto GC: 48%, Tm: 57.7
Oligo Reverse PRUNE: ACATAGCTACAGACATCACACCCTC (SEQ ID NO:2)
Lunghezza: 25, Contenuto GC: 48%, Tm: 57.7
Probe PRUNE: ATGGTTTTGGCATGACATCTTCAGT (SEQ ID NO:3) Lunghezza: 25, Contenuto GC: 40%, Tm: 54.4
Cut off per PRUNE1: LOG2 > 8,03>8,55>10,11875
IL1R1 Probe set: 202948_at
AMPLICONE IL1R1:
GTGAACTTCCTTTGACTTATTGTCCCCACTAAAACAAAACAAA
AAACTTTTAATGCCTTCCACATTAATTAGATTTTCTTGCAGTTTTTTTA TGGCATTTTTTTAAAGATGCCCTAAGTGTTGAAGAAG (SEQ ID NO:18) Lunghezza: 129, Contenuto GC: 31%, Tm: 72.4
Oligo Forward IL1R1: GTGAACTTCCTTTGACTTATTG (SEQ ID NO:7) Lunghezza: 22, Contenuto GC: 36%, Tm: 49,2
Oligo Reverse IL1R1: CTTCTTCAACACTTAGGGCATCTTT (SEQ ID NO:8)
Lunghezza: 25, Contenuto GC: 40%, Tm: 54.4
Probe IL1R1: TTTCTTGCAGTTTTTTTATGGCATT (SEQ ID NO:9) Lunghezza: 25, Contenuto GC: 28%, Tm: 49.5
Cut off per IL1R1: LOG2 >6,41>9,43>10,96875*
COL4A1 Probe set: 211980_at
AMPLICONE COL4A1 :
GTATCAGTATTTTCACACGTAAGCACATTCGGGCCATTTCCGT
GGTTTCTCATGAGCTGTGTTCACAGACCTCAGCAGGGCATCGCATGG ACCGCAGGAGGGCAGATTCGGACCACT (SEQ ID NO:19) Lunghezza: 117, Contenuto GC: 53%, Tm: 80,9
Oligo Forward COL4A1: GTATCAGTATTTTCACACGTAAGCA (SEQ ID NO: 4)
Lunghezza: 25, Contenuto GC: 36%, Tm: 52,8
Oligo Reverse COL4A1: AGTGGTCCGAATCTGCCCTCCT (SEQ ID NO: 5)
Lunghezza: 25, Contenuto GC: 59%, Tm: 58.6
Probe COL4A1: GTGGTTTCTCATGAGCTGTGTTCAC (SEQ ID NO: 6) Lunghezza: 25, Contenuto GC: 48%, Tm: 57.7
Cut off per COL4A1: LOG2 >8,42>10,195>11,79625*
* Il gene di riferimento interno utilizzato ? la beta-Actina, rilevata con tecnologia Taqman utilizzando i seguenti probe e oligo:
Oligo Forward Beta-Actina: AGCCTCGCCTTTGCCGA (SEQ ID NO:10); Oligo Reverse Beta Actina, CTGGTGCCTGGGGCG (SEQ ID NO: 11); Probe Beta Actina, CCGCCGCCCGTCCACACCCGCC (SEQ ID NO: 12) Il valore LOG2 si calcola sui valori logaritmici in base 2 dei valori di espressione. Tali valori sono calcolati attraverso il metodo ?delta Ct?. In dettaglio, il valore di Ct del gene housekeeping utilizzato come riferimento interno (Beta-actina) viene sottratto al valore di Ct del gene target. Successivamente, l?algoritmo 2^<-Delta Ct >? applicato a questa differenza.
I cut off sono stati determinati calcolando la media del valore minimo, medio e massimo di espressione dei geni in analisi (PRUNE1, IL1R1, COL4A1) in diversi datasets pubblici di carcinoma mammario (Bos, n. 204, [Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature 2009]; Iglehart, n. 123 [Iglehart et al., Predicting Features of Breast Cancer with Gene Expression Patterns, GEO ID: GSE5460]; Bertucci, n.266 [Sabatier et al., A gene expression signature identifies two prognostic subgroups of basal breast cancer, Breast Cancer Res Treat 2011 Apr;126(2):407-20]; M-Heijboer, n.155 [Massink et al., Proper genomic profiling of (BRCA1-mutated) basal-like breast carcinomas requires prior removal of tumor infiltrating lymphocytes, Mol Oncol. 2015 Apr;9(4):877-88.]; Smid, n.210 [Smid et al., Expression data from primary breast tumors. GEO ID: gse29271]; Black, n.107 [Black et al., Expression data from primary breast tumors (Auckland), GEO ID: gse36771]; Prat, n.156 [Prat et al., Research-based PAM50 subtype predictor identifies higher responses and improved survival outcomes in HER2-positive breast cancer in the NOAH study. Clin Cancer Res. 2014 Jan 15;20(2):511-21]; EXPO, n.351 [Expression Project for Oncology (expO), GEO ID: GSE2109]) e paragonati al dataset di carcinoma mammario triplo negativo (Brown, n.198 [Burstein, et al., Comprehensive genomic analysis identifies novel subtypes and targets of triple-negative breast cancer. Clin Cancer Res, 2015. 21, 1688-98.) Qualunque dataset di carcinoma mammario che abbia le seguenti caratteristiche pu? essere utilizzato per determinare il livello di espressione dei geni target. Tali dataset devono contenere dati di espressione genica ottenuti su campioni umani di carcinoma mammario (contenenti pi? di n.100 campioni analizzati).
Analisi mutazionali
Il sequenziamento dell'esoma (WES) ? stato eseguito su cellule tumorali ottenute da tumori primari sviluppati nei topi MMTV-Prune-1-Wnt1 e MMTV-Wnt1. I campioni sono stati preparati secondo le linee guida del kit SureSelect Target Enrichment (kit SureSelect Mouse Capture; Agilent). Le librerie sono state sequenziate con la piattaforma HiSeq Illumina. Il ?riferimento? per la mappatura ? mm10 da UCSC (originale GRCm38 da NCBI, dicembre 2011) ed il database per le annotazioni ? dbSNP (versione 142).
Campione MMTV-Prune-1-Wnt1. Per le statistiche post-allineamento, le ?reads? iniziali (ovvero il numero di ?reads? mappate sul genoma murino) erano 74.311.106, le ?reads? non ridondanti (ovvero il numero di letture ?de-duplicate? dal tool Picard [versione picard-tools-1.118]) erano 68,415,279, le ?on-target reads? (cio? il numero di ?reads? mappate sulle regioni target) erano 45,504,404, le ?on target-yield? (cio? la somma delle basi nell'allineamento finale alle regioni target) erano 5.298.453.340 bp, e la ?average? (profondit? di lettura delle regioni target) era 107,3 X.
Campione MMTV ? Wnt1. Per le statistiche post-allineamento, le ?reads? iniziali erano 81.372.126, le ?reads? non ridondanti 74.412.189, le ?on-target reads? 50.202.591, ?on-target yields? 5.880.337.790 bp e la ?average? di 119,1 X.
Le varianti esclusive del campione MMTV ? Prune-1-Wnt1 sono state selezionate utilizzando il software Ablebitis. Le mutazioni sono state filtrate escludendo: (i) le varianti sinonime, (ii) le varianti esoniche non codificanti, (iii) le varianti mappate nelle regioni introniche ed intergeniche, (iv) le delezioni e le varianti che non cambiavano la corniche di lettura ?in-frame? (vi) le varianti che mappavano della regione 3? e 5? UTR. Inoltre, le varianti annotate con impatto "basso" sulla funzionalit? della proteina codificata sono state escluse. Solo le varianti ?codificanti? (che avevano superato tutti i filtri) con un impatto "alto, modificatore o moderato" sono state analizzate tramite Ensemble Variant Effect Predictor (VEP) per determinare gli effetti delle varianti selezionate sulla sequenza proteica. Infine, sono state escluse anche le varianti previste come "tollerate" da Sorting Intolerant From Tolerant, versione 5.2.2, (GRCh38).
Analisi dei dati di sopravvivenza
Le analisi dei dati di sopravvivenza sono state ottenute dal dataset pubblico di Breast Invasive Carcinoma (n = 1075) da TCGA. In dettaglio, i pazienti sono stati classificati in due gruppi di espressione ed ? stata esaminata la correlazione tra i livelli di espressione e la sopravvivenza del paziente. I risultati di sopravvivenza dei due gruppi sono stati confrontati mediante test log-rank.
Analisi di RNAseq
Costruzione e sequenziamento della libreria: l'RNA totale ? stato isolato dalle cellule utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen). Le librerie di cDNA sono state preparate utilizzando i kit TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep (Illumina) In breve, dopo essere stato purificato dall'RNA totale, l'mRNA ? stato frammentato in modo casuale e convertito in cDNA. Gli adattatori sono stati legati su entrambe le estremit? dei frammenti di cDNA poi amplificati utilizzando la PCR. Dopo l'amplificazione, i frammenti con dimensioni dell'inserto comprese tra 200 bp e 400 bp sono stati selezionati per il sequenziamento ?paired-end?. Il processo di sequenziamento ? stato eseguito su uno strumento NovaSeq 6000 Illumina, utilizzando i kit di reagenti NovaSeq 6000 S4 e secondo la TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Guide, Part # 15031047 Rev. E.
Profili di espressione: La qualit? delle letture ? stata determinata utilizzando FastQC1 (versione 0.11.7). Trimmomatic2 (versione 0.38) ? stata utilizzata per filtrare le letture di bassa qualit? eseguendo le seguenti attivit? di ?trimming?: taglio delle sequenze degli adattatori, taglio delle basi dalle estremit? delle letture se inferiore a un punteggio di qualit? di 3, taglio di finestre di quattro basi se la qualit? media ? al di sotto di un punteggio di qualit? di 15 ed infine, taglio delle letture inferiori a 36 bp. HISAT2 (versione 2.1.03), ? un programma di allineamento spliced utilizzato per allineare le letture tagliate al genoma di riferimento (Mouse GRCm38 / mm10). I livelli di espressione dei geni noti sono stati determinati utilizzando StringTie (versione 1.3.4d4), con l'annotazione di riferimento mm10 come guida all'assemblaggio. I conteggi delle letture grezze sono stati normalizzati utilizzando il metodo di normalizzazione del rapporto mediano e le tabelle di conteggio normalizzate risultanti sono state analizzata con GFOLD (versione 1.1.46) per eseguire l'analisi dell'espressione genica, impostando il valore limite significativo a 0,01. Deposito dei dati di RNAseq: http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-9231.
Analisi di arricchimento ?gene set?: L'analisi dell'arricchimento del set genico ? stata eseguita utilizzando la versione pre-classificata GSEA 4. Come input, abbiamo utilizzato l'elenco dei valori gfold calcolati da GFOLD e l'elenco dei set di geni dal Molecular Signatures Database7,9 (versione MSigDB 7.0) appartenente alla raccolta dei ?pathways? canonici (CP) dei Curated Gene Sets (C2). I geni con gfold = 0 (che GFOLD classifica come espressi in modo non differenziale) sono stati rimossi dall'elenco prima di eseguire GSEA. Il numero di permutazioni per valutare la significativit? statistica del punteggio di arricchimento ? stato impostato su 1000. Per identificare un sottoinsieme di "geni core" abbiamo confrontato gli elenchi di geni dall'estremit? iniziale di set di geni arricchiti provenienti da ciascuna sotto-raccolta di CP (Biocarta, Kegg, Pid, Reactome, Naba) e selezionato quelli condivisi da almeno quattro su cinque di queste sotto-raccolte.
Esperimenti in-vivo nei topi
Gli esperimenti sui topi sono stati approvati da: Institutional Animal Care and Ethical Committee of CEINGE ?Federico II? University of Naples (Protocol 29, September 30, 2012; Dipartimento Sanit? Pubblica Veterinaria D.L.
116/92). Il modello murino transgenico MMTV ? Prune-1 MMTV?Prune-1 (Strain ID: EM:09937; code: FVB-Tg(MMTV-PRUNE)/Cnrm) ? stato archiviato a The European Mutant Mouse Archive (EMMA).
RISULTATI
Iperespressione di Prune-1 nel TNBC
Attraverso l'applicazione di approcci di ?data mining? a database pubblici di espressione genica in campioni di BC (R2 Genomics Analysis and Visualization Platform; http://r2.amc.nl) abbiamo identificato una maggiore espressione di Prune-1 nel dataset pubblico di TNBC (Brown [20], n = 198; Figure 1A). Questo dato pu? essere dovuto alla maggiore frequenza di ?gain? del cromosoma 1q21 nei carcinomi di tipo basale (incluso il TNBC; 30% -40%;
[5, 21]), e nei BC recidivi (70%; [22]). Questo suggerisce un ruolo potenziale di Prune-1 nella tumorigenesi del TNBC.
? noto che il TNBC ? caratterizzato da espressione negativa di ER, PgR e HER2 [10]. Pertanto, per approfondire il ruolo di Prune-1 nel TNBC, abbiamo analizzato la sua potenziale associazione allo stato di ER, PgR e HER2 utilizzando il ?dataset? pubblico di carcinoma mammario invasivo (Tumor Breast Invasive Carcinoma) contenente i dati di espressione genica raccolti in ?The Cancer Genome Atlas? (TCGA; n = 1097). Utilizzando questo ?dataset?, i campioni di BC sono stati stratificati in base all?espressione di ER, PgR e HER2 (valutata attraverso approcci di immunoistochimica [IHC]), che varia da 0 a 3+ (con 0 che indica la negativit?). I dati mostrano che i livelli di espressione pi? elevati di Prune-1 sono stati identificati in quei campioni con punteggi negativi per ER, per PgR e in quelli con punteggi compresi tra 0 e 1+ per HER2 (Figura 1B). Questi dati suggeriscono quindi un potenziale ruolo di Prune-1 nella patogenesi del TNBC.
Prune-1 modula i TAMs nel TME di un modello murino geneticamente modificato di TNBC metastatico
Per caratterizzare gli effetti della iper-espressione di Prune-1 nel TME del BC, abbiamo generato un GEMM che iper-esprime il Prune-1 umano nella ghiandola mammaria. Questo GEMM ? stato generato utilizzando un costrutto plasmidico che contiene il cDNA di Prune-1 umano sotto il controllo del promotore MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) [23]. I modelli GEMM ottenuti (MMTV-Prune-1) generavano iperplasia della ghiandola mammaria. Tali modelli sono stati poi incrociati con il modello MMTV-Wnt1 (Figura 2A). Quest?ultimo modello GEMM (MMTV-Wnt1) ricapitola il BC "basale" (incluso il TNBC) [24-26], ma non sviluppa metastasi spontanee ai polmoni [27]. Al contrario, il modello murino doppio transgenico risultante dall?incrocio tra MMTV-Prune-1 ed MMTV-Wnt1 (cio? MMTV-Prune-1/Wnt1) sviluppa tumore mammario TNBC e metastasi al polmone. Per dissezionare ulteriormente la funzione di Prune-1 in questo modello di TNBC metastatico, sono state ottenute cellule tumorali murine primarie dai tumori generati da topi MMTV-Prune-1/ Wnt1 e MMTV-Wnt1 (dopo 2 mesi dall'insorgenza del tumore) (Figura 2A). Su tali cellule sono stati condotti studi di sequenziamento e/ o co-cultura con cellule immunitarie TAMs (vedi paragrafo in basso).
Genetica, trascrittomica e ?rate? mutazionale nel TME del TNBC Per definire un quadro pi? globale del meccanismo di comunicazione tra le cellule TNBC iper-esprimenti Prune-1 ed i TAMs, abbiamo analizzato il carico mutazionale delle cellule tumorali primarie murine MMTV-Prune-1/ Wnt1 e MMTV-Wnt1. Attraverso analisi di sequenziamento dell?esoma (WES), abbiamo identificato le varianti geniche deleterie esclusive delle cellule MMTV-Prune-1-Wnt1 (n.177 varianti in 126 geni; Figura 2B). Tra queste varianti, n.39 geni sono stati trovati mutati anche nel ?dataset? pubblico di BC basale umano del ?Catalogo delle mutazioni somatiche nel cancro? (COSMIC, v91; versione del 7 aprile 2020) (Figura 2C). Le analisi di ?Gene Ontology? eseguite su questi n.39 geni umani hanno mostrato che le varianti deleterie identificate sono coinvolte nell'attivazione della risposta immunitarie innata, nei processi di adesione cellulare, nell?apoptosi e nei sistemi di riparo del DNA. Successivamente, tra questi n.39 geni che erano mutati nel ?dataset? di BC basale umano in COSMIC, ci siamo focalizzati su quelli che avevano prognosi sfavorevole nei pazienti con BC (in termini di livelli di espressione e sopravvivenza a 5 anni). A tal fine, abbiamo preso in considerazione le analisi dei dati di sopravvivenza presenti nei ?dataset? pubblici di Breast Invasive Carcinoma (n = 1075) da TCGA. Queste analisi hanno indicato che bassi livelli di espressione dei geni PDE9A, ERCC5, Iqca, Sirpb1b, CD244, SP140 e PIP5k1b sono associati ad una riduzione del tasso di sopravvivenza a 5 anni nei pazienti con BC (Figura 2D). Inoltre, tutti i geni sopra elencati, sono stati trovati anche mutati nel dataset pubblico di BC invasivo (Cbioportal for cancer genomics; https://www.cbioportal.org) (Figura 3A). Tra questi, le mutazioni in PD9A (44,4%) e CD244 (70%) sono pi? frequentemente correlate a peggiore prognosi nei pazienti con BC invasivo (Figura 3B).
Successivamente, abbiamo analizzato il trascrittoma (mediante analisi di RNAseq) dei macrofagi murini (J774A.1 e Raw264.7) cresciuti nei mezzi condizionati raccolti da cellule tumorali TNBC (Figura 4A). Attraverso analisi di RNAseq effettuate sui macrofagi (J774A.1 e Raw264.7), abbiamo identificato un sottoinsieme di ``geni core'' che sono iper-espressi nei macrofagi in risposta alla iper-espressione di Prune-1 nelle cellule tumorali TNBC. La rete di interazione proteica ? stata generata utilizzando il database di Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) (confidenza: 0.4; https://string-db.org/cgi/network.pl?taskId=41jaTsLzWNqT) dai geni ?core? ha identificato proteine coinvolte nei processi del sistema immunitario (GO: 0002376), vie di segnalazione mediate da citochine (GO: 0019221), regolazione positiva della cascata MAPK (GO: 0043410), regolazione positiva della migrazione cellulare (GO: 0030335), regolazione della risposte infiammatorie (GO: 0050727), regolazione positiva della cascata ERK1 ed ERK2 (GO: 0070374), regolazione positiva della chemiotassi (GO: 0050921), regolazione positiva della fosforilazione in tirosina della proteina STAT (GO: 0042531) e chemiotassi dei macrofagi (GO: 0048246) (Figura 4B). Tra queste reti di interazione proteica ottenute dai ``geni core'' identificati nei macrofagi, i livelli di espressione di COL4A1, IL-10, IL1R1 e PDGFB sono positivamente correlati a prognosi sfavorevole (in termini di dati di sopravvivenza a 5 anni) in pazienti con BC presenti nel dataset pubblico di Breast Invasive Carcinoma (n = 1075) in The Cancer Genome Atlas (TCGA) (Figura 4C). Tra questi n.4 geni, COL4A1 e IL1R1 sono iper-espressi nel dataset pubblico di TNBC (Brown [20], n = 198; Figure 1A, all'interno della linea tratteggiata), suggerendo un ruolo di questi geni nella progressione tumorale del TNBC.
CONCLUSIONI
Attraverso analisi WES condotte su cellule tumorali derivate da un modello murino GEMM di TNBC metastatico, abbiamo identificato varianti geniche in cellule TNBC iper-esprimenti Prune-1. Tra queste varianti, n.39 varianti geniche sono state trovate anche nel database pubblico di TNBC basale umano (COSMIC, v91). I geni mutati sono coinvolti principalmente nell'attivazione della risposta immunitaria innata, adesione cellulare, apoptosi e riparo del DNA. Inoltre, ridotti livelli di espressione nei geni PDE9A, Iqca1, Sirpb1b, CD244, SP140 e PIP5k1b sono correlati a prognosi sfavorevole (in termini di analisi di sopravvivenza a 5 anni) in pazienti con BC (dataset of Breast Invasive Carcinoma [n = 1075] da TCGA). Gli stessi geni sono stati trovati anche mutati anche nei pazienti con BC invasivo (cbioportal). Tra questi geni, le mutazioni in PD9A (44,4%) e CD244 (70%) sono pi? frequentemente correlate a peggiore prognosi nei pazienti con BC. CD244 ha un ruolo cruciale ruolo nell'attivazione dei linfociti T natural killer [29]. ? stato definito come uno dei marcatori dell'attivit? citolitica nel TME del TNBC, insieme allo stato mutazionale di TP53mut e PIK3CAwt [30]. PDE9A ? un regolatore della via di segnalazione del cGMP ed ? meno espresso nelle cellule BC (incluso il TNBC) rispetto alle normali cellule epiteliali mammarie umane [37]. Inoltre, PDE9A ? stato identificato come un gene prognostico correlato alla linea germinale dei BC ER-negativi, coinvolto nel controllo della crescita cellulare e dell'angiogenesi [38].
Abbiamo anche utilizzato analisi RNAseq per mostrare l?iper-espressione di IL-10, COL4A1, ILR1 e PDGFB nei macrofagi cresciuti nei mezzi condizionati delle cellule TNBC iper-esprimenti Prune-1. I livelli di espressione di questi geni sono correlati a prognosi negativa in pazienti con TNBC.
Nel complesso, l?iper-espressione di Prune-1, IL-1R, COL4A1, insieme alle varianti deleterie nei geni PDE9A e CD244, rappresentano nuovi indicatori prognostici per esiti sfavorevoli e malattia metastatica nei pazienti con TNBC.

Claims (11)

RIVENDICAZIONI
1. Metodo in vitro per prevedere lo sviluppo di metastasi a distanza in un paziente affetto da carcinoma mammario triplo negativo (TNBC), che comprende i seguenti passaggi:
(a) determinazione del livello di espressione dei geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 in un campione bioptico di TNBC del paziente in esame;
e
(b) determinazione della presenza di mutazioni nei geni CD244 e PDE9A in un campione bioptico di TNBC dello stesso paziente;
dove un'aumentata espressione di almeno due, preferibilmente di tutti e tre i geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 rispetto ai valori di espressione rilevati in tessuto non tumorale di ghiandola mammaria, e la concomitante presenza di mutazioni in almeno uno, preferibilmente in entrambi i geni CD244 e/o PDE9A, indicano un'elevata probabilit? di sviluppare metastasi a distanza.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il livello di espressione dei geni PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 (geni target) nel campione bioptico di TNBC ? determinato con la tecnica Real-Time PCR con sonde TaqMan.
3. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui il livello di espressione ? determinato attraverso i seguenti passaggi:
(1) estrazione di RNA dal campione bioptico;
(2) retrotrascrizione di cDNA
(3) amplificazione del cDNA mediante Real-Time PCR con sonde TaqMan.
4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui il passaggio (3) viene effettuato come segue:
(a) amplificazione del cDNA di PRUNE1 con la coppia di primer SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 e la sonda SEQ ID NO:3;
(b) amplificazione del cDNA di COL4A1 con la coppia di primer SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 e la sonda SEQ ID NO:6;
(c) amplificazione del cDNA di IL-1R1 con la coppia di primer SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8 e la sonda SEQ ID NO:9.
5. Metodo secondo la rivendicazione 4, che comprende inoltre l'amplificazione del gene housekeeper beta actina utilizzando la coppia di primer SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:11 e la sonda SEQ ID NO:12.
6. Metodo secondo le rivendicazioni 4-5, in cui dette amplificazioni sono condotte in termociclatore secondo lo schema seguente:
(a) 95? per 10 min, seguito da (b) 95? per 15 sec, seguito da (c) 60?C per 60 sec, dove le fasi (b) e (c) sono ripetute per un totale di 40 cicli.
7. Metodo secondo le rivendicazioni 2-6, in cui:
(i) viene determinato il valore Log2, dove Log2= -??Ct che corrisponde alla differenza di variazione di Ct tra il gene target e il gene housekeeping beta-actina nel campione biotpico in esame rispetto al tessuto non tumorale di ghiandola mammaria, e
(ii) detto valore ? confrontato con il valore Log2 di riferimento ricavato da datasets pubblici di carcinoma mammario,
dove:
(a) un valore di Log2 rilevato nel campione bioptico >8,03, preferibilmente >8,55 e ancora pi? preferibilmente >10,12 indica un'aumentata espressione di PRUNE1;
(b) un valore Log2 rilevato nel campione bioptico >8,42, preferibilmente >10,195 e ancora pi? preferibilmente >11,8 indica un'aumentata espressione di COL4A1;
(c) un valore Log2 rilevato nel campione bioptico >6,41, preferibilmente >9,43 e ancora pi? preferibilmente >10,97 indica un'aumentata espressione di IL1R1.
8. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui nel passaggio (b):
(i) vengono identificate una o pi? delle seguenti mutazioni nel gene CD244 SEQ ID NO:13 o nella corrispondente proteina SEQ ID NO:14: 839G>A o R280K; 383C>A o S128Y; 383C>G o S128C; 756G>C o R252S; 671-1G>T o X224 (variante nel sito accettore di splicing); 1099G>A o D367N;
(ii) vengono identificate una o pi? delle seguenti mutazioni nel gene PDE9A SEQ ID NO:15
o nella corrispondente proteina SEQ ID NO:16: 976A>C o S326R; 140G>A o R47Q; 498-1G>A o X166 (variante nel sito accettore di splicing); 1127A>G o N376S; 787G>A o V263I; 240del o V81Wfs*26; 353G>A o R118Q; 1219G>A o D407N, dove "fs" indica una mutazione da scivolamento della cornice di lettura; * indica un codone di stop; "del" indica una delezione.
9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui dette mutazioni nei geni CD244 e PDE9A sono determinate mediante la tecnica di Whole Exome Sequencing (WES) o mediante la tecnica SNP array o mediante discriminazione allelica in real time PCR con sonde Taqman.
10. Kit per l'uso in un metodo secondo le rivendicazioni 1-9, comprendente, in contenitori separati, reagenti per determinare i livelli di espressione di PRUNE1, COL4A1 e IL-1R1 in un campione bioptico di TNBC e reagenti per identificare le mutazioni nei geni CD244 e PDE9A.
11. Kit secondo la rivendicazione 10, comprendente primers, sonde e reagenti per effettuare una RT-PCR come definita nelle rivendicazioni 2-7 e, separatamente, primers, sonde e reagenti per identificare le mutazioni secondo le rivendicazioni 8-9.
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