IT202000022015A1 - Nuovo uso dell'ormone luteinizzante - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
?NUOVO USO DELL?ORMONE LUTEINIZZANTE?
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto l?ormone luteinizzante (LH) o una composizione che lo comprende per l?uso nell?indurre la follicologenesi in un individuo. Preferibilmente, LH ? utilizzato per indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente e la attivazione e maturazione di follicoli primordiali in un individuo.
STATO DELL?ARTE
Nell?ovaio della donna postpubere troviamo contemporaneamente presenti diversi tipi di follicoli ovarici: primordiali, primari, secondari o antrali e preovulatori.
I follicoli primordiali sono strutture microscopiche caratterizzate da uno strato monocellulare di cellule della granulosa che circondano l?ovocita; essi vengono generati durante la vita intrauterina e restano quindi quiescente fino alla loro attivazione. L?attivazione avviene per meccanismi ancora poco noti, seppure sembra ipotizzabile che diversi fattori intraovarici, tra cui: la citochina fattore delle cellule staminali (Stem Cell Factor, SCF), fattori di crescita appartenenti alla famiglia delle neurotrofine, il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), la proteina morfogenetica ossea 4 (Bone Morphogenetic Protein 4, BMP-4), il fattore inibitore della leucemia (Leukemia Inhibitory Factor, LIF), il fattore di crescita basico dei fibroblasti (Basic Fibroblast Growth Factor, FGF2) e il fattore di crescita dei cheratinociti (Keratinocyte Growth Factor, KGF), giochino un ruolo chiave nei processi che regolano l?attivazione dei follicoli primordiali dallo stato quiescente.
Inoltre, uno studio condotto su topi transgenici ha dimostrato che la delezione del gene codificante per il fattore di trascrizione forkhead box O3a (FOXO3a) provoca l?attivazione di tutti i follicoli primordiali con la conseguente deplezione della riserva ovarica, con ci? evidenziando come FOXO3a sia il principale regolatore della transizione tra stato quiescente e attivato nei follicoli primordiali.
Ad oggi i dettagli molecolari sul completo meccanismo mediato dall?espressione di FOXO3a non sono stati ancora del tutto chiariti ma ? stato supposto che FOXO3a possa agire attraverso la via di trasduzione del segnale conosciuta come via del fosfatidil-inositolo chinasi 3 (Phosphatidylinositol-3-Kinase, PI3K)
Quando il follicolo primordiale viene attivato, inizia un processo che nel migliore delle ipotesi pu? portare all?ovulazione nell?arco di alcuni mesi (fino anche a 6 mesi) Il follicolo primordiale diventa primario e questo comporta un aumento del diametro e un ispessimento in multistrato delle cellule della granulosa. Quindi all?interno del follicolo compare un antro pieno di liquido, dove si ritrovano le secrezioni delle granulose; a questo stato il follicolo viene definito follicolo secondario o antrale. In questo percorso, la maggior parte dei follicoli va incontro ad un processo di atresia ed apoptosi; pertanto, il numero di follicoli antrali sar? molto minore rispetto al numero dei follicoli primordiali che si erano attivati per crescere. I follicoli antrali possono avere delle dimensioni sub-millimetriche ma anche essere pi? grandi fino a raggiungere i 9 mm. La popolazione dei follicoli antrali pu? pertanto essere riconosciuta all?ecografia (quando hanno dimensioni superiori ad 1-2 mm). I follicoli antrali inoltre producono l?ormone anti-mulleriano (AMH) che viene secreto nel circolo. L?ecografia e/o la misurazione di AMH permettono quindi ai clinici di misurare il pool follicolare antrale.
Questa parte della follicologenesi ? definita gonadotropino-indipendente (Fig. 1) perch? non ? controllata dall?ormone follicolo-stimolante (FSH). Tanto ? vero che avviene anche nelle pazienti prive di ipofisi o nelle donne con che assumono il contraccettivo ormonale.
I follicoli antrali sono invece sensibili alle gonadotropine e ne sono dipendenti. Inizia quindi la follicologenesi gonadotropino-dipendente (Fig.1) e i follicoli antrali continuano a crescere solo sotto il controllo di dell?FSH. Tra i follicoli antrali che mensilmente sono presenti nelle ovaie, quello che presenta pi? recettori (ovvero maggiore sensibilit?) per FSH, sar? il follicolo che crescer? con maggiore velocit? ed efficienza. Nel crescere, questo follicolo produrr? estradiolo che immesso in circolo porter? alla riduzione relativa e momentanea della produzione di FSH ipofisario e questo rende ragione del fatto che nel 99,5% dei casi la donna ovula un ovocita per volta. Il follicolo pre-ovulatorio, dietro stimolo dell?LH (picco di LH) , ovuler? permettendo quindi all?ovocita di poter essere catturato dall?ampolla tubarica ed eventualmente fecondato da uno spermatozoo.
Che l?ormone LH sia coinvolto nel controllare la follicologenesi (gonadotropino-dipendente) ? noto da molti decenni. Inoltre, da circa 30 anni ? sul mercato una molecola di LH ricombinante che viene usata proprio per la stimolazione ovarica. La stimolazione ovarica ? quel processo farmacologico ottenuto con la somministrazione di FSH ed LH. Si va ad agire sui follicoli antrali presenti nell?ovaio e, somministrando una quantit? di farmaco adeguata (di solito 75 o 150 Unita die), per circa due settimane, in associazione a FSH (a dosi variabili a seconda delle caratteristiche delle pazienti), si ottiene la crescita di tutti i follicoli antrali presenti, evitando quindi il processo naturale di selezione e reclutamento che porterebbe invece alla crescita ed ovulazione di un solo follicolo.
La stimolazione farmacologica ? la base delle tecniche di fecondazione assistita dal momento che permette l?ottenimento di un numero possibilmente alto di ovociti per la fecondazione. Il numero di ovociti che viene ottenuto dopo stimolazione ovarica dipende dall?estensione del pool follicolare antrale. Pi? alto ? il numero di follicoli antrali disponibili, maggiore sar? il numero di ovociti reclutati. Dal momento che il numero di ovociti recuperati correla direttamente con il numero di embrioni che potranno essere creati questo porta inevitabilmente ad un aumento del tasso cumulativo di gravidanza predetto.
Per queste ragioni, ? molto sentita l?individuazione di una terapia che sia in grado di promuovere l?attivazione e la maturazione di follicoli primordiali, in modo da aumentare la riserva di follicoli antrali che, a loro volta, potranno maturare e divenire ovociti maturi dopo opportuna stimolazione ovarica.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione si riferisce all?ormone luteinizzante (LH) per l?uso nell?indurre la follicologenesi in un individuo. Preferibilmente, LH ? utilizzato per indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente e la attivazione e maturazione di follicoli primordiali in un individuo. Infatti, la Richiedente ha dimostrato come la somministrazione di LH sia in grado di stimolare la follicologenesi gonadotropino-indipendente, ovvero quel processo che porta all?attivazione dei follicoli primordiali, ovvero alla loro maturazione in follicoli primari. L?assunzione di LH, per gli scopi medici sopra riportati, avviene preferibilmente in una quantit? compresa e tra 150 e 450 Unit? Internazionali (UI) al giorno, per un periodo di tempo di almeno 30 giorni, preferibilmente di almeno 60 giorni.
Un secondo aspetto della presenta invenzione si riferisce ad una composizione comprendente LH per gli usi medici sopra descritti. In una forma di attuazione, la composizione comprende sali, tamponi, tensioattivi, eccipienti, veicolanti, preservanti e/o loro combinazioni accettati per la preparazione di prodotti farmaceutici. Preferibilmente, la composizione ? formulata in forma liquida, preferibilmente in forma di soluzione, emulsione o sospensione sterile oppure ? in forma di polvere, preferibilmente liofilizzata, per essere ricostituita ed ottenere una formulazione liquida. Un terzo aspetto della presente invenzione, si riferisce ad un metodo per indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente in un individuo. Detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione di una quantit? efficace di LH o di una composizione che lo comprenda ad un individuo che ne abbia necessit?.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La Figura 1 mostra uno schema della follicologenesi umana gonadotropino-indipendente e gonadotropino-dipendente;
La Figura 2 mostra il numero dei follicoli (A) primordiali e (B) primari (media per sezione istologica ? SEM) nella corticale ovarica originale o dopo due giorni di cultura senza (controllo) o con LH. All?interno di ogni grafico * denota la significativit? statistica verso le biopsie originali mentre ** denota significativit? nei confronti delle biopsie originali e dei controlli (two-way ANOVA; P < 0.05; n = 6 culture, 11-18 sezioni esaminate per campione);
La Figura 3 mostra una rappresentazione della proporzione dei follicoli nei diversi stadi di maturazione nei campioni di corticale ovarica delle biopsie originali, dopo due giorni di cultura senza LH o con LH. La distribuzione dei follicoli ? mostrata come percentuale del totale dei follicoli vitali. * denota significativit? statistica relativa alle biopsie originali mentre ** mostra significativit? nei confronti sia delle biopsie originali che dei controlli (p < 0.05);
La Figura 4 mostra gli aumenti nella frazione di ovociti che mostrano traslocazione citoplasmatica di FOXO3a;
La Figura 5 mostra l?espressione relativa dei geni CCN in culture primarie di tessuto ovarico incubato per 48 ore con LH. Differenze significative tra i campioni trattati con LH e i controlli sono stati contrassegnati con * (P < 0.005);
La Figura 6 mostra l?immagine di un immunoblot relativo ad una membrana rappresentativa dell?espressione dei geni della famiglia CCN in seguito a stimolazione con LH;
La Figura 7 mostra la correlazione tra LH basale ed aumento percentuale di AMH.
DEFINIZIONI
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?Unit? Internazionale? (UI) come qui utilizzato, si intende un'unit? di misura della quantit? di una sostanza, basata sul suo effetto ovvero sulla sua attivit? biologica.
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?conta ecografica di follicoli antrali? o ?AFC? si intende la conta dei follicoli antrali in un individuo tramite una ecografia pelvica transvaginale.
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?riserva ovarica? si intende il numero di ovociti ovvero la capacit? dell'ovaio di produrre follicoli ovarici capaci di essere fertilizzati per iniziare una gravidanza.
Nel contesto della presente invenzione, per ?CCN? si intende una famiglia di proteine extracellulari associate alla matrice coinvolte nella segnalazione intercellulare. A causa del loro ruolo dinamico all'interno dell'ECM sono considerate proteine matricellulari.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presenta invenzione si riferisce all?Ormone Luteinizzante (LH) per l?uso nell?indurre la follicologenesi in un individuo. Preferibilmente, LH ? utilizzato per indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente e l?attivazione e maturazione di follicoli primordiali in un individuo. Infatti, la Richiedente ha dimostrato come la somministrazione di LH sia in grado di stimolare la follicologenesi gonadotropino-indipendente, ovvero quel processo che porta all?attivazione dei follicoli primordiali, ovvero alla loro maturazione in follicoli primari. La maturazione dei follicoli primordiali ? infatti associata ad un aumento dei follicoli primari e ad una diminuzione dei follicoli primordiali.
In una forma di realizzazione, l?induzione della follicologenesi gonadotropino-indipendente ? associata ad un aumento della riserva ovarica nell?individuo. Preferibilmente, l?aumento della riserva ovarica ? definito tramite la conta ecografica di follicoli antrali (AFC) e/o tramite il dosaggio sierico dell?ormone anti-mulleriano (AMH). La Richiedente ha dimostrato come la somministrazione di LH sia in grado di aumentare la riserva ovarica nell?individuo, con conseguente aumento dei valori di AFC e dei livelli sierici di AMH.
Preferibilmente, l?individuo ? un soggetto umano di sesso femminile.
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una riserva ovarica nella norma. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC superiore a 10, pi? preferibilmente superiore a 12 e/o l?individuo ha un dosaggio sierico di AMH superiore a 2ng/ml, pi? preferibilmente superiore a 2,5 ng/ml.
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una ridotta riserva ovarica. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC inferiore a 10, pi? preferibilmente inferiore a 8 e/o l?individuo ha un dosaggio sierico di AMH inferiore a 2 ng/ml, pi? preferibilmente inferiore a 1,5 ng/ml.
In una forma di realizzazione, detto LH ? umano (hLH), preferibilmente ? umano ricombinante (rhLH).
Detto LH ? preferibilmente utilizzato come proteina ricombinante oppure purificata/isolata.
Preferibilmente, in questo contesto, ci si riferisce all?uso dell?intera proteina LH, oppure a omologhi, analoghi, varianti, derivati, frammenti della proteina LH a condizione che l?attivit? dell?LH venga mantenuta.
In una forma di realizzazione, detto LH ? un omologo biologicamente attivo. In una forma di realizzazione dell?invenzione, le varianti proteiche di LH a cui si fa riferimento hanno delle modifiche alla regione N-terminale e/o C-terminale, per esempio atte ad aumentare l?attivit? di LH. Dette modifiche sono scelte preferibilmente tra delezioni, addizioni, alterazioni di amminoacidi e loro combinazioni. Alternativamente detto LH pu? essere modificato, preferibilmente nella struttura primaria, mediante acetilazione, carbossilazione, glicosilazione, fosforilazione e loro combinazioni.
In una ulteriore forma di realizzazione, detto LH ? coniugato/legato con una molecola, con un metallo, con un marker, per esempio proteine, per la preparazione di proteine di fusione. In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, detto LH ? modificato tramite tecniche di biologia molecolare per migliorarne la resistenza alla degradazione proteolitica e/o per ottimizzarne la solubilit? o per migliorarne le caratteristiche farmacocinetiche. In una ulteriore forma di realizzazione, detto LH, preferibilmente la forma proteica, ? coniugato con almeno una molecola in grado di migliorarne la stabilit? e/o l?emivita e/o la solubilit? in acqua e/o le caratteristiche immunologiche. Detta molecola ? a titolo di esempio il polietilene glicole (PEG).
In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, detta proteina LH ? sintetizzata tramite le tecniche convenzionali per la sintesi di proteine note al tecnico esperto. Per esempio, la proteina pu? essere sintetizzata tramite sintesi chimica utilizzando la sintesi peptidica su fase solida. Alternativamente, LH pu? essere prodotta con tecniche di DNA ricombinante note al tecnico esperto del ramo.
In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, la proteina LH, dopo la sintesi o la produzione con tecniche di DNA ricombinante, ? isolata o purificata con metodi noti al tecnico del ramo. Per esempio, LH pu? essere purificata con metodi cromatografici (filtrazione-gel, scambio ioni e immunoaffinit?), tramite cromatografi liquida ad alta efficienza (HPLC, RP-HPLC, HPLC a scambio ionico, size-exclusion HPLC) o tramite precipitazione (immunoprecipitazione).
In una forma di realizzazione, detto LH ? utilizzato, per gli scopi medici sopra riportati, in una quantit? compresa e tra 150 e 450 Unit? Internazionali (UI) al giorno, pi? preferibilmente tra 170 e 350 UI al giorno, ancor pi? preferibilmente compresa tra 180 e 250 UI al giorno.
In una forma di attuazione, LH ? assunto almeno una volta al giorno, preferibilmente almeno due volte al giorno. Per gli scopi medici sopra descritti, LH ? assunto per un periodo di tempo di almeno 30 giorni, preferibilmente per un periodo compreso tra 40 e 120 giorni, pi? preferibilmente compreso tra 50 e 100 giorni. In una forma di realizzazione preferita, LH viene assunto per almeno 60 giorni. Preferibilmente, LH ? assunto per via parenterale, preferibilmente per via sottocutanea o per via intramuscolare.
In una forma di realizzazione, LH ? assunto in associazione o in combinazione con un trattamento per l?infertilit?, preferibilmente in associazione o in combinazione con la stimolazione ovarica.
Preferibilmente, LH ? assunto prima del trattamento per l?infertilit?, preferibilmente prima della stimolazione ovarica.
In una forma di attuazione, LH ? assunto in associazione o in combinazione con farmaci utilizzati per il trattamento dell?infertilit?. Detti farmaci sono per esempio: FSH, hMG, Clomifene citrato, antiestrogeni, analoghi dell?FSH, analogi del GnRH, integratori, complessi vitaminici, probiotici, paraprobiotici, e loro combinazioni.
In una forma di realizzazione, LH viene assunto non in associazione n? in combinazione con FSH.
Un secondo aspetto della presenta invenzione si riferisce ad una composizione comprendente LH per gli usi medici sopra descritti. In una forma di attuazione, la composizione comprende sali, tamponi, eccipienti, veicolanti, preservanti e/o loro combinazioni accettati per la preparazione di prodotti farmaceutici.
In una forma di realizzazione, la composizione ? formulata per una somministrazione parenterale, preferibilmente per una somministrazione sottocutanea o intramuscolare. Preferibilmente, la composizione ? formulata in forma liquida, preferibilmente in forma di soluzione, emulsione o sospensione sterile oppure ? in forma di polvere, preferibilmente liofilizzata, per essere ricostituita ed ottenere una formulazione liquida. In una forma di realizzazione preferita, la composizione ? formulata come polvere preferibilmente liofilizzata, per essere ricostituita ed ottenere una formulazione liquida.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, detta composizione ? formulata per una somministrazione enterale, preferibilmente per la somministrazione orale. In particolare, la composizione ? formulata in forma solida, preferibilmente in forma di compresse, capsule, tavolette, polvere granulare, opercoli, granuli orosolubili, bustine o confetti.
Un terzo aspetto della presente invenzione, si riferisce ad un metodo per indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente in un individuo. Detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione di una quantit? efficace di LH o di una composizione che lo comprenda ad un individuo che ne abbia necessit?.
Preferibilmente, LH ? utilizzato per indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente e la attivazione e maturazione di follicoli primordiali in un individuo.
In una forma di realizzazione, l?induzione della follicologenesi gonadotropino-indipendente ? associata ad un aumento della riserva ovarica nell?individuo. Preferibilmente, l?aumento della riserva ovarica ? definito tramite la conta ecografica di follicoli antrali (AFC) e/o tramite il dosaggio sierico dell?ormone anti-mulleriano (AMH).
Preferibilmente, l?individuo ? un soggetto umano di sesso femminile.
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una riserva ovarica nella norma. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC superiore a 10, pi? preferibilmente superiore a 12 e/o l?individuo ha un dosaggio sierico di AMH superiore a 2 ng/ml, pi? preferibilmente superiore a 2,5 ng/ml.
In una forma di attuazione dell?invenzione, l?individuo ha una ridotta riserva ovarica. Preferibilmente, l?individuo ha un valore di AFC inferiore a 10, pi? preferibilmente inferiore a 8 e/o l?individuo mostra un dosaggio sierico di AMH inferiore a 2 ng/ml, pi? preferibilmente inferiore a 1,5 ng/ml.
In una forma di attuazione, il metodo per indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente in un individuo ? associato o combinato con un metodo di trattamento dell?infertilit? in un individuo
In una forma di realizzazione, LH ? assunto in associazione o in combinazione con un trattamento per l?infertilit? in un individuo, preferibilmente in associazione o in combinazione con la stimolazione ovarica.
Preferibilmente, LH ? assunto prima del trattamento per l?infertilit?, preferibilmente prima della stimolazione ovarica.
In una forma di attuazione, LH ? assunto in associazione o in combinazione con farmaci utilizzati per il trattamento dell?infertilit? in un individuo. Detti farmaci sono per esempio: FSH, hMG, Clomifene citrato, antiestrogeni, analoghi dell?FSH, analogi del GnRH, integratori, complessi vitaminici, probiotici, paraprobiotici e loro combinazioni.
In una forma di realizzazione, LH viene assunto da solo e non in associazione con FSH.
ESEMPIO
Studio in vitro
Nei mammiferi le ovaie contengono un numero limitato e finito di ovociti organizzati in follicoli primordiali. La maggior parte dei follicoli primordiali sono mantenuti quiescenti come riserva nella durata della vita riproduttiva. Solo pochi di essi vengono attivati e si sviluppano fino ai pi? avanzati stadi follicolari. Sebbene i meccanismi molecolari che regolano il mantenimento della dormienza e l?attivazione dei follicoli primordiali non siano stati completamente compresi, diversi studi hanno dimostrato che dipendono da azioni coordinate di molecole inibitorie/attivatrici prodotte dall?ovocita e dalla comunicazione dell?ovocita stesso con le cellule somatiche e intraovocitarie.
Per queste ragioni gli obiettivi di questo studio sono investigare a) se l?ormone luteinizzante, (LH) possa promuovere la traslocazione citoplasmatica-nucleare di FOXO3a b) se LH possa essere in grado di attivare i membri della famiglia CCN in colture di tessuto ovarico in vitro.
Materiali e metodi
Donatori di tessuto ovarico
Pezzi di tessuto corticale ovarico 2x2x2 mm<3>, sono stati ottenuti da biopsie prelevate a pazienti che si sottoponevano a laparoscopia diagnostica e salpingocromoscopia come esame di workout nello studio dell?infertilit? di coppia. I pazienti arruolati in questo studio hanno storicamente un ciclo mestruale regolare e hanno dichiarato di non avere patologie al momento del campionamento. A tutti i pazienti ? stato richiesto e ottenuto, il consenso scritto per l?uso dei campioni e dei dati clinici allo scopo di ricerca.
Preparazione del tessuto
Il tessuto ovarico ? stato ottenuto in condizioni di sterilit? e trasferito a una piastra Petri contenente 1X PBS dove il tessuto midollare ? stato separato dalla corticale mediante l?uso di un bisturi. Il tessuto ovarico corticale ? stato ulteriormente diviso in pezzi pi? piccoli della dimensione di 1 mm<3>. Un singolo pezzo derivante dalla biopsia iniziale ? stato direttamente fissato in 4% paraformaldeide a 4?C over-night per l?immunoistochimica. Un singolo pezzo derivante dalla biopsia iniziale ? stato invece trattato per l?estrazione dell?RNA totale col metodo descritto in seguito. I restanti pezzi sono stati deposti in una piastra multiwell da 12 pozzetti (un pezzo a pozzetto) e coperti con mezzo di cultura (500 ?l/pozzetto) pre-equilibrato (1 ora a 37 ?C).
Il mezzo di cultura ? compost da 25 mM HEPES, 1 mM penicillina/streptomycina, 1 mM L-glutamina, 1 mM Amfotericina B, 10% siero bovino fetale (FBS) dissolti nel mezzo base McCoy 5A. Tutti i reagenti sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). I campioni sono stati messi in cultura a 37 ?C in condizioni di atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 per 24 ore prima dei trattamenti.
Trattamenti
Dopo 24 ore di cultura primaria, i campioni sono stati trattati con 10 ?M di LH (dissolti nel mezzo di cultura) per ulteriori 48 ore (un cambio del mezzo dopo le prime 24 ore). I campioni di controllo sono stati messi in coltura solo col mezzo senza LH. I campioni cos? trattati sono stati processati per l?estrazione dell?RNA totale o per l?immunoistochimica come descritto in seguito.
RT-qPCR
Il singolo pezzo di ovaio derivante dalla biopsia originale e i campioni trattati con 10 ?M di LH (e I corrispettivi controlli) sono stati direttamente lisati in 1 ml of Tri-Reagent? (Sigma Aldrich) e immediatamente processati per l?estrazione dell?RNA totale secondo il protocollo descritto dalla casa produttrice. L?RNA estratto ? stato posto in 20 ?l acqua RNase free e digerito con DNase I (Promega, Madison, WI, USA). L?RNA purificato ? stato quantificato usando lo spettrofotometro Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientic, Waltham, MA, USA). L?RNA messaggero corrispondente a ogni campione ? stato retrotrascritto a cDNA usando M-MuLV reverse transcriptase (NEB, Ipswich, MA, USA). I cDNAs sono stati impiegati come stampo per rezioni di RT-qPCR.
Per ogni gene considerato i campioni sono stati valutati in triplicato ed espressi come media al fine di consentire l?analisi dell?espressione genica. I risultati sono stati normalizzati usando l?espressione del gene costitutivamente espresso ?-actina. I controlli negativi delle reazioni amplificavano acqua distillate al posto del cDNA. I geni valutati sono stati: CCN2, CCN3 and CCN5. L?espressione relativa di ogni gene ? stata calcolata applicando il metodo del 2<-??Ct >descritto da Livak and Schmittgen, 2001.
Preparazione dei vetrini
I campioni derivanti dalla biopsia originale, I campioni trattati con LH (e I relativi campioni di controllo) sono stati fissati in 4% paraformaldeide a 4 ?C over-night. I campioni sono stati successivamente disidratati con scala ascendente di alcol e inclusi, dopo chiarificazione in xylene, in blocchetti di paraffina. Fette seriali di ovaio sono state ottenute per mezzo di taglio al microtomo (7 ?m) e utilizzate per immunoistochimica o colorazioni morfologiche (ematossilina eosina) per permettere la conta dei follicoli.
Immunoistochimica
I vetrini sono stati ?sparaffinati? con xylene e reidratati con scala discendente di alcol. I vetrini sono stati smascherati per permettere l?esposizione di antigeni nucleari. I vetrini sono stati trattati con l?anticorpo primario anti -FOXO3a o -FOXO3a-P (mouse anti-human; 1:100) e successivamente incubati con un anticorpo secondario coniugato a TRITC o FITC (goat anti-mouse; 1:10000). Tutti gli anticorpi utilizzati sono stati acquistati da Santa Cruz, CA, USA. I campioni sono stati contro-colorati con DAPI per permettere l?individuazione dei nuclei. I follicoli positivi sono stati contati in doppio cieco da due diversi operatori selezionando almeno 5 campi scelti a caso a vetrino.
SDS-PAGE
Le proteine contenute nei singoli campioni sono state estratte con RIPA buffer e quantificate col saggio di Bradford. Una stessa quantit? di proteine (50 ?g) ? stata mischiata con 2X loading buffer (4% SDS; 20% glicerolo; 0.004% blu di bromofenolo; 0.125 M Tris-HCl a pH 6.8; 10% 2-mercaptoetanolo), 1X cocktail inibitore delle proteasi e 5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) e infine bollita per 10 minuti per linearizzare le proteine. Gli estratti proteici sono stati risolti attraverso un gel di polyacrylamide/bis-polyacrylamide al 12% in condizioni denaturanti. Il ColorBurst Electrophoresis Marker (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ? stato usato come marker di peso molecolare. I campioni sono stati caricati in triplicato in tre gel identici. Le proteine sono state fatte correre per 90 minuti a voltaggio costante (120 V).
Immunoblot
Le proteine separate in base al peso molecolare sono state trasferite usando il Trans-Blot SD semi-dry transfer cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) su tre membrane (una per gel) di polyvinylidene fluoride (PVDF, Thermo scientific, Rockford, IL, USA). Le membrane sono state bloccate overnight in una soluzione di Tris-buffered saline (TBS, pH 7,4) e il 5% di latte parzialmente scremato (skim milk powder, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Le membrane sono state successivamente incubate per 1 ora singolarmente con l?anticorpo anti CCN2; CCN3 or CCN5 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) diluite 1:200. Dopo con tre lavaggi con 0.05% Tween 20 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) in TBS, le membrane sono state ulteriormente incubate con l?anticorpo secondario rabbit anti-goat horseradish peroxidase (HRP) conjugated (Bethyl, Montgomery, TX, USA) 1:10000. Le membrane sono infine state coperte ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) e le bande sono state rivelate in chemoluminescenza mediante l?uso di ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). I segnali sono stati acquisiti e semi-quantificati mediante un sistema per l?analisi delle immagini digitali (VersaDoc Imaging System and QuantityOne software, Bio-Rad Laboratories Inc.). Dopo l?acquisizione delle immagini le membrane sono state lavate e ri-ibridate con l?anticorpo primario antihuman ? tubulin (Abcam, Cambridge, UK) ottenuto in coniglio diluito 1:500 e processate come gi? descritto. Dopo lo sviluppo l?intensit? delle bande della ? tubulina ? stata usata come controllo interno sulla quantit? di proteine inizialmente caricata.
Analisi statistica
L?analisi statistica sulle espressioni relative ottenute con la RT-qPCR ? stata eseguita combinando il test di Kruskal-Wallis seguito dal Dunn-Bonferroni?s test (P<0.005). L?analisi statistica sull?intensit? delle bande dopo immunoblot ? stata eseguita usando il Software GraphPad Prism applicando il two-way ANOVA test, considerando significativa una probabilit? P<0.05. Per la conta dei follicoli ovarici il numero dei follicoli ? stato comparato all?interno dei gruppi trattati usando ANOVA test seguito da post hoc test. Sono state considerate significative, differenze con una probabilit? P < 0.05.
Risultati
Come riportato in Figura 2, il numero dei follicoli primari (e il conseguente calo nel numero dei follicoli primordiali) ? aumentato dal trattamento con LH. Negli esperimenti ? anche presente il ben documentato fenomeno dell?attivazione spontanea dei follicoli primordiali a seguito della messa in cultura del tessuto ovarico. Infatti, i controlli (tessuto ovarico in cultura senza LH) mostrano un significativo aumento del numero dei follicoli primari se paragonati a quelli presenti nella biopsia originale. LH si ? rivelato in grado di aumentare il numero dei follicoli primari sia nei confronti dei controlli che delle biopsie originali. In Figura 3 ? rappresentata la percentuale dei follicoli nei diversi stadi di maturazione in relazione al totale presente nella biopsia iniziale. Le variazioni nelle percentuali delle diverse sottopopolazioni sono risultate significative sia nei campioni controllo che nei campioni trattati con LH. LH si ? mostrato efficace non solo nell?aumentare il numero dei follicoli che, passando attraverso la transizione fenotipica, raggiungono lo stadio di follicolo primario ma anche il numero dei follicoli che progrediscono oltre questa fase per raggiungere il fenotipo pre-antrale. In Figura 4 ? stata riassunta la percentuale di ovociti risultata positiva a livello citoplasmatico paragonata alla percentuale di ovociti dove FOXO3a ? stato localizzato nel nucleo. LH ha indotto l?attivazione dei follicoli primordiali promuovendo la traslocazione di FOXO3a dal nucleo al citoplasma. LH ? stato in grado di indurre l?espressione relative di tutti e tre i geni e delle proteine appartenenti alla famiglia CCN dopo due giorni di trattamento confermando che la via del phosphatidylinositol-3-kinase ? stata attivata (Figura 5 e 6).
Studio in vivo
? stato svolto un trial pilota di natura prospettica su 30 pazienti affette da infertilit? idiopatica. Scopo dello studio era studiare gli affetti sulla riserva ovarica di un trattamento con LH a medio-lungo termine.
Le pazienti sono state arruolate in un range tra 18 e 40 anni. Criteri di esclusione erano: presenza di noti fattori di infertilit? (fattore endocrinoovulatorio, fattore tubarico, endometriosi), presenza di cisti ovariche, presenza di malattie endocrino-metaboliche, fattore maschile. Le caratteristiche demografiche delle pazienti sono rappresentate in tabella 1. Tutte le pazienti avevano regolare ciclicit? mestruale (ogni 28-35 giorni). Tabella 1
Le 30 pazienti in studio sono state trattate con LH ad un dosaggio di 187.5 U die (75 U al mattino e 112.5U alla sera) per due mesi. Sono state sottoposte allo studio della riserva ovarica tramite il dosaggio dell?AMH sierico e la conta ecografica dei follicoli antrali (AFC) al tempo 0, dopo un mese ed al termine della terapia (2 mesi). Delle 30 pazienti, 11 avevano eseguito la stimolazione ovarica in un intervallo di tempo che va da 10 giorni a 90 giorni prima dell?inizio della terapia con LH. Queste pazienti hanno ripetuto la stimolazione ovarica dopo i due mesi di terapia con LH. Il protocollo di stimolazione ovarica era in ogni caso basato sul protocollo flessibile con GnRH antagonista e follitropina alfa al dosaggio di 225 U die.
Obiettivi dello studio
Obiettivo primario dello studio: valutare l?effetto della somministrazione di LH sui markers di riserva ovarica
Obiettivo secondario: valutare i criteri predittivi di risposta alla terapia. Valutare la risposta ovarica alla stimolazione prima e dopo terapia con LH
Risultati dello studio
Dallo studio ? emerso che, dopo trattamento con LH per due mesi vi era un aumento medio di AFC del 60% e di AMH del 52% (Tabella 2)
Tabella 2. Markers di riserva ovarica dopo uno e due mesi di terapia
Delle 30 pazienti arruolate, 12 presentavano riserva ovarica estremamente ridotta (definita come AMH <1ng/ml e/o AFC <7). In queste pazienti la risposta alla terapia ? stata sovrapponibile a quella riscontrata nelle pazienti con normale riserva ovarica.
Con analisi di regressione multipla, abbiamo quindi indagato quali sono i le variabili che possono predire la risposta positiva alla terapia con LH ed ? emerso che l?et? pi? bassa , i bassi livelli sierici di FSH ed LH sono i criteri predittivi di buona risposta alla terapia con LH esogeno. In particolare l?aumento percentuale di AMH era tanto maggiore quanto pi? bassa l?et? a pi? bassi i livelli plasmatici basali di LH (Figura 7).
Tabella 3: Predittori dell?Aumento di AMH dopo terapia con LH
Equazione di regressione
Coefficienti di correlazione di ordine zero
Pretrattamento con LH e stimolazione Ovarica
Alcune delle pazienti reclutate avevano eseguito un ciclo di stimolazione ovarica nei 3 mesi precedenti alla terapia con LH, senza ottenere la gravidanza. Questi pazienti sono state sottoposte ad un secondo ciclo IVF dopo due mesi di terapia con LH. Il confronto tra le due stimolazioni ovarica ? riportata nella tabella 4. Emerge che il trattamento con LH ha portato ad un aumento medio di ovociti e ad un aumento di embrioni ottenuti. In particolare, ha permesso di ottenere pi? blastocisti e pi? pazienti hanno crioconservati embrioni dopo il trattamento di stimolazione ovarica.
Tabella 4
Claims (14)
1. Ormone Luteinizzante (LH) o una composizione che lo comprende per l?uso nell?indurre la follicologenesi gonadotropino-indipendente e la attivazione e maturazione di follicoli primordiali in un individuo.
2. LH per l?uso secondo la rivendicazione 1, dove la maturazione dei follicoli primordiali ? associata ad un aumento dei follicoli primari.
3. LH per l?uso secondo la rivendicazione 1 o 2, dove l?induzione della follicologenesi gonadotropino-indipendente ? associata ad un aumento della conta ecografica di follicoli antrali (AFC) e ad un aumento dei valori sierici di ormone anti-mulleriano (AMH).
4. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove l?individuo ha una riserva ovarica nella norma definita come dosaggio sierico di AMH superiore a 2 ng/ml, preferibilmente superiore a 2,5 ng/ml.
5. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, dove l?individuo ha una riserva ovarica nella norma definita come AFC superiore a 10, pi? preferibilmente superiore a 12.
6. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove l?individuo ha una ridotta riserva ovarica definita come dosaggio sierico di AMH inferiore a 2 ng/ml, preferibilmente inferiore a 1,5 ng/ml.
7. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 e 6, dove l?individuo ha una ridotta riserva ovarica definita come AFC inferiore a 10, preferibilmente inferiore a 8.
8. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, dove LH ? umano (hLH), preferibilmente umano ricombinante (rhLH).
9. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, dove detto LH ? assunto in una quantit? compresa e tra 150 e 450 Unit? Internazionali (UI) al giorno, pi? preferibilmente tra 170 e 350 UI al giorno, ancor pi? preferibilmente compresa tra 180 e 250 UI al giorno.
10. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, dove LH ? assunto per un periodo di tempo di almeno 30 giorni, preferibilmente per un periodo compreso tra 40 e 120 giorni, pi? preferibilmente compreso tra 50 e 100 giorni.
11. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, dove LH ? assunto per un periodo di tempo di almeno 60 giorni.
12. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, dove LH ? assunto in associazione o in combinazione con un trattamento per l?infertilit? in un individuo, preferibilmente in associazione o in combinazione con la stimolazione ovarica.
13. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12, dove LH ? assunto prima del trattamento per l?infertilit?, preferibilmente prima della stimolazione ovarica.
14. LH per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13, dove LH ? assunto non in associazione n? in combinazione con FSH.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116348127A (zh) | 2023-06-27 |
| WO2022058951A1 (en) | 2022-03-24 |
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