IT202000018064A1 - Sviluppo di una nuova proteasi tobacco etch virus (tev) ingegnerizzata attivabile nel citosol o nel pathway secretorio - Google Patents
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Description
"Sviluppo di una nuova proteasi Tobacco Etch Virus (TEV) ingegnerizzata attivabile nel citosol o nel pathway secretorio?
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad una proteina avente attivit? proteolitica inducibile e attivabile dallo sperimentatore nel citosol o nel pathway secretorio, e a i suoi usi nel controllo della maturazione in una cellula vitale di una proteina soggetta a taglio proteolitico, e in un procedimento di purificazione di proteine ricombinanti.
STATO DELL?ARTE
Molti processi biologici utilizzano proteasi per attivare o inattivare cascate di segnalazione cellulare. In particolare, le proteasi virali, rispetto alle proteasi di mammifero, sono caratterizzate da elevata specificit? e sono state ampiamente sfruttate come strumenti biotecnologici (Waugh, 2011). Tra queste, quelle maggiormente conosciute sono la proteasi 3C del Rinovirus umano, la proteasi del Potyvirus dal Tobacco Vein Mottling Virus (TVMV) e la proteasi del Tobacco Etch Virus (TEV) (Blommel and Fox, 2007).
L?impiego della proteasi TEV in applicazioni biotecnologiche ha generato un grande interesse negli ultimi anni poich? la sua specificit? di sequenza ? molto maggiore rispetto a quella delle altre proteasi generalmente utilizzate, e presenta inoltre una serie di caratteristiche vantaggiose. In primo luogo, l?espressione ectopica di TEV in diverse linee cellulari di origine umana (HeLa, HEK-293, PC12, U2OS, COS-7 e COS1) o in colture di cellule primarie (neuroni, astrociti) di roditori non induce effetti citotossici n? causa alcun cambiamento morfologico (Cesaratto et al., 2015; Chen et al., 2010; Wehr et al., 2006). L?alta specificit? della TEV le consente, infatti, di non processare alcuna proteina endogena nei modelli sopra citati, rendendola cos? totalmente inerte, assai ben tollerata e potenzialmente sfruttabile per lo sviluppo di approcci biotecnologici innovativi anche per scopi terapeutici nei mammiferi (Hwang et al., 2015; Jenny et al., 2003; Xiao et al.,2007). In secondo luogo, oltre a possedere un?elevata specificit? proteolitica, TEV ? caratterizzata da un?azione indipendente da co-fattori o secondi messaggeri e da stabilit? a pH fisiologici.
Ad oggi, TEV ? utilizzata principalmente per la rimozione di ?tag? di affinit? da proteine ricombinanti purificate, anche se il suo utilizzo ? sempre pi? rivolto al controllo dell?espressione genica e del processamento di pro-proteine nelle quali la sequenza di taglio riconosciuta da TEV sia inserita mediante mutagenesi. Queste pi? recenti applicazioni di TEV aprono la strada allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici basati su biotecnologie innovative, tuttavia necessitano di una TEV la cui attivit? proteolitica possa essere inducibile e controllabile dallo sperimentatore.
Recentemente, numerose strategie sono state sviluppate con l?obiettivo di controllare l?attivit? proteolitica di TEV, impiegando: i) promotori condizionali (shock termico, galattosio, promotori luceindotti; Cesaratto et al.2016); ii) attivazioni a livello post-traduzionale (split-TEV, Dougherty et al., 1991) o iii) peptidi segnale per promuovere una localizzazione della proteasi a livello subcellulare (Uhlmann et al., 2000; Xiao et al., 2007). In questo contesto, ? importante sottolineare che la TEV pu? essere utilizzata per processare substrati citosolici tanto quanto vescicolari, anche se l?espressione della TEV nel reticolo endoplasmatico (RE), e quindi nel pathway secretorio, richiede alcune modifiche specifiche. Infatti, per poter indirizzare la proteasi all?interno del lume del RE delle cellule di mammifero ? necessario inserire un peptide segnale (sec) all?estremit? N-terminale della proteina (secTEV). Inoltre, nel lume del RE, la TEV viene N-glicosilata su 4 differenti amminoacidi (N23, N52, N68 e N171) distribuiti in diverse regioni dell?enzima. Due di loro (N23 e 171) inattivano l?enzima e sono pertanto mutati per impedire la N-glicosilazione (N23Q, T173G); una terza mutazione su una C esposta (C130S) pu? aumentare l?attivit? di TEV nel lume del RE (secTEV-QSG) (Cesaratto et al., 2015).
Sebbene siano state sviluppate numerose metodologie con l?obiettivo di controllare chimicamente l?attivit? proteolitica di TEV nel tempo, gli approcci utilizzati finora sono stati principalmente limitati alla ?protein complementation assay? (PCA) in cui l?espressione di due frammenti non funzionali di TEV (split TEV) ripristinano l?attivit? enzimatica della proteasi in seguito ad associazione di altri peptidi di fusione coniugati. I principali costrutti di split TEV consistono in due frammenti: N-TEV (1? 120) e C-TEV (121?242). La ricostituzione dei due frammenti avviene, quindi, mediante l?interazione tra altri peptidi di fusione ad essi coniugati quali FKBP (FK506-binding protein) e la sua controparte FRB (FKBP-rapamycin-binding). In seguito ad aggiunta di rapamicina i peptidi FRB e FKBP dimerizzano con alta affinit?, inducendo la riassociazione dei due rispettivi frammenti di TEV ai quali sono coniugati, ripristinando cos? la sua attivit? proteolitica (Gray et al., 2010; Morgan et al., 2015; Williams et al., 2009). Questo approccio risulta in realt? poco efficiente e presenta molteplici limiti legati alla necessit? di co-esprimere due diversi costrutti. Infatti, la stechiometria variabile di espressione dei due frammenti non ? controllabile, ancor di pi? in compartimenti subcellulari come il pathway secretorio dove molte proteine subiscono modificazioni che ne influenzano la funzione e/o la localizzazione. La stechiometria variabile nell?espressione dei due frammenti rende variabile anche la risposta proteolitica, con possibili ri-assemblaggi spontanei dei due frammenti e attivit? di background anche in assenza di stimoli.
Per ovviare a questi limiti ? stato necessario ricorrere all?utilizzo di strategie biotecnologiche ausiliarie, basate, ad esempio, sul controllo dell?accessibilit? di split TEV alla sequenza di riconoscimento di TEV (TEVcs), al fine di limitare un taglio del substrato anche in assenza di induzione. Secondo una specifica strategia, la sequenza di taglio TEVcs pu? essere mascherata con l'elica J? del Light-oxygen-voltage-sensing domain 2 dell?Avena sativa phototropin 1 (AsLOV2) che cambia conformazione in seguito all'esposizione alla luce blu, rendendo quindi il substrato disponibile solo in finestre temporali controllate da illuminazioni a 428-474nm (Lee et al., 2017). Per provare a migliorare il rapporto segnale-background, si ? anche provato ad introdurre nei substrati di TEV la sequenza a bassa affinit? ENLYFQ/M piuttosto che la sequenza ad alta affinit? ENLYFQ/SX. Questa strategia, se da una parte consente di attenuare l?attivit? di background, presenta tuttavia lo svantaggio di ridurre anche l?attivit? proteolitica di TEV.
Una riduzione dell'attivit? di background della split TEV ? ottenuta anche sostituendo il dominio FKBP in N-TEV-FKBP con una versione troncata (iFKBP) che, destabilizzando maggiormente il frammento N-TEV in assenza di induzione, riduce la possibilit? di riassemblamento spontaneo con C-TEV-FRB (spell TEV, Dagliyan et al., 2018). Sebbene gli approcci sopracitati consentano di ridurre l?attivit? di background della split-TEV ingegnerizzata, la stechiometria variabile di espressione dei due frammenti non ? tuttavia controllabile, ancor pi? in compartimenti subcellulari come il pathway secretorio.
La split TEV presenta dunque ancora oggi diverse limitazioni che non la rendono adatta per un ampio utilizzo in vivo. L?ingegnerizzazione di TEV basata sulla PCA ha di fatto limitato enormemente le potenziali applicazioni di TEV in vivo atte a sviluppare nuovi approcci terapeutici.
In questo contesto, appare pertanto ancora molto sentita l?esigenza di poter disporre di proteasi con elevata specificit?, la cui attivazione possa essere indotta e controllata dallo sperimentatore in maniera efficace, assicurando una bassa attivit? di background. L?impiego di una simile proteasi ingegnerizzata permetterebbe di studiare approfonditamente diversi processi fisiopatologici e potrebbe aprire la strada allo sviluppo di approcci terapeutici innovativi.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Lo scopo della presente invenzione ? quello di fornire una proteasi con attivit? proteolitica chimicamente inducibile e controllabile dallo sperimentatore che consenta di superare gli svantaggi dei sistemi noti nella tecnica. A differenza dei costrutti di split TEV, la proteina ingegnerizzata oggetto dell?invenzione ? ottenuta dall?inserzione di un dominio regolatore artificiale all?interno della catena amminoacidica della proteasi, rendendo non pi? necessaria la divisione della proteina in due peptidi distinti (Fig. 1). Questa strategia consente di realizzare una proteasi caratterizzata da attivit? proteolitica chimicamente inducibile, avente una singola catena peptidica.
Vantaggiosamente, questa soluzione rende la proteasi oggetto dell?invenzione non pi? soggetta ad una stechiometria variabile, tipica della split TEV, rendendo la risposta proteolitica meno eterogenea e riducendo l?attivit? di background. La proteasi oggetto dell?invenzione ? in grado di raggiungere substrati localizzati sia nel citosol che nel compartimento vescicolare, risultato che sarebbe stato difficile ottenere impiegando un approccio basato sulla split-TEV.
L?inserimento all?interno della sequenza polipeptidica della proteina di un dominio artificiale legante un attivatore, in grado di inibire l?attivit? proteolitica di detta proteasi in assenza di detto attivatore e di ripristinarne l?attivit? proteolitica a seguito dell?aggiunta dell?attivatore stesso, consente di controllare in maniera efficiente l?attivit? proteolitica della proteasi.
In una forma di realizzazione preferita l?invenzione ha come oggetto una nuova proteasi del Tobacco Etch Virus (TEV) ingegnerizzata, denominata unimolecular chemical-activatable-TEV o unica-TEV, chimicamente inducibile e costituita da una singola catena polipeptidica, ottenuta dall?inserzione di un singolo dominio regolatore artificiale (uniRapR) all?interno della catena amminoacidica di TEV. L?inserimento del peptide sintetico nella sequenza polipeptidica di TEV ne annulla l'attivit? proteolitica, la quale pu? essere ripristinata a seguito dell?applicazione di rapamicina (o analoghi non immunosoppressori) rendendo di conseguenza l?attivit? di unica-TEV controllabile dallo sperimentatore. Infatti, la rapamicina determina una modificazione conformazionale di UniRapR in grado di riattivare la proteasi. La possibilit? di utilizzare la rapamicina o un suo analogo strutturale inerte ? ideale in quanto questa molecola ? in grado di permeare le membrane cellulari permettendo il taglio controllato di qualsiasi proteina all?interno dei compartimenti cellulari.
Come risulta chiaro dai risultati riportati nella sezione sperimentale della presente descrizione, gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che la proteasi unica-TEV, oltre ad offrire il vantaggio di essere espressa da un unico costrutto, mostra un significativo miglioramento nella riduzione del segnale di background (Figure 1-3) se confrontata con la split-TEV nota, proponendosi cos? come valido strumento biotecnologico capace di superare i limiti degli approcci noti nella tecnica. La unica-TEV oggetto dell?invenzione mantiene il vantaggio, condiviso da split TEV, di essere attivata da un farmaco, e presenta inoltre una elevata specificit? nei confronti della sequenza di taglio TEVcs (Fig.2-3).
Grazie a queste caratteristiche vantaggiose, la proteasi oggetto dell?invenzione pu? trovare impiego in molteplici potenziali applicazioni terapeutiche, ad esempio per studiare i meccanismi molecolari alla base della maturazione di proteine che vanno incontro a taglio proteolitico tanto nel citosol quanto nel pathway secretorio, e pu? essere anche utilizzata in vivo in modelli sperimentali di malattie come tool terapeutico.
Secondo un aspetto dell?invenzione, inserendo la sequenza di riconoscimento TEVcs (ENLYFQ/S) al posto della sequenza di taglio riconosciuta da proteasi endogene all?interno di una proteina di interesse, ? possibile impiegare la unica-TEV chimicamente attivabile per controllare a livello temporale la maturazione di tale proteina all?interno del citosol o nel pathway secretorio. Questa applicazione pu? trovare ampio utilizzo come strategia terapeutica per ripristinare, in maniera controllabile, i livelli di proteine mature che risultino alterati in contesti patologici.
Unica-TEV pu? rappresentare pertanto una nuova opportunit? per sviluppare strategie terapeutiche atte a contrastare alterazioni nei livelli di proteine che devono andare incontro a maturazione a livello neuronale. Gli autori della presente invenzione hanno ad esempio dimostrato che la unica-TEV, nella forma di unica-sec-TEV, pu? essere impiegata efficacemente per controllare all?interno di cellule vitali la maturazione della neurotrofina proBDNF, avente un ruolo chiave nella plasticit? sinaptica dei neuroni. L?inserimento della sequenza di TEVcs nella sequenza di proBDNF, mediante sostituzione del sito di riconoscimento della furina/plasmina, assicura che la maturazione del BNDF sia strettamente sotto il controllo dello sperimentatore, attraverso l?uso di unica-TEV, e non sia soggetta alla regolazione da parte delle proteasi endogene. I risultati ottenuti con esperimenti di Western blot e immunofluorescenza hanno indicato che i livelli di espressione di pro-TEVcs-BDNF sono simili a quelli di proBDNF wild-type, suggerendo che la minima perturbazione introdotta in pro-TEVcs-BDNF non ne influenza la produzione o degradazione. Tale approccio consente di superare le note limitazioni degli approcci terapeutici basati sulle iniezioni di BDNF come proteina purificata o sulla overespressione genica di BDNF. A differenza di altre strategie, l?utilizzo combinato di unicasecTEV e pro-TEVcs-BDNF permette di controllare la maturazione di queste neurotrofine solo in finestre temporali e solo in specifiche sottopopolazioni di neuroni (utilizzando promotori specifici) evitando gli effetti avversi di una overespressione o di una somministrazione come proteina purificata.
Il gene che codifica la unica-TEV o unica-secTEV pu? eventualmente anche essere trasferito in vettori AAV al fine di sviluppare nuovi approcci di terapia genica per contrastare anche molteplici disturbi associati ad alterazioni dei livelli di pro-proteine mature prodotte.
Dunque, nel complesso, la presente invenzione consente di superare i limiti noti dell?utilizzo della split TEV, aprendo la strada ad un nuovo utilizzo di proteasi con attivit? proteolitica inducibile per lo sviluppo di efficaci approcci terapeutici.
Formano pertanto oggetto dell?invenzione:
- una proteina con attivit? proteolitica inducibile comprendente la sequenza polipeptidica di una proteasi e la sequenza polipeptidica di un dominio legante un attivatore, in cui detto dominio in assenza di detto attivatore inibisce l?attivit? proteolitica di detta proteasi e in presenza di detto attivatore ripristina l?attivit? proteolitica di detta proteasi ed il suo uso in un metodo di trattamento;
- una sequenza nucleotidica codificante una proteina secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione dell?invenzione;
- un vettore per l?espressione di una proteina con attivit? proteolitica inducibile comprendente una sequenza nucleotidica secondo una delle forme di realizzazione dell?invenzione;
- l?uso di una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione per il controllo della maturazione in una cellula di una proteina soggetta a taglio proteolitico;
- l?uso di una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione in un procedimento di purificazione di proteine ricombinanti; e
- un metodo per il controllo della maturazione in una cellula di una proteina soggetta a taglio proteolitico comprendente i seguenti passaggi:
a) co-esprimere in una cellula una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi forma di realizzazione ed una proteina soggetta a taglio proteolitico; b) incubare detta cellula con l?attivatori di detta proteina con attivit? proteolitica in modo da indurre la maturazione di detta proteina.
Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Rappresentazione grafica di unica-TEV. La TEV ? stata scissa a livello di S120-M121 in due porzioni, N-term (1-120) e C-term (121-236) (A). Struttura cristallografica (PDB: 1LVM) di TEV, con indicato il sito di inserzione di UniRapR e il subtrato ENLYFQ (B). Rappresentazione grafica dei 4 costrutti che presentano linker di diversa lunghezza (LL: GGSGGG, ML: GGS e SL: G) (C). ? stato poi interposto il costrutto UniRapR, composto dalla fusione delle seguenze dei due domini peptidici FRB e FKBP, che in seguito a interazione con la rapamicina cambia conformazione strutturale al fine di ripristinare l?attivit? enzimatica di unica-TEV (D). LL ? long linker, ML ? medium linker, SL ? small linker, NL ? no linker.
Figura 2. La split TEV presenta considerevoli livelli di background di taglio in assenza di attivazione. La strategia comunemente usata per controllare l?attivit? enzimatica di TEV ad oggi ? quella di dividerla in 2 costrutti (split TEV) teoricamente inattivi in assenza di induttore. Quello che per? si evince ? che in seguito a coespressione della pozione N- e C-terminale coniugati rispettivamente ai domini FRB e FKBP la proteasi ripristina l?attivit? proteolitica anche in assenza di rapamicina (colonna 3). In particolare, ? stato utilizzato il costrutto sintetico citosolico CFP-TEVcs-YFP che presenta due fluorofori (Cerulean e Yellow Fluorescent Protein) separati dalla sequenza di taglio (TEVcs) riconosciuta dalla TEV (ENLYFQ).
Figura 3. Unica-TEV ? in grado di processare il substrato in presenza di rapamicina. L?utilizzo di unica-TEV permette di controllare il taglio del costrutto artificiale CFP-TEVcs-YFP nel citosol. Analisi di Western blot mostrano un taglio completo da parte della TEV costitutivamente attiva (colonna 2) e un profilo di taglio identico quando utilizziamo unica-TEV in presenza di rapamicina (NL - no linker). Di rilievo ? l?assenza di background di taglio quando utilizziamo unica-TEV in assenza di rapamicina. Questo risultato evidenzia un grande vantaggio nell?utilizzo di unica-TEV rispetto alla controparte split TEV (vedere Fig.2) e spell TEV (colonne 3 e 4). LL ? long linker, ML ? medium linker, SL ?small linker, NL ? no linker.
Figura 4. Controllo della maturazione di BDNF in cellule vitali. L?utilizzo di unica-secTEV ingegnerizzata permette il controllo del taglio del costrutto artificiale pro-TEVcs-BDNF nel pathway secretorio (A). L?analisi mostra come il pro-TEVcs-BDNF abbia un profilo di espressione identico al proBDNF wild type (B). Inoltre, analisi di Western blot (C) mostrano la capacit? di unica-secTEV di far maturare il pro-TEVcs-BDNF in cellule vitali in presenza di rapamicina. Di rilievo ? l?assenza di background di taglio quando utilizziamo unica-secTEV in assenza di rapamicina. Questo risultato evidenzia un grande vantaggio nell?utilizzo di unica-TEV rispetto alla controparte split TEV. Al fine di visualizzare l?attivit? di taglio ? stato co-espresso in ciascuna condizione il plasmide HA-pro-TEVcs-BDNF-Flag-SEP.
Figura 5. Descrizione della strategia per purificare BDNF maturo da cellule eteroleghe di mammifero, quantificazione mediante ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e dimostrazione di un suo effetto biologico.
(A) Schema sperimentale: transfezione delle cellule HEK293 con i plasmidi codificanti unica-secTEV e pro-TEVcs-BDNF. Dopo 24 h, le cellule sono state lisate per estrarre le proteine che sono state soggette a immunoprecipitazione (IP) e purificazione mediante colonnine cromatografiche. B) le proteine a seguito di IP sono state rilevate mediante Western blot, si noti la produzione di BDNF maturo intorno ai 40 kDa (BDNF+tag) in presenza di rapamicina. C) l?immunoprecipitazione con anticorpo legante BDNF dimostra la capacit? del kit ELISA di rivelare la presenza di proBDNF (3) e BDNF maturo (4) mentre dal lisato delle cellule non trasfettate (1) o trasfettate con la sola unica-sec-TEV (2) non si immunoprecipita n? proBDNF n? BDNF. Il pro-TEVcs-BDNF viene scisso in BDNF maturo in presenza di unica-sec-TEV nelle cellule trasfettate in seguito all?aggiunta di 1-4 ?M rapamicina per 6 h. D) il BNDF maturo purificato da cellule eteroleghe di mammifero applicato a sezioni organotipiche ippocampali di ratto induce una fosforilazione della proteina ERK come mostrato da esperimenti di Western blot, a dimostrazione che ha un effetto biologico.
Figura 6. Aumento del numero e del volume delle spine dendritiche a seguito del controllo della maturazione del BDNF in neuroni vitali.
A) Rappresentazione dei plasmidi usati per transfettare le sezioni di cervello contenenti l?ippocampo.
B) Immagini dell?effetto dell?attivazione di unica-secTEV e della conseguente maturazione di BDNF sul numero di spine dendritiche in neuroni della regione CA1 di sezioni organotipiche di ippocampi murini. Grafici che mostrano gli aumenti % nel numero di spine dendritiche (C) e gli aumenti di volume (D) indotti dal controllo della maturazione di BDNF.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
GLOSSARIO
Tutti i termini scientifici e tecnici usati nel presente documento hanno lo stesso significato comunemente inteso da un esperto del settore, salvo ove diversamente indicato.
Nucleotidi e amminoacidi sono indicati secondo la nomenclatura IUPAC-IUB e/o mediante il codice a una lettera e/o codice a tre lettere (37 C.F.R. ? 1.822). Le sequenze nucleotidiche sono presentate solo per singolo filamento, nella direzione da 5' a 3', da sinistra a destra.
Metodi standard possono essere usati per clonare geni, amplificare e rivelare acidi nucleici, e tali tecniche sono note agli esperti del settore. Si vedano, per esempio, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2<nd >Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); Ausubel et al., Protocolli attuali in Biologia Molecolare (Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., New York), qui incorporati come riferimento.
Con il termine ?proteasi?, anche noto come ?proteinasi?, ?peptidasi? o ?enzima proteolitico?, si fa riferimento ad un enzima che sia in grado di catalizzare la rottura del legame peptidico tra il gruppo amminico e il gruppo carbossilico delle proteine. Il meccanismo di rottura del legame prevede l?impiego di una molecola di acqua, per questo le proteasi sono anche classificate come idrolasi. Le proteasi possono essere suddivise sulla base delle propriet? strutturali del substrato oggetto dell?attacco: le esopeptidasi catalizzano la rimozione di un amminoacido dalla parte carbossi terminale (carbossipeptidasi) o dall?estremit? N-terminale (aminopeptidasi); le endopeptidasi catalizzano la rottura di un residuo amminoacidico presente all?interno della catena polipeptidica e non alle estremit?.
Le proteasi possono essere anche classificate sulla base del residuo amminoacidico catalitico impiegato nel processo di attivazione della molecola di acqua utilizzata per effettuare l?idrolisi: queste includono proteasi a serina, proteasi a treonina, proteasi a cisteina, proteasi ad aspartato (acido aspartico), proteasi a glutammato (acido glutammico), o metalloproteasi.
Le proteasi possono essere ulteriormente classificate in base al pH ottimale per la loro attivazione: si distinguono pertanto proteasi alcaline, neutre, o acide.
Nella presente descrizione, l?acronimo ?TEV? ? utilizzato per identificare, a seconda del contesto, il ?Tobacco Etch Virus? e/o l?enzima endopeptidasi ?Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a? derivante dal Tobacco Etch Virus. Il Tobacco Etch Virus ? un virus patogeno per le piante appartenente alla famiglia dei Potyviridae, codificato da un filamento di RNA a polarit? positiva circondato da un capside costituito da una singola proteina virale.
Il genoma di TEV viene espresso per intero in una singola poliproteina dal peso di 350 kDa, la quale viene poi tagliata da 3 endoproteasi, tra cui la Nuclear-inclusion-A endopeptidase (NIa) sopracitata, meglio nota come ?proteasi TEV? (49 kDa). Secondo la classificazione MEROPS, questa proteasi appartiene alla famiglia ?PA? delle peptidasi C4 con struttura costituita da due foglietti? antiparalleli (Nunn et al., 2005; Phan et al., 2002). Sebbene omologa delle proteasi a serina, la proteasi TEV impiega una cisteina come sito catalitico nucleofilo.
La regione di taglio riconosciuta da TEV (TEVcs) ? una specifica sequenza di sette amminoacidi: ENLYFQ-S/G, dove la proteolisi avviene tra la Q e la S o la G (Dougherty et al., 1989). La TEV contiene inoltre una sequenza di auto-proteolisi (GHKVFM-S) nella porzione C-terminale tra i residui 213?219, che causa un taglio a livello di M218 (Kapust et al., 2001; Parks et al., 1995). In seguito ad auto-proteolisi ? osservata una perdita di attivit? in quanto la porzione peptidica tagliata (219? 242), va ad inibire il sito catalitico dell?enzima impedendo l?accesso al substrato (Nunn et al., 2005). Per questo motivo viene spesso introdotta una mutazione puntiforme che tronca la proteasi a livello della V219.
Il termine ?attivit? proteolitica? secondo la presente invenzione ha il significato comunemente riconosciuto nella tecnica, ovvero fa riferimento alla capacit? di una proteina di catalizzare l?idrolisi del legame peptidico all?interno di una sequenza amminoacidica. Tecniche volte a saggiare l?attivit? proteolitica di una proteina sono note al tecnico del settore. Tali tecniche includono saggi di attivit? enzimatica, ad esempio mediante l?impiego di costrutti caratterizzati da una coppia di fluorofori legati tra loro mediante la sequenza di taglio specifica della proteasi in esame.
?Peptide leader segnale" ha il significato comunemente noto nella tecnica, e si riferisce a corti peptidi (sequenze leader) presenti alla estremit? N-terminale della maggior parte delle proteine di nuova sintesi che sono destinate verso il pathway secretorio.
Con l?acronimo ?BDNF?, nella presente descrizione si intende il fattore neurotrofico cerebrale (in inglese ?brain-derived neurotrophic factor?), polipeptide presente a livello cerebrale nei mammiferi, appartenente alla famiglia delle neurotrofine, molecole che regolano il funzionamento delle cellule nervose. Il BDNF maturo ? attivo sia nel sistema nervoso centrale sia in quello periferico, e attraverso il recettore TrkB contribuisce alla plasticit? sinaptica, alla sopravvivenza e alla differenziazione dei neuroni. Il BDNF si ritrova in alte concentrazioni anche in alcuni tessuti periferici, in seguito all?attivazione delle piastrine che determina un significativo aumento della concentrazione ematica di BDNF. In generale, la concentrazione cerebrale di BDNF varia a seconda delle diverse condizioni fisiologiche (ormoni, stress, abitudini alimentari, attivit? fisica, processi infiammatori), e quindi pu? indicare la presenza di patologie neurodegenerative. Al contrario, il precursore del BDNF, denominato ?proBDNF?, pu? legarsi al recettore NGF/TNFRSF16 inducendo depressione sinaptica a lungo termine e apoptosi cellulare.
Come precedentemente menzionato, l?obiettivo della presente invenzione ? quello di fornire una proteasi ingegnerizzata caratterizzata da attivit? proteolitica chimicamente inducibile e controllabile dallo sperimentatore in maniera efficace. La strategia proposta nella presente invenzione per conferire ad una proteasi una attivit? proteolitica inducibile in maniera controllata prevede l?inserimento all?interno della sequenza polipeptidica della proteina di interesse di un dominio artificiale in grado di legare un agente attivatore. Il legame con tale agente attivatore si traduce in una modifica o cambiamento conformazionale del dominio artificiale che consente di ripristinare l?attivit? proteolitica della proteasi di interesse. Il vantaggio principale offerto da questa strategia ? rappresentato dalla possibilit? di ottenere una proteasi con attivit? inducibile caratterizzata da una singola catena polipeptidica, superando dunque i limiti derivanti dall?impiego di pi? costrutti e/o frammenti separati inattivi, come nel caso della split-TEV. Tali limiti comprendono, ad esempio, una pi? lenta attivit? catalitica della proteasi, una attivit? residua di background indipendente dall?induzione, nonch? una risposta proteolitica eterogenea derivante da una stechiometria variabile e non controllabile. La proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo l?invenzione pu? essere vantaggiosamente espressa sia nel citosol che nel pathway secretorio di una cellula di interesse, in modo controllabile dallo sperimentatore, e pu? pertanto essere impiegata per controllare la maturazione di proteine di interesse che siano soggette a taglio proteolitico all?interno di qualsiasi compartimento cellulare desiderato.
Oggetto dell?invenzione ? perci? una proteina con attivit? proteolitica inducibile comprendente la sequenza polipeptidica di una proteasi e la sequenza polipeptidica di un dominio legante un attivatore, in cui detto dominio in assenza di detto attivatore inibisce l?attivit? proteolitica di detta proteasi e in presenza di detto attivatore ripristina l?attivit? proteolitica di detta proteasi.
Preferibilmente, secondo un aspetto dell?invenzione, la sequenza polipeptidica di detto dominio legante un attivatore, potr? essere integrata all?interno della sequenza polipeptidica della proteasi di interesse, ad esempio in corrispondenza di un sito di inserimento presente all?interno della sequenza polipeptidica della proteasi, come descritto in seguito, in modo tale da formare una singola catena polipeptidica contigua. Ci? consente di ottenere una proteasi con attivit? proteolitica inducibile caratterizzata da un singolo costrutto, ovvero da una singola catena polipeptidica, superando i limiti precedentemente citati.
Secondo un aspetto dell?invenzione, l?integrazione della sequenza peptidica del dominio legante un attivatore all?interno della sequenza polipeptidica della proteasi pu? avvenire in corrispondenza di un sito di inserimento interno di detta sequenza proteica, anche dunque determinando una interruzione della sequenza della proteasi stessa, purch? tale inserimento non comprometta il ripristino dell?attivit? della proteasi a seguito dell?aggiunta di un composto attivatore.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto inserimento della sequenza polipeptidica del dominio legante un attivatore pu? avvenire tra un dominio A e un dominio B della sequenza peptidica della proteasi, in cui detti domini A e B corrispondono a due frammenti inattivi della proteasi che possano essere ricongiunti per ripristinare l?attivit? enzimatica della proteasi. Ad esempio, a seguito dell?aggiunta di un composto attivatore, il dominio legante detto attivatore pu? andare incontro ad una modifica conformazionale in grado di favorire la dimerizzazione dei due domini inattivi A e B, ripristinando l?attivit? enzimatica della proteasi.
Secondo un aspetto dell?invenzione, un dominio legante un attivatore idoneo ad essere impiegato nella presente invenzione, ? pertanto una qualsiasi sequenza peptidica la cui stabilit? termica e/o conformazione e/o distanza tra i suoi residui N-terminale e C-terminale sia dipendente in maniera specifica dal legame con e/o dal riconoscimento da parte di un agente attivatore.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto dominio legante un attivatore ? un dominio costituito dalla fusione del dominio FRB e FKBP. In altri termini, la sequenza peptidica del dominio legante un attivatore secondo la presente invenzione, pu? essere ottenuta dalla fusione delle sequenze dei due domini peptidici FRB e FKBP.
Con i termini ?dominio FRB? e ?dominio FKBP?, la presente descrizione si riferisce rispettivamente ai peptidi di fusione noti come ?FKBP-rapamycin binding? e ?FK506-binding protein? capaci di dimerizzare con elevata affinit? in seguito all?aggiunta di rapamicina. In una forma di realizzazione dell?invenzione, possono essere utilizzati i domini FRB e FKBP come descritti nell?articolo dal titolo ?Rational design of a ligand-controlled protein conformational switch? di O. Dagliyan et al. PNAS 2013, vol.110, no.17, qui incorporato come riferimento.
A seguito dell?interazione con l?agente attivatore, il dominio ottenuto dalla fusione delle sequenze dei domini FRB e FKBP subisce una modifica conformazionale che consente di ripristinare l?attivit? enzimatica della proteasi.
Secondo una forma di realizzazione, detto dominio legante un attivatore ? il dominio regolatore artificiale noto con la sigla ?uniRapR?. In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, detto dominio legante un attivatore ha la sequenza polipeptidica SEQ ID No.1.
Esempi di agenti attivatori secondo la presente invenzione, comprendono composti che siano in grado di riconoscere e/o legare la sequenza amminoacidica di detto dominio presente nella sequenza della proteina avente attivit? proteolitica inducibile, e di provocare una alterazione e/o modifica conformazionale di detto dominio in grado di ripristinare l?attivit? proteolitica di detta proteina. Il riconoscimento dell?agente attivatore da parte del dominio corrispondente potr? avvenire mediante formazione di un legame covalente o mediante interazione di natura non covalente, purch? in grado di provocare una modica conformazionale della struttura peptidica di detto dominio volta a ripristinare la attivit? proteolitica della proteina.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto attivatore e/o agente attivatore ? la rapamicina o un suo analogo. La rapamicina ? un antibiotico macrolide scoperto come prodotto di un batterio (Streptomyces hygroscopicus) in un campione di terreno proveniente da Rapa Nui. La rapamicina ? anche nota con il nome di ?Sirolimus?, un farmaco immunosoppressore che ha come bersaglio nei mammiferi una serina treonina chinasi (mTOR, da mammalian Target of Rapamycin) in grado di regolare la crescita, la proliferazione, la motilit? e la sopravvivenza cellulare.
Analoghi della rapamicina che possono essere impiegati per l?attivazione della proteasi oggetto della presente invenzione, includono, ad esempio, analoghi non immunosoppressori come ad esempio C-16-(S)-3-methylindolerapamycin (iRap), ma anche DL001, AP23573 , RAD001, CCI-779.
Secondo un aspetto della presente invenzione, la proteina con attivit? proteolitica inducibile comprende la sequenza polipeptidica di una proteasi appartenente alla famiglia delle peptidasi C4. Secondo il sistema di classificazione MEROPS delle proteasi, con il codice ?C4? si fa riferimento in particolare ad una famiglia di proteasi con attivit? endopeptidasica, aventi la cisteina come sito catalitico nucleofilo. Da un punto di vista strutturale, le proteasi appartenenti alla famiglia delle peptidasi C4 condividono un motivo centrale costituito da due foglietti ? antiparalleli, e un motivo di istidina-acido aspartico-cisteina (His/Asp/Cys), noto come triade catalitica, compreso tra i foglietti ?, in cui un residuo di istidina ? utilizzato per attivare il sito catalitico di cisteina rendendolo nucleofilo. Come precedentemente accennato, un esempio di proteasi appartenente alla famiglia delle peptidasi C4 ? rappresentato dalla proteasi TEV, o Nuclear-inclusion-a endopeptidase (NIa).
In una forma preferita di realizzazione, la proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle varianti ivi descritte, comprende la sequenza polipeptidica della proteasi TEV avente SEQ ID No.3 o SEQ ID No.4.
A seconda che si desideri indirizzare l?espressione della proteasi all?interno del citosol o all?interno del pathway secretorio, ad esempio nel lume del reticolo endoplasmatico (RE) di una cellula, la sequenza polipeptidica della proteina con attivit? proteolitica inducibile potr? comprendere la sequenza di un peptide leader di segnale nota nella tecnica, in grado di trasportare la proteina attaccata ad essa nel pathway secretorio. Diverse sequenze leader di segnale sono note nella tecnica e potranno essere selezionate da un esperto del settore a seconda della proteasi e della cellula bersaglio di interesse.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, la proteina con attivit? proteolitica inducibile comprende la sequenza polipeptidica della proteasi TEV comprendente la sequenza di un peptide leader segnale (sec) in corrispondenza dell?estremit? N-terminale, avente sequenza MGWSLILLFLVAVATGVHS (SEQ ID No: 11).
Secondo un aspetto dell?invenzione, la proteina secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte pu? comprendere una o pi? sequenze linker per il legame tra detta proteasi e detto dominio legante un attivatore. Esempi di sequenze linker che possono essere impiegate per il legame tra il dominio legante l?attivatore e la proteasi, includono sequenze amminoacidiche di diversa lunghezza, ad esempio comprendenti 1, 2, 3, 4, 5, o 6 residui amminoacidici. La lunghezza del linker pi? idonea potr? essere scelta a seguito di esperimenti come quelli riportati in Fig.3 della presente invenzione.
Secondo un aspetto dell?invenzione dette sequenze linker comprendono almeno un residuo di glicina (Gly). In una forma di realizzazione, detti linker hanno una delle seguenti sequenze: Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID No.2), Gly-Gly-Ser e Gly.
Secondo un aspetto dell?invenzione, due molecole linker identiche aventi una sequenza scelta tra Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID No.2), Gly-Gly-Ser o Gly possono essere legate alle due estremit? della sequenza del dominio legante un attivatore; la sequenza cos? ottenuta potr? essere a sua volta inserita all?interno della sequenza peptidica della proteasi di interesse.
Per mezzo di questa ingegnerizzazione, la proteasi potr? mantenere una efficace e costante attivit? in presenza di un agente attivatore, offrendo, rispetto alla controparte costitutivamente attiva, la possibilit? di controllare il processamento del substrato nel tempo.
Un ulteriore aspetto dell?invenzione riguarda una proteina secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte, in cui detta proteasi ? la proteasi TEV avente SEQ ID No.3 o SEQ ID No.
4. e in cui detto dominio ? inserito tra il residuo S120 e M121 rispetto alla SEQ ID No. 3 di detta proteasi.
La proteina con attivit? inducibile secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte potr? comprendere la sequenza polipeptidica di una proteasi caratterizzata dalla sostituzione e/o mutazione di uno o pi? amminoacidi rispetto alla sequenza amminoacidica nativa. Sostituzioni e/o mutazioni idonee nella sequenza amminoacidica di una proteasi sono quelle volte a: (1) incrementare l?attivit? proteolitica della proteasi, ad esempio velocizzando le cinetiche di taglio proteolitico e/o (2) limitare la possibilit? di inattivazione della proteasi, ad esempio a causa della N-glicosilazione che avviene tipicamente nel lume del RE in cellule di mammifero.
In una forma di realizzazione preferita, detta proteina avente attivit? proteolitica inducibile comprende la sequenza polipeptidica di una proteasi, in cui detta proteasi ? la proteasi TEV avente SEQ ID No.3 o SEQ ID No.4., e in cui nella sequenza di detta proteasi sono inserite una o pi? delle seguenti mutazioni: N23Q, T173G, C130S, I138T, S153N e T180A rispetto alla sequenza della proteasi TEV wild-type (SEQ ID No. 3). I siti di glicosilazione N23 e N171 inattivano l?enzima, pertanto le mutazioni N23Q e T173G possono essere inserite in corrispondenza di tali siti per impedirne la N-glicosilazione. La mutazione C130S pu? essere inserita per incrementare l?attivit? proteolitica della proteasi TEV nel lume del RE, come descritto nell?articolo di Casaratto et al.2015. Le mutazioni puntiformi I138T, S153N e T180A possono essere inserite al fine di incrementare le cinetiche (kcat/Km) di taglio proteolitico di TEV ingegnerizzata (unica-TEV/wtTEV = 2.81)(Sanchez, M. I., & Ting, A. Y., 2019). Queste mutazioni sono in grado di rendere la proteasi TEV ingegnerizzata oggetto dell?invenzione pi? veloce rispetto alla controparte split-TEV o TEV wild type.
In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta proteina con attivit? proteolitica inducibile ha SEQ ID No.5, ed ? denominata come ?unimolecular chemical-activatable TEV?, abbreviata come ?unica-TEV?.
Come gi? accennato, al fine di indirizzare l?espressione della proteasi TEV nel pathway secretorio, ovvero nel lume del reticolo endoplasmatico (RE) di cellule di interesse, ? possibile inserire la sequenza di un peptide leader segnale (sec) alla estremit? N-terminale della proteina, ad esempio un peptide segnale avente la sequenza: MGWSLILLFLVAVATGVHS (SEQ ID No: 11).
? pertanto anche oggetto dell?invenzione una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, avente SEQ ID No.6 e denominata come ?unica-sec-TEV?.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione si riferisce ad una sequenza nucleotidica codificante una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte.
Secondo una forma di realizzazione preferita, detta sequenza nucleotidica codifica una proteina con attivit? proteolitica inducibile avente SEQ ID No. 5 (unica-TEV) oppure SEQ ID No. 6 (unica-sec-TEV). In una forma di realizzazione, detta sequenza nucleotidica ha SEQ ID No.9 oppure SEQ ID No. 10.
? inoltre oggetto della presente invenzione anche un vettore per l?espressione di una proteina con attivit? proteolitica inducibile comprendente una sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte. Tale vettore potr? comprendere anche una sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte, legata operativamente a una o pi? sequenze regolatorie (ad esempio un promotore e/o una sequenza di terminazione), che consentano di controllare l?espressione, ovvero la trascrizione e la traduzione, di una proteina secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione dell?invenzione in una cellula ospite. Secondo un aspetto dell?invenzione, detto vettore potr? comprendere una sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte, legata operativamente a (i) una o pi? sequenze regolatorie come sopra definite e opzionalmente a (ii) una o pi? sequenze nucleotidiche e/o costrutti genetici quali sequenze leader, marker di selezione, marker di espressione o geni e/o elementi che possano aumentare o facilitare la trasformazione o l?integrazione del vettore nella cellula o nell?organismo ospite.
Esempi di vettori secondo l?invenzione includono molecole di DNA o RNA, preferibilmente DNA a doppio filamento. Vettori idonei ad essere impiegati secondo la presente invenzione includono vettori in una forma adatta alla trasformazione della cellula ospite o dell?organismo di interesse, vettori in una forma adatta per l?integrazione all?interno del DNA genomico della cellula ospite o dell?organismo di interesse, o ancora in una forma idonea per la replicazione autonoma all?interno della cellula o organismo di interesse. In particolare, tale vettore pu? essere un plasmide, un cosmide, YAC, un vettore virale o trasposone. Esempi di vettori virali adatti ad essere impiegati nella presente descrizione includono retrovirus, adenovirus, herpes simplex, virus del vaccino, e virus adenoassociati.
Un esperto del settore, a seconda delle cellule e dell?organismo di interesse, avr? informazioni sufficienti nella tecnica per selezionare il vettore ottimale per l?applicazione desiderata.
? oggetto della presente invenzione anche le proteine, i geni ed i vettori qui descritti secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione per uso in un metodo di trattamento, in particolare per uso in un metodo di trattamento mediante il controllo della maturazione di una proteina associata ad una patologia.
? oggetto della presente invenzione anche l?uso di una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte per il controllo della maturazione in una cellula di una proteina soggetta a taglio proteolitico.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detta proteina con attivit? proteolitica inducibile pu? essere impiegata per il controllo della maturazione di una proteina soggetta a taglio proteolitico nel citosol o in altri pathway secretori all?interno di una cellula, ad esempio nel lume del RE di una cellula. Esempi di proteine soggette a taglio proteolitico secondo l?invenzione, includono una qualsiasi proteina all?interno della quale la sequenza di taglio da parte di proteasi endogene sia stata mutata e/o sostituita da una sequenza di taglio che possa essere riconosciuta in maniera specifica dalla proteasi con attivit? proteolitica inducibile oggetto dell?invenzione.
Secondo una forma di realizzazione, detta proteina soggetta a taglio proteolitico ? il BDNF, e in particolare il suo precursore pro-BDNF. In una forma di realizzazione preferita, detta proteina soggetta a taglio proteolitico ? il pro-BDNF all?interno del quale la sequenza di riconoscimento da parte della furina/serina sia stata sostituita con la sequenza di taglio della proteasi TEV (TEVcs, ENLYFQ, SEQ ID No: 12). Come evidente dai risultati degli esperimenti di Western Blot e immunofluorescenza riportati in Figura 4, la sostituzione del sito di riconoscimento da parte della furina/serina all?interno della sequenza di pro-BDNF con il sito di taglio caratteristico TEVcs, consente di ottenere livelli di espressione della proteina pro-TEVcs-BDNF simili a quelli di proBDNF wild-type, suggerendo che tale modifica non ha un impatto sulla produzione o sulla degradazione della proteina.
Altri esempi non limitanti di proteine soggette a taglio proteolitico includono proteine che vanno incontro a maturazione proteolitica, quali ADAM10, la pro-insulina, la pro-interleukina-1b, la proorexina oppure molti proenzimi, come ad esempio le pro-caspasi, l?angiotensinogeno, il tripsinogeno o il plasminogeno.
? oggetto dell?invenzione anche l?uso di una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte in un procedimento di purificazione di proteine ricombinanti.
Secondo un aspetto dell?invenzione, tali proteine ricombinanti comprendono proteine soggette a taglio proteolitico selezionate fra quelle precedentemente menzionate, all?interno delle quali, ad esempio, la sequenza di taglio da parte di proteasi endogene sia stata mutata e/o sostituita con una sequenza di taglio specifica per il riconoscimento da parte della proteasi inducibile oggetto della presente invenzione. La sequenza di tali proteine ricombinanti potr? preferibilmente comprendere un elemento marcatore, ad esempio un tag di affinit? quale FLAG-tag, His-tag, strep-tag, tag-epitopo o simili che ne consenta la purificazione utilizzando una tecnica di affinit?. In tal modo, conseguentemente alla maturazione della proteina di interesse grazie all?aggiunta di un agente attivatore della proteasi con attivit? proteolitica inducibile (ad esempio, rapamicina), sar? possibile purificare la proteina di interesse mediante tecnica di affinit?, ad esempio mediante immunoprecipitazione, impiegando un reagente in grado di riconoscere e/o legare detto tag di affinit?.
Un ulteriore aspetto dell?invenzione riguarda un metodo per il controllo della maturazione in una cellula di una proteina soggetta a taglio proteolitico comprendente i seguenti passaggi:
a) Co-esprimere in una cellula una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte ed una proteina soggetta a taglio proteolitico;
b) Incubare detta cellula con l?attivatore di detta proteina con attivit? proteolitica in modo da indurre la maturazione di detta proteina.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detta proteina soggetta a taglio proteolitico ? una proteina all?interno della quale la sequenza originaria di taglio da parte di proteasi endogene sia mutata e/o sostituita da una sequenza di taglio specifica che possa essere riconosciuta dalla proteina con attivit? proteolitica inducibile oggetto dell?invenzione.
Secondo una forma di realizzazione preferita, in detto metodo, detta proteina soggetta a taglio proteolitico ? il BDNF, e in particolare il proBDNF nel quale i residui di riconoscimento da parte della furina e della plasmina (MRVRRH) siano stati mutati con la sequenza di taglio di TEV (ENLYFQ, SEQ ID No: 12).
Secondo un aspetto dell?invenzione, tale passaggio a) pu? essere effettuato utilizzando qualsiasi tecnica compresa nello stato della tecnica nell?ambito della biologia cellulare, coltura cellulare, ingegneria genetica, o simili, nonch? utilizzando una qualsiasi delle sequenze nucleotidiche o vettori precedentemente descritti. Preferibilmente, secondo un aspetto dell?invenzione, in detto metodo, detta cellula ? una cellula di mammifero.
Note le caratteristiche della proteina con attivit? proteolitica inducibile impiegata, l?esperto del settore potr? utilizzare nel passaggio b) del metodo ivi descritto un composto attivatore adeguato selezionato tra i composti precedentemente descritti.
Secondo un aspetto ulteriore dell?invenzione, detto metodo comprende un ulteriore passaggio c) di rivelazione della forma matura di detta proteina ottenibile con il passaggio b). Tale rivelazione pu? essere effettuata impiegando una qualsiasi tecnica nota nel settore, ad esempio mediante analisi elettroforesica, saggio immunoenzimatico, saggio colorimetrico.
Secondo una forma di realizzazione preferita, tale passaggio c) di rivelazione della proteina matura pu? essere effettuato mediante analisi elettroforesica su gel di SDS-poliacrilammide.
? anche oggetto dell?invenzione una proteina o sequenza nucleotidica o vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte per uso in un metodo di trattamento, in particolare per uso in un metodo di trattamento per il controllo della maturazione di una proteina associata ad una patologia.
ESEMPI
Materiali e metodi
I metodi per l?ottenimento della TEV ingegnerizzata nonch? la sua validazione funzionale
comprendono:
? Utilizzo di set specifici di primers descritti nella sezione ?Lista di sequenze?;
? Clonaggio di plasmidi e mutagenesi mediante il ?QuikChange site-directed mutagenesis kit? della Agilent Technologies, Inc;
? La reazione a catena della polimerasi (PCR);
? Trasformazione cellule competenti;
? Sequenziamento DNA;
? Trasfezione di cellule eterologhe;
? Reazione enzimatica;
? Western blot.
Nello specifico, per ciascuna mutagenesi ? stato utilizzato il seguente protocollo:
1) Aggiungere a 35.5 ?l di H2O bidistillata 5 ?l di 10? reaction buffer (Agilent Technologies); 5
?l dNTP mix (stock 10 mM); 1.25 ?l primer forward (stock 20 ?M); 1.25 ?l primer reverse (stock 20
?M); 1 ?l di plasmide 0.1 ?g/?l; 1 ?l di PfuTurbo DNA polymerase (Agilent Technologies);
2) PCR:
a) 95?C per 30 s;
b) 95?C per 30 s;
c) 55?C per 60 s;
d) 72?C per 1 min/kb di plasmide;
Ripetere b, c, d per 16 cicli;
3) Aggiungere 1 ?l di DpnI restriction endonuclease (Agilent Technologies) e incubare a 37?C
per 1 h;
4) Usare 2 ?l della soluzione finale per trasformare le cellule competenti;
5) Scegliere alcune colonie, estrarre il plasmide e sequenziare.
Per ingegnerizzare ciascuna delle due TEV e inserire il costrutto ?UniRapR? ? stata eseguita la
Gibson Assembly. Sono state effettuate inizialmente 2 PCR distinte:
6) Nella prima PCR ? stata utilizzata la soluzione 1), con primers specifici, con il DNA templato di
TEV e le seguenti condizioni di reazione:
a) 95?C per 30 s;
b) 95?C per 30 s;
c) 66?C per 60 s;
d) 72?C per 1 min/kb di plasmide;
Ripetere b, c, d per 25 cicli;
7) Nella seconda PCR ? stata utilizzata la soluzione 1), con primers specifici, con il DNA templato
di UniRapR con e le seguenti condizioni di reazione:
e) 95?C per 30 s;
f) 95?C per 30 s;
g) 72?C per 60 s;
h) 72?C per 1 min/kb di plasmide;
Ripetere b, c, d per 25 cicli;
8) Caricare parte del prodotto della PCR su gel di agalosio allo 0.7% e separare il DNA mediante
elettroforesi al fine di valutare la qualit? dell?amplificato;
I prodotti della PCR ammontano a 6783 bp per il plasmide di TEV aperto, 6213 bp per il
plasmide di sec-TEV aperto e ~600 per il frammento di UniRapR da inserire.
9) Aggiungere 1 ?l di DpnI restriction endonuclease (Agilent Technologies) e incubare a 37?C per
1 h;
10) Preparare la reazione di Gibson Assembly; unire a 6 ?l di H2O bidistillata 2 ?l di amplificato di
PCR proveniente dal plasmide di TEV e 2 ?l di amplificato di PCR proveniente dal frammento di
UniRap amplificato. Aggiungere i 10 ?l cos? ottenuti alla Master Mix Gibson Assebly (Gibson
Assembly? Cloning Kit, NEB). Incubare 1 h a 50?C.
11) Usare 2 ?l della soluzione finale per trasformare le cellule competenti;
12) Scegliere alcune colonie, estrarre il plasmide e sequenziare;
Attivit? enzimatica di unica-TEV in cellule vitali
13) Usare la proteina ricombinante sintetica CFP-TEVcs-YFP come substrato;
Questo costrutto artificiale possiede due fluorofori coniugati dalla sequenza di taglio riconosciuta da TEV (TEVcs). ? stato utilizzato l?anticorpo antiGFP (Biolegend) per verificare il taglio di CFP-TEVcs-YFP da parte di unica-TEV.
Per farlo, sono state trasfettate (PEI MAX - Polysciences, Inc.) cellule HEK293T con i plasmidi che codificano per TEV wild-type costitutivamente attiva (pcDNA-TEV), e TEV ingegnerizzata con UniRapR (pcDNA-unica-TEV) e lasciate crescere per 24-48 h a 37?C, 5% CO2.
Per entrambi ? stata co-trasfettata CFP-TEVcs-YFP.
Dopo 24h le cellule sono state trattate per 1-3 h con rapamicina (1 ?M) o DMSO come controllo. Le cellule sono state lavate con PBS freddo e lisate con buffer di lisi contenente rapamicina (1 ?M) o DMSO. Il 10 % del volume dei campioni ? stato preparato (aggiunta di 2?Laemmli protein sample buffer bollitura per 5 min) per l?analisi elettroforesica su gel di SDS-poliacrilammide.
Attivit? enzimatica di unica-secTEV in cellule vitali
Usare la proteina ricombinante umana pro-TEVcs-BDNF come substrato;
Il proBDNF ? stato mutagenizzato al fine di presentare, al posto della canonica sequenza di taglio (MRVRRH) la sequenza di taglio (TEVcs) riconosciuta dalla TEV (ENLYFQ). ? stato utilizzato l?anticorpo antiHA (Biolegend) per verificare il taglio di pro-TEVcs-BDNF in BDNF maturo da parte di unica-TEV.
Per farlo sono state trasfettate (PEI MAX - Polysciences, Inc.) cellule HEK293T con i plasmidi che codificano per TEV wild type costitutivamente attiva (pcDNA-secTEV-SV5), e unica-TEV ingegnerizzata (pcDNA-unica-secTEV -SV5) e lasciate crescere per 24-48 h a 37?C, 5% CO2. Per entrambi ? stato co-trasfettato pro-TEVcs-BDNF (HA-pro-TEVcs-BDNF-Flag-SEP).
Dopo 24h le cellule sono state trattate per 1-3 h con rapamicina (1 ?M) o DMSO come controllo. Le cellule sono state lavate con PBS freddo e lisate con buffer di lisi contenente rapamicina (1 ?M) o DMSO. Il 10 % del volume dei campioni ? stato preparato (aggiunta di 2?Laemmli protein sample buffer bollitura per 5 min) per l?analisi elettroforesica su gel di SDS-poliacrilammide.
Produzione BDNF purificato
Sono state trasfettate (PEI MAX - Polysciences, Inc.) le cellule HEK293T con i plasmidi che codificano per unica-secTEV (pcDNA-unica-secTEV -SV5) e pro-TEVcs-BDNF (HA-pro-TEVcs-BDNF-Flag-SEP) e lasciate per 24 h a 37?C, 5% CO2.
Dopo 24 h le cellule sono state trattate per 1-3 h con rapamicina (1 ?M) o DMSO come controllo. Le cellule sono state lavate con PBS freddo e lisate con buffer di lisi contenente rapamicina (1 ?M) o DMSO. Il lisato ? stato immunoprecipitato con FLAG-M2-beads per 1 h ed ? stato successivamente aggiunto FLAG peptide (sigma F3290-4mg). Dopo 1 h sono state rimosse le biglie mediante Micro bio-spin colums? - Bio-Rad. La proteina eluita ? stata conservata a -20?C. Una volta quantificata mediante kit ELISA commercialmente disponibili ? stato testato il suo effetto biologico come descrtitto in Fig.6.
LISTA SEQUENZE NELLA DESCRIZIONE
SEQ ID No:1 Sequenza peptidica del dominio legante un attivatore TCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGA TGHGSGSGSGVKDLLQAWDLYYHVFRRISGPPGPGSGLWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKG MFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGSSGGSGSGIIPPHATLVF DVELLKLE
SEQ ID No:2 Sequenza peptidica di una molecola linker
GGSGGG
SEQ ID No:3 Sequenza peptidica della proteasi TEV wild-type GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVK NTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPS SDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWV SGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN
SEQ ID No:4 Sequenza peptidica della proteasi sec-TEV MGWSLILLFLVAVATGVHSQGESLFKGPRDYNPISSTICHLTQESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLF RRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTN FQTKSMSSMVSDTSSTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFGNTNNYFT SVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMSKPEEPFQPVKEATQLMNEGGLE
SEQ ID No:5 Sequenza peptidica della proteasi ingegnerizzata unica-TEV GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVK NTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSGGSTCVVHYTGML EDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHGSGSGS GVKDLLQAWDLYYHVFRRISGPPGPGSGLWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHA MMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGSSGGSGSGIIPPHATLVFDVELLKLEGG SMSSMVSDTSCTFPSSDGTFWKHWIQTKDGQCGNPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFASVP KNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN
SEQ ID No:6 Sequenza peptidica della proteasi ingegnerizzata unica-sec-TEV MGWSLILLFLVAVATGVHSQGAQGESLFKGPRDYNPISSTICHLTQESDGHTTSLYGIGFGPFIITN KHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICL VTTNFQTKSGGSTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQR AKLTISPDYAYGATGHGSGSGSGVKDLLQAWDLYYHVFRRISGPPGPGSGLWHEMWHEGLEEA SRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGSSGG SGSGIIPPHATLVFDVELLKLEGGSMSSMVSDTSSTFPSSDGTFWKHWIQTKDGQCGNPLVSTRD GFIVGIHSASNFGNTNNYFASVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMSKPEE PFQPVKEATQLMNEGGLE
SEQ ID No:7 Sequenza nucleotidica della proteasi TEV wild-type ATGGGAGAAAGCTTGTTTAAGGGGCCGCGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCAT TTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATC ATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTG TATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAA TTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAG GGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTC AGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGTATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAG GATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCA GCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGT TGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAACGCTGACTCAGTATTG TGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAACCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGC GACTCAACTCATGAAT
SEQ ID No:8 Sequenza nucleotidica della proteasi sec-TEV ATGGGCTGGAGCCTGATCCTCCTGTTCCTCGTCGCTGTGGCTACAGGTGTGCACTCTCAGatg GGGGAAAGCCTGTTCAAGGGACCAAGGGACTACAATCCAATCTCCTCAACTATCTGCCACCT GACTcAgGAAAGCGACGGACATACCACATCTCTGTACGGAATTGGCTTCGGGCCCTTCATCAT TACTAACAAGCACCTGTTTCGGAGAAACAATGGCACCCTGCTGGTGCAGAGTCTGCACGGGG TGTTCAAGGTCAAAAATACTACCACACTGCAGCAGCATCTGATTGACGGACGAGATATGATCA TTATCCGGATGCCAAAGGACTTCCCCCCTTTTCCCCAGAAGCTGAAGTTCCGGGAGCCCCAG AGGGAGGAACGCATCTGCCTGGTGACTACCAACTTCCAGACCAAATCCATGAGCTCCATGGT CTCCGACACCTCTTcTACATTCCCTTCTAGTGATGGCATCTTCTGGAAGCACTGGATCCAGAC AAAAGACGGACAGTGCGGCAGTCCACTGGTGTCAACCAGAGATGGGTTTATTGTCGGAATCC ATTCAGCCAGCAACTTCggAAATACTAACAATTACTTCACCTCTGTGCCCAAAAACTTCATGGA GCTGCTGACTAATCAGGAAGCACAGCAGTGGGTGAGCGGATGGCGCCTGAATGCTGATTCC GTGCTGTGGGGCGGGCATAAGGTCTTCATGAGCAAACCTGAAGAGCCATTTCAGCCCGTCAA GGAAGCCACCCAGCTGATGAaCGAAggGGgCctggaA
SEQ ID No:9 Sequenza nucleotidica della proteasi ingegnerizzata unica-TEV ATGGGAGAAAGCTTGTTTAAGGGGCCGCGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCAT TTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATC ATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTG TATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAA TTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAG GGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCggtggatcaacctgcgtggtgcac tacaccgggatgcttgaagatggaaagaaatttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtg atccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccact gggcacggttcgggctccggatcaggcgtcaaggacctcctccaagcctgggacctctattatcatgtgttccgacgaatctcaggtcctcc aggacctggatcaggtctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgtttgtactttggggaaaggaacgtgaaagg catgtttgaggtgctggagcccttgcatgctatgatggaacggggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatcaggcctatggtcga gatttaatggaggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggtcatcagggggctccggatcaggcatcatcccaccacatg ccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaggtggatcaATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCA CATTCCCTTCATCTGATGGTACGTTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTG GCAATCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCAC CAACACAAACAATTATTTCGCAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGA GGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAACGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCAT AAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAACCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATG AAT
SEQ ID No:10 Sequenza nucleotidica della proteasi ingegnerizzata unica-sec-TEV ATGGGCTGGAGCCTGATCCTCCTGTTCCTCGTCGCTGTGGCTACAGGTGTGCACTCTCAGGG CGCGCAAGGGGAAAGCCTGTTCAAGGGACCAAGGGACTACAATCCAATCTCCTCAACTATCT GCCACCTGACTcAgGAAAGCGACGGACATACCACATCTCTGTACGGAATTGGCTTCGGGCCCT TCATCATTACTAACAAGCACCTGTTTCGGAGAAACAATGGCACCCTGCTGGTGCAGAGTCTGC ACGGGGTGTTCAAGGTCAAAAATACTACCACACTGCAGCAGCATCTGATTGACGGACGAGAT ATGATCATTATCCGGATGCCAAAGGACTTCCCCCCTTTTCCCCAGAAGCTGAAGTTCCGGGAG CCCCAGAGGGAGGAACGCATCTGCCTGGTGACTACCAACTTCCAGACCAAATCCggtggatcaac ctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaatttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggc aagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatg cctatggtgccactgggcacggttcgggctccggatcaggcgtcaaggacctcctccaagcctgggacctctattatcatgtgttccgacga atctcaggtcctccaggacctggatcaggtctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgtttgtactttggggaaag gaacgtgaaaggcatgtttgaggtgctggagcccttgcatgctatgatggaacggggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatca ggcctatggtcgagatttaatggaggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggtcatcagggggctccggatcaggcatc atcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaggtggatcaATGAGCTCCATGGTCTCCGACA CCTCTTcTACATTCCCTTCTAGTGATGGCAcCTTCTGGAAGCACTGGATCCAGACAAAAGACG GACAGTGCGGCAaTCCACTGGTGTCAACCAGAGATGGGTTTATTGTCGGAATCCATTCAGCCA GCAACTTCggAAATACTAACAATTACTTCgCCTCTGTGCCCAAAAACTTCATGGAGCTGCTGAC TAATCAGGAAGCACAGCAGTGGGTGAGCGGATGGCGCCTGAATGCTGATTCCGTGCTGTGG GGCGGGCATAAGGTCTTCATGAGCAAACCTGAAGAGCCATTTCAGCCCGTCAAGGAAGCCAC CCAGCTGATGAaCGAAggGGgCctggaA
SEQ ID No:11 Sequenza peptidica del peptide leader segnale
MGWSLILLFLVAVATGVHS
SEQ ID No:12 Sequenza peptidica di taglio della proteasi TEV
ENLYFQ
Lista dei primers impiegati per realizzare le mutagenesi
SEQ ID No:13 Sequenza nucleotidica del primer RV TEV_I138T CCAATGCTTCCAGAACGTACCATCAGATGAAGGGAATGTGCAA SEQ ID No:14 Sequenza nucleotidica del primer FW TEV_I138T TTGCACATTCCCTTCATCTGATGGTACGTTCTGGAAGCATTGG SEQ ID No:15 Sequenza nucleotidica del primer RV TEV_S153N TTGATACTAATGGATTGCCACACTGCCCATCCTTG SEQ ID No:16 Sequenza nucleotidica del primer FW TEV_S153N CAAGGATGGGCAGTGTGGCAATCCATTAGTATCAA SEQ ID No:17 Sequenza nucleotidica del primer RV TEV_T180A GTTTTTCGGCACGCTTGCGAAATAATTGTTTGTGTTGGTGAA SEQ ID No:18 Sequenza nucleotidica del primer FW TEV_T180A TTCACCAACACAAACAATTATTTCGCAAGCGTGCCGAAAAAC SEQ ID No:19 Sequenza nucleotidica del primer RV secTEV_I138T CCAGTGCTTCCAGAAGGTGCCATCACTAGAAGG SEQ ID No:20 Sequenza nucleotidica del primer FW secTEV_I138T CCTTCTAGTGATGGCACCTTCTGGAAGCACTGG SEQ ID No:21 Sequenza nucleotidica del primer RV secTEV_S153N
GACACCAGTGGATTGCCGCACTGTCCGTC
SEQ ID No:22 Sequenza nucleotidica del primer FW secTEV_S153N GACGGACAGTGCGGCAATCCACTGGTGTC SEQ ID No:23 Sequenza nucleotidica del primer RV secTEV_T180A GTTTTTGGGCACAGAGGCGAAGTAATTGTTAGTATTTCCGA SEQ ID No:24 Sequenza nucleotidica del primer FW secTEV_T180A TCGGAAATACTAACAATTACTTCGCCTCTGTGCCCAAAAAC SEQ ID No:25 Sequenza nucleotidica del primer FW pro-TEVcs-BDNF (MRV?ENL) gggtcagagtggcgccggagattctcggacatgtttgcagcatct
SEQ ID No:26 Sequenza nucleotidica del primer RV pro-TEVcs-BDNF (MRV?ENL) agatgctgcaaacatgtccgagaatctccggcgccactctgaccc
SEQ ID No:27 Sequenza nucleotidica del primer FW pro-TEVcs-BDNF (RRH?YFQ) ccctcggcgggcagggtcagactggaaatagagattctcggacatgtttgc
SEQ ID No:28 Sequenza nucleotidica del primer RV pro-TEVcs-BDNF (RRH?YFQ) gcaaacatgtccgagaatctctatttccagtctgaccctgcccgccgaggg
Primers usati per la Gibson Assembly Reaction
SEQ ID No:29 Sequenza nucleotidica del primer FW Inserto_TEV-UniRap CAACTTCCAAACTAAGAGCGGTGGATCAACCTGCGTGG SEQ ID No:30 Sequenza nucleotidica del primer RV Inserto_TEV-UniRap TGACACCATGCTAGACATTGATCCACCTTCCAGTTTTAGAAGCT SEQ ID No:31 Sequenza nucleotidica del primer FW Open_TEV120/121 ATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAG SEQ ID No:32 Sequenza nucleotidica del primer RV Open_TEV120/121 GCTCTTAGTTTGGAAGTTGGTTGT SEQ ID No:33 Sequenza nucleotidica del primer FW Inserto_SecTEV-UniRap CCAACTTCCAGACCAAATCCGGTGGATCAACCTGCGTGGTGCACTACACCGG SEQ ID No:34 Sequenza nucleotidica del primer RV Inserto_SecTEV-UniRap TGACACCATGCTAGACATTGATCCACCTTCCAGTTTTAGAAGCT
SEQ ID No:35 Sequenza nucleotidica del primer FW Open_SecTEV120/121 ATGAGCTCCATGGTCTCCGACAC SEQ ID No:36 Sequenza nucleotidica del primer RV Open_SecTEV120/121 GGATTTGGTCTGGAAGTTGGTAG
Claims (23)
1. Proteina con attivit? proteolitica inducibile comprendente la sequenza polipeptidica di una proteasi e la sequenza polipeptidica di un dominio legante un attivatore, in cui detto dominio in assenza di detto attivatore inibisce l?attivit? proteolitica di detta proteasi e in presenza di detto attivatore ripristina l?attivit? proteolitica di detta proteasi.
2. Proteina secondo la rivendicazione 1, in cui detto dominio ? un dominio costituito dalla fusione del dominio FRB e FKBP.
3. Proteina secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto dominio ha la sequenza polipeptidica SEQ ID No.1.
4. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto attivatore ? la rapamicina o un suo analogo.
5. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detta proteasi appartiene alla famiglia delle peptidasi C4.
6. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detta proteasi ? la proteasi TEV avente SEQ ID No.3 o SEQ ID No.4.
7. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detto dominio ? inserito tra il dominio A e B di detta proteasi, in cui detti domini A e B corrispondono a due frammenti inattivi di detta proteasi.
8. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui detta proteina comprende una o pi? sequenze linker per il legame tra detta proteasi e detto dominio.
9. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detti linker hanno una delle seguenti sequenze: Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID No.2), Gly-Gly-Ser e Gly.
10. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, in cui detta proteasi ? la proteasi TEV avente SEQ ID No.3 SEQ ID No.4. e in cui detto dominio ? inserito tra il residuo S120 e M121 di detta proteasi.
11. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, in cui detta proteasi ? la proteasi TEV avente SEQ ID No.3 o SEQ ID No.4., in cui nella sequenza di detta proteasi sono inserite una o pi? delle seguenti mutazioni N23Q, T173G, C130S, I138T, S153N e T180A.
12. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui detta proteina con attivit? proteolitica inducibile ha SEQ ID No.5 (unica-TEV).
13. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui detta proteina con attivit? proteolitica inducibile ha SEQ ID No.6 (unica-sec-TEV).
14. Sequenza nucleotidica codificante una proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13.
15. Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 14, in cui detta proteina con attivit? proteolitica inducibile ha SEQ ID No.5 (unica-TEV) o SEQ ID No.6 (unica-sec-TEV).
16. Vettore per l?espressione di una proteina con attivit? proteolitica inducibile comprendente una sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 14 o 15.
17. Uso di una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 per il controllo della maturazione in una cellula di una proteina soggetta a taglio proteolitico.
18. Uso secondo la rivendicazione 17 per il controllo nel citosol o in altri pathway secretori.
19. Uso secondo la rivendicazione 17 o 18, in cui detta proteina soggetta a taglio proteolitico ? il BDNF.
20. Uso di una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 in un procedimento di purificazione di proteine ricombinanti.
21. Metodo per il controllo della maturazione in una cellula di una proteina soggetta a taglio proteolitico comprendente i seguenti passaggi:
a) Coesprimere in una cellula una proteina con attivit? proteolitica inducibile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 ed una proteina soggetta a taglio proteolitico b) Incubare detta cellula con l?attivatori di detta proteina con attivit? proteolitica in modo da indurre la maturazione di detta proteina.
22. Metodo secondo la rivendicazione 21, in cui ? indotta la maturazione della proteina BDNF.
23. Proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 o sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 15 o vettore secondo la rivendicazione 16 per uso in un metodo di trattamento, in particolare per uso in un metodo di trattamento per il controllo della maturazione di una proteina associata ad una patologia.
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