IT202000016948A1 - Metodo analitico di rilevazione di sars-cov-2 di facile utilizzo e relativo kit monouso miniaturizzato - Google Patents
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Description
METODO ANALITICO DI RILEVAZIONE DI SARS-CoV-2 DI FACILE
UTILIZZO E RELATIVO KIT MONOUSO MINIATURIZZATO
La presente invenzione riguarda un metodo analitico per il rilevamento di SARS-CoV-2 facile da utilizzare ed il relativo kit monouso miniaturizzato. In particolare, la presente invenzione riguarda un metodo di semplice impiego per il rilevamento in vitro di SARS-CoV-2 in un campione liquido, come la saliva. La diffusione del nuovo coronavirus SARS-CoV-2 nel mondo ha generato l'avvenimento pandemico COVID-19 come dichiarato dall'Organizzazione Mondiale della Sanit? (OMS) nel marzo 2020. L'enorme problema ? amplificato dall'alta infettivit? e dall'assenza di vaccini e farmaci specifici necessari per la gestione di tale focolaio infettivo, quindi per contenere la diffusione di COVID-19, si rende necessaria un'analisi rapida e in loco.
L'evento pandemico della nuova infezione da coronavirus SARS-CoV-2 ? ufficialmente iniziato il 31 dicembre 2019 quando le autorit? sanitarie cinesi hanno segnalato all'Ufficio Nazionale dell'OMS una polmonite da causa sconosciuta, rilevata nella citt? di Wuhan. Dopo, il 5 gennaio 2020, l'OMS ha pubblicato le prime notizie sull'epidemia patologica causata dal nuovo virus riportando una valutazione del rischio e le informazioni sulla risposta dei pazienti e sulle condizioni della salute pubblica circa i casi di polmonite comparsi a Wuhan. Il 12 gennaio 2020 la Cina ha condiviso la sequenza genetica del coronavirus SARS-CoV-2 e il giorno seguente in Tailandia ? stato registrato il primo caso al di fuori dei confini cinesi. L'11 febbraio, l'OMS ha definito col nome di COVID-19 la malattia causata dal SARS-CoV-2 (COrona Virus Disease 2019) e il mese successivo sempre l'OMS ha segnalato COVID-19 come epidemia pandemica, con impatto in tutto il mondo. Ad esempio, ad oggi si riscontrano ancora pi? di 50.000 infezioni al giorno solo negli Stati Uniti.
In Europa, il Presidente della Commissione Europea ha indicato come priorit? assoluta la tutela della salute e del benessere dei cittadini, mediante l?uso di tutti i mezzi disponibili, con il coordinamento di tutti gli Stati membri [https://www.who.int/news-room/detail/ 27-04-2020-who-timeline --- covid-19]. Sono state prese diverse contromisure per affrontare questo imprevisto evento pandemico, tra cui una strategia europea per accelerare lo sviluppo, la produzione e la distribuzione di vaccini contro COVID-19 , per garantire la disponibilit? di attrezzature ed equipaggiamenti, agevolazione dei trasporti, quattro diversi bandi per apparecchiature e forniture mediche, la garanzia della disponibilit? delle forniture, l'assegnazione e l'uso di medicinali salvavita evitando carenze di disponibilit?, procedure e linee guida per metodologie di alta qualit? relative a test per il coronavirus, comprensive di strumenti analitici per la rilevazione del virus SARS-CoV-2 e per monitorare la risposta immunitaria del corpo umano all'infezione [https://ec.europa.eu/info/livework-travel-eu / health / coronavirus-response / publichealth_en].
Come sottolineato dall'UE, uno dei principali pilastri ? rappresentato dall'analisi, infatti la rilevazione rapida e accurata ? tremendamente importante per la gestione di COVID-19, rappresentando il passaggio chiave per l?identificazione delle persone infette, in particolare dei soggetti asintomatici, permettendo di prendere tempestivamente le corrette contromisure.
Per valutare la risposta immunitaria del corpo umano all'infezione, sono stati descritti e sono presenti sul mercato diversi test sierologici. Per esempio, il qSARS-CoV-2 IgG / IgM test Rapido prodotto da Cellex, un kit immunocromatografico a flusso laterale per rilevare anticorpi IgM e IgG sviluppati contro il virus della SARS-CoV-2. Tuttavia, tale kit non indica quali epitopi delle proteine S, N, E e M del virus sono in grado di legare le IgM e le IgG presenti nel sangue del paziente. La Diagnostic Systems Chembio mette a disposizione il COVID-19 Sistema IgG / IgM, riferendo che l'individuazione degli anticorpi avviene utilizzando le proteine come bersaglio. VITROS Immunodiagnostic Products Ant-SARS-CoV2 Total Reagent Pack,
? un test ELISA che utilizza la proteina S come target [ TEST CLINICO 1 PER COVID-19 , Journal of Allergy and Clinical Immunology , https:
//doi.org/10.1016/j.jaci.2020.05.012 ] .
Per quanto riguarda il tipo di kit sopra menzionati, l'UE ha riferito nel 2020 / C 122 I / 01 che ?L'efficacia dei test anticorpali nella diagnosi precoce di COVID-19 ? molto limitata perch? gli anticorpi diventano rilevabili nel sangue del paziente solo diversi giorni dopo l'infezione. Questo dipende da un lato dal sistema immunitario dell'individuo e dall'altro dalla sensibilit? della tecnica impiegata. Inoltre, gli anticorpi persistono per qualche tempo dopo che l'infezione ? scomparsa. Non offrono una risposta definitiva sulla presenza od assenza di SARS-CoV-2 e quindi non sono adatti a valutare se l'individuo testato pu? essere contagioso per gli altri"[EUROPEAN COMMISSION COMMUNICATION FROM THE COMMISSION Guidelines on COVID-19 in vitro diagnostic tests and their performance (2020/C 122 I/01)]. In ogni caso, l'utilit? di questi test si basa sulla loro efficacia nello screening sieroepidemiologico su larga scala sulla popolazione, per la valutazione e la gestione della pandemia quando questa ? sotto controllo, tuttavia con essi non si pu? escludere che il paziente, pur avendo sviluppato una difesa immunitaria, non sia ancora contagioso.
Per quanto riguarda il rilevamento del virus, la quantificazione di SARS-CoV-2 alle basse cariche virali rappresenta l?aspetto pi? problematico nella diagnosi rapida di COVID-19 perch? il rilevamento di SARS-CoV-2 all'inizio dell'infezione ? la principale condizione per un approccio di successo per una efficace gestione di COVID-19 e per limitare la diffusione del contagio virale.
Per rilevare il virus SARS-CoV-2, l'approccio consigliato dall'OMS e dal Centro europeo per la prevenzione e il controllo delle malattie (ECDC) ? rappresentato dalla quantificazione del materiale genetico virale, mediante l?amplificazione a catena della polimerasi nelle secrezioni nasali o della gola (ossia tamponi nasali o faringei). Tuttavia, questo metodo richiede almeno 3 ore, un laboratorio appositamente attrezzato e personale specializzato. L'altro approccio si basa sul rilevamento di antigeni come le proteine virali di superficie, base per lo sviluppo di sistemi di biosensing intelligenti e affidabili [Morales-Narv?ez, E., & Dincer, C. (2020). Morales-Narv?ez, E., & Dincer, C. (2020). The impact of biosensing in a pandemic outbreak: COVID-19. Biosensors and Bioelectronics, 112274].].
In dettaglio, SARS-CoV-2 ? un coronavirus con dimensioni comprese tra 50 e 200 nm di diametro, consistente in un virus con singolo filamento di acido ribonucleico (RNA) a polarit? positiva, caratterizzato da un involucro con glicoproteine superficiali, tra le quali la proteina transmembranaria Spike (S), le proteine E ed M. La proteina S viene scissa da una proteasi furin-like, nei due polipeptidi separati S1 e S2 ed ? caratterizzata da un'affinit? con l?enzima di conversione dell?angiotensina 2 (ACE2) dell?ospite, o Angiotensin-converting enzyme 2 che quindi viene utilizzato come recettore del virus. La proteina N avvolge a spirale il genoma virale in ?perle? con una conformazione a stringa mentre la proteina E si trova in piccole quantit? incorporate nella membrana dell'involucro virale derivata dalla cellula ospite. La proteina M ? la proteina strutturale pi? abbondante con due diverse conformazioni per favorire la curvatura della membrana e legarsi al nucleocapside.
La proteina del nucleocapside (proteina N) ? una fosfoproteina altamente immunogenica ed ? normalmente molto conservata. La proteina N del coronavirus ? spesso usata come marker nei test diagnostici per la SARS (Fehr A.R. and Perlman S., 2015. Coronaviruses: An Overview of Their Replication and Pathogenesis Helena Jane Maier et al. (eds.), Coronaviruses: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1282, DOI 10.1007/978-1-4939-2438-7_1, ? Springer Science+Business Media New York 2015). Secondo altri autori, l'antigene N della SARS-CoV -2 ha una elevata sensibilit? nella fase iniziale della SARS, che potrebbe essere utile per la diagnosi precoce (Di, B. Hao W., Gao Y., Wang M., Wang Y., Qiu L., Wen K., Zhou D.,, Wu X., Lu E., Liao Z., Mei Y., Zheng B., and Che X., (2005). Monoclonal antibody-based antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay reveals high sensitivity of the nucleocapsid protein in acute-phase sera of severe acute respiratory syndrome patients. Clinical and diagnostic laboratory immunology, 12(1), 135-140<]>). Ci? indica che il rilevamento dell'antigene pu? svolgere un ruolo importante nella diagnosi precoce. Pi? recentemente Diao et al., 2020 ( Diao B., Wen K., Chen J., Liu Y., Yuan Z., Han C., Chen J., Pan Y. ?Chen L., Dan Y., Wang J., Chen Y., Deng G., Zhou H., Wu Y. , 2020 Diagnosis of Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection by Detection of Nucleocapsid Protein. On line medRxiv doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.07.20032524), riferiscono che un dosaggio proteico del nucleocapside ? un metodo accurato, rapido, precoce e semplice per la diagnosi di COVID-19 nelle urine e nel tampone nasofaringeo, applicando un test immunocromatografico a fluorescenza per titolare la proteina nucleocapsidica di SARS-CoV -2 nei campioni da tampone rinofaringeo e nelle urine, con una risposta entro 10 minuti. Dopo aver confrontato le loro titolazioni della proteina N con i dati raccolti sugli stessi campioni con il test degli acidi nucleici (PCR), gli autori hanno concluso che il loro metodo di titolazione dell'antigene N pu? garantire una diagnosi precoce negli ospedali, inoltre pu? essere usato negli screening test in ampia scala sulla popolazione.
Le proteine N e S2 condividono una struttura altamente conservata con SARS-CoV, mentre la sottounit? S1 ? meno conservata e pi? altamente specifica di SARS-CoV-2, quindi queste proteine possono essere utilizzate come antigeni per lo sviluppo rapido del test [Ward, S., Lindsley, A., Courter, J., & Assa?ad, A. (2020). Clinical Testing For Covid-19. Journal of Allergy and Clinical Immunology., in press, https://doi.org/10.1016/j.jaci.2020.05.012].
Seo et al. Hanno sviluppato un dispositivo a transistor e field-effect per rilevare SARS-CoV-2 usando un analita bersaglio della proteina S di SARS-CoV-2 e l'anticorpo per la proteina S come biocomponente immobilizzato su fogli di grafene che rivestono il transistor [Seo, G., Lee, G., Kim, M. J., Baek, S. H., Choi, M., Ku, K. B., Lee, C. S., Jun, S., Park., D., Kim, H. G., Kim, S. J., Lee, J. O., Kim B. T., Park E. C., Kim, S. (2020). Rapid detection of COVID-19 causative virus (SARS-CoV-2) in human nasopharyngeal swab specimens using field-effect transistor-based biosensor. ACS nano, 14(4), 5135-5142].
Questo biosensore ? stato testato in campioni di tampone nasofaringeo di pazienti COVID- 19 e di virus in coltura osservando un limite di rilevazione pari a 100 fg / mL e 1,6 ? 10<1 >pfu / mL, rispettivamente.
Sul mercato, ? disponibile un kit (COVID-19 antigen Respi-Strip) per il rilevamento dell'antigene. Esso consiste in un test a flusso laterale per il rilevamento qualitativo del virus in un campione nasofaringeo o nasale con un valore di LOD pari a 5 ? 10<3 >PFU/mL [https://www.intermed.be/en/professional-products/ laboratory-diagnostics/serology-amp-virology/rapidtest/coris-covid-19-ag-respi-strip.html].
Questi biosensori sono concepiti per essere utilizzati in modo pi? semplice rispetto alla PCR, comunque richiedono campioni di tampone nasofaringeo, quindi devono essere eseguiti da personale specializzato.
Alla luce di quanto sopra, ? quindi evidente la necessit? di disporre di un nuovo metodo e del relativo kit per la titolazione di SARS-CoV-2, che superi gli svantaggi dei metodi ad ora noti.
Considerando il suddetto stato dell'arte, il ichiedente si ? posta la priorit? di fornire un metodo alternativo ed un dispositivo analitico in grado di rilevare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione liquido, in modo rapido, preciso e semplice.
Il Richiedente ha scoperto che questi e altri obiettivi che saranno meglio illustrati nelle descrizioni seguenti, possono essere raggiunti con un test immunologico che fa uso di bigliemagnetiche e relativo kit per rilevare SARS-CoV-2 in campioni liquidi.
Pi? in dettaglio, la presente invenzione fornisce un metodo per rilevare il SARS-CoV-2 in campioni liquidi, basato sull'uso di:
- Biglie magnetiche (o magnetic beads MBs) rivestite con un anticorpo in grado di legare una proteina del virus, ovvero la proteina S oppure la N;
- un anticorpo primario in grado di legare una proteina del virus legato ad un anticorpo secondario marcato con un enzima, oppure esso stesso marcato con un enzima e
- un substrato in grado di reagire con detto enzima al fine di produrre un prodotto rilevabile mediante misurazione elettrochimica od ottica, come ad esempio la misurazione colorimetrica o di fluorescenza, quando SARS-CoV-2 ? presente nel campione.
A titolo di esempio, la presente invenzione fornisce un test elettrochimico basato su un sistema di biglie magnetiche (MBs), in cui un elettrodo stampato su base di Carbon black viene utilizzato come sensore in combinazione con un potenziostato palmare portatile, al fine di disporre di un dispositivo elettroanalitico miniaturizzato.
Entrambe le proteine S ed N del SARS-CoV-2, sono state utilizzate come bersaglio immobilizzando il relativo anticorpo per la proteina S od N in due diverse configurazioni, con test a sandwich.
Il legame ? stato valutato usando un anticorpo secondario marcato con fosfatasi alcalina.
Il saggio sviluppato sulla base di MBs ? stato testato in soluzione tampone, in saliva sperimentalmente contaminata, con virus SARS-CoV-2 in coltura, nonch? in saliva con virus SARS-CoV-2 da campioni clinici positivi da tampone rinofaringeo, confrontando i risultati con quelli ottenuti con la PCR.
I risultati sperimentali riportati di seguito mostrano lo sviluppo di un test immunologico elettrochimico e di un test ottico, per l?analisi rapida ed affidabile in una matrice facile da campionare, vale a dire la saliva, secondo la presente invenzione. Il test elettrochimico ? stato concepito per la determinazione della proteina S o della proteina N con l?uso di biglie magnetiche come supporto della catena immunologica e anticorpo secondario con fosfatasi alcalina come label immunologico.
In particolare, al fine di sviluppare uno strumento analitico altamente performante in termini di sensibilit? e selettivit?, lo sviluppo del test ? stato focalizzato sull'uso di anticorpi specifici per la proteina N e per la subunit? S1 della proteina S, tenendo conto che molte proteine S sono presenti in ciascuna particella virale e questa S, essendo meno conservata, ? pi? specifica per SARS-CoV-2 rispetto alla subunit? S2 o alla proteina N.
Il sottoprodotto enzimatico 1-naftolo ? stato determinato utilizzando un elettrodo serigrafato altamente performante ottenuto utilizzando il nanomateriale carbon black. Le caratteristiche analitiche del test immunologico elettrochimico sono state valutate utilizzando la soluzione standard di proteina S e della proteina N in soluzione tampone e saliva non trattata. La sua efficacia ? stata determinata utilizzando sia virus in coltura in livello di biosicurezza 3, che campioni clinici di saliva, confrontando i dati con i corrispettivi tamponi rinofaringei testati a loro volta con RT-PCR. L'accordo tra i dati confrontati, il basso limite di rilevazione raggiunto, il risultato in tempi brevi (30 min), la miniaturizzazione e la portabilit? dello strumento combinata con la facilit? d'uso e il campionamento non invasivo, rappresentano i principali vantaggi di questo primo sensibile immunodosaggio elettrochimico per la rilevazione SARS-CoV-2 nella saliva non trattata.
Il test immunologico elettrochimico con biglie magnetiche, oggetto della presente invenzione , in cui le biglie magnetiche sono utilizzate come supporto per la catena immunologica, offre i seguenti vantaggi: i) la possibilit? di caricare un'elevata quantit? di anticorpo di cattura grazie all'elevato rapporto superficie-volume delle biglie, quindi incrementando la sensibilit?; ii) utilizzare il campo magnetico per spostare le biglie magnetiche in uno spazio apposito, eliminando con una semplice fase di lavaggio qualsiasi matrice durante la misura; iii) la pre-concentrazione delle biglie magnetiche sulla superficie dell'elettrodo di lavoro usando uno strumento magnetico miniaturizzato dedicato per aumentare il sottoprodotto enzimatico a stretto contatto con la superficie dell'elettrodo di lavoro e quindi la sensibilit? della misura elettrochimica.
Inoltre, tra i vari biosensori, quelli elettrochimici basati sull'impiego di celle elettrochimiche stampate, ossia elettrodi stampati, presentano i seguenti vantaggi: la miniaturizzazione sia del sensore elettrochimico che del lettore [Caratelli, V., Ciampaglia, A., Guiducci, J., Sancesario, G., Moscone, D., Arduini, F. Biosensors and Bioelectronics 2020, in press, 2020, https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112411], la sensibilit?, la capacit? di lavorare in matrici complesse e la facilit? di utilizzo [Arduini, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Piermarini, S., Ricci, F., & Volpe, G. (2016). Electrochemical biosensors based on nanomodified screen-printed electrodes: Recent applications in clinical analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 79, 114-126]. Inoltre, gli elettrodi stampati sono facilmente modificabili con nanomateriali, ovvero nanoparticelle d'oro, grafene e carbon black durante la produzione di massa al fine di migliorare le prestazioni elettroanalitiche e aumentare la sensibilit? dei biosensori [Cinti, S., & Arduini, F. (2017). Graphenebased screen-printed electrochemical (bio) sensors and their applications: Efforts and criticisms. Biosensors and Bioelectronics, 89, 107-122; Arduini, F., Cinti, S., Mazzaracchio, V., Scognamiglio, V., Amine, A., & Moscone, D. (2020). Carbon black as an outstanding and affordable nanomaterial for electrochemical (bio) sensor design. Biosensors and Bioelectronics, 156, 112033; Antu?a-Jim?nez, D., Gonz?lez-Garc?a, M. B., Hern?ndez-Santos, D., & Fanjul-Bolado, P. (2020). Screen-Printed Electrodes Modified with Metal Nanoparticles for Small Molecule Sensing. Biosensors, 10(2), 9]. L'elevata sensibilit? del rilevamento elettrochimico unita alla miniaturizzazione garantisce di raggiungere l'obiettivo prioritario di un rilevamento di SARS-CoV-2 ad alta sensibilit? economico e affidabile, utilizzando un fluido biologico prelevato in modo semplice e non invasivo, vale a dire la saliva, cos? come altri campioni liquidi, come acqua e acque reflue. Per eseguire questa operazione, secondo la presente invenzione, le biglie magnetiche sono state sfruttate come supporto per la catena immunologica come sopra descritto, come pure gli elettrodi stampati sono stati modificati con nanomateriale a base di carbonio per migliorare la sensibilit?. Lo stesso saggio immunologico a base di biglie magnetiche per la rilevazione SARS-CoV-2 ? concepito anche usando un metodo ottico che si basa sulla valutazione del sottoprodotto enzimatico colorimetrico, vale a dire il 4-nitrofenolo, usando un substrato enzimatico 4-nitrofenilfosfato.
Come menzionato sopra, il metodo secondo la presente invenzione pu? essere vantaggiosamente applicato su qualsiasi campione liquido, come acqua, acque reflue, liquami, urina, saliva, ecc .
Per quanto riguarda la diagnosi di SARS-CoV-2, ? particolarmente vantaggioso l'uso di campioni di saliva non trattati. Infatti, secondo la presente invenzione, il campione di saliva pu? essere usato direttamente senza alcun trattamento, semplicemente introducendo lo sputum nella provetta precedentemente caricata con i reagenti necessari per la reazione, senza ulteriori compiti a carico degli utilizzatori finali, al fine di attivare la catena delle reazioni immunologiche. E? noto (To, K. K. W., Tsang, O. T. Y., Yip, C. C. Y., Chan, K. H., Wu, T. C., Chan, J. M. C., Leung, W. S., Chik, TS. H., Choi, CY. C., Kandamby, D. H., Lung, D.C., Tam, A.R., Poon, RW. S., Fung, AY. F., Hung, IF. N., Cheng, VC. C., Chan, JF. W., Yuen, K. Y. (2020). Consistent detection of 2019 novel coronavirus in saliva. Clinical Infectious Diseases, in press, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa149) che SARS-CoV-2 ? presente nella saliva del 91,7% dei pazienti e quella saliva ? un promettente campione non invasivo per la diagnosi, il monitoraggio e il controllo delle infezioni nei pazienti con infezione 2019-nCoV. Inoltre, un altro studio ha riportato che tra il campione rinofaringeo e di saliva, quest?ultimo ha mostrato una maggiore sensibilit? con l'enorme vantaggio della possibile raccolta di autocampioni di saliva che presentano minore variabilit? rispetto ai campioni nasofaringei [Wyllie A FJ, Casanovas-Massana A, Campbell M, Tokuyama M, et al. Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.200, 5v1 Web site. Published 2020.Accessed 12 May 2020].
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un metodo per il rilevamento in vitro di SARS-CoV-2 in un campione liquido, detto metodo comprendendo o essendo consistente in:
a) mettere a contatto un campione liquido con una miscela biomarker comprendente un primo anticorpo e un secondo anticorpo, detto primo anticorpo essendo legato a biglie magnetiche e detto secondo anticorpo (che ? libero, cio? non legato a biglie magnetiche) essendo marcato con un enzima o legato a un anticorpo secondario marcato con un enzima, in cui detti primo anticorpo e secondo anticorpo sono in grado di legare una proteina SARS-CoV-2 scelta dal gruppo consistente in proteina Spike, come la subunit? S1 della proteina Spike, o proteina del nucleocapside, al fine di ottenere una catena immunologica legata alle biglie magnetiche quando SARS-CoV-2 ? presente nel campione liquido;
b) applicare un campo magnetico in grado di trattenere le biglie magnetiche e scartare il surnatante al fine di ottenere un prodotto trattenuto;
c) mettere in contatto il prodotto trattenuto ottenuto dalla fase b) con un substrato in grado di reagire con detto enzima, ottenendo un prodotto elettroattivo od otticamente attivo (cio? un prodotto rivelabile tramite la lettura elettrochimica oppure ottica); e
d) effettuare una misurazione elettrochimica oppure ottica,
in cui SARS-CoV-2 ? presente nel campione liquido quando il prodotto elettroattivo e/o otticamente attivo ? rivelato da detta misurazione elettrochimica od ottica.
Secondo la presente invenzione, il termine ?in vitro? ? diretto al settore biomedico cos? come al settore ambientale o al settore alimentare.
La suddetta fase a) di mettere in contatto viene mantenuta per un periodo di incubazione sufficiente per consentire la realizzazione della catena immunologica nel formato sandwich sulle biglie magnetiche. Ad esempio, un periodo sufficiente pu? essere superiore a 15 minuti, preferibilmente 30 minuti.
La fase b) viene eseguita per rimuovere il surnatante, che comprende il secondo anticorpo libero (cio? che non forma la catena immunologica nel formato sandwich sulle biglie magnetiche). Il prodotto trattenuto consiste nel primo anticorpo legato alle biglie magnetiche, quando SARS-CoV-2 non ? presente nel campione liquido, mentre consiste nella catena immunologica legata alle biglie magnetiche quando SARS-CoV-2 ? presente nel campione liquido. La fase b) pu? includere uno o pi? lavaggi, preferibilmente uno o due lavaggi, del prodotto trattenuto, ad esempio con una soluzione tampone, al fine di rimuovere la possibile presenza del secondo anticorpo libero marcato con un enzima o legato all?anticorpo secondario marcato con un enzima.
La fase c) del metodo, secondo la presente invenzione, pu? essere eseguita in un contenitore per la reazione. In questo caso, il prodotto risultante dalla fase c) viene quindi trasferito su un sensore per la misurazione elettrochimica o su un supporto per la misurazione ottica. In alternativa, la fase c) pu? essere eseguita direttamente su un sensore caricato con il substrato, ad esempio utilizzando un supporto a base di carta.
Secondo la presente invenzione, gli anticorpi possono essere di tipo monoclonale o policlonale, consentendo la costruzione della catena immunologica in formato sandwich sulle biglie magnetiche. Preferibilmente, il primo anticorpo ? un anticorpo monoclonale, poich? aumenta la selettivit? del metodo.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, il primo anticorpo ? un anticorpo monoclonale e il secondo anticorpo ? un anticorpo policlonale legato un anticorpo policlonale secondario marcato con un enzima.
Secondo un'ulteriore forma di realizzazione, il primo e il secondo anticorpo possono essere anticorpi monoclonali che agiscono sullo stesso o su diversi epitopi.
Ad esempio, la concentrazione di anticorpi, come PAb oppure PAb-AP pu? essere tra 0,1 e 10 ng/mL, preferibilmente 1 ng/mL.
Secondo la presente invenzione, il campione liquido ? scelto dal gruppo consistente in saliva, urina, liquame, acqua come acqua potabile o acque reflue. Come menzionato sopra, il metodo secondo la presente invenzione pu? essere vantaggiosamente applicato anche alla saliva non trattata (o sputum).
Secondo la presente invenzione, l'enzima pu? essere scelto dal gruppo consistente in fosfatasi, come fosfatasi alcalina, perossidasi, come perossidasi di rafano, ossidasi, come glucosio ossidasi, idrolasi, come colinesterasi.
Per quanto riguarda il substrato, secondo la presente invenzione il substrato, che viene convertito in un prodotto elettroattivo o in un prodotto otticamente attivo dalla reazione dell'enzima, pu? consistere in: 1-naftil fosfato o p-nitrofenilfosfato quando l'enzima ? una fosfatasi, come fosfatasi alcalina; tetrametilbenzidina e perossido di idrogeno, quando l'enzima ? una perossidasi, come la perossidasi di rafano; glucosio quando l'enzima ? un'ossidasi, come glucosio ossidasi; butirriltiocolina quando l'enzima ? un'idrolasi, come butirrilcolinesterasi.
Secondo il metodo della presente invenzione, il prodotto elettroattivo pu? essere scelto dal gruppo consistente in: 1-naftolo, perossido di idrogeno, tiocolina o tetrametilbenzidina diammina.
Secondo una forma di realizzazione alternativa, il prodotto otticamente attivo pu? essere un prodotto colorato scelto dal gruppo consistente in 4-nitrofenol tetrametilbenzidina diammina o acido 5-tio-2-nitrobenzoico.
Sulla base di quanto sopra, la misurazione ottica pu? consistere nel rivelare un prodotto colorato o fluorescente o un'emissione ottica risultante dalla reazione tra l'enzima e il substrato nella fase c) del metodo messo a confronto con un campione liquido di controllo. La visualizzazione del colore viene eseguita dal personale stesso o da un'app dedicata che utilizza lo smartphone.
La misurazione elettrochimica ? la valutazione dell'intensit? di corrente del prodotto ottenuto con la fase c) del metodo rispetto all'intensit? corrente di un campione liquido di controllo. Il campione liquido di controllo ? un campione liquido dello stesso tipo di quello da testare, ma che non contiene Sars-CoV-2. Infatti, il metodo secondo la presente invenzione fornisce vantaggiosamente valori ottici o elettrochimici che sono pi? alti rispetto a un campione di controllo, quando SARS-CoV-2 ? presente nel campione liquido testato, anche quando il campione non ? stato trattato. Secondo la presente invenzione, sono state ottenute curve di calibrazione elettrochimiche e curve di calibrazione ottiche rispetto al controllo dei campioni liquidi al fine di valutare la sensibilit? del kit nei confronti della proteina S e della proteina N. L'analisi di un pool di campioni di saliva positivi e negativi testati con i valori soglia del metodo standard (RT-PCR) ? stata impostata per discriminare i campioni liquidi positivi e negativi. Valori ottici o elettrochimici pari o superiori alla soglia indicano la presenza di SARS-CoV-2 nel campione liquido testato.
Ad esempio, secondo la presente invenzione, quando il campione liquido ? saliva e il primo e il secondo sono anticorpo sono in grado di legare la proteina S o la proteina N, il valore soglia elettrochimico scelto per discriminare tra negativi e positivi era 1,8 microA, come riportato nell'esempio. Pertanto, i valori elettrochimici uguali o superiori a 1,8 microA indicano la presenza di SARS-CoV-2 nei campioni di saliva.
In particolare, la misurazione elettrochimica pu? essere eseguita applicando impulsi di potenziale con i seguenti parametri:
avvio del potenziale applicato 0 Volt; potenziale applicato da 0,3 a 0,8 Volt, preferibilmente 0,6 Volt;
potenziale applicato tra due impulsi da 0,01 a 0,02 Volt, preferibilmente 0,016 Volt;
potenziale applicato per ciascun impulso da 0,04 a 0,06 Volt, preferibilmente 0,05 Volt;
velocit? di scansione durante la valutazione DPV da 0,01 a 0,02 Volt, preferibilmente 0,016 Volt;
lunghezza dell?impulso da 0,04 a 0,08 secondi, preferibilmente 0,06 secondi.
La presente invenzione riguarda anche un kit per la rilevazione in vitro di SARS-CoV-2, detto kit comprendendo
a) una miscela di biomarcatori comprendente un primo anticorpo e un secondo anticorpo, detto primo anticorpo essendo legato a biglie magnetiche e detto secondo anticorpo (che ? libero, cio? non legato a biglie magnetiche) essendo marcato con un enzima o essendo legato a un anticorpo secondario marcato con un enzima, in cui
detti primo anticorpo e secondo anticorpo sono in grado di legare una proteina di SARS-CoV-2 scelta dal gruppo consistente in proteina Spike, come la subunit? S1 della proteina Spike, o la proteina del nucleocapside.
Le biglie magnetiche possono essere micro o nano biglie magnetiche superparamagnetiche ricoperte da gruppi funzionali consistenti in amino, tosyl, carboxy, biotin, streptavidina o funzionalizzate con anticorpi.
Secondo la presente invenzione, detto kit pu? comprendere ulteriormente b) un substrato in grado di reagire con detto enzima risultando in un prodotto elettroattivo o in un prodotto otticamente attivo (cio? un prodotto misurabile che pu? essere misurato mediante misurazione elettrochimica od ottica).
Inoltre, il kit della presente invenzione pu? comprendere ulteriormente almeno una soluzione di lavaggio, come ad esempio una soluzione tampone da utilizzare dopo ogni fase del procedimento.
Secondo la presente invenzione, il kit pu? comprendere ulteriormente c) un sensore elettrochimico od ottico, eventualmente caricato con un substrato in grado di reagire con detto enzima risultando in un prodotto elettroattivo od otticamente attivo.
Il sensore elettrochimico pu? essere un sensore elettrochimico stampato comprendente un elettrodo di lavoro a base di grafite, non modificato o modificato con micro e nanomateriale consistente in nanoparticelle d'oro, nanoparticelle d'argento, grafene, nerofumo, nanotubi di carbonio.
Secondo la presente invenzione, per il rilevamento ottico la soluzione pu? essere caricata su una striscia a base di carta.
Il kit dell'invenzione pu? comprendere ulteriormente un lettore, come un potenziostato assistito da smartphone o un dispositivo colorimetrico comprendente la fotocamera dello smartphone.
Secondo una forma di realizzazione, il kit dell'invenzione pu? comprendere:
un contenitore con un'apertura e un fondo chiuso per contenere il campione liquido e la miscela di biomarcatori,
un magnete, come un tappo magnetico comprendente mezzi di accoppiamento in grado di essere accoppiati con il fondo di detto contenitore,
almeno un tappo di lavaggio comprendente mezzi di accoppiamento in grado di essere accoppiati con l?apertura del contenitore, un serbatoio con la soluzione di lavaggio e mezzi di rilascio, come una membrana da rompere, per il rilascio di detta soluzione di lavaggio quando detto tappo di lavaggio ? accoppiato a detto contenitore;
un tappo del reagente comprendente mezzi di accoppiamento in grado di essere accoppiati con l?apertura del contenitore, un serbatoio con la miscela di biomarcatore e mezzi di rilascio, come una membrana da rompere, per rilasciare detta miscela di biomarcatore quando detto tappo del reagente ? accoppiato con detto contenitore.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, per la misurazione, l'utente finale deve: i) aggiungere lo sputum nel contenitore (come una bottiglia) (componente 1);
ii) tappare il flacone con il tappo del reagente (componente 2) e premere il tappo per liberare la miscela di biomarcatore nel contenitore;
iii) attendere il tempo di reazione;
iv) mettere in contatto il magnete sul fondo della bottiglia e rimuovere il liquido;
v) tappare la bottiglietta con la soluzione di lavaggio (componente 3) e premere il tappo in modo da liberare la soluzione di lavaggio nel contenitore e miscelare manualmente la soluzione per tre volte;
vi) mettere il magnete a contatto del fondo della bottiglietta e rimuovere il liquido;
vii)tappare la bottiglietta con un tappo contenente una soluzione tampone (componente 4) e aggiungere una goccia della soluzione sulla striscia di carta contenente il substrato adsorbito in caso di rilevamento ottico o sull'elettrodo stampato in caso di rilevamento elettrochimico. In alternativa, il substrato pu? essere aggiunto nel contenitore da un tappo che lo contiene e quindi una goccia di liquido viene aggiunta sulla striscia o sull'elettrodo che non contiene il substrato.
La presente invenzione verr? ora descritta in modo illustrativo, ma non limitativo, secondo la forma di realizzazione preferita, con particolare riferimento agli esempi e ai disegni allegati, in cui:
- La Figura 1 mostra uno schema del saggio per il rilevamento di SARS-CoV-2 nella saliva non trattata usando il metodo elettrochimico e / o ottico.
- La Figura 2 mostra
A) Risposta ottenuta mediante ELISA per due diversi anticorpi policlonali anti-SARS-CoV-2 testati a 1 ng/mL (Sinobiological e ProSci) verso due diverse proteine S immobilizzate in piastra a concentrazione pari a 2 ng/mL;
B) Curva di legame ottenuta mediante ELISA tra l?anticorpo monoclonale anti-SARS-CoV-2 in concentrazione compresa tra 0,12 e 2 ng / mL e la proteina S immobilizzata in piastra concentrazione pari a 2 ng / mL;
C) Risposta elettrochimica usando il saggio basato su MBs usando un elettrodo modificato con CB (linea tratteggiata) ed elettrodo nudo (linea nera);
- La Figura 3 mostra
A) Studio della risposta del segnale in funzione della miscelazione durante la fase di incubazione. 10 ?L di MB, 200 ?L di PAb anti-SARS-CoV-2 1ng/mL (in PBS) 200 ?L di PAb-AP anti IgG di coniglio 1 ng/mL (in PBS) 300 ?L di campione, tempo di incubazione 30 min con e senza agitazione, 3 fasi di lavaggio, testando un controllo negativo e concentrazioni tra 0,16 e 2,5 ?g / mL di proteina S.
B) Studio della risposta del segnale per la valutazione dell'effetto del tempo di incubazione. 10 ?L di MB, 200 ?L di PAb anti-SARS-CoV-2 1ng/mL (in PBS) PAb-AP anti IgG di coniglio 1 ng/mL (in PBS) 300 ?L di campione testato, tempo di incubazione (15/30 min) senza agitazione, 3 fasi di lavaggio, testando un controllo negativo e concentrazioni tra 0,16 e 2,5 ?g / mL di proteina S.
C) Studio della risposta del segnale per la valutazione della concentrazione di PAb. 10 ?L di MB, 200 ?L di PAb anti-SARS-CoV-2 0.5/1/2 ng/mL (in PBS) 200 ?L di PAb-AP anti IgG di coniglio 0.5/1/2 ng/mL (in PBS) 300 ?L di campione testato, tempo di incubazione 30 min senza agitazione, 3 fasi di lavaggio, testando un controllo negativo e concentrazioni tra 0,16 e 2,5 ?g / mL di proteina S.
D) Studio della risposta del segnale per la valutazione dell'effetto del numero delle fasi di lavaggio. 10 ?L di MB, 200 ?L di PAb anti-SARS-CoV-2 1ng/mL (in PBS) PAb-AP anti IgG di coniglio 1 ng/mL (in PBS) 300 ?L di campione testato, tempo di incubazione 30 min senza agitazione, 1/2/3 fasi di lavaggio, testando un controllo negativo e concentrazioni tra 0,16 e 2,5 ?g / mL di proteina S.
- La Figura 4 mostra A) Curva elettrochimica di calibrazione con parametri ottimizzati per il rilevamento della proteina spike nel tampone (punto bianco) e saliva non trattata (punto nero). B) Curva elettrochimica di calibrazione per la titolazione della proteina N nel tampone (punto bianco) e saliva non trattata (punto nero). C) Curva di calibrazione ottica con i parametri ottimizzati per la titolazione della proteina spike nella saliva non trattata. D) Curva di calibrazione ottica per la titolazione della proteina N nella saliva non trattata;
- La Figura 5 mostra A) Voltammogrammi ottenuti senza (linea nera) e con (linea tratteggiata) virus SARS-CoV-2 coltivato alla concentrazione 6,5 PFU / mL, utilizzando il test immunologico basato su MBs per la spike B) Voltammogrammi ottenuti senza ( linea nera) e con (linea tratteggiata ) virus SARS-CoV-2 in coltura a concentrazione 6,5 x 10<4 >PFU / mL usando test immunologico basato su MBs per la proteina N;
ESEMPIO 1 : Preparazione di un immunosensore elettrochimico per il rilevamento di SARS-CoV-2 secondo l'invenzione e test per campioni liquidi
Materiali e metodi
2.1 Reagenti e soluzioni
La proteina bersaglio SARS-CoV spike (subunit? S1) (0,5 mg / mL), l'anticorpo monoloclonale anti SARS-CoV (prodotto in topo, 1 mg / mL) e l'anticorpo policlonale SARS-CoV spike (prodotto in coniglio, 1mg / mL), che riconoscono la proteina spike, sono stati acquistati da Sinobiological (Germania); il target SARS Coronavirus 2019 Spike proteina ricombinante (1 mg / mL) e l'anticorpo policlonale SARS-CoV-2 a Spike S1 (prodotto in coniglio, 0,1 mg) provenivano da ProSci (USA); la proteina Nucleocapside SARS-CoV-2 target era di Acrobiosystem (USA, 0,6 mg / mL); L'anticorpo monoclonale per SARS-CoV-2 (prodotto in topo, 3,4 mg / mL) e l'anticorpo policlonale per SARS-CoV-2 (prodotto in coniglio, 7,8 mg / mL), che riconoscono la proteina N, sono stati acquistati da Biorbyt (Regno Unito); anticorpi IgG anti-coniglio e alta affinit? marcati con fosfatasi alcalina (PAb-AP, 1 mg / mL) che si lega agli anticorpi di coniglio e IgG-AP anti-topo (MAb-AP, 1 mg / mL) che si lega agli anticorpi del topo provengono da Vector Laboratories (USA); l'albumina di siero bovino (BSA) per ridurre gli adsorbimenti aspecifici su biglie magnetiche o piastre ELISA, il substrato elettrochimico 1-naftil fosfato sale disodico, e ottico 4-nitrofenil fosfato sale disodico (PNPP), dietanolamina, tween 20 , sodio azide e tutti gli altri reagenti sono stati acquistati da Sigma (USA). La superficie Maxisorp ?, piastre di microtitolazione in polistirene a 96 pozzetti, ? stata acquistata da Nunc (Roskilde, Danimarca). Dynabeads? Pan Mouse IgG pre-coated con IgG anti-topo (fornite come sospensione di 4 x 10<8 >microsfere / ml in soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4) proveniva da Life Technologies (USA). Un agitatore rotante e un rack magnetico / concentratore di particelle provenivano da Dynal Biotech (USA). Tampone salino fosfato (PBS) = 0,0015 M KH2PO4, 0,0081 M Na2HPO4, 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, pH 7,4; Tampone di lavaggio = PBS 0,05% Tween 20; Tampone di stoccaggio = PBS 0,02% NaN3 e tampone DEA = DEA - MgCl2 - KCl buffer = 0,97 M DEA 1 mM MgCl2 +0,1 M KCl pH 9,6 sono stati usati come soluzione tampone.
2.2 Produzione e modifica di elettrodi stampati Gli elettrodi screen-printed (SPE) sono prodotti su un supporto in poliestere trasparente e flessibile impiegando la stampante serigrafica 245 DEK (Weymouth, Regno Unito). Una cella a tre elettrodi ? stata realizzata utilizzando un inchiostro a base di grafite (Electrodag 423 SS) per l'elettrodo di lavoro (superficie pari a 0,07 cm<2 >) e il contro-elettrodo, e un inchiostro a base d'argento (Electrodag 6033 SS) per l?elettrodo di pseudo-riferimento. Gli SPE sono stati modificati con 6 ?L di dispersione di CB N220 (1 mg / mL in N, N-dimetilformammide: dH<2 >O 1: 1 v / v), mediante una procedura consecutiva di deposizione in tre fasi di 2 ?L sull?elettrodo di lavoro [Arduini, F., Di Nardo, F., Amine, A., Micheli, L., Palleschi, G., & Moscone, D. (2012). Carbon black?modified screen?printed electrodes as electroanalytical tools. Electroanalysis, 24(4), 743-751] per migliorare la sensibilit? del sensore.
2.3 Procedura ELISA
Questo test ? stato eseguito per verificare la capacit? degli anticorpi di legare le proteine target. 100 ?L di entrambe le proteine spike (da Sinobiological e da ProSci) 2 ng / mL preparati in tampone PBS sono stati aggiunti in ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione e lasciati per una notte a 4 ? C. Quindi, la piastra rivestita ? stata bloccata con 100 ?L di 3% (p / v) di BSA in PBS, incubando per 1 ora a 37 ? C. Le curve di legame per ciascun anticorpo anti-SARS-CoV sono state costruite aggiungendo nei pozzetti 100 ?L di diverse diluizioni di anticorpi preparate in PBS e che vanno da 2 da ng / mL a 0,5 ng / mL (tutti gli anticorpi acquistati sono stati testati ), dopo 1 ora di incubazione a 37 ? C, la fase di marcatura inclusa l'aggiunta di 100 ?L di IgG-AP anti-coniglio 2 ng / mL e un'incubazione per 1 ora a 37 ? C (quando viene testato l' anticorpo MAb , la fase di marcatura prevede IgG-AP 2 ng / ml anti-topo). Tra ogni step, si provvedeva a 3 cicli di lavaggio con PBS 0,05% Tween 20. Infine, sono stati utilizzati 100 ?L di soluzione di PNPP (2 mg / mL in tampone DEA, pH 9,6) e l'assorbanza ? stata letta (a 415 nm) dopo 30 minuti di incubazione.
2.4 Test immuno-elettrochimico
Il saggio elettrochimico basato su MBs prevede tre procedure sequenziali: I) una procedura preliminare di rivestimento per bloccare le IgG Dynabeads <? >Pan Mouse (per conservarle a 4 ? C per diversi mesi, fino all'utilizzo); II) una procedura di immunodosaggio (in cui le incubazioni sequenziali classiche per gli eventi di immuno-riconoscimento sono riunite assieme in un?incubazione di 30 minuti); III) un rilevamento elettrochimico utilizzando elettrodi stampati. Dynabeads? Pan Mouse IgG sono microsfere di polistirene superparamagnetico uniforme (diametro 4,5 ? m) ricoperte di anticorpi monoclonali di IgG anti-topo umane. L'anticorpo rivestito su Dynabeads? riconosce tutte le sottoclassi di IgG di topo ed ? specifico per il frammento Fc. Dynabeads? Pan Mouse IgG contiene 4 ? 10<8 >Dynabeads? / mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, contenente 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,02% di sodio azide come
conservante [https://www.thermofisher.com/documentconnect/document
connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com% 2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fdynabeads_pan_mouse_IgG_man.pd f&title=RHluYWJlYWRzIFBhbiBNb3VzZSBJZ0c=].
I) Procedura di bloccaggio e rivestimento delle MBs: 250 ml di MBs sono pipettati in una provetta da 2 ml, lavati due volte con 1 ml di PBS pH 7,4, e bloccate incubandole in 1 ml di PBS pH 7,4 3% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) in rotazione lenta. Quindi ? scartato il surnatante e 500 ?L di PBS, contenenti 10 ?g di MAb, sono stati aggiunti alle biglie e incubati per 30 minuti a temperatura ambiente in rotazione lenta. Le MBs bloccate e rivestite sono lavate due volte con 1 ml di PBS. Infine, sono risospese in 250 ?L di PBS 0,02% di NaN3 e conservate a 4 <?>C dove possono rimanere per diversi mesi. Per ogni fase di lavaggio, la provetta Eppendorf contenente le microsfere magnetiche ? stata posizionata nel MPC Dynal (alloggiatore magnetico) e dopo 30 secondi il surnatante ? stato rimosso.
II) Procedura di immunodosaggio:
1. Agitare e trasferire 10 microlitri della sospensione di microsfere rivestite e bloccate (conservate a 4 ?C) in un tubo da 2 ml;
2. lavare 2 volte con 1 ml di PBS, agitando e scartando ogni volta il surnatante posizionando il magnete per 1 minuto;
3. aggiungere consecutivamente 200 ?L di PAb anti SARS-CoV2 1 ng / mL in PBS (prodotto in coniglio), 200 ?L di PAb-AP anti-IgG di coniglio 1 ng / mL in PBS e 300 ?L di campione;
4. incubare per 30 minuti a temperatura ambiente; 5. lavare 2 volte con 1 mL di PBS 0,05% Tween 20 e una volta con PBS, ogni volta agitando e scartando il surnatante posizionando il magnete.
III A) Misura elettrochimiche: al termine della procedura di immunodosaggio, le biglie (con la catena immunologica) sono risospese in 100 ?L di tampone DEA e 20 ?L di questa sospensione (tre replicati per ciascun campione) vengono posti sull?elettrodo di lavoro e concentrati magneticamente sulla sua superficie. La catena immunologica ? quindi rivelata aggiungendo 70 ?l di 1- naftil fosfato (5 mg / mL, preparato in tampone DEA - MgCl2? KCl) su ciascun elettrodo. Dopo 2 minuti di attesa per la reazione enzimatica, il prodotto enzimatico elettroattivo (1-naftolo) viene misurato applicando la tecnica voltammetrica ad impulsi differenziali (DPV) con i seguenti parametri, ottimizzata in lavori precedenti (Fabiani et al., 2019): E begin= 0 V; E fine= 0,6 V; E step= 0,016 V; E impulso= 0,05 V; t <impulso >= 0,06 s; velocit? di scansione = 0,016 V / s.
Le titolazioni elettrochimiche sono state eseguite con un potenziostato portatile, PalmSens<3 >(Palm Instrument, Paesi Bassi), collegato a un personal computer. Ebegin significa avvio dell?applicazione del potenziale applicato ; Eend indica l?interruzione dell?applicazione del potenziale; Estep indica il potenziale applicato tra due impulsi; Epulse indica il potenziale applicato per ciascun impulso; La velocit? di scansione indica la velocit? di scansione durante la misurazione DPV.
IIIB) Titolazioni ottiche: al termine della procedura di immunodosaggio, le MBs (con la catena immunologica) sono risospese in 350 ?L di pnitrofenilfosfato 2 mg / mL in tampone DEA. Dopo 20 minuti l'assorbanza del prodotto colorato enzimatico (pnitrofenolo) viene misurata a 415 nm.
2.5 Isolamento e caratterizzazione del virus SARS-CoV-2
SARS-CoV-2 (origine: Italia) ? stato coltivato nelle in Vero cellule per produrre uno stock master del virus. Lo stock master di virus ? stato utilizzato per generare uno stock operativo di virus che ? stato utilizzato per gli esperimenti nel presente studio. Il virus ? stato propagato in Vero cellule coltivate nel terreno (MEM) contenente 2% (p / v) di siero bovino fetale (Euroclone SpA). Dopo l'infezione, lo stock di virus ? stato raccolto centrifugando i supernatanti delle colture in Vero cellule a 600 g per 5 minuti. Il superrnatante o ? stato addizionato con il 20% siero bovino fetale (p / v), per poi essere congelato a -80 ? C fino al momento dell'uso. La concentrazione del virus infettivo ? stata misurata valutando la formazionedella placca.
2.6 Quantificazione SARS-CoV-2 tramite RT-PCR Tamponi rinofaringei raccolti e testati dal Dipartimento scientifico del Policlinico Militare Celio per SARS-CoV-2,. I campioni sono stati raccolti con il consenso esplicito, gratuito e informato, di questo campionamento ed utilizzo del campione, della persona dalla quale il materiale ? stato prelevato, in conformit? con la normativa della legislazione vigente.
L'RNA virale ? stato estratto da 300 ?L di prodotto del tampone mediante un kit di purificazione dell'acido nucleico totale virale Maxwell RSC utilizzando uno strumento Maxwell RSC (Promega, USA). L'acido nucleico totale ? stato eluito in un volume finale di 50 ?L di acqua priva di nucleasi. Quindi, la rRT-PCR ? stata eseguita utilizzando il Novel Coranavirus (2019- nCoV) Nucleic Acid Diagnostic Kit (Sansure Biotech Inc., China) Con lo strumento LC480 (Roche Diagnostics, Germania). Questo test utilizza ORF1ab 2019-CoV e il gene della proteina del nucleocapside (N) come regioni bersaglio e un controllo interno, che monitora la presenza di inibitori della PCR. La miscela di reazione contiene 13 ?L di miscela 2019-nCoV-PCR, 2 ?L 2019-nCoV-PCR e 5 ?L di RNA virale per raggiungere il volume finale di 20 ?L. Il programma dei cicli di amplificazione era il seguente: trascrizione inversa a 50 ? C per 30 minuti; denaturazione del cDNA a 95 ?C per 1 minuto e 45 cicli di PCR a 95 ? C per 15 secondi e 60 ?C per 30 secondi (acquisizione del segnale). I canali FAM, ROX e Cy5 sono stati selezionati rispettivamente per ORF1ab, N e il rilevamento del controllo interno.
2.7 Misura elettrochimica di SARS-CoV2 in ambiente di livello 3 di sicurezza biologica (BLS3)
Ad oggi ? impossibile mettere in relazione la concentrazione proteica con la carica virale totale, quindi, per valutare la sensibilit? dell?invenzione sul dosaggio del virus, SARS-CoV-2 ? stata attentamente eseguita la misura elettrochimica con MBs in un laboratorio BLS3. A partire da un'aliquota SARS-CoV2 di 6,5 x 10 <5 >PFU / mL, cinque diluizioni seriali 1:10 v / v in PBS sono state preparate e incubate per 30 minuti usando 300 ?L come soluzione stimata per ogni diluizione (e un controllo negativo) con 10 ?L di MBs (pre-ricoperto con MAb anti SARS-CoV e lavato), 200 ?L di PAb anti-SARS-CoV 1 ng / mL in PBS e 200 ?L di PAb-AP 1 ng / mL in PBS. Il test ? stato eseguito su proteine N e proteine S in parallelo usando anticorpi che riconoscono le proteine N e S. Dopo la fase di lavaggio, ? stata eseguita la misurazione elettrochimica. Tutti gli apparecchi utilizzati sono rivestiti in plastica per evitare qualsiasi contaminazione.
3. Risultati e discussioni
3. 1 Ottimizzazione del metodo elettrochimico MBsassay per la titolazione della proteina spike.
La selezione degli anticorpi ad alta sensibilit? ? uno dei passaggi principali per lo sviluppo di dispositivi analitici selettivi e ad alta sensibilit? , perci? per la selezione degli anticorpi ? stato utilizzato un metodo spettrofotometrico ELISA per valutare la reattivit? di MAb e di due diversi PAb (Sinobiological, Germany e ProSci, USA) verso due diverse proteine S (provenienti da due diverse aziende), ovvero la SARS Coronavirus 2019 proteina spike ricombinante (1000-1200 aa) e la proteina ricombinante spike SARS-CoV, subunit? S1. Per tutte le misureottiche, l'anticorpo secondario marcato con enzima fosfatasi alcalin ? stato aggiunto utilizzando 4-nitrofenil fosfato come substrato enzimatico e monitorando il legame attraverso la formazione del sottoprodotto enzimatico 4-nitrofenolo a 415 nm. In Figura 2A ? stata riportata la risposta del test ELISA sui due PAb e due proteine Spike con cui si riscontra la migliore affinit? tra il PAb Sinobiological e la proteina Spike SARS-CoV ricombinante, subunit? S1, da Sinobiological, quindi questi reagenti sono stati selezionati per gli studi successivi. Successivamente il MAb ? stato testato con ELISA verso questa proteina spike e la curva di legame ? riportata nella Figura 2 B, dove si osserva un'elevata affinit?.
Per la misura elettrochimica, l'anticorpo secondario marcato con enzima fosfatasi alcalina ? stato usato con 1-naftilfosfato come substrato enzimatico, monitorando la formazione del sottoprodotto enzimatico 1-naftolo a circa 0,1 V usando voltammetria a impulsi differenziali. L'uso degli elettrodi stampati modificati con il carbon black ha permesso di migliorare la sensibilit?, come riportato nella Figura 2 C. In effetti, il prodotto enzimatico ? stato rilevato con una sensibilit? aumentata di ca. 4 volte e al potenziale di 0,1 V utilizzando un elettrodo modificato con il carbon black (linea tratteggiata ), rispetto al potenziale 0,2 V con un elettrodo non modificato(linea nera).
La realizzazione della catena immunologica richiede l'ottimizzazione delle concentrazioni di PAb essendo l'anticorpo libero in soluzione (MAb ? immobilizzato su MBs), nonch? il tempo e la modalit? di reazione, come il tempo di reazione tra antigene e anticorpi e la modalit? di incubazione vale a dire in rotazione o senza agitazione (condizione statica).
Allo scopo di utilizzare un dispositivo facilmente personalizzabile per l'utente finale, ? stato valutato l'effetto dell'agitazione. Come illustrato nella Figura 3 A, la concentrazione pi? bassa testata, ovvero 0,16 ?g / mL, ha generato un segnale pi? alto con l?agitazione rispetto a quello generato in incubazione statica, tuttavia anche senza agitazione il segnale ? risultato diverso dal segnale del bianco. Inoltre, con la concentrazione pi? elevata pari a 2,5 ?g / mL ? stata osservata la stessa sensibilit?. Tenendo conto del fatto che il dispositivo ? stato impostato per una facile miniaturizzazione, la misurazione senza agitazione ? stata selezionata per proseguire il lavoro. Nella figura 3 B ? stato valutato l?effetto del tempo di incubazione verificando che 15 minuti non sono sufficienti per una buona sensibilit?, quindi ? scelto un tempo di 30 minuti. L?anticorpo PAb ? libero in soluzione, perci? pu? influenzare la risposta del dosaggio perch? ? in grado di completare il sandwich immunologico. Concentrazioni di 1 e 2 ng / mL sono state testate osservando un segnale pi? alto per 1 ng / mL, quindi questa concentrazione ? stata scelta per via di una migliore sensibilit? e minor costo di analisi (Figura 3 C). Al fine di semplificare il compito all?utente finale, ? stato valutato il numero di fasi di lavaggio necessario per evitare l'assorbimento specifico per gli MB, scegliendo due fasi di lavaggio per la costruzione della curva di calibrazione (figura 3 D).
3. 2 Caratteristiche analitiche del saggio elettrochimico basato su MBs per il rilevamento di proteine Spike in soluzione standard e in saliva
Per valutare le caratteristiche analitiche del test sviluppato per titolare la proteina spike in soluzioni standard, sono state testate diverse concentrazioni di proteina spike diluite in tampone fosfato 0,015 M 0,137 M NaCl 0,0027 M KCl pH = 7,4 compreso tra 0, 04 e 2,5 ? g / mL, osservando un comportamento sigmoidale descritto da un?equazione logistica non lineare a quattro parametri come segue:
Con un limite di rilevazione pari a 14 ng / mL calcolato come segnale bianco 3 volte la deviazione standard (SD). L'effetto matrice dovuto all'analisi nella saliva senza alcun pretrattamento ? stato valutato costruendo la curva di calibrazione nella saliva non trattata osservando lo stesso comportamento sigmodale con corrente a intensit? pi? bassa rispetto all'effetto matrice. La curva di calibrazione nella saliva ? stata descritta da un?equazione logistica non lineare a quattro parametri con limite di rilevazione pari a 19 ng / mL (Figura 4 A).
3. 3 Caratteristiche analitiche del test elettrochimico a base di biglie magnetiche per il rilevamento di N in soluzione standard e saliva
Per valutare le caratteristiche analitiche del test sviluppato per titolare la proteina N in soluzioni standard, sono state testate diverse concentrazioni di proteina N diluite in tampone fosfato 0,015 M 0,137 M NaCl 0,0027 M KCl pH = 7,4 compreso tra 0, 04 e 2,5 ? g / mL, osservando il comportamento sigmoidale descritto da un diagramma di calibrazione logistica non lineare a quattro parametri Eq. 1 osservando un limite di rilevazione di 4 ng / mL . L'effetto matrice dovuto all'analisi nella saliva senza alcun pretrattamento ? stato valutato costruendo la curva di calibrazione nella saliva non trattata osservando lo stesso comportamento sigmodale con corrente a intensit? pi? bassa rispetto all'effetto matrice e con limite di rilevazione pari a 8 ng / mL (Figura 4 A).
3. 4 Misura del virus SARS-CoV-2 in ambiente BLS3 Il test di effettuato in laboratorio BLS3 ha permesso all?Applicante di valutare la risposta del dosaggio dell'invenzione sul virus nativo che va da 6,5 x 10<4 >a 6,5 pfu / ml. In Fig. 5 i voltammogrammi che mostrano il segnale relativo alla concentrazione del virus rispetto al segnale di controllo negativo sono elencati usando il saggio elettrochimico MBs per la proteina Spike e la proteina N.
Come illustrato nella Figura 5 A, quando il test viene eseguito usando anticorpi diretti contro la proteina Spike, la sensibilit? del test ? eccellente (pu? essere rilevato 6.5 PFU / mL), rispetto al dosaggio della proteina N (Figura 5 B), in effetti, nel caso del test basato sulle proteine N, la sensibilit? ? inferiore perch? le proteine N nelle particelle virali sono presenti in quantit? inferiore rispetto alle proteine S nel virus SARS-CoV-2. La diversa sensibilit? pu? essere sfruttata per monitorare le persone asintomatiche con la saliva avente carica virale bassa, mentre per la misura su pazienti altamente infetti pu? essere pi? indicato misurare la proteina N, personalizzando cos? il kit in funzione delle esigenze dell'utente finale.
3. 5 Misura di SARS-CoV-2 in campioni clinici Per valutare l'efficacia della misura basata su MBs su campioni clinici, i tamponi salivari e rinofaringei sono stati testati usando sia la titolazione MBs che RT-PCR. Nel dettaglio, i campioni di saliva sono stati testati usando campioni freschi e campioni congelati osservando una riduzione del segnale in caso di campione congelato sia per pazienti positivi che negativi, quindi 1,8 ?A sono stati presi come soglia in caso di campioni non congelati, mentre in caso di campione congelato la soglia selezionata era di 1 ?A. L'uso di saliva fresca soddisfa l'obiettivo di un facile campionamento senza alcun trattamento per soddisfare i requisiti dei sistemi point of care. Come illustrato nella Tabella 1, che mostra i risultati ottenuti su campioni clinici analizzati usando il test immunologico basato su MB ed RT-PCR, ? stato osservato un accordo in 14/15 campioni. I risultati sono molto soddisfacenti, tenendo conto della bassa carica virale rilevata.
Tabella 1
* campioni congelati 3.6 Caratteristiche analitiche del test ottico a base di microsfere magnetiche per il rilevamento della proteina S in saliva
Per valutare le caratteristiche analitiche del test sviluppato per titolare la proteina S nella saliva, sono state testate concentrazioni diverse di proteina spike comprese tra 0,04 e 2,5 ? g / mL, osservando un comportamento sigmoidale descritto da un?equazione logistica non lineare a quattro parametri (Eq. 1) con un limite di rilevazione di 12 ng / mL.
3.7 Caratteristiche analitiche del test ottico a base di microsfere magnetiche per il rilevamento della Per valutare le caratteristiche analitiche del test sviluppato per misurare la proteina N nella saliva, sono state testate concentrazioni diverse della proteina N comprese tra 0,0 1 e 0,6 ? g / mL, osservando un comportamento sigmoidale descritto da un?equazione logistica non lineare a quattro parametri (Eq. 1) con un limite di rilevabilit? di 2 ng / mL.
Claims (16)
1) Metodo per il rilevamento in vitro di SARS-CoV-2 in un campione liquido, detto metodo comprendendo o essendo consistente in:
a) mettere a contatto un campione liquido con una miscela di biomarcatori comprendente un primo anticorpo e un secondo anticorpo, detto primo anticorpo essendo legato a biglie magnetiche e detto secondo anticorpo essendo marcato con un enzima o legato a un anticorpo secondario marcato con un enzima,
in cui
detti primo anticorpo e secondo anticorpo sono in grado di legare una proteina di SARS-CoV-2 scelta dal gruppo consistente in proteina Spike, come la subunit? S1 della proteina Spike, o proteina del nucleocapside, al fine di ottenere una catena immunologica legata alle biglie magnetiche quando SARS CoV-2 ? presente nel campione liquido;
b) applicare un campo magnetico in grado di trattenere le biglie magnetiche e scartare il supernatante al fine di ottenere un prodotto trattenuto;
c) mettere in contatto il prodotto trattenuto ottenuto dalla fase b) con un substrato in grado di reagire con detto enzima ottenendo un prodotto elettroattivo o otticamente attivo; e
d) effettuare una misurazione elettrochimica o ottica,
in cui SARS-CoV-2 ? presente nel campione liquido quando il prodotto elettroattivo e/o otticamente attivo viene rivelato mediante detta misurazione elettrochimica o ottica.
2) Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il primo anticorpo ? un anticorpo monoclonale e il secondo anticorpo ? un anticorpo policlonale legato a un anticorpo policlonale secondario marcato con un enzima.
3) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui il campione liquido ? scelto dal gruppo consistente in saliva, urina, liquami, acqua come acqua potabile o acque reflue.
4) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui l'enzima ? scelto dal gruppo consistente in fosfatasi, come fosfatasi alcalina, perossidasi, come perossidasi di rafano, ossidasi come glucosio ossidasi, idrolasi come colinesterasi.
5) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto substrato consiste in:
1-naftilfosfato o p-nitrofenilfosfato quando l'enzima ? una fosfatasi, come fosfatasi alcalina;
tetrametilbenzidina o perossido di idrogeno, quando l'enzima ? una perossidasi, come la perossidasi di rafano;
glucosio quando l'enzima ? un'ossidasi, come glucosio ossidasi;
butirriltiocolina quando l'enzima ? un'idrolasi, come butirrilcolinesterasi.
6) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detto prodotto elettroattivo ? scelto dal gruppo consistente in:
1-naftolo, perossido di idrogeno, tiocolina o tetrametilbenzidina diammina.
7) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detto prodotto otticamente attivo ? un prodotto colorato scelto dal gruppo consistente in 4- nitrofenolo, tetrametilbenzidina diammina o acido 5-tio-2-nitrobenzoico.
8) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui la misurazione elettrochimica viene effettuata applicando impulsi di potenziale con i seguenti parametri:
avvio del potenziale applicato 0 Volt;
potenziale applicato da 0,3 a 0,8 Volt, preferibilmente 0,6 Volt;
potenziale applicato tra due impulsi da 0,01 a 0,02 Volt, preferibilmente 0,016 Volt;
potenziale applicato per ciascun impulso da 0,04 a 0,06 Volt, preferibilmente 0,05 Volt;
velocit? di scansione durante la valutazione DPV da 0,01 a 0,02 Volt, preferibilmente 0,016 Volt;
tempo di impulso da 0,04 a 0,08 secondi, preferibilmente 0,06 secondi.
9) Kit per il rilevamento in vitro di SARS-CoV-2, detto kit comprendendo
a) una miscela di biomarcatori comprendente un primo anticorpo e un secondo anticorpo, detto primo anticorpo essendo legato a biglie magnetiche e detto secondo anticorpo essendo marcato con un enzima o essendo legato a un anticorpo secondario marcato con un enzima, in cui
detti primo anticorpo e secondo anticorpo sono in grado di legare una proteina di SARS-CoV-2 scelta dal gruppo consistente in proteina Spike, come la subunit? S1 della proteina Spike o la proteina del nucleocapside.
10) Kit secondo la rivendicazione 9, detto kit comprendendo ulteriormente b) un substrato in grado di reagire con detto enzima risultando in un prodotto elettroattivo o otticamente attivo.
11) Kit secondo la rivendicazione 9, detto kit comprendendo ulteriormente almeno una soluzione di lavaggio, come una soluzione tampone.
12) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9-11, detto kit comprendendo ulteriormente c) un sensore elettrochimico o ottico, eventualmente caricato con un substrato in grado di reagire con detto enzima risultando in un prodotto elettroattivo o otticamente attivo.
13) Kit secondo la rivendicazione 12, in cui il sensore elettrochimico ? un sensore elettrochimico stampato comprendente un elettrodo di lavoro a base di grafite, non modificato o modificato con micro e nanomateriale consistente in nanoparticelle d'oro, nanoparticelle d'argento, grafene, nerofumo, nanotubi di carbonio.
14) Kit secondo la rivendicazione 12, in cui il sensore ottico ? una striscia a base di carta.
15) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 -14, detto kit comprendendo ulteriormente un lettore, come un potenziostato assistito da smartphone o un dispositivo colorimetrico comprendente la fotocamera dello smartphone.
16) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9-15, detto kit comprendendo:
un contenitore con un'apertura e un fondo chiuso per contenere il campione liquido e la miscela di biomarcatori,
un magnete, come un tappo magnetico comprendente mezzi di accoppiamento in grado di essere accoppiati con il fondo di detto contenitore,
almeno un tappo di lavaggio comprendente mezzi di accoppiamento in grado di essere accoppiati con l?apertura del contenitore, un serbatoio con la soluzione di lavaggio e mezzi di rilascio per rilasciare detta soluzione di lavaggio quando detto tappo di lavaggio ? accoppiato con detto contenitore;
un tappo del reagente comprendente mezzi di accoppiamento in grado di essere accoppiati con l?apertura del contenitore, un serbatoio con la miscela di biomarcatori e mezzi di rilascio per rilasciare detta miscela di biomarcatori quando detto tappo del reagente ? accoppiato con detto contenitore.
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