IT202000014815A1 - Dispositivo microfuidico per colture e screening cellulari e relativo metodo di produzione - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: ?Dispositivo microfuidico per colture e screening cellulari e relativo metodo di produzione?
La presente invenzione ? relativa al campo tecnico dei dispositivi microfluidici per colture e screening cellulari. In particolare, la presente invenzione ? relativa a un dispositivo microfluidico utilizzabile per effettuare colture, riprogrammazione, espansioni e differenziazione, monitoraggi cellulari. Il dispositivo microfluidico secondo l?invenzione trova applicazione nel monitoraggio di effetti di farmaci su popolazioni cellulari in ambito farmaceutico e medico, la riprogrammazione, l?espansione e differenziazione di cellule staminali nell?ambito dell?ingegneria tissutale e medico.
La presente invenzione ? inoltre relativa ad un metodo di produzione del dispositivo microfluidico.
Come ? noto, i sistemi microfluidici consentono un ottimo controllo del microambiente, utile per effettuare screening cellulari ad alto rendimento. Sono note alcune pubblicazioni di studi relativi a dispositivi passivi, tuttavia i dispositivi microfluidici attualmente in uso, per poter funzionare necessitano di interventi esterni o di sorgenti di energia attive. La maggior parte dei sistemi microfluidici attualmente noti sono provvisti di sorgenti pressorie esterne che assicurano portate costanti, ossia sono a carattere attivo, non possono essere definiti dispositivi passivi e sono dispositivi sostanzialmente chiusi.
Seppure nelle configurazioni dei dispositivi microfluidici attualmente noti, la regolazione della portata risulti semplice e versatile, tali dispositivi necessitano di personale specializzato che li sappia manovrare, di un?alimentazione esterna e di molti componenti risultando pi? complessi. Inoltre, i sistemi chiusi attualmente noti limitano gli accessi ai vari compartimenti di coltura.
Scopo della presente invenzione ? fornire un dispositivo microfluidico per colture e screening cellulari che sia passivo, ovvero non necessiti di interventi esterni o di sorgenti di energia attive per poter funzionare.
Inoltre, scopo della presente invenzione, ? fornire un dispositivo microfluidico che consenta l?accesso ai campioni cellulari trattati per un loro agevole recupero e successive analisi mediante strumenti e attrezzature convenzionali.
Infine, scopo della presente invenzione, ? fornire un dispositivo microfuidico in grado di operare all?interno di convenzionali incubatori o mini incubatori dedicati accoppiati a strumenti ottici convenzionali.
Secondo la presente invenzione viene realizzato un dispositivo microfluidico per colture e screening cellulari, come definito nella rivendicazione 1.
Per una migliore comprensione della presente invenzione viene ora descritta una forma di realizzazione preferita, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:
- la Figura 1 mostra una vista in esploso del dispositivo microfluidico, secondo l?invenzione;
- la Figura 2 mostra una vista schematica dal basso di una porzione del dispositivo microfluidico, secondo l?invenzione
- La figura 3 una vista superiore del dispositivo microfluidico assemblato, secondo l?invenzione;
- la Figura 4 mostra una seconda vista superiore del dispositivo microfluidico, secondo l?invenzione;
- la figura 5 mostra una vista in sezione del dispositivo microfluidico, secondo l?invenzione;
- le figure 6a e 6b mostrano due schemi di reti microfluidiche del dispositivo microfluidico rispettivamente con una pluralit? di serbatoi connessi a una singola camera di coltura e con una pluralit? di camere di coltura in parallelo, secondo l?invenzione.
Con riferimento alle figure ed in particolare alla figura 1, il dispositivo microfluidico 100 per colture e screening cellulari secondo l?invenzione comprende un chip costituito da una pluralit? di strati, in particolare da un elemento di copertura 102, un elemento intermedio 103 ed un elemento inferiore di PMMA, e da un vetrino 105 in CaF2.
Ciascun elemento 102, 103, 104 presenta almeno quattro fori di allineamento 101, posti in corrispondenza delle estremit? di ciascun lato, e preferibilmente aventi diametro pari a 3 mm. Tali fori di allineamento 101 sono atti a consentire la fase di assemblaggio del dispositivo microfluidico 100.
Come evidenziato in figura 1, il chip ? costituito da una pluralit? di strati costituita da:
- un elemento di copertura 102 in PMMA;
- un elemento intermedio 103 dotato di microcanali 103a ;
- un elemento inferiore 104, e
- un vetrino 105.
L?elemento di copertura 102, ? costituito da un primo strato di PMMA di forma sostanzialmente piana avente uno spessore compreso tra 5 mm e 1 mm, preferibilmente pari a 3 mm, lavorato su entrambe le sue facce. Una prima faccia interna dell?elementodi copertura 102 presenta una pluralit? di aperture 102a che consentono l?inserimento di fluidi all?interno di serbatoi di alimentazione 103d e di scarico 103e, formati nello strato intermedio sottostante, e il loro successivo prelievo. Dette aperture 102a sono realizzate vantaggiosamente in modo che la zona in prossimit? dei microcanali 103a sia accessibile, in modo da facilitare l?iniezione e l?aspirazione di liquidi. Una faccia esterna dell?elemento di copertura 102 presenta un foro passante centrale 102b del diametro preferibilmente di 39 mm, che costituisce una finestra ottica superiore 106 che si forma a seguito dell?assemblaggio del dispositivo microfluidico 100.
L?elemento intermedio 103 dotato di canali consiste in un secondo strato di PMMA dello spessore, compreso tra 4 mm e 8mm, preferibilmente pari a 6mm e lavorato su entrambe le sue facce. Una faccia inferiore dell?elemento intermedio 103 comprende una pluralit? di microcanali 103a, preferibilmente cinque microcanali 103a, che costituiscono un?estesa rete microfluidica in cui ciascun microcanale 103a misura preferibilmente una lunghezza pari a 300 mm e avente una sezione rettangolare avente larghezza compresa tra 0.005 mm e 0.5 mm, preferibilmente pari a 0.254 mm, e altezza compresa tra 0.005 mm e 0,5 mm, preferibilmente pari a 0.100 mm.
La faccia inferiore comprende almeno una camera di coltura 103c, una pluralit? di serbatoi di alimentazione 103d, preferibilmente quattro, ed almeno un serbatoio di scarico 103e connessi tra loro mediante i microcanali 103a. I serbatoi di alimentazione 103d ed il serbatoio di scarico 103e sono accessibili dall?esterno mediante le aperture 102a in modo tale da poter immettere e rimuovere i fluidi che i serbatoi contengono in uso.
Una faccia superiore dell?elemento intermedio 103 comprende una cavit? a fondo cieco 103b, che costituisce a seguito dell?assemblaggio con l?elemento superiore 102 una porzione della finestra ottica superiore 106. La cavit? a fondo cieco 103b ha diametro corrispondente al foro passante centrale 102b e preferibilmente pari a 39 mm, e risulta ribassata di 3 mm rispetto alla superficie superiore dell?elemento intermedio 103.
L?elemento inferiore 104 consiste in un terzo strato di PMMA avente spessore compreso tra 5 mm e 1 mm, preferibilmente pari a 3 mm, lavorato su entrambe le sue facce, una faccia inferiore e una faccia superiore.
La faccia superiore dell?elemento inferiore 104 risulta in uso rivolta verso l?interno del dispositivo microfluidico 100 a chiusura dei microcanali 103a. La faccia superiore comprende un serbatoio di raccolta 104e costituito da una porzione ribassata, ovvero una cavit? a fondo cieco, preferibilmente di profondit? pari a 2.7 mm ed a un livello pi? basso rispetto all?altezza finale a cui sfocia il canale di uscita. Inoltre, la faccia superiore comprende un?apertura centrale per la camera di coltura 103c.
La faccia inferiore dell?elemento inferiore 104 comprende una porzione centrale rientrante, preferibilmente di 2.20 mm, costituente la finestra ottica inferiore 107 centrale a seguito di assemblaggio del dispositivo 100. La porzione centrale rientrante ha diametro corrispondente al foro centrale passante 102b e alla cavit? a fondo cieco 103b, risultando preferibilmente pari a 39 mm .
All?interno della porzione centrale entrante, o finestra ottica inferiore 107, ? compresa una tasca di alloggiamento del vetrino 105 in CaF2, avente preferibilmente 26 mm di diametro e profondit? 0.600 mm. Come mostrato in figura 2 e 5, la faccia inferiore comprende inoltre una seconda tasca 104b circolare con profilo a gradino avente diametro esterno De preferibilmente pari a 37.50 mm e diametro interno Di preferibilmente pari a 30.5 mm, rientrante, rispetto alla superficie inferiore dell?elemento 104, di 0.600 mm, realizzata per il supporto cilindrico cavo usato all?interno di un mini-incubatore in fase sperimentale e posta tra la tasca di alloggiamento del vetrino 105 e le porzioni di elemento 104 che definiscono la finestra ottica inferiore 107.
L?elemento intermedio 103 in uso, ed a seguito dell?assemblaggio, viene fissato tra l?elemento di copertura 102 e l?elemento inferiore 104, risultando tra loro interposto, formando centralmente la finestra ottica superiore 106.
Secondo una forma di realizzazione preferita l?elemento di copertura 102, l?elemento intermedio 103 e l?elemento inferiore 104 hanno lati di dimensione pari a 80 mm x 72 mm.
Come mostrato nella vista di dettaglio della figura 5, la camera di coltura 103c ? costituita da un foro centrale passante ricavato nello strato intermedio 103 e nello strato inferiore 104, e chiuso inferiormente dal vetrino 105.
Il vetrino 105 in CaF2, ? atto ad essere alloggiato nella tasca di alloggiamento ricavata nell?elemento inferiore 104. Il vetrino 105 ha preferibilmente diametro pari a 25 mm e spessore compreso tra 0.2 mm e 0.9 mm, preferibilmente pari a 0,5 mm. Il vetrino 105 chiude inferiormente la camera di coltura 103c centrale come mostrato in figura 5.
Sul vetrino 105, in uso, aderiscono le cellule durante la messa in coltura. Di conseguenza, in uso, le cellule si trovano ad una distanza di 3.2 mm dall?inizio della finestra ottica superiore 106 e 0,200 mm al di sotto dei microcanali 103a.
Vantaggiosamente, in uso, il dispositivo microfluidico 100 ? totalmente passivo. Grazie alla specifica geometria del dispositivo 100, la differenza nei livelli di fluido tra serbatoi 103d e camera di coltura 103c genera un gradiente pressorio. Tale gradiente consente la movimentazione del fluido all?interno dei microcanali 103a assicurandone una determinata portata, in accordo con la loro resistenza idraulica calcolabile, nel caso di canale di sezione quadrangolare, con la formula seguente:
dove ? ? la viscosit? dell?acqua.
L?altezza del fluido influenza la portata, ? quindi importante che i serbatoi 103d abbiano una superficie sufficientemente ampia da consentire una diminuzione lenta del livello del liquido al proprio interno.
Con riferimento alla figura 4, il dispositivo microfluidico 100 comprende quattro serbatoi di alimentazione 103d ciascuno avente volume tale da fornire una portata sufficiente nei microcanali per un tempo variabile da 12 ore a 1440 ore. Un primo serbatoio 103da ed un terzo serbatoio 103dc hanno caratteristiche tali da consentire una portata accettabile per 48 ore. Un secondo serbatoio 103cb pu? essere utilizzato per avere una portata sufficiente per 24 ore, mentre un quarto serbatoio 103dd ha caratteristiche e dimensioni tali da consentire una portata accettabile per 168 ore ovvero per 7 giorni. In particolare, preferibilmente, il primo serbatoio 103da ha volume pari a 10307.58 ?l, il secondo serbatoio 103db ha volume pari a 600 ?l, il terzo serbatoio 103dc ha volume pari a 1307.58 ?l mentre il quarto serbatoio 103dd ha volume pari a 4681.5 ?l.
Ciascun serbatoio di alimentazione 103da, 103db, 103dc, 103dd va utilizzato escludendo gli altri serbatoi mediante la chiusura dei serbatoi che non servono durante l?uso specifico.
Il dispositivo microfluidico 100 viene vantaggiosamente dimensionato in modo da avere resistenze idrauliche di tutti i microcanali di ingresso uguali a quella del microcanale di uscita verso il serbatoio di scarico 103e. ? necessario quindi per questioni fluidodinamiche che un solo serbatoio per volta possa essere in funzione.
Ogni canale in ingresso o in uscita dalla camera di coltura si trova ad una altezza compresa nell?intervallo 0.005 mm e 0.5 mm dal fondo della camera stessa, a cui in uso aderiscono le cellule. Tale conformazione vantaggiosamente consente una proliferazione cellulare minimamente inficiata dagli sforzi di taglio causati dai flussi di liquido che scorrono nei canali. In ciascun canale la portata di fluido Q calcolabile con l?equazione di Hagen-Poiseulle e pari a :
In cui ? ? la densit? dell?acqua e ?H ? la differenza di altezza tra le colonne di fluido del serbatoio (pari a 6 mm quando ? completamente pieno) e nella camera di coltura al di sopra del microcanale (2 mm). La pressione ? funzione della differenza tra le colonne di fluido secondo la legge di Stevino.
La pluralit? di serbatoi aventi differenti caratteristiche consente al dispositivo 100, vantaggiosamente, di mettere in atto protocolli di espansione, e/o differenziazione e/o riprogrammazione di cellule staminali per scopi di ingegneria tissutale oppure per assoggettare il campione cellulare a farmaci diversi in tempi diversi in ambito farmaceutico o di medicina personalizzata. In questi usi vi ? infatti l?esigenza di dispensare differenti reagenti in differenti istanti di tempo nella camera di coltura centrale.
Dalla almeno una camera di coltura 103c si diparte il microcanale di scarico che sfocia nel serbatoio di scarico 103e, costituito da una tasca ribassata e profonda 2.7 mm realizzata sulla faccia interna dell?elemento inferiore 104 del dispositivo 100. Vantaggiosamente, la tasca ribassata mantiene la pressione sul canale nel serbatoio d?uscita quanto pi? possibile irrilevante. Infatti, fino a quando il livello di fluido nel serbatoio di scarico 103e non avr? raggiunto l?altezza del microcanale, avremo una pressione in uscita nulla garantendo una massimizzazione del deflusso dalla camera di coltura.
Vantaggiosamente, le finestre ottiche ricavate al di sopra e al di sotto del dispositivo 100 permettono agli obiettivi di strumenti ottici (ad esempio microscopi) in configurazione diretta ed invertita di avvicinarsi quanto pi? possibile ai campioni presenti nella camera di coltura per effettuare indagini microscopiche e/o spettroscopiche.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il dispositivo microfluidico 100 comprende una pluralit? di valvole 108, passive o attive, tali da gestire dei flussi all?interno dei vari microcanali, o possono essere utilizzati materiali idrosolubili che vadano ad ostruire momentaneamente i microcanali e che solubilizzino in un determinato periodo di tempo. Ovviamente, la gestione dei flussi pu? essere effettuata anche agendo a livello delle varie resistenze idrodinamiche. In pi? ? possibile mettere in parallelo anche una pluralit? camere di coltura alimentate o meno dagli stessi serbatoi come mostrato in figura 6.
In particolare, in figura 6a viene mostrata una rete microfluidica che connette una pluralit? di serbatoi (R1, R2,? Rn) con una singola camera di coltura (CC). Dalla camera di coltura si diparte il canale di scarico verso il serbatoio di scarico (indicato con W in figura 6a). I flussi all?interno dei microcanali vengono regolati mediante valvole 108 attive o passive poste lungo i microcanali stessi.
In figura 6b viene invece mostrata una rete microfluidica avente una pluralit? di camere di coltura (CC) poste in parallelo, ed una pluralit? di serbatoi (R1, R2, ? Rn) che alimenta tutte le camere di coltura. Da ciascuna camera di coltura si diparte un microcanale di scarico verso il serbatoio di scarico (W).
Il Richiedente ha effettuato prove sperimentali a supporto della funzionalit? ottimale del dispositivo microfluidico 100.
Il dispositivo microfluidico 100, a seguito di sterilizzazione in autoclave, viene utilizzato per effettuare colture cellulari. Sono state coltivate cellule HeLa per 72 ore, osservando un trend di crescita cellulare confrontabile con quanto presente in letteratura. L?ottimizzazione dei volumi dei serbatoi e delle geometrie ? possibile effettuare l?esperimento senza effettuare un nuovo riempimento dei serbatoi per tutta la durata della coltura. Al termine della coltura si apprezza una perfetta adesione delle cellule al vetrino 105 senza che esse siano state perturbate dalle portate di fluido presenti nel dispositivo microfluidico 100. Se le portate di fluido fossero troppo elevate, le cellule potrebbero essere smosse dalla camera di coltura. Inoltre, si ha un notevole aumento del numero di cellule al raggiungimento della confluenza. Al termine della coltura, il dispositivo mocrofluidico 100 pu? essere posto sotto uno strumento ottico (ad esempio un microscopio) o di spettroscopia (ad esempio Raman) per effettuare lo screening cellulare ed investigare i costituenti biochimici. Selezionando una regione di interesse, si acquisische una mappa Raman dell?intera area. A seguito di fasi di processing a cui vengono sottoposti gli spettri ottenuti, si ottiene un plot delle PC3 loadings.
La presente invenzione riguarda inoltre il metodo di produzione di un dispositivo microfluidico 100 per coltura e screening cellulare, secondo la rivendicazione 10.
Il metodo di produzione del dispositivo microfluidico 100 comprende le fasi di:
- realizzare l?elemento superiore 102, l?elemento intermedio 103 e l?elemento inferiore 104 mediante microfresatura
La pluralit? di strati in PMMA, ovvero l?elemento superiore 102, l? elemento intermedio 103 e l?elemento inferiore, sono realizzati mediante la tecnica di microfresatura e rifiniti a mano per ottimizzare l?allineamento e l?adesione tra loro durante il successivo allineamento ed assemblaggio. Gli elementi vengono poi puliti mediante cavitazione ultrasonora in un bagno di acqua distillata e assemblati per mezzo del bonding assistito da solventi.
Nella fase del bonding assistito da solventi, gli elementi 102, 103,104 ovvero gli strati di PMMA vengono posti in un beaker molto ampio pieno di etanolo, in modo tale da non essere in contatto tra loro ed evitare una adesione involontaria, e risultano interamente sommersi nel solvente. Il beaker, o recipiente, ? coperto da fogli di alluminio per evitare che l?etanolo evapori. Dopo un intervallo di tempo t1 preferibilmente pari a 80 minuti, gli strati vengono rimossi dal recipiente e dall?etanolo e rapidamente assemblati e immobilizzati nella posizione reciproca definitiva, sovrapposti l?uno all?altro e fissati mediante una pluralit? di viti poste nei fori di allineamento. Il sistema composto dai tre elementi 102, 103, 104 sovrapposti viene quindi posto in una pressa pneumatica preriscaldata su entrambe le facce di contatto a 45?C e viene applicata una forza di 1.5 kN per un tempo t2 preferibilmente pari a 70 min.
Terminata la fase di bonding, viene effettuata una fase di controllo del dispositivo, verificando che le parti di interesse siano correttamente saldate.
Vengono poi realizzate le finestre ottiche superiori ed inferiori. Per ciascuna delle finestre ottiche il dispositivo assemblato viene fissato sul paino di lavoro di una microfresa e viene allineata la punta utensile rispetto al dispositivo lungo le tre dimensioni. Si lavora il dispositivo su entrambe le facce, realizzando sulla faccia superiore la finestra ottica superiore 106, mentre sulla faccia inferiore si realizza una finestra ottica inferiore 107 e la tasca di alloggiamento 105a per il vetrino 105. A seguire si incolla il vetrino 105 nella tasca di alloggiamento mediante deposito di PMMA A3 sui bordi del vetrino 105 e sulla sua superficie, evitando di far andare il polimero nella zona della camera di coltura per evitare il rischio di occlusione dei microcanali.
Il dispositivo viene poi posto in forno preriscaldato a 70?C per un tempo t3 preferibilmente pari a 60 minuti, al fine di velocizzare l?evaporazione del solvente e l?adesione tra la faccia inferiore ed il vetrino in Ca F2.
Vantaggiosamente, il dispositivo microfluidico secondo l?invenzione consente la creazione di ambienti dinamici.
Vantaggiosamente secondo l?invenzione il dispositivo microfluidico presenta sistemi passivi ed autonomi nella gestione dei flussi, funzionanti per gravit?.
Vantaggiosamente, il dispositivo microfluidico secondo l?invenzione presenta valvole integrate ad azionamento passivo.
Vantaggiosamente il dispositivo microfluidico secondo l?invenzione consente un facile accesso ottico ai dispositivi, permettendo un?ampia variet? di analisi, mediante le finestre ottiche integrate.
Vantaggiosamente, il dispositivo microfluidico secondo l?invenzione consente di migliorare la gestione dei volumi di fluido e le cellule nei vari compartimenti mediante sistemi aperti. Tale configurazione infatti facilita l?iniezione ed il prelievo di campioni.
Vantaggiosamente secondo l?invenzione, il dispositivo microfluidico usa materiali e tecnologie di basso costo in modo tale che ciascun chip risulti economico.
Vantaggiosamente secondo l?invenzione il dispositivo microfluidico integra sensori tali da fornire informazioni biochimiche, metaboliche, morfologiche dettagliate, tra le quali tecnologie plasmoniche.
Risulta, infine, chiaro che al dispositivo microfluidico per colture e screening cellulari qui descritto ed illustrato possono essere apportate modifiche e varianti senza per questo uscire dall?ambito protettivo della presente invenzione, come definito nelle rivendicazioni allegate.
Claims (11)
1. Dispositivo microfluidico (100) per colture e screening cellulari, comprendente:
- un elemento di copertura (102) comprendente una pluralit? di aperture (102a) atte all?immissione e prelievo di fluidi, e di un foro passante centrale (102b);
- un elemento intermedio (103) comprendente su una sua superficie inferiore una pluralit? di microcanali (103a), una pluralit? di serbatoi di alimentazione (103d) ed almeno un serbatoio di scarico (103e), e su una sua superficie superiore una cavit? a fondo cieco (103b), di diametro corrispondente al foro passante centrale (102b), che presenta centralmente in foro passante;
- un elemento inferiore (104), comprendente su una sua faccia superiore un serbatoio di raccolta costituito da una porzione ribassata e un foro passante, e su una sua faccia inferiore una porzione centrale rientrante ;
- un vetrino (105) alloggiato in una tasca di alloggiamento ricavata nella porzione centrale rientrante dell?elemento inferiore (104);
caratterizzato dal fatto che detto elemento intermedio (103) ? atto ad essere assemblato interposto tra l?elemento di copertura (102) e l?elemento inferiore (104) a formare una finestra ottica superiore (106) e almeno una camera di coltura (103c), costituita dal foro centrale passante ricavato nell?elemento intermedio (103) e nell?elemento inferiore (104) e chiuso inferiormente dal vetrino (105), detta pluralit? di microcanali (103a) mettendo in comunicazione fluida la pluralit? di serbatoi di alimentazione (103a), la camera di coltura (103c) e il serbatoio di scarico (103e).
2. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere una pluralit? di valvole (108) atte a gestire i flussi di fluido nei microcanali (103a).
3. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto elemento di copertura (102) ha spessore compreso tra 5 mm e 1 mm, detto elemento intermedio (103) ha spessore compreso tra 4mm e 8mm e detto elemento inferiore(104) ha spessore compreso tra 5mm e 1mm.
4. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto elemento di copertura (102), detto elemento intermedio (103) e detto elemento inferiore (104) presentano ciascuno almeno quattro fori di allineamento (101) atti a consentire l?assemblaggio del dispositivo microfluidico (100).
5. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l?elemento di copertura (102), l?elemento intermedio (103) e l?elemento inferiore (104) sono realizzati in PMMA.
6. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la pluralit? di microcanali (103a) ? costituita da microcanali ciascuno avente sezione rettangolare con larghezza compresa tra 0.005 mm e 0.5 mm e altezza compresa tra 0.005 mm e 0.5 mm
7. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la pluralit? di serbatoi di alimentazione (103d) comprende un primo serbatoio (103da), un secondo serbatoio (103db), un terzo serbatoio (103dc) ed un quarto serbatoio (103dd) aventi volume tale da consentire una portata di fluido nei microcanali (103a) accettabile per un tempo variabile tra 12 ore e 1440 ore.
8. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che ciascun microcanale (103a) in ingresso o in uscita dalla camera di coltura (103c) si trova ad una altezza compresa nell?intervallo 0.005 mm e 0.5 mm dal fondo della camera (103c) stessa, a cui in uso aderiscono le cellule.
9. Dispositivo microfluidico (100) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che dalla camera di coltura (103c) si diparte un microcanale di scarico che sfocia nel serbatoio di scarico (103e) , costituito da una rientranza realizzata sulla faccia interna dell?elemento inferiore (104).
10. Metodo di produzione del dispositivo microfluidico (100) secondo una delle rivendicazioni precendenti, comprendente le fasi di:
- realizzare l?elemento superiore (102), l?elemento intermedio (103) e l?elemento inferiore (104) mediante microfresatura;
- pulire gli elementi (102, 103, 104) mediante cavitazione ultrasonora in bagno di acqua distillata; - assemblare tra loro gli elementi (102, 103, 104) mediante bonding assistito da solventi;
- Realizzare le finestre ottiche (106, 107) e la tasca di alloggiamento del vetrino (105) mediante microfresatura;
- Fissare il vetrino (105) nella tasca di alloggiamento dell?elemento inferiore (104)
11. Metodo di produzione secondo la rivendicazione 10 caratterizzato dal fatto che la fase di assemblare mediante bonding assistito da solventi consiste in :
- immergere in un recipiente contenente etanolo gli elementi (102, 103, 104) ;
- coprire il recipiente con fogli di alluminio per evitare l?evaporazione di etanolo,
- dopo un tempo t1, assemblare tra loro l?elemento superiore (102), l?elemento intermedio (103) e fissarli mediante viti poste nei fori di allineamento (101);
- porre gli elementi fissati in una pressa pneumatica preriscaldata per un tempo t2;
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