IT202000004939A1 - Impieghi di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone e suoi derivati - Google Patents
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Description
?IMPIEGHI DI 1,8-DIIDROSSI-3-[IDROSSIMETIL]-ANTRACHINONE E SUOI DERIVATI?
CAMPO DELL?INVEZIONE
La presente invenzione riguarda 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone e suoi derivati e i loro impieghi come farmaci nel trattamento di patologie nelle quali il recettore 2 (SSTR2) e/o il recettore 5 (SSTR5) della somatostatina sono sovraespressi.
STATO DELL?ARTE
Nell?era della chimica combinatoriale e dell?alta capacit? di analisi di grandi librerie di composti, lo sviluppo di prodotti naturali ? stato trascurato. Tuttavia, malgrado il costante progresso nei campi sopracitati, le modalit? di trattamento di un certo numero di patologie sono insoddisfacenti e c?? ancora un bisogno non ancora soddisfatto di scoperte di nuovi farmaci.
Le somatostatine (SSTs) rappresentano una famiglia di ciclopeptidi che sono prodotti principalmente da cellule normali endocrine, gastrointestinali, immuni e neuronali cos? come da alcuni tipi di tumori. I peptidi di somatostatina pi? efficaci, SST14 e SST28, contengono rispettivamente 14 e 28 amminoacidi.
Le SSTs sono uniche nel loro ampio spettro d?azione inibitoria sia sulla secrezione endocrina ? per esempio dell?ormone della crescita, dell?insulina, del glucagone, della gastrina, della colecistochinina, del peptide vasoattivo intestinale e della secretina ? che sulla secrezione esocrina ? per esempio degli acidi gastrici, dei fluidi intestinali e degli enzimi pancreatici. Questo profilo pan-antisecretorio ha portato a ?trial? clinici sperimentali del peptide naturale SST14 per il trattamento di un ampio numero di condizioni patologiche quali: diabete di tipo I e II; tumori neuroendocrini e ipersecretori; disordini neuronali e gastrointestinali che comprendono ulcere gastriche emorragiche, pancreatiti, complicazioni derivanti da chirurgia del pancreas e fistole pancreatiche. Le somatostatine sono anche note per avere effetti modulatori sulla risposta immunitaria e le loro propriet? anti-proliferative, anti-angiogeniche e analgesiche le rendono interessanti candidati per un uso terapeutico nelle malattie immuno-mediate, come l?artrite reumatoide. Sembra pertanto importante ridurre i livelli dei mediatori dell?infiammazione nei macrofagi, essendo noto il ruolo giocato dall?infiammazione nei disordini autoimmuni o autoinfiammatori, nelle malattie neurodegenerative o nel cancro.
Tuttavia, sussistono ostacoli allo sviluppo di nuovi farmaci pi? efficaci e meno tossici, che possano curare i segnali e la sintomatologia dell?infiammazione acuta ma anche le conseguenze a lungo termine delle malattie infiammatorie croniche.
Sebbene alcuni studi abbiano indicato che, in determinate circostanze, SST14 ? efficace, gli stessi hanno anche evidenziato che il suo pieno potenziale terapeutico non pu? essere sfruttato a causa della sua breve emivita nel plasma, di meno di 3 minuti.
Composti metabolicamente stabili, con propriet? SST-simili, avrebbero dovuto dimostrare un profilo clinico migliorato. Cos? gli attuali SST analoghi sono o composti peptidici o composti non-peptidici, e includono agonisti selettivi per la sstrs, cos? come composti con un profilo universale di legame che simuli il naturale SST.
Gli agenti terapeutici attualmente in uso non sono completamente efficaci per un certo numero delle precedenti patologie elencate, sono spesso non specifici, e hanno molteplici effetti collaterali avversi.
E? sempre pi? sentita la necessit? e l?importanza di identificare composti alternativi che agiscano specificamente sui recettori per la somatostatina e che non abbiano gli svantaggi sopracitati.
E? dunque oggetto della presente invenzione lo sviluppo di un nuovo uso di composti noti, che sorprendentemente dimostrano una attivit? migliorata nel trattamento di malattie nelle quali siano sovraespressi i recettori 2 e 5 della somatostatina.
SOMMARIO DELL?INVEZIONE
La presente invenzione riguarda l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, nel trattamento di patologie nelle quali il recettore 2 (SSTR2) e/o il recettore 5 (SSTR5) della somatostatina sono sovraespressi, in cui questi derivati sono 3?-esteri di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone con amminoacidi.
Il problema alla base della presente invenzione riguarda la capacit? di avere molecole disponibili che siano efficaci nel trattamento di patologie nelle quali sia implicata la sovraespressione dei recettori 2 e/o 5 della somatostatina, con lo scopo di permettere la produzione di farmaci destinati al trattamento delle patologie.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Le caratteristiche e i vantaggi della presente invenzione saranno evidenti dalla descrizione dettagliata riportata pi? avanti, dagli Esempi dati con finalit? illustrative e non limitative e dalle annesse Figure 1-4:
Figura 1A ? Saggio di vitalit? cellulare. Le cellule sono state trattate con differenti concentrazioni di AE per 72 ore. La vitalit? ? stata comparata con le cellule nontrattate. L?assorbanza delle piastre (ABS) ? stata misurata in uno spettrofotometro, alla lunghezza d?onda di 620 nm. La sopravvivenza cellulare ? stata espressa come percentuale calcolata come segue: [(ABS delle cellule trattate con AE ? ABS basale)/(veicolo ABS delle cellule trattate ? ABS basale] x 100 con analisi del test MTT. Figura 1B ? Espressione genica dell?mRNA per sstr2 e sstr5. Le cellule IMR5 e MRC5 sono state esposte ad AE (50?M) e a SST14 (10 ?M) per diversi intervalli di tempo (5,30,60,120 min). Il gene sstr5 non ? stato espresso nelle cellule MRC5.
Figura 1C ? Western-blot analisi: espressione delle proteine SSTR2 e SSTR5 dopo trattamento con AE (50?M) nelle cellule sensibili ad AE (IMR5) e nelle cellule nonsensibili ad AE (MRC5). L?analisi densitometrica dei dati da rappresentare di tre esperimenti ? presentata come incremento rispetto al controllo.
Figura 2 ? Docking molecolare predittivo della modalit? di legame per Aloe-emodina nel complesso con SSTR2 (Figura 2A) e con SSTR5 (Figura 2B) nel modello per omologia; i residui coinvolti nella valutazione molecolare sono marcati, mentre il legame fra il ligando e il recettore sono indicati con una freccia.
Figura 3A ? Modulazione della vitalit? cellulare. La capacit? proliferativa delle cellule IMR5 ? stata testata in presenza di SSTR2 o SSTR5 Abs e SST14. Dopo 24 ore di coesposizione ad AE (50?M) e al ligando naturale o ad Abs, le cellule sono state valutate per la vitalit? cellulare. L?assorbanza delle piastre (ABS) ? stata misurata allo spettrofotometro, alla lunghezza d?onda di 620 nm. La sopravvivenza cellulare ? stata espressa come percentuale calcolata come segue: [(ABS delle cellule trattate con AE ? ABS basale)/(veicolo ABS delle cellule trattate ? ABS basale] x 100.
Figura 3B ? Analisi al microscopio confocale. Le cellule IMR5 e MRC5 sono state pretrattate per 20 min con SSTR2, SSTR5 Abs o SST14 ed ? stata valutatala quantit? di fluorescenza relativa nelle cellule a 3 minuti dalla somministrazione di AE. La fluorescenza di AE (F) ? stata espressa come una percentuale raccolta durante l?incorporazione ed ? stata valutata (?F%) come media di 30 regioni di interesse (ROIs): [(massimo valore di fluorescenza ? fluorescenza basale)/ fluorescenza basale]x100.
Figura 3C ?siRNA knockdown. Le cellule IMR5 sono state trasfettate con un siRNA per il recettore 5 della somatostatina. L?analisi Western blot per l?espressione di SSTR5 ha dimostrato che il gene viene silenziato 48 ore dopo la trasfezione con siRNA ed ? stabile per 72 ore. Le cellule IMR5 trasfettate sono state trattate con AE (50?M) per 24 ore e sono state valutate per l?inibizione della vitalit?.
Figura 4A ? Immunoistichimica per SSTR2. Immunoistochimica rappresentativa per SSTR2 di campioni chirurgici d?archivio di neuroblastoma che dimostrano un?intensa immunoreattivit?. Scala della barra, 100 ?m.
Figura 4B ? SSTR2 H-punteggio nei campioni chirurgici di neuroblastoma.
Figura 4C ? Immunoistichimica per SSTR5. Immunoistochimica rappresentativa per SSTR5 di campioni chirurgici d?archivio di neuroblastoma che dimostrano un?immunoreattivit? lieve (caso 1) o assente (casi 2 e 3). Scala della barra, 100 ?m. Figura 4D ? SSTR5 H-score nei campioni chirurgici di neuroblastoma.
Figura 5 ? Azione di AE sull?espressione della citochina IL-1???I macrofagi attivati sono stati incubati con AE (0,1-50 ?M) o solo con il veicolo. Dopo 60 minuti sono stati aggiunti al terreno LPS (100 ng/ml) o solo veicolo (ns). Le cellule sono state incubate per 24 ore. Il terreno di coltura ? stato raccolto per quantificare la citochina IL-1??? Figura 6 ? Influenza di AE sull?attivazione di Caspasi-1. I macrofagi trattati con AE sono stati incubati con una sonda fluorescente capace di legarsi irreversibilmente con la Caspasi-1 attiva e sono stati quindi raccolti e marcati con un anticorpo fluorescente anti-CD11b. L?analisi al FACS valuta la percentuale di macrofagi con doppia positivit? (CD-11b+ e Caspasi-1 attiva).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, nel trattamento di patologie nelle quali il recettore 2 (SSTR2) e/o il recettore 5 (SSTR5) della somatostatina sono sovraespressi, in cui questi derivati sono 3?-esteri di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone con amminoacidi.
La presente invezione riguarda 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone e suoi derivati e i loro impieghi come farmaci nel trattamento di patologie nelle quali il recettore 2 (SSTR2) e/o il recettore 5 (SSTR5) della somatostatina sono sovraespressi e in cui questi derivati sono 3?-esteri di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone con amminoacidi.
Con il termine ?Aloe-emodin? o ?AE?, come usati nella presente, si ? inteso comprendere l?antrachinone naturale 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone, prodotto da diverse specie di piante ben note, come Aloe e Rheum, come dai vermi anellidi del genere Tomopteris.
Con ?derivati di AE? o ?derivati? si intende comprendere i derivati esterei di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone, in cui l?estere ? un estere di un amminoacido come l?estere della lisina di AE: AE-lisina. Altri derivati sono derivati di aloe-emodin in posizione 3? (che portano o una carica positiva o una carica negativa) che dimostrano migliorate propriet? di solubilit?. I derivati di aloe-emodina di formula (I)
dove R pu? essere il radicale di: un acido policarbossilico alifatico a catena lineare o ramificata C2-C6 saturo o insaturo, o un acido arilico policarbossilico, o un amminoacido, o un acetale con un amminozucchero, o un gruppo di un acido organico, come descritto in WO02/090313.
Nei derivati dell?aloe-emodina di formula (I) il radicale R sull?ossidrile in posizione 3? pu? essere: un acido policarbossilico alifatico a catena lineare o ramificata da 2 a 6 atomi di carbonio saturo o insaturo, anche sostituito sulla catena alifatica con opportuni gruppi idrofilici. Quando R ? un acido alifatico del gruppo a), detto acido ? scelto preferibilmente tra uno dei seguenti gruppi: (i) un acido bicarbossilico alifatico saturo lineare, e.g. acidi ossalico, malico, succinico, glutarico, adipico, pimelico, diglicolico; (ii) o ramificato; (iii) o insaturo, e.g. acido maleico; (iv) o un acido tricarbossilico, e.g citrico; un acido policarbossilico arilico anche sostituito sull?anello aromatico con piccoli residui idrofilici, quali ad esempio OH, CH2OH ed equivalenti. Quando R ? un acido aromatico del gruppo b) detto acido ? scelto preferibilmente nel gruppo consistente in sistemi aromatici aventi uno o pi? anelli, sostituenti idrofili, se presenti, ed almeno due gruppi carbossilici, come ad esempio acido ftalico e acido 1,2,4 benzentricarbossilico; un amminoacido, (amminogruppo in ?- o in altre posizioni), per esempio lisina, alanina, isoleucina, tirosina, triptofano e GABA; un acetale con un amminozucchero, quali ad esempio la daunosammina ed altri equivalenti; il residuo di un acido inorganico, quali ad esempio l?acido fosforico ed equivalenti.
Inoltre, nei derivati oggetto della presente invenzione, nei quali R appartiene ai gruppi a) e b), i gruppi funzionali carbossilici non esterificati possono essere in forma libera o anche salificata; in quest?ultimo caso, possono essere impiegati noti controioni farmaceuticamente accettabili, essendo particolarmente preferiti sodio o potassio. Nei derivati oggetto dell?invenzione, nei quali R appartiene ai gruppi c) e d) il gruppo amminico pu? essere in forma libera o anche salificata; in quest?ultimo caso possono essere impiegati i noti gruppi anionici farmaceuticamente accettabili, essendo particolarmente preferiti acetato, trifluoroacetato, nitrato, cloruro, bromuro e solfato acido.
I derivati di aloe-emodina pi? preferiti sono: AE-lisina, AE-alanina, AE-isoleucina, AE-tirosina, AE-triptofano e AE-GABA.
Come sar? evidente nella sezione Esempi, i risultati dell?espressione genica, del western blotting e delle tecniche di imaging, indicano che i SSTR sono espressi in modo differente nelle cellule neuroectodermiche e nelle cellule AE-sensibili e nonsensibili e che AE ha le caratteristiche biologiche e molecolari per essere riconosciuta da SSTR2 e SSTR5. In particolare, questi recettori sono indotti dopo esposizione ad AE. Inoltre, gli esperimenti di knockdown e di competizione dimostrano un diverso pattern di espressione di SSTR2 e SSTR5 nelle cellule AE-sensibili e non-sensibili, che correla con il diverso potenziale citotossico di AE. Questi dati sono corroborati da studi preliminari di modeling molecolare che dimostrano come AE possa essere riconosciuta dai recettori SSTR2 e SSTR5 stabilendo, nel sito di legame ortosterico, una rete di interazioni stabilizzanti.
In un ulteriore aspetto, l?invenzione riguarda l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, in cui gli amminoacidi di detti 3?-esteri di 1,8-diidrossi-3[idrossimetil]-antrachinone con amminoacidi sono scelti dal gruppo consistente in lisina, alanina, isoleucina, tirosina, triptofano e GABA.
Ancor pi? preferito, ? il derivato di aloe-emodina AE-lisina e AE-lisina(CF3COO)2 di formula:
In un ulteriore aspetto, l?invenzione prevede l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, nel trattamento di patologie nelle quali il recettore 2 (SSTR2) e/o il recettore 5 (SSTR5) della somatostatina sono sovraespressi, in cui dette patologie sono scelte dal gruppo consistente in tumori, patologie immunomediate, patologie infiammatorie croniche e disordini neurodegenerativi.
In un aspetto preferito, l?invenzione prevede l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, nel trattamento di patologie nelle quali il recettore 2 (SSTR2) e/o il recettore 5 (SSTR5) della somatostatina sono sovraespressi, in cui detti tumori sono neuroblastoma, tumori neuroendocrini o tumori neuroectodermici primitivi (PNETs).
Senza essere legati ad alcuna teoria, i dati qui presentati sono la spiegazione molecolare e biologica della selettivit? di AE.
Inoltre, le osservazioni sul meccanismo d?azione recettore-mediato del composto antrachinonico, combinato con la robusta e diffusa espressione di SSTR2 nei campioni di neuroblastoma umano, porta a un ulteriore sviluppo di AE come un agente antitumorale personalizzato e all?esplorazione del suo uso potenziale per altre applicazioni biologiche mediate dai recettori della somatostatina.
In un ulteriore aspetto, l?invenzione prevede l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, in cui le dette palatologie immuno-mediate sono la malattia di Chron e l?artrite reumatoide.
In un ulteriore aspetto, l?invenzione prevede l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, in cui i detti disordini neurodegenerativi sono la malattia di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica e la sclerosi multipla.
In un ulteriore aspetto, l?invenzione prevede l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati da, in cui detto 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone ? sotto forma di formulazioni farmaceutiche comunemente utilizzate per la somministrazione di farmaci per via parenterale e orale, cos? come formulazioni per somministrazione locale.
In un ulteriore aspetto, l?invenzione prevede l?uso di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, in cui detto 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone ?, per esempio presente in un intervallo compreso da 5 a 500 mg per unit? di somministrazione.
ESEMPI
Si fa riferimento ai seguenti esempi, che insieme alle precedenti descrizioni, illustrano alcune forme di realizzazioni dell?invenzione.
Esempio1.
COMPOSTI
Aloe-emodina (AE) ? stata fornita da Angelini S.p.A., ? stata dissolta in DMSO in soluzioni stock da 200 mM.
Somatostatina (SST14) ? stata acquistata da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Tutti i prodotti sono stati conservati a -20?C.
COLTURE CELLULARI
Cellule di neuroblastoma (IMR5), fibroblasti umani di polmone (MRC5), cellule di carcinoma epiteliale della cervice (HeLa) e cellule di carcinoma epatocellulare (Huh7) sono state acquistate da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), fibroblasti umani di prepuzio (HuF) sono stati derivati da tessuti primari nel nostro laboratorio, cellule di melanoma (M19-Mel) e di carcinoma a piccole cellule del polmone (DMS114) sono state ricevute dal National Cancer Institute (NCI, New York). MRC5, M19Mel, HeLa, HuF, e Huh7 sono cresciute in terreno DMEM; DMS114 e IMR5, sono cresciute in terreno RPMI-1640 (Lifetechnologies Gibco, Milano, Italia). Il terreno di coltura ? stato supplementato con 10% di siero fetale bovino inattivato con il calore (Lifetechnologies Gibco, Milano, Italia), 100 unit?/ml di penicillina e 100 ?g/ml di streptomicina (Lifetechnologies Gibco, Milano, Italia). Tutte le linee cellulari sono cresciute a 37?C con 5% CO2 in atmosfera umidificata.
SAGGIO DI VITALITA? CELLULARE
Le cellule sono state seminate in piastre da 96-well in normale terreno di crescita. Dopo 24 ore di incubazione, il terreno ? stato eliminato e sostituito con 100 ?L di normale terreno di crescita supplementato con diverse concentrazioni di AE, per 72 ore. Quindi, le cellule sono state lavate due volte in PBS e la loro vitalit? ? stata valutata usando il kit Cell Proliferation Kit I (Cell Proliferation Kit I, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) in accordo con le istruzioni del produttore. Tutti i saggi hanno incluso cellule trattate solo con il veicolo (DMSO) sciolto in normale terreno di crescita alla concentrazione di 0,05%. Tutti gli esperimenti sono stati condotti almeno in triplicato.
RISULTATI DELLA CITOTOSSICITA? DI AE
Quando la citotossicit? di AE ? stata valutata su un pannello di linee cellulari di diversa origine embrionale, ? stata osservata una significativa attivit? citotossica su cellule di IMR5 e M19-Mel rispetto alle cellule di HuF, HeLa, DMS114, MRC5 e Huh-7. E? degno di nota rilevare che le cellule M19-Mel, IMR5 e DMS114 sono di origine neuroectodermica, mentre le cellule HuF, HeLa, MRC5 e Huh sono di origine mesodermica ed ectodermica (Fig.1A).
Esempio 2.
ANALISI DELL?ESPRESSIONE DI RNA
Per quantificare l?espressione dei geni di sstrs selezionati, sono state condotte analisi di Real-Time PCR sulle cellule IMR5, DMS114 e MRC5. L?RNA totale ? stato isolato usando un kit di Qiagen ?RNeasy Mini Kit? in accordo con le istruzioni del produttore. La sintesi di cDNA ? stata condotta usando GeneAmp? RNA PCR Core Kit (Roche, New Jersey, U.S.A.). I livelli di espressione dell?mRNA di sstrs sono stati valutati tramite RT-PCR qualitativa usando primers specifici. Delle due linee cellulari di origine neuroectodermica, IMR5 esprimeva SSTR2 e 5, mentre DMS114 non ha dimostrato di esprimere alcun recettore per somatostatina. MRC5, presa come linea cellulare rappresentativa di cellule di origine non-neuroectodermica, esprimeva mRNA per SSTR1 e SSTR2.
I primers usati in questi esperimenti sono i seguenti:
Le analisi quantitative di RT-PCR (qPCR) sono state condotte in un volume finale di 25 ?l utilizzando 3 ?l di cDNA, 0.2 ?M di ogni primers, usando i reagenti di ?SYBRgreen? in accordo con le istruzioni del produttore. Le reazioni di PCR comprendevano 40 cicli dopo un iniziale step di denaturazione (95?C, 10 min) in accordo con i seguenti parametri: denaturazione a 95?C,15 sec e appaiamento/estensione a 60?C, 1 min, in un ABI PRISM 7700 Sequence Detection system. Per normalizzare la quantit? di RNA nei campioni estratti, ? stata condotta anche la real-time PCR del cDNA del gene umano GAPDH. Inoltre, abbiamo ottimizzato il metodo per la quantificazione relativa con sonde sequenze-specifiche di DNA per i geni sstr2 and sstr5 usando i reagenti del kit ?TaqMan Gene Expression Assays? in accordo con le istruzioni del produttore
La quantificazione relativa del frammento di cDNA target presente nei campioni ? stato valutato usando il metodo 2<-??CT>. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato. I primers usati in questi esperimenti sono i seguenti:
RISULTATI DELLE ANALISI DELL?ESPRESSIONE DELL?RNA
L?espressione del gene sstr5 ? stata significativamente indotta nelle cellule IMR5 tramite l?esposizione ad AE. Al contrario, i geni sstr2 e sstr5 sono stati indotti entrambi tramite l?esposizione a somatostatina-14 in questa linea cellulare (fig.1B). Nelle cellule della linea cellulare MRC5 il gene sstr5 non ? espresso ma il gene sstr2 ? stato significativamente indotto sia dall?esposizione ad AE che a SST14 (fig.1B).
SAGGI WESTERN-BLOT
Le cellule IMR5 e MRC5 sono state seminate e incubate con o senza AE (50 ?M). Le cellule raccolte sono state solubilizzate su ghiaccio in tampone di lisi RIPA supplementato con un cocktail completo di inibitori delle proteasi E? seguita una centrifugazione a 14,000 rpm per 5 min a 4?C. La concentrazione delle proteine ? stata determinata con il saggio BCA (Pierce, Thermo Fisher), usando BSA come standard in accordo con le istruzioni del produttore. Un uguale quantit? di proteine totali (40?g) ? stata oggetto di analisi Western-blot. Le membrane sono state bloccate con 5% m/v di latte magro in polvere in PBS con lo 0.1% di Tween-20 e le bande sono state ibridate con specifici anticorpi (Ab) verso SSTR2, SSTR5 e GAPDH . I blots sono stati visualizzati con anticorpi secondari anti-coniglio IgG, coniugati con la perossidasi e sviluppati con reagenti con migliorata chemioluminescenza L?intensit? dei pixels delle bande visualizzate ? stata determinata usando un Image J software
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato.
RISULTATI DELLE ANALISI WESTERN-BLOT
Le analisi Western-blot hanno confermato le precedenti scoperte sull?induzione del recettore per l?esposizione ad AE nelle cellule IMR5, con l?eccezione della proteina SSTR2 il cui livello non ? risultato significativamente aumentato nelle cellule IMR5 e nelle cellule MRC5 (Fig. 1C).
Esempio 3.
MODELING MOLECOLARE
Allo scopo di trovare un plausibile ruolo di questi recettori nelle cellule sensibili ad AE sono state utilizzate simulazioni di ?docking? molecolare usando i due sottotipi di SSTR, che sono espressi e indotti in modo significativo.
Dal momento che non sono ancora disponibili strutture cristallografiche dei recettori della somatostatina, sono stati costruiti due modelli per omologia, usando come modello la struttura cristallina del recettore k-opioide (KOP) (PDB ID: 6B73), recentemente pubblicata, data la sua elevata sequenza di similarit? con entrambi i sottotipi di SSTR considerati in questo studio. La qualit? dei modelli ? stata valutata usando il ?workspace SWISS-MODEL?.
Le strutture tridimensionali dei ligandi analizzati sono state costruite e correttamente disposte utilizzando la piattaforma MOE (Molecular Operating Environment).
Come programma per la ricerca conformazionale ? stato scelto ?GOLD docking tool? e PLP (Piecewise Linear Potential) ? stata scelta come funzione di punteggio.
Sono state condotte in totale 20 corse di docking per ogni recettore della somatosatina, ricercando in una sfera di 15 ? di raggio. Oltre ad AE, il composto analizzato, le simulazioni di ?docking? sono state condotte anche con i ligandi L-779,976 e L-817,818, gli agonisti non-peptidici, potenti e selettivi, di riferimento rispettivamente per SSTR2 e SSTR5.
RISULTATI DEL MODELING MOLECOLARE
Poich? AE ? una molecola considerevolmente pi? piccola dell?agonista endogeno SST o dei composti di riferimento non-peptidici, lo spazio esplorabile dal ligando all?interno del sito ortosterico di legame ? abbastanza grande da incrementare la variabilit? della predittivit? delle posizioni di legame. Sono presentate le modalit? di legame pi? ragionevoli di AE, all?interno dei siti di legame rispettivamente di SSTR2 (Fig.2A) e di SSTR5 (Fig.2B). AE interagisce soprattutto con i residui dei segmenti transmembrana TM3, TM5, TM6 e con il ?loop? extracellulare EL2, una porzione del sito di legame molto simile a quella descritta per il composto agonista di riferimento.
Example 4
MODULAZIONE DELLA VITALITA? CELLULARE DA PARTE DI ANTICORPI ANTI-SSTR-2 E ANTI-SSTR-5 E SST14
E? stata studiata la modulazione della vitalit? cellulare usando anticorpi contro SSTR2 e SSTR5 cos? come il ligando naturale SST14, nell?ottica di ottenere una validazione funzionale degli esperimenti di espressione genica e della previsione dinamica molecolare.
Le cellule IMR5 sono state seminate come descritto precedentemente. Dopo 24 ore di incubazione il terreno ? stato eliminato e sostituito con 100 ?L di terreno supplementato con SST14 (10?M), 1:500 di anticorpi anti-SSTR2, anticorpi anti-SSTR5, o anticorpi anti-SSTR2 e anticorpi anti-SSTR5 insieme. Quindi le cellule IMR5 sono state esposte a diverse concentrazioni di AE, come indicato precedentemente. RISULTATI DELLA MODULAZIONE DELLA VITALITA? CELLULARE
E? stato osservato un significativo incremento della sopravvivenza nelle cellule IMR5 dopo 24 ore di co-esposizione ad AE e agli anticorpi anti-SSTR2 e anti-SSTR5. Non ? stato osservato alcun aumento di vitalit? nelle cellule co-trattate con AE e SST14 (Fig.3A).
ANALISI AL MICROSCOPIO CONFOCALE
Poich? AE ? una molecola autofluorescente (?ecc a 410 nm e ?em a 610 nm) ? stato studiato il suo accumulo nelle cellule sensibili e in quelle non-sensibili dopo trattamento con anticorpi e il ligando naturale somatostatina, SST14.
Le cellule IMR5 e MRC5 sono state seminate su vetrini da microscopio in piastre da 12-well e coltivate in terreno senza farmaci 24 ore prima del trattamento. Le cellule sono state trattate con i diversi composti e sono state osservate in vivo. AE ? stata aggiunta alla concentrazione finale di 50?M. Le cellule IMR5 e MRC5 sono state pretrattate con SST14 a 10 ?M per 20 min e con -SSTR5 e anti-SSTR2 Abs (1:100) per 20 min.
La fluorescenza di AE ? stata raccolta durante l?incorporazione ed ? stata calcolata come il rapporto fra la fluorescenza basale delle cellule e il massimo valore di fluorescenza raggiunto in 3 min. La fluorescenza ? stata monitorata con eccitazione a 488 nm e con emissione a 500-550 nm. Le immagini confocali sono state ottenute con un microscopio A1Rsi+Laser Scan Confocal (Nikon Instruments Inc, Melville, USA) con sistema di rilevamento e un obiettivo 20x. L?intensit? luminosa del laser era del 5%. I dati sono presentati come variazione di fluorescenza relativa rispetto al valore iniziale per ogni singola cellula. Le immagini sono state catturate ogni 5 secondi. L?analisi dell?intensit? di fluorescenza ? stata condotta dopo l?acquisizione delle immagini usando NISElements Advanced research (Nikon Instruments Inc.). RESULTS OF CONFOCAL MICROSCOPY ANALYSES
La fluorescenza ? stata significativamente ridotta nelle cellule IMR5 dopo incubazione con anticorpi anti-SSTR5; non ? stata osservata questa differenza dopo i pretrattamenti con SST14 e con gli anticorpi anti-SSTR2; non ? stato osservato alcun accumulo di fluorescenza AE ? stato osservato nelle cellule MRC5 pre-trattate o non pre-trattate con gli anticorpi o con SST14 (Fig.3B).
SILENZIAMENTO DEL GENE SSTR5 CON siRNA
Le cellule IMR5, come rappresentanti di una linea cellulare altamente espressiva di SSTR5, sono state trasfettate con siRNA (small interfering RNA) contro sstr5.
Un gruppo di siRNA, finalizzato per il gene umano di sstr5 e un controllo duplex negativo disordinato sono stati acquistati da Origene (OriGene Technologies, Rockville, MD, USA). Le cellule IMR5 sono state trasfettate con aliquote di 20 nM di siRNA anti-sstr5 e di siRNA di controllo mediante Lipofectamine RNAiMAX in accordo con le istruzioni del produttore. Ventiquattr?ore prima della trasfezione 30,000 cellule sono state piastrate in 500 ?l di terreno di coltura senza antibiotici per 24 h. Quindi le cellule sono state trasfettate con RNAi duplex-Lipofectamine? RNAiMAX complessi, ad una concentrazione finale di RNA di 20 nM, per 20 minuti a temperatura ambiente.
Le cellule sono state incubate a 37?C in un incubatore a CO2 fino alla valutazione del silenziamento del gene. Il gene silenziante ? rimasto stabile per 72 ore. Dopo 48 ore le cellule sono state trattate con AE (50 ?M). 24 ore dopo il trattamento con AE le cellule sono state raccolte e preparate per il saggio quantitativo di proliferazione, come precedentemente descritto. Le cellule trattate con siRNA non-targhettizzati sono state utilizzate come controllo negativo.
RISULTATI DEL SILENZIAMENTO GENICO
Dopo il silenziamento genico, le cellule sono risultate significativamente meno sensibili all?inibizione della crescita indotta da AE (Fig.3C).
Esempio 5
IMMUNOCOLORAZIONE
Per investigare ulteriormente il possibile ruolo degli SSTR nel trattamento con AE del neuroblastoma in vivo, abbiamo valutato l?immunoreattivit? verso SSTR2 e SSTR5 in campioni chirurgici di neuroblastoma.
Sono stati esaminati campioni chirurgici di neuroblastoma (n=9), fissati in paraffina, prelevati dagli archivi dell?Unit? di Patologia Chirurgica dell?Ospedale Universitario di Padova.
La colorazione immunologica ? stata condotta automaticamente usando il kit ?Bond Polymer Refine Detection? nel sistema ?BOND-MAX? (Leica Biosystems) su sezioni di spessore 3-4 ?m con anticorpi primari contro SSTR2 ([UMB1]; Abcam, Cambridge, UK) e contro SSTR5 ([UMB4]; Abcam, Cambridge, UK).
Le soglie di intensit? di colorazione sono state settate come segue: intensa, (3+); moderata, (2+); debole, (1+). E? stato calcolato il numero totale di cellule per ogni intensit? di colorazione ed ? stato calcolato un H-score modificato per ogni tumore con la seguente formula: (1?[% cellule 1+]+2?[% cellule 2+]+3?[% cellule 3+])/100. I punteggi si trovano su una scala continua da 0 a 3 (20).
RISULTATI DELLE ANALISI DI IMMUNOCOLORAZIONE
Mentre l?immunoreattivit? per SSTR5 ? stata rilevabile in 1 dei nove campioni tumorali valutati, mentre ? stata rilevabile un?immunoreattivit? da moderata a forte, per SSTR2 in tutte le sezioni di neuroblastoma esaminate (Fig 4).
Esempio 6.
VALUTAZIONE DELL?ATTIVITA? DI AE SU MACROFAGI MURINI ATTIVATI EX VIVO
Gli esperimenti sono stati condotti su macrofagi murini peritoneali.
I macrofagi sono stati raccolti da lavaggi peritoneali 10 giorni dopo l?inoculazione intraperitoneale di tioglicolato sterile. Le cellule sono state centrifugate, contate e seminate in piastre. Dopo 48 ore il terreno di coltura ? stato eliminato e le cellule sono state incubate con diverse concentrazioni di AE (0.1-50 ?M) o con il solo terreno di coltura. Dopo 60 minuti sono stati aggiunti al terreno di coltura LPS (100 ng / ml) o solo veicolo. Le cellule sono state incubate per 24 ore al termine delle quali ? stato raccolto il terreno di coltura per la quantificazione mediante saggio ELISA della citochina IL-1?. In altri pozzetti della piastra le cellule sono state incubate per ulteriori due ore con una sonda fluorescente in grado di legare irreversibilmente la Caspasi-1 attiva (enzima chiave dell?inflammosoma). Al termine di questa incubazione le cellule sono state staccate, marcate con un anticorpo fluorescente anti-CD11b (specifico per i macrofagi) e quindi analizzate al FACS per valutare la percentuale di macrofagi con doppia positivit? (CD11b caspasi1 attivata).
Le Figure 5 e 6 riportano i risultati di due diversi esperimenti condotti con determinazioni in quadruplicato (ELISA) o duplicato (caspasi1).
RISULTATI DELL?ATTIVITA? DI AE SU MACROFAGI MURINI ATTIVATI EX VIVO Dai saggi preliminari eseguiti appare evidente che in presenza di AE a partire da concentrazioni di 5 ?M viene quasi completamente abolita la secrezione di IL-1? indotta da LPS nei macrofagi. Inoltre, la dose di 5 ?M di AE inibisce quasi del tutto l?attivazione della Caspasi1, enzima chiave nella produzione di IL-1? attiva nei processi infiammatori, nei macrofagi murini. I nostri dati preliminari indicano che AE lega i recettori 2 e 5 per la somatostina permettendo la loro internalizzazione. I recettori 2 e 3 per la somatostina sono sovraespressi nei macrofagi attivati.
ANALISI STATISTICHE
Le analisi statistiche sono state condotte con il t-test di Student con *P<0.05 e *P< 0,01.
Dalla precedente descrizione e dagli esempi sopracitati, i vantaggi che attengono all?uso dei composti di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone descritti e ottenuti secondo la presente invenzione sono evidenti.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone o suoi derivati, per l?uso nel trattamento di patologie nelle quali il recettore 2 (SSTR2) e/o il recettore 5 (SSTR5) della somatostatina sono sovraespressi, in cui detti derivati sono 3?-esteri di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone con amminoacidi.
- 2. L?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti amminoacidi sono scelti dal gruppo consistente in amminoacidi con l?amminogruppo in ?- o in altre posizioni.
- 3. L?uso secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detti derivati di 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone sono scelti dal gruppo consistente in lisina, alanina, triptofano, isoleucina, tirosina e GABA.
- 4. L?uso secondo le rivendicazioni da 1 a 3, in cui dette patologie sono scelte dal gruppo consistente in tumori, patologie immuno-mediate, patologie infiammatorie croniche e disordini neurodegenerativi.
- 5. L?uso secondo le rivendicazioni da 1 a 4, in cui detti tumori sono neuroblastoma, tumori neuroendocrini o tumori neuroectodermici primitivi (PNETs).
- 6. L?uso secondo le rivendicazioni da 1 a 5, in cui dette palatologie immunomediate sono la malattia di Chron e l?artrite reumatoide.
- 7. L?uso secondo le rivendicazioni da 1 a 6, in cui detti disordini neurodegenerativi sono la malattia di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica e la sclerosi multipla.
- 8. L?uso secondo le rivendicazioni da 1 a 7, in cui detto 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone ? in forma di formulazioni farmaceutiche per la somministrazione di farmaci per via parenterale, orale, e per somministrazione locale.
- 9. L?uso secondo le rivendicazioni da 1 a 8 in cui detto 1,8-diidrossi-3-[idrossimetil]-antrachinone ? in un intervallo compreso da 5 a 500 mg per unit? di somministrazione.
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