IT201900011844A1 - Diagnosi predittiva di insorgenza diabete e di alterata tolleranza glucidica - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Della Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal Titolo:

“Diagnosi predittiva di insorgenza diabete e di alterata tolleranza glucidica”

STATO DELL’ARTE

Il diabete mellito di tipo 2 (DM) è una malattia metabolica cronica causata da diminuita o assente secrezione di insulina o anche da ridotta sensibilità del tessuto all'insulina. Il DM rappresenta oggi una sfida per i sistemi di assistenza sanitaria ovunque nel mondo.

L'International Diabetes Federation (IDF) stima che uno su undici adulti sia affetto da DM, per un totale di circa 415 milioni di persone, e 193 milioni di loro non sono ancora stati diagnosticati (International Diabetes Federation: IDF Diabetes Atlas.7th ed. Belgium: IDF, 2015).

L'iperglicemia cronica è una caratteristica comune in tutti i sottotipi di questa malattia ed è associata a un danno a lungo termine, che aumenta i tassi di morbilità e mortalità e causa disfunzione di diversi organi, come insufficienza renale, cecità e amputazione degli arti.

Attualmente, i test di laboratorio utilizzati per diagnosticare il DM sono l'emoglobina glicata (HbA1c), il glucosio plasmatico a digiuno (FG) e il glucosio plasmatico a 2 ore (2hG) dopo un test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) da 75g (Sacks DB et al. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem. 2011; 57:e1-e47). HbA1c rappresenta finora il test di riferimento per il monitoraggio glicemico poiché riflette direttamente la glicemia media ed è fortemente correlata alle complicanze a lungo termine di DM. Tuttavia, numerosi studi recenti indicano che l’attuale valutazione della sola HbA1c o della glicemia a digiuno non riescono a evidenziare la risposta ai “picchi” glicemici o di fruttosio, e rappresentano quindi una misurazione inadeguata e incompleta per caratterizzare una condizione prediabetica o indicare la possibile evoluzione diabetica (Rodriguez-Segade S et al., Prediabetes defined by HbA1c and by fasting glucose: differences in risk factors and prevalence. Acta Diabetol.2019; doi: 10.1007/s00592-019-01342-5; Schmidt MI et al., Intermediate hyperglycaemia to predict progression to type 2 diabetes (ELSA-Brasil): an occupational cohort study in Brazil. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019; 7:267-277).

L'uso di HbA1c non è inoltre indicato in alcune situazioni cliniche che influenzano il metabolismo dell'emoglobina (Cavagnolli G et al. Factors affecting A1C in non-diabetic individuals: Review and meta-analysis. Clin Chim Acta. 2015; 445:107-14) a causa delle possibili interferenze di queste situazioni nei risultati, responsabili di una non corretta interpretazione degli stessi. Inoltre, studi recenti hanno mostrato un disaccordo tra i livelli di HbA1c in diversi gruppi etnici per uguali livelli di glicemia, seppur le ragioni di queste disparità non siano ancora completamente chiarite.

L'albumina glicata (GA) è un test di laboratorio che ha acquisito una certa importanza per il monitoraggio glicemico in DM in anni recenti (Kohzuma T et al., Glycated albumin assay kit: a new diagnostic test for diabetes mellitus. Mol Diagn Ther. 2010; 14:49-51). GA è una delle fruttosamine, per la sua misurazione non richiede digiuno preventivo e riflette la glicemia a breve termine a causa dell’emivita dell’albumina, che è di circa 3 settimane. Rispetto a HbA1c, GA non è influenzata dalla presenza di processi emolitici e di anormalità di Hb (Kim C et al., Association between iron deficiency and A1C Levels among adults without diabetes in the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2006. Diabetes Care. 2010; 33:780-5). Inoltre, in condizioni come l'anemia, la gravidanza, l'iperglicemia postprandiale e DM che utilizza l'insulina, la GA sembra essere un marker glicemico migliore rispetto a HbA1c, particolarmente indicata per i pazienti diabetici in emodialisi. Recentemente, studi su pazienti con diabete di tipo 1 (Nathan DM et al. DCCT/EDIC Research Group. Relationship of glycated albumin to blood glucose and HbA1c values and to retinopathy, nephropathy, and cardiovascular outcomes in the DCCT/EDIC study. Diabetes. 2014; 63:282-90) e di tipo 2 (Selvin E et al. Fructosamine and glycated albumin for risk stratification and prediction of incident diabetes and microvascular complications: a prospective cohort analysis of the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2014; 2:279-88) hanno riportato un'associazione di GA con le complicanze croniche della malattia. Sebbene la GA sia stata studiata negli ultimi anni, questo test non è ancora ampiamente utilizzato nelle routine di laboratorio e pochi reagenti commerciali sono disponibili sul mercato per la sua analisi. Tuttavia, i risultati delle indagini cliniche fanno di GA un marker promettente in DM.

L'albumina è una proteina di 66,7 kDa, composta da una singola catena polipeptidica che contiene 585 aminoacidi, 17 ponti disolfuro e 3 domini omologhi che sono collegati in una struttura elicoidale (Anguizola J et al. Glycation of human serum albumin. Clin Chim Acta. 2013; 425:64-76). È la principale proteina plasmatica, rappresentando circa il 60% delle proteine totali nel sangue, con concentrazioni comprese tra 3,0 e 5,0 g/dl e un'emivita di 14-20 giorni.

L'albumina passa attraverso il processo fisiologico della glicazione, dove la glicazione è una reazione spontanea non enzimatica in cui uno zucchero riducente viene aggiunto ad un gruppo amminico libero, tipicamente lisina o arginina presente all'interno delle proteine, chiamata anche reazione di Maillard. Il primo stadio di questa reazione comporta la formazione di un prodotto instabile e reversibile noto come base di Schiff, formato dal legame di un gruppo carbonile di un carboidrato aciclico con l'amminoacido N-terminale. Questo prodotto intermedio può subire un cambiamento nella sua conformazione e risultare in un composto stabile e irreversibile, noto come prodotto Amadori. L'insieme di composti formati dalla glicazione non enzimatica delle proteine è denominato "fruttosamina". Tra le fruttosamine del siero, la GA è il costituente principale, rappresentando circa l'80% del totale delle glicazioni nel plasma (Anguizola J et al., citato).

Le proteine extracellulari, come l'albumina, possono essere più sensibili ai ri-arrangiamenti di Amadori rispetto alle proteine intracellulari come Hb. Ciò è dovuto al fatto che le proteine plasmatiche sono direttamente esposte al glucosio plasmatico.

La concentrazione di glucosio e il tempo di esposizione delle proteine allo zucchero sono i fattori determinanti per le glicazioni, che equivale a dire che la glicazione dipende dal grado e dalla durata dell'iperglicemia.

Negli stadi di glicazione avanzati, si verificano ulteriori eventi ossidativi e irreversibili sulle proteine glicate che portano a composti stabili ed eterogenei noti come prodotti finali di glicazione avanzata. Sebbene la formazione di AGE (Advanced Glycation End-products) sia un processo fisiologico, condizioni di iperglicemia tipica nei pazienti con DM aumentano i loro tassi di produzione. I recettori degli AGE sono presenti in cellule di diversi tessuti, come macrofagi, muscoli, cellule endoteliali e gliali. Sono espressi come molecole di membrana, costituenti della superfamiglia delle immunoglobuline e agiscono come recettori di trasduzione del segnale, avviando una cascata infiammatoria. Come conseguenza di questa cascata, c'è una maggiore produzione di specie reattive dell'ossigeno, che è direttamente associata alla patogenesi e alle complicanze a lungo termine nel DM.

Storicamente, la fruttosamina è stata utilizzata nella pratica clinica quando si rendeva necessaria una valutazione della glicemia a breve termine (Raghav A, Ahmad J. Glycated serum albumin: a potential disease marker and an intermediate index of diabetes control. Diabetes Metab Syndr. 2014; 8:245-51). Tuttavia, questo test presenta una bassa accuratezza poiché è influenzato da tutte le proteine plasmatiche e anche da altre molecole presenti nel sangue, come la bilirubina, l'acido urico e le sostanze a basso peso molecolare. Il test per la fruttosamina non è disponibile in tutti i laboratori e non ci sono standard internazionali consolidati per l’analisi.

La GA può essere misurata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni a scambio ionico (HPLC), cromatografia di affinità con boro, saggi immunologici (dosaggio radioimmunologico e saggio immuno-assorbente collegato all'enzima), metodo colorimetrico con acido tiobarbiturico e metodi enzimatici che utilizzano proteinasi e chetamina ossidasi. Nessun metodo è tuttavia attualmente disponibile nella routine di laboratorio (Furusyo N, Hayashi J. Glycated albumin and diabetes mellitus. Biochim Biophys Acta.

2013; 1830:5509-14).

Alternativamente, GA viene misurata con una metodologia enzimatica a tre fasi, basata su una proteinasi specifica per l'albumina e la chetamina ossidasi. Hb e acido ascorbico, tipicamente presenti nei campioni in analisi, portano però ad interferenze nella lettura.

Apparentemente, la GA è predittiva delle complicanze microvascolari sia nel DM di tipo 1 che di tipo 2. Tuttavia, per quanto riguarda gli esiti macrovascolari, la GA sembra essere un buon marker solo nel DM di tipo 2. I meccanismi coinvolti nello sviluppo di aterosclerosi e malattie cardiovascolari nel DM di tipo 1 potrebbero spiegare questi risultati.

Il grado, il tipo di modificazione e la variabile combinazione delle alterazioni di struttura e conformazione in circolo dell’albumina danno ragione della variazione della sua affinità di legame per diverse molecole, talora osservata in opposte direzioni. In generale, GA mostra una sensibile perdita di affinità di legame per diversi ligandi. In particolare, essa risulta drasticamente alterata nei confronti della bilirubina e degli acidi grassi a catena lunga. Viceversa, aumenta quella per il ferro, mentre per il rame la variazione è ambivalente. La capacità di legame della GA è d’altronde anche diminuita nei confronti di importanti farmaci, quali furosemide, ibuprofene e warfarin, benché, per quest’ultimo è riportato anche un aumento dell’affinità o nessuna modificazione.

Allo stesso modo, le proprietà antiossidanti dell’albumina risultano compromesse dalla glicazione. La capacità antiradicalica della GA risulta drasticamente diminuita a causa dell’incremento del suo stato ossidativo, documentato dall’aumento del livello di carbonilazione e dalla riduzione della quantità di Cys-34 ridotta. GA non solo perde in potere antiossidante, ma diviene essa stessa fonte di stress ossidativo, alterando il metabolismo cellulare e inducendo modificazioni di altre proteine. È evidente il potenziale contributo, nella fisiopatologia del diabete mellito e nella patogenesi delle sue complicanze, dell’attenuazione dell’attività radical scavenger della GA, sommata all’acquisizione di attività inducente stress ossidativo, a livello cellulare e tissutale.

È stato di recente sviluppato un metodo enzimatico per la determinazione delle proteine sieriche glicate (GlycoGap®, Diazyme, CA, USA), proposto in particolare per la valutazione del glycation gap, che ha mostrato un’ottima correlazione col test giapponese per GA, riuscendo a dare risultati equivalenti in termini di GA% per mezzo di alcune correzioni matematiche. Tale metodo correlava con il valore calcolato dall’equazione di Sato A et al. (Establishment of glycated albumin unit conversion equation from the standardized value (mmol/mol) to the routinely used value (%). Ann Clinical Biochem: Intntl J Lab Med.2018, 56: 204-209):

GA%=0.05652*GA (mmol/mol)-0.4217

A causa dei limiti iniziali legati alla mancanza di specificità e standardizzazione delle metodologie, la determinazione dell’GA non ha ottenuto lo stesso successo dell’HbA1c che è invece stata validata come indice di riferimento dai grandi studi clinici sul diabete (Hashimoto K et al A1C but not serum glycated albumin is elevated because of iron deficiency in late pregnancy in diabetic women. Diabetes Care 2010, 33:509-511; Barman I et al Raman spectroscopy-based sensitive and specific detection of glycated hemoglobin. Anal Chem 2012, 84(5):2474-2482; Yamaguchia M et al Point of care testing system via enzymatic method for the rapid, efficient assay of glycated albumin. Biosens Bioelectron 2005, 21:426-432).

HbA1c non è però sempre di per se sufficiente a rispecchiare i valori glicemici medi.

A questo concetto ci si riferisce comunemente con il termine “glycation gap”, proposto per la prima volta da Cohen et al.2003 (Discordance between HbA1c and fructosamine. Diabetes Care 26:163-167).

Il Metilgliossale (MGO) è una sostanza ossidante, il cui valore cresce in modo proporzionale all’andamento della glicemia. I livelli di MGO nell’organismo sano vengono controllati da un sistema enzimatico che detossifica l’organismo convertendo il 99% del MGO in prodotti meno reattivi.

Un accumulo eccessivo di MGO provoca l’aggiunta di questa molecola a proteine e DNA, portando a diversi effetti a livello cellulare come stress ossidativo, invecchiamento cellulare e mutazioni del DNA. Tali effetti si traducono in disfunzione vascolare, insulino-resistenza, aterosclerosi, invecchiamento e neurodegenerazione.

Il MGO che tipicamente si misura è quello legato agli aminoacidi delle proteine mediante la reazione spontanea di Maillard. Altre tecniche di misurazione del MGO (ad esempio in HPLC) rilevano i livelli totali di MGO. E’ fortemente avvertita l’esigenza di una metodica combinata in grado di riportare in maniera stabile e precoce gli effetti di glucosio e fruttosio nell’organismo.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Forma oggetto della presente invenzione un metodo che evidenzia la propensione allo sviluppo del diabete o di altre patologie correlate agli zuccheri, detto metodo comprendendo la valutazione contemporanea e l’interpretazione integrata della percentuale di GA e dei livelli di MGO in un campione biologico da un soggetto.

Detto campione biologico è preferibilmente un campione di sangue e detto soggetto è un soggetto umano.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1: valori MGO misurati in relazione ai livelli di GA%.

Figura 2: correlazione grafica tra valori di GA% e MGO negli stessi soggetti

Albumina glicata (GA)

La metodica impiegata nella presente invenzione, sensibile e riproducibile, si basa sul metodo immunometrico che si avvale dell’utilizzo di anticorpi monoclonali che legano specificamente l’albumina glicata. Le analisi vengono effettuate su albumina glicata e albumina totale mediante tecnica ELISA. Il saggio ELISA è stato condotto con kit specifici per GA e albumina totale.

Le concentrazioni risultanti vengono utilizzate nella seguente equazione: GA%=(alb glicata/alb totale)*100

Sono stati definiti, allo scopo della presente invenzione, i valori che seguono:

- minore di 1,15%

- tra 1,15 e 2,95%

- oltre 2,95%

Detti valori portano quindi ad una suddivisione dei soggetti in 3 classi, a seconda che presentino valori di GA% < 1,15%, compresi tra 1,15 e 2,95%, oppure > 2,95%.

Metilgliossale (MGO)

Il Metilgliossale è una sostanza ossidante, il cui valore cresce in modo proporzionale all’andamento dei valori ematici di glucosio, di fruttosio e di altri zuccheri, considerandone anche i picchi raggiunti e le relative discese. Un picco di zuccheri successivo al pasto o all’assunzione di dolci o di fruttosio (ad esempio vino o importanti quantità di frutta), ne determina la crescita immediata, crescita che si riporta ai valori pre-carico in qualche ora, mentre la discesa dei valori basali, rilevati a digiuno, che possono essere sbilanciati verso l’alto nei soggetti con alterata sensibilità glucidica, avviene nel corso di qualche giorno di dieta controllata. I valori di MGO sono indicativi del possibile effetto tossico dei picchi zuccherini (sia di fruttosio sia di glucosio) nel sangue, su base individuale, consentendo così di definire se una singola persona ha, nei confronti di una certa quantità di zuccheri ingeriti, una risposta normale o sospetta di una possibile intolleranza glucidica.

In relazione alla distribuzione percentile dei valori di una popolazione normale, sono state identificate tre classi corrispondenti al 25% percentile, ai pazienti compresi tra il 25% e il 75% e quelli oltre il 75%ile. Gli autori della presente invenzione hanno definito un livello ematico di MGO definito livello controllo pari a 0,200 µg/ml. Detto livello controllo definisce due gruppi di soggetti, ovvero soggetti caratterizzati da un livello di MGO < di detto livello controllo e soggetti caratterizzati da un livello di MGO > di detto livello controllo.

Combinazione GA% e MGO

Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente dimostrato che un’analisi combinata di GA% e MGO è in grado di predire il rischio di sviluppare diabete, nel medio e nel lungo termine, fornendo altresì una classificazione del rischio (rischio moderato o rischio forte nel lungo termine). Si rivendica pertanto un metodo che comprende:

mettere a disposizione un campione biologico da un soggetto;

- misurare, in detto campione, i livelli di albumina totale, di GA e di MGO;

- calcolare GA%, dove detta GA% è calcolata come segue:

GA% =(albumina glicata/albumina totale)*100;

- combinare detti valori di MGO e GA% e classificare detto soggetto in una delle classi che seguono:

(1) soggetti sani;

(1D) soggetti in trattamento per diabete ben compensati;

(2) soggetti sani che hanno una alterazione della sensibilità glucidica, con probabili eccessi zuccherini recenti, che devono evitare eccessi di zuccheri; (2D) soggetti diabetici in corretto trattamento che devono comunque evitare eccessi zuccherini ripetuti;

(3) soggetti con picchi di glucosio e/o di fruttosio e/o altri zuccheri con alterazione della sensibilità glucidica e scarsa capacità di adattamento al carico glucidico, che devono programmare una attenzione dietetica corretta; (3D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta inadeguata e inadatta al controllo dei valori ematici;

(4) soggetti che hanno una elevata alterazione della sensibilità glucidica, che devono evitare eccessi zuccherini, e che segnalano probabili introduzioni recenti di quantità rilevanti di zuccheri;

(4D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta inadeguata e inadatta al controllo dei livelli ematici, con probabili eccessi zuccherini recenti;

(5) soggetti con picchi di glucosio o di fruttosio (e altri zuccheri) con alterazione della sensibilità glucidica e scarsa capacità di adattamento al carico glucidico, che devono programmare una attenzione dietetica corretta a lungo termine;

(5D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta inadeguata e inadatta al controllo dei livelli ematici;

(6) soggetti che hanno una elevata alterazione della sensibilità glucidica e che segnalano probabili introduzioni recenti di quantità rilevanti di zuccheri; ancora in grado di compensare gli eccessi ma che devono programmare una attenzione dietetica corretta a lungo termine;

(6D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta fortemente inadeguata e inadatta al controllo effettivo dei valori ematici, con probabili eccessi zuccherini recenti.

In una forma preferita, detto campione biologico viene dapprima classificato come GA% basso, GA% intermedio, GA% alto. Lo stesso campione biologico è altresì classificato come MGO basso o MGO alto.

Detta combinazione è preferibilmente ottenuta applicando i criteri riportati tabella 1 che segue:

Tabella 1

In una forma di realizzazione, detta classificazione GA% soddisfa i criteri che seguono:

GA% basso: GA% < 1,15 %;

GA% intermedio: 1,15% < GA% < 2,95%;

GA% alto: GA% > 2,95%.

In una forma di realizzazione, detta classificazione MGO soddisfa i criteri che seguono:

MGO basso: MGO < 0,200 µg/ml;

MGO alto: MGO > 0,200 µg/ml.

Detta valutazione integrata, frutto della combinazione della classificazione GA% e MGO, è riassunta nella tabella 2 che segue.

Tabella 2

Si descrive altresì un kit che comprende un test ELISA specifico per GA, un test ELISA specifico per albumina totale e un test ELISA per la misura del metilgliossale legato agli aminoacidi delle proteine e le istruzioni per la lettura di detti test. Opzionalmente detto kit comprende altresì almeno una provetta ed almeno un pungidito.

In una forma di realizzazione, dette istruzioni, fornite su supporto analogico o digitale con il kit oppure messe a disposizione con modalità diverse, ad esempio online, comprendono i parametri per una corretta lettura dei test, preferibilmente comprendono le indicazioni di cui alla tabella 2.

Vantaggiosamente, la metodica secondo la presente invenzione permette di rilevare con largo anticipo rispetto alle metodiche dell’arte nota la presenza in un campione di un’alterata sensibilità agli zuccheri. Una rilevazione precoce permette di attuare in maniera tempestiva quei cambi alimentari e di stile di vita che possano prevenire lo sviluppo diabetico.

Una comprensione anticipata degli effetti degli zuccheri nell’organismo è sicuramente di supporto nella scelta consapevole del loro uso. La metodica secondo la presente invenzione permette sorprendentemente di evidenziare l’impatto degli zuccheri nell’organismo di un soggetto specifico in maniera anticipata rispetto al manifestarsi di eventuali danni indotti dagli stessi. Come descritto sopra, ed evidenziato dagli esempi che seguono, la metodica secondo la presente invenzione evidenzia situazioni di criticità che le analisi tipicamente in uso, ovvero i valori della glicemia a digiuno e della emoglobina glicata, riconoscono solo parzialmente e spesso solo in ritardo.

La metodica secondo la presente invenzione è pertanto di supporto per tutti i soggetti, poiché fornisce indicazioni per la definizione di un regime dietetico personalizzato.

Non solo la metodica si rivela utile per i soggetti sani ma anche per quei soggetti ai quali è già stato diagnosticato il diabete. Nei soggetti diabetici, la metodica secondo la presente invenzione è di sicuro supporto per la valutazione dei possibili danni dei picchi di fruttosio e glucosio, laddove la lettura di glicemia ed emoglobina glicata si sono rilevate non completamente soddisfacenti a rilevare gli effetti dei picchi glicemici postprandiali o immediatamente successivi all’assunzione di sostanze zuccherine.

Gli esempi che seguono hanno il solo scopo di illustrare l’invenzione, senza voler in alcun modo limitarne l’ambito che è definito dalle rivendicazioni.

ESEMPI

Sono stati valutati 84 soggetti standard non selezionati e 12 soggetti diabetici o prediabetici noti.

In figura 1 sono riportati i valori di MGO misurati in relazione ai 3 gruppi di GA%, come sopra definiti. A valori molto elevati di GA% corrispondono bassi livelli di MGO.

Dette misurazioni sono state effettuate con test ELISA, utilizzando, per GA, il kit Human Glycated Albumin (GA) ELISA Kit - Catalog No.: abx252493 - Abbexa Ltd., Cambridge Science Park, Cambridge, UK. e, per l’albumina totale, il kit Human Albumin Immunoperoxidase Assay for Determination of Albumin in Human Samples - Catalog No.: E-80AL - Immunology Consultants Laboratory, Portland, OR, USA.

Entrambi i kit (albumina glicata e albumina totale) si basano sull’utilizzo di sandwich di anticorpi coniugati ad enzima HRP. Un anticorpo specifico per l’analita copre la superficie del pozzetto su cui verrà caricato il campione. Gli standard e i campioni vengono aggiunti ai pozzetti e lavati con tampone di lavaggio. Uno specifico anticorpo coniugato con la biotina che riconosce e lega specificatamente l’analita è usato come anticorpo di rilevazione. L'intensità del colore della reazione avvenuta col substrato aggiunto alla reazione è proporzionale alla quantità di analita legato nel pozzetto. L'assorbanza viene misurata spettrofotometricamente a 450 nm in un lettore di micropiastre, e quindi la concentrazione dell’analita viene calcolata mediante interpolazione dell’assorbanza su una curva di calibrazione.

MGO è stato misurato con OxiSelect™ Methylglyoxal (MG) Competitive ELISA Kit - Catalog No.: STA-811 - Cell Biolabs, San Diego, CA, USA, un test immunoenzimatico sviluppato per l’individuazione e la quantizzazione degli addotti proteici di MG-H1 (metil-gliossal-idroimidazolone). Un anticorpo anti-MG riveste la superficie del pozzetto della piastra ELISA. I campioni contenenti gli addotti proteici di MG o MGBSA standard vengono aggiunti alla piastra preassorbita del coniugato MG. Dopo una breve incubazione, viene aggiunto un anticorpo anti-MG, seguito da un anticorpo secondario coniugato con HRP. Il contenuto degli addotti proteici di MG nei campioni incogniti sono determinati confrontando le assorbanze relative ai campioni con quelle della curva standard di MG-BSA a concentrazione nota.

I dati portano alla conclusione che l’innalzamento del MGO è possibile solo in condizioni di equilibrio glicemico e di mantenuta capacità di compenso. Tale capacità è persa quando i valori di GA %sono eccessivi e segnaletici di uno squilibrio diabetico ormai evoluto, come schematizzato in figura 2.

L’analisi, effettuata a seguito delle prime valutazioni euristiche, ha confermato l’allineamento con i dati internazionali e l’evidenza del fatto che il diabetico non evidenzia elevati livelli di MGO mentre soggetti in ottima forma fisica, con valori corretti di glicemia, ma con possibile intolleranza agli zuccheri (definita ad esempio per conoscenza clinica o famigliarità) manifestano, a seguito della somministrazione di zuccheri, un innalzamento del MGO, quasi fosse, pur nel suo essere un segnale di allarme, ancora una manifestazione di compenso possibile.

A titolo di esempio, nel campione indicato con Gly04 sono stati misurati GA % = 3,87 e MGO = 0,168 µg/ml. L’algoritmo secondo la presente invenzione classifica Gly04 nella classe 5, ovvero soggetto a rischio forte di insorgenza diabete, con la necessità di un trattamento di tipo farmacologico e di impegno dietetico nutrizionale rilevante. E’ rilevante notare che detto soggetto presenta una glicemia inferiore ai 110 mg/dl e una HbA1c pari a 44 mmol/mol, valori non indicativi di patologia.

Il soggetto dal quale era stato ottenuto il campione Gly04 è stato monitorato nel tempo. Lo stesso non si è attenuto al regime dietetico consigliato ed è andato incontro a diabete nei mesi successivi, con la necessità di una terapia farmacologica antidiabetica.

Come ulteriore esempio, si riportano i risultati ottenuti per il campione indicato con Gly14: GA% = 0,18% e MGO = 0,137 L’algoritmo secondo la presente invenzione classifica Gly14 nella classe 1D, ovvero soggetto diabetico in trattamento adeguato. L’anamnesi del soggetto conferma il risultato.

Da un soggetto è stato ottenuto il campione indicato con Gly20 e, a distanza di un anno, un ulteriore campione, Gly99. Il soggetto era in trattamento con un basso dosaggio di metformina (500 mg x2v/die) da almeno 3 anni ed evidenziava valori di glicemia sempre su livelli compresi tra i 140 e i 150 mg/dl, con Hb glicata 52 mmol/mol. Al momento del primo prelievo, campione Gly20, le condizioni cliniche erano stabili da tempo, ma la fruttosamina si stava muovendo in modo rilevante verso l’alto. In Gly20 GA% = 3,26% e MGO = 0,084, portando a classificare il soggetto nella classe 5D. In seguito al primo prelievo e per circa 8 mesi il soggetto ha mantenuto valori di glicemia e di emoglobina glicata in linea. Lo stesso soggetto ha quindi iniziato a sospendere saltuariamente la terapia, per poi passare ad una terapia farmacologica diversa, sempre seguita in maniera non rigorosa e introducendo numerosi squilibri alimentari che lo hanno portato ad evidenziare una clinica alterata (aumento pressorio, calo di massa muscolare e microalbuminuria, precedentemente assente). In Gly99 sono stati misurati valori di GA% = 10,21% e di MGO = 0,22 µg/ml portando a classificare lo stesso soggetto, ad un anno di distanza, nel gruppo 6D, ovvero soggetti diabetici con dieta fortemente inadeguata. Questa riclassificazione nonostante valori di glicemia di 136 mg/dl e di Hb glicata di 46 mmol/mol. Il soggetto è stato posto in trattamento con metformina 850 mgx3v/die e a dieta stretta in 2 mesi ha ristabilizzato valori di glicemia a 139 mg/dl e Hb glicata a 45,3 mmol/mol, con recupero di condizioni cliniche accettabili.

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per determinare la propensione allo sviluppo del diabete o di altre patologie correlate agli zuccheri, detto metodo comprendendo la valutazione contemporanea e l’interpretazione integrata della percentuale di Albumina Glicata (GA) e dei livelli di Metilgliossale (MGO) in un campione biologico da un soggetto.
2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 che comprende: - mettere a disposizione un campione biologico da un soggetto; - misurare, in detto campione, i livelli di albumina totale, di albumina glicata e di MGO; - calcolare GA%, dove detta GA% è calcolata come segue: GA% =(albumina glicata/albumina totale)*100; - combinare detti valori di MGO e GA% e classificare detto soggetto in una delle classi che seguono: (1) soggetti sani; (1D) soggetti in trattamento per diabete ben compensati; (2) soggetti sani che hanno una alterazione della sensibilità glucidica, con probabili eccessi zuccherini recenti, che devono evitare eccessi di zuccheri; (2D) soggetti diabetici in corretto trattamento che devono comunque evitare eccessi zuccherini ripetuti; (3) soggetti con picchi di glucosio e/o di fruttosio e/o altri zuccheri con alterazione della sensibilità glucidica e scarsa capacità di adattamento al carico glucidico, che devono programmare una attenzione dietetica corretta; (3D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta inadeguata e inadatta al controllo dei valori ematici; (4) soggetti che hanno una elevata alterazione della sensibilità glucidica, che devono evitare eccessi zuccherini, e che segnalano probabili introduzioni recenti di quantità rilevanti di zuccheri; (4D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta inadeguata e inadatta al controllo dei livelli ematici, con probabili eccessi zuccherini recenti; (5) soggetti con picchi di glucosio o di fruttosio (e altri zuccheri) con alterazione della sensibilità glucidica e scarsa capacità di adattamento al carico glucidico, che devono programmare una attenzione dietetica corretta a lungo termine; (5D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta inadeguata e inadatta al controllo dei livelli ematici; (6) soggetti che hanno una elevata alterazione della sensibilità glucidica e che segnalano probabili introduzioni recenti di quantità rilevanti di zuccheri; ancora in grado di compensare gli eccessi ma che devono programmare una attenzione dietetica corretta a lungo termine; (6D) soggetti diabetici in trattamento che segnalano dieta fortemente inadeguata e inadatta al controllo effettivo dei valori ematici, con probabili eccessi zuccherini recenti.
3. 3. Il metodo secondo una delle rivendicazioni 1 o 2, dove detto campione biologico è un campione di sangue e detto soggetto è un soggetto umano.
4. 4. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detto campione biologico viene classificato come GA% basso, GA% intermedio, GA% alto.
5. 5. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detto campione biologico viene classificato come MGO basso o MGO alto.
6. 6. Il metodo secondo la rivendicazione 4, dove detta classificazione GA% soddisfa i criteri che seguono: - GA% basso: GA% < 1,15 %; - GA% intermedio: 1,15% < GA% < 2,95%; - GA% alto: GA% > 2,95%.
7. 7. Il metodo secondo la rivendicazione 5, dove detta classificazione MGO soddisfa i criteri che seguono: - MGO basso: MGO < 0,200 µg/ml; MGO alto: MGO > 0,200 µg/ml. metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 7, dove detta alutazione contemporanea e interpretazione integrata è secondo i criteri he seguono:

   9. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8, dove detta valutazione contemporanea e interpretazione integrata è secondo i criteri che seguono:

   10. Un kit che comprende un test ELISA specifico per GA, un test ELISA specifico per albumina totale e un test ELISA per la misura del metilgliossale legato agli aminoacidi delle proteine e le istruzioni per la lettura di detti test, opzionalmente detto kit comprende altresì almeno una provetta ed almeno un pungidito.