IT201900011412A1

IT201900011412A1 - New antimicrobial compounds

Info

Publication number: IT201900011412A1
Application number: IT102019000011412A
Authority: IT
Inventors: Gabriele Costantino; Clotilde Silvia Cabassi; Giannamaria Annunziato; Andrea Mozzarelli; Barbara Campanini; Stefano Bettati; Marco Pieroni; Agostino Bruno
Original assignee: Universita’ Degli Studi Di Parma
Priority date: 2019-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2021-01-10

Description

DESCRZIONE DESCRIPTION

CAMPO DELL’INVENZIONE FIELD OF THE INVENTION

La presente invenzione riguarda il campo dei prodotti antimicrobici e del loro utilizzo in medicina umana e veterinaria. Si descrivono nuovi composti con attività antibatterica e antifungina, e loro associazioni con antibiotici, utili nel trattamento delle relative infezioni. The present invention relates to the field of antimicrobial products and their use in human and veterinary medicine. New compounds are described with antibacterial and antifungal activity, and their associations with antibiotics, useful in the treatment of related infections.

STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNIQUE

A causa dei sempre crescenti fenomeni di farmaco-resistenza, l’utilizzo degli antimicrobici in medicina umana e veterinaria è sempre più soggetto al rispetto di linee guida emanate da organismi nazionali ed internazionali . Due to the ever increasing phenomena of drug resistance, the use of antimicrobials in human and veterinary medicine is increasingly subject to compliance with guidelines issued by national and international bodies.

Già nel 2011 la Commissione Europea aveva pubblicato un piano d’azione di lotta ai crescenti rischi di resistenza antimicrobica. Come riportato nelle Linee guida sull’uso prudente degli antimicrobici in medicina umana {2017/C 212/01 nella Gazzetta ufficiale dell’Unione Europea), attualmente la resistenza antimicrobica è una priorità nell’Unione Europea. Tra gli obiettivi chiave del piano figura un uso più prudente degli antimicrobici nell’uomo e negli animali. Already in 2011 the European Commission had published an action plan to combat the growing risks of antimicrobial resistance. As reported in the Guidelines on the prudent use of antimicrobials in human medicine (2017 / C 212/01 in the Official Journal of the European Union), antimicrobial resistance is currently a priority in the European Union. The plan's key objectives include a more prudent use of antimicrobials in humans and animals.

In particolare, nelle Linee guida sull'uso prudente degli antimicrobici in medicina veterinaria (2015/C 299/04 G.U dell’Unione Europea) viene sottolineato come gli antimicrobici rappresentino uno strumento essenziale per le cure sanitarie e la salute delle popolazioni di animali e di bestiame, ma che nell’ambito di un uso prudente degli antimicrobici sia anche necessario favorire un impiego più razionale e mirato, ottimizzando in tal modo l’effetto terapeutico e riducendo al minimo lo sviluppo della resistenza antimicrobica. Tenendo conto della resistenza incrociata e della co-resistenza, ovvero del fatto che qualsiasi esposizione ad antimicrobici aumenta l’insorgenza della resistenza antimicrobica, il risultato finale dell’uso prudente deve essere una riduzione globale dell’uso di antimicrobici, limitato per lo più alle sole situazioni in cui sono necessari. In particular, in the Guidelines on the prudent use of antimicrobials in veterinary medicine (2015 / C 299/04 G.U of the European Union) it is emphasized that antimicrobials represent an essential tool for health care and the health of animal populations and livestock, but that in the context of a prudent use of antimicrobials it is also necessary to favor a more rational and targeted use, thus optimizing the therapeutic effect and minimizing the development of antimicrobial resistance. Taking into account cross-resistance and co-resistance, i.e. the fact that any exposure to antimicrobials increases the occurrence of antimicrobial resistance, the end result of prudent use must be an overall reduction in the use of antimicrobials, mostly limited to only situations where they are needed.

In quest’ottica, è esplicitamente indicato dalla legislazione europea che le Università e gli altri istituti di ricerca diano priorità alla ricerca nel settore della resistenza antimicrobica, dedicandosi maggiormente allo sviluppo di strumenti alternativi per il controllo delle infezioni, in particolare allo sviluppo di nuovi antimicrobici. In questo ambito rientra la ricerca che abbiamo sviluppato, relativa al potenziamento e all’utilizzo di associazioni sinergiche, che potenziando l’efficacia antimicrobica di ciascun componente dell’associazione, portino ad una riduzione della quantità complessiva di antimicrobici somministrati. With this in mind, it is explicitly indicated by European legislation that universities and other research institutes give priority to research in the field of antimicrobial resistance, devoting themselves more to the development of alternative tools for infection control, in particular to the development of new antimicrobials. . This includes the research we have developed, relating to the enhancement and use of synergistic associations, which by enhancing the antimicrobial efficacy of each component of the association, lead to a reduction in the overall amount of antimicrobials administered.

Inoltre, occorre considerare anche che in un’epoca di emergenza della resistenza antibiotica, molto spesso esistono limitate possibilità terapeutiche per il trattamento delle infezioni dovute ad organismi multi-resistenti. La possibilità di associare diversi principi attivi, aumentandone l’attività antimicrobica, favorisce il superamento delle resistenze agli antimicrobici e pertanto fornisce ulteriori possibilità per il trattamento dei batteri multi-resistenti. In particolare, quando un singolo farmaco non è efficace a causa dell’insorgenza di mutanti resistenti durante la terapia, l’uso concomitante di due o più farmaci attivi può aumentare la percentuale di successo prevenendone lo sviluppo di resistenza. In addition, it should also be considered that in an era of emergency of antibiotic resistance, very often there are limited therapeutic possibilities for the treatment of infections due to multi-resistant organisms. The possibility of combining different active ingredients, increasing their antimicrobial activity, favors the overcoming of resistance to antimicrobials and therefore provides further possibilities for the treatment of multi-resistant bacteria. In particular, when a single drug is not effective due to the onset of resistant mutants during therapy, the concomitant use of two or more active drugs can increase the success rate by preventing the development of resistance.

Gli adiuvanti antibatterici sono composti che hanno poca o nessuna attività antibiotica ma co-somministrati con l'antibiotico/i bloccano i principali meccanismi di resistenza batterica e/o migliorano l'azione antimicrobica del farmaco e i loro bersagli molecolari sono enzimi detti “non essenziali” per il ciclo di vita della cellula batterica. Antibacterial adjuvants are compounds that have little or no antibiotic activity but co-administered with the antibiotic (s) block the main mechanisms of bacterial resistance and / or improve the antimicrobial action of the drug and their molecular targets are enzymes called "non-essential" for the life cycle of the bacterial cell.

Tra i bersagli non essenziali maggiormente studiati c’è il reductive sulfur assimilation pathway, attraverso il quale la cellula batterica capta lo zolfo presente nel terreno e, attraverso alcuni steps enzimatici, sintetizza la cisteina e altre molecole contenenti zolfo, come ad esempio Co-A, metionina, glutatione, che sono essenziali soprattutto quando il batterio si trova in condizioni di stress ossidativo. Questo pathway rappresenta un importante e selettivo bersaglio terapeutico nella terapia antibatterica in quanto non è presente nell'uomo e quindi è possibile attaccare la cellula batterica escludendo effetti secondari off target nelluomo. Among the most studied non-essential targets is the reductive sulfur assimilation pathway, through which the bacterial cell captures the sulfur present in the soil and, through some enzymatic steps, synthesizes cysteine and other sulfur-containing molecules, such as Co-A , methionine, glutathione, which are essential especially when the bacterium is in conditions of oxidative stress. This pathway represents an important and selective therapeutic target in antibacterial therapy as it is not present in humans and therefore it is possible to attack the bacterial cell, excluding secondary off target effects in humans.

L’ultimo step della biosintesi della cisteina è catalizzato da due enzimi, serina acetil transferasi (SAT) e o-acetilserina sulfidrilasi (OASS). Di quest’ultima ne sono state identificate due isoforme, OASS-A e OASS-B ed è preferibile inibirle entrambe per avere un effetto fenotipico sulla crescita batterica. The last step of cysteine biosynthesis is catalyzed by two enzymes, serine acetyl transferase (SAT) and o-acetylserine sulfhydrylase (OASS). Two isoforms of the latter have been identified, OASS-A and OASS-B and it is preferable to inhibit both to have a phenotypic effect on bacterial growth.

I primi inibitori non peptidici dell’OASS descritti in letteratura (Med.Chem.Commun. , 2012, 3, 1111-1116) sono piccole molecole aventi le seguenti strutture: The first non-peptide inhibitors of OASS described in the literature (Med.Chem.Commun., 2012, 3, 1111-1116) are small molecules having the following structures:

oppure, come riportato in Molecular Informatics, 2013, 32, pp. or, as reported in Molecular Informatics, 2013, 32, pp.

447-457: 447-457:

Più recentemente, OASS inibitori con struttura: More recently, OASS inhibitors with structure:

in cui Ri è una catena alchilica corta (etile) ed R2 può essere variamente sostituito, sono stati descritti in Journal of Chemical Information and Modelling, 2018, 58, pp.710-723. La pubblicazione Journal of Enzy me Inhibition and Medicinal Chemistry, 2018, 33(1), pp. in which Ri is a short alkyl chain (ethyl) and R2 can be variously substituted, have been described in Journal of Chemical Information and Modeling, 2018, 58, pp. 710-723. The Journal of Enzy me Inhibition and Medicinal Chemistry, 2018, 33 (1), pp.

1444-1452 descrive ulteriori inibitori dell’OASS aventi le strutture: 1444-1452 describes additional OASS inhibitors having the structures:

La pubblicazione Journal of Bnzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34(1), pp. 31-43 descrive inibitori dell’OASS con struttura: Journal of Bnzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34 (1), pp. 31-43 describes OASS inhibitors with structure:

in cui R2 può essere un gruppo eterociclico o alchinilico. wherein R2 can be a heterocyclic or alkynyl group.

Studi di knock out dei geni cysK e cysM che codificano rispettivamente per gli enzimi OASS-A e OASS-B hanno dimostrato che la crescita di cellule batteriche knock-out per questi due geni è inibita in condizioni di starvation e stress ossidativo, ovvero quando nel terreno alcuni nutrienti, tra cui la cisteina, sono presenti in basse concentrazioni; invece non si ha effetto inibitorio sulla crescita in terreno ricco di nutrienti ( Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59, 6848-6859). Knock-out studies of the cysK and cysM genes encoding the OASS-A and OASS-B enzymes respectively have shown that the growth of knock-out bacterial cells for these two genes is inhibited under conditions of starvation and oxidative stress, i.e. when in soil some nutrients, including cysteine, are present in low concentrations; instead there is no inhibitory effect on growth in nutrient-rich soil (Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59, 6848-6859).

La ridotta o assente attività antibatterica in terreni ricchi di cisteina è un tratto tipico di questa classe di molecole: in presenza di elevate quantità di cisteina ambientale, i microorganismi bypassano l’inibizione del pathway naturale di sintesi della cisteina, causata dall’inibitore dell’OASS, ed utilizzano la cisteina esogena per la crescita e funzionalità della loro struttura cellulare; questa caratteristica rappresenta uno svantaggio in fase di applicazione terapeutica: infatti, in alcuni casi, determinati compartimenti del corpo umano o animale presentano elevate concentrazioni di cisteina ed in questi casi gli inibitori di OASS risultano poco efficaci; in altre situazioni, è noto somministrare cisteina esogena per sostenere pazienti affetti da infezioni: anche tale pratica rende poco efficaci gli inibitori di OASS. The reduced or absent antibacterial activity in soils rich in cysteine is a typical trait of this class of molecules: in the presence of high quantities of environmental cysteine, the microorganisms bypass the inhibition of the natural pathway of synthesis of cysteine, caused by the inhibitor of the OASS, and use exogenous cysteine for the growth and functionality of their cellular structure; this characteristic represents a disadvantage in the therapeutic application phase: in fact, in some cases, certain compartments of the human or animal body have high concentrations of cysteine and in these cases the OASS inhibitors are not very effective; in other situations, it is known to administer exogenous cysteine to support patients suffering from infections: even this practice makes OASS inhibitors ineffective.

A fronte delle ricerche condotte al presente, resta ancora insoddisfatta la necessità di nuovi affidabili composti adiuvanti antibatterici che esplichino una forte interazione con antibiotici tradizionali, con lo scopo di ridurre l’impiego di questi ultimi. Nel campo degli inibitori dell’OASS, inoltre, è sentita la necessità di ulteriori adiuvanti che presentino una bassa o nulla dipendenza dalle concentrazioni ambientali di cisteina, così da permetterne un impiego efficace in svariati compartimenti del corpo umano o animale, inclusi quelli caratterizzati da un’elevata concentrazione di cisteina; è egualmente sentita la necessità di ulteriori adiuvanti che presentino una bassa o nulla dipendenza dalle concentrazioni ambientali di cisteina, così da permettere un impiego efficace in pazienti soggetti ad infezioni batteriche che assumono cisteina a scopo terapeutico. E’ inoltre sentita la necessità di adiuvanti che presentino un’interazione particolarmente intensa nei confronti di specifici antibiotici, così da permettere un trattamento particolarmente efficace e/o ridurre in modo consistente la quantità di specifico antibiotico somministrata, mantenendo un adeguato effetto terapeutico: questo obbiettivo risulta di particolare interesse in quanto, quando l’interazione tra adiuvante e antibiotico non è sufficientemente alta, è possibile che il trattamento antibatterico non sia completo e vengano selezionati ceppi resistenti. In the face of research conducted to date, the need for new reliable adjuvant antibacterial compounds that have a strong interaction with traditional antibiotics remains unsatisfied, with the aim of reducing the use of the latter. Furthermore, in the field of OASS inhibitors, the need is felt for further adjuvants that have little or no dependence on the environmental concentrations of cysteine, so as to allow their effective use in various compartments of the human or animal body, including those characterized by a 'high concentration of cysteine; the need is also felt for further adjuvants that have low or no dependence on the environmental concentrations of cysteine, so as to allow effective use in patients subject to bacterial infections who take cysteine for therapeutic purposes. The need is also felt for adjuvants that present a particularly intense interaction with specific antibiotics, so as to allow a particularly effective treatment and / or significantly reduce the quantity of specific antibiotic administered, while maintaining an adequate therapeutic effect: this goal it is of particular interest since, when the interaction between adjuvant and antibiotic is not sufficiently high, it is possible that the antibacterial treatment is not complete and resistant strains are selected.

SOMMARIO SUMMARY

E’ stata ora individuata una ristretta classe di composti antibatterici, con struttura significativamente diversa da quelli finora noti, che mostrano un interessante attività antibatterica e antifungina quando utilizzati da soli o in associazione con antibiotici. I nuovi derivati corrispondono alla seguente formula di struttura (I) A restricted class of antibacterial compounds has now been identified, with a significantly different structure from those known so far, which show an interesting antibacterial and antifungal activity when used alone or in association with antibiotics. The new derivatives correspond to the following structural formula (I)

e loro sali farmaceuticamente accettabili, in cui: and pharmaceutically acceptable salts thereof, wherein:

R1 è il gruppo C1-4 alcossi, preferibilmente etossi; R1 is the C1-4 alkoxy group, preferably ethoxy;

R2 è scelto nel gruppo costituito da piperazina e pirimidina, opzionalmente sostituite; preferibilmente i sostituenti opzionali di R2 sono scelti tra C1-4 alchile, lineare o ramificato, alogeno, idrossi, ammino; più preferibilmente, detti sostituenti opzionali sono scelti tra metile e NH2; ancor più preferibilmente, detti sostituenti opzionali definiscono, insieme con R2, un gruppo scelto tra 4-metil piperazin-1-il e 2-ammino pirimidin-5-il; R2 is selected from the group consisting of piperazine and pyrimidine, optionally substituted; preferably the optional R2 substituents are selected from C1-4 alkyl, linear or branched, halogen, hydroxy, amino; more preferably, said optional substituents are selected from methyl and NH2; even more preferably, said optional substituents define, together with R2, a group selected from 4-methyl piperazin-1-yl and 2-amino pyrimidin-5-yl;

R3 è un gruppo C1-4 alchile, lineare o ramificato, preferibilmente metile. R3 is a linear or branched C1-4 alkyl group, preferably methyl.

In una realizzazione particolarmente preferita, i nuovi composti di formula (I) sono scelti tra le strutture (IA) e (IB) di seguito rappresentate : In a particularly preferred embodiment, the new compounds of formula (I) are selected from the structures (IA) and (IB) represented below:

e loro sali farmaceuticamente accettabili; il composto (IA) è qui anche riferito come UPAR790; il composto (IB) è qui riferito come UPAR806; le attività antibatteriche / antifungine dei suddetti composti in accordo con l’invenzione sono riportate nella parte sperimentale. and pharmaceutically acceptable salts thereof; compound (IA) is also referred to herein as UPAR790; compound (IB) is referred to herein as UPAR806; the antibacterial / antifungal activities of the aforementioned compounds in accordance with the invention are reported in the experimental part.

Diversamente da altri composti noti in questo campo, i nuovi composti di formula (I) non presentano consistenti variazioni di efficacia antibatterica quando testati in presenza di elevate o scarse concentrazioni ambientali di cisteina; tale comportamento denota, da un lato, un’attività non strettamente riconducibile all’inibizione del pathway di sintesi della cisteina (inibizione dell’OASS); dall’altro, la riscontrata indipendenza dalle concentrazioni di cisteina rende questi composti particolarmente adatti al trattamento di aree infette del paziente che presentano elevate concentrazioni di questo aminoacido, nonché per il trattamento di pazienti soggetti ad infezioni batteriche che assumono in concomitanza farmaci o integratori contenenti cisteina o suoi derivati. Unlike other compounds known in this field, the new compounds of formula (I) do not show consistent variations in antibacterial efficacy when tested in the presence of high or low environmental concentrations of cysteine; this behavior denotes, on the one hand, an activity not strictly attributable to the inhibition of the cysteine synthesis pathway (inhibition of OASS); on the other hand, the found independence from cysteine concentrations makes these compounds particularly suitable for the treatment of infected areas of the patient with high concentrations of this amino acid, as well as for the treatment of patients subject to bacterial infections who concomitantly take drugs or supplements containing cysteine or its derivatives.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Un primo oggetto della presente invenzione sono nuovi composti di formula (I) in quanto tali: A first object of the present invention are new compounds of formula (I) as such:

(I) (THE)

dove R1, R2 e R3 hanno i significati generali e preferiti sopra descritti e di cui i composti di formula (IA) e (IB) rappresentano le realizzazioni maggiormente preferite. wherein R1, R2 and R3 have the general and preferred meanings described above and of which the compounds of formula (IA) and (IB) represent the most preferred embodiments.

L’invenzione include inoltre un processo di preparazione dei suddetti composti di formula (I) caratterizzato dall’utilizzo del reagente di formula (II) The invention also includes a preparation process of the aforementioned compounds of formula (I) characterized by the use of the reagent of formula (II)

dove Hai indica un alogeno, preferibilmente bromo. Il procedimento include, in ordine variabile: where Hai indicates a halogen, preferably bromine. The procedure includes, in varying order:

a) la sostituzione del gruppo -Br con un gruppo R2, dove R2 è come definito nella formula (I); a) the replacement of the -Br group with an R2 group, where R2 is as defined in formula (I);

b) la conversione del gruppo ossirano in ciclopropile sostituito, in posizione 1, dal gruppo C(=O)-R1 e dal gruppo R3-fenil-CH2-, dove R1 e R3 sono definiti e posizionati come in formula (I). b) the conversion of the oxirane group into cyclopropyl substituted, in position 1, by the group C (= O) -R1 and by the group R3-phenyl-CH2-, where R1 and R3 are defined and positioned as in formula (I).

Il passaggio a) può essere effettuato mediante reazione con la piperazina o pirimidina opzionalmente sostituita corrispondente al gruppo R2 desiderato; l’atomo ciclico che deve sostituire l’atomo di alogeno può essere previamente attivato ad es. mediante conversione nel corrispondente derivato -B(OH)2. Step a) can be carried out by reaction with the optionally substituted piperazine or pyrimidine corresponding to the desired R2 group; the cyclic atom that must replace the halogen atom can be previously activated e.g. by conversion into the corresponding derivative -B (OH) 2.

Il passaggio b) avviene generalmente mediante reazione con un composto di formula (III), dove R1 ed R3 sono come definiti nella rivendicazione 1, in presenza di butil litio e dimetossietano (reazione di Wittig-Horner) . Step b) generally takes place by reaction with a compound of formula (III), where R1 and R3 are as defined in claim 1, in the presence of butyl lithium and dimethoxyethane (Wittig-Horner reaction).

Il composto di formula (III) può a sua volta essere preparato facendo reagire i composti di formula (IV) e (V) (dove R1 ed R3 sono come definiti nella rivendicazione 1 ed Hal indica un alogeno, preferibilmente bromo) in presenza di sodio idruro e dimetossietano. The compound of formula (III) can in turn be prepared by reacting the compounds of formula (IV) and (V) (where R1 and R3 are as defined in claim 1 and Hal indicates a halogen, preferably bromine) in the presence of sodium hydride and dimethoxyethane.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione sono i suddetti composti di formula (I) per uso in terapia. A further object of the present invention are the above compounds of formula (I) for use in therapy.

Un ulteriore oggetto dell'invenzione sono i suddetti composti di formula (I) per uso nel trattamento di infezioni batteriche e/o fungine. A further object of the invention are the above compounds of formula (I) for use in the treatment of bacterial and / or fungal infections.

Un ulteriore oggetto dellinvenzione è l’uso dei suddetti composti di formula (I) nella preparazione di un medicamento per il trattamento di infezioni batteriche e/o fungine. A further object of the invention is the use of the aforementioned compounds of formula (I) in the preparation of a medicament for the treatment of bacterial and / or fungal infections.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è un metodo di trattamento di infezioni batteriche e/o fungine, comprendente la somministrazione di un composto di formula (I) ad un paziente che ne necessita. A further object of the invention is a method of treating bacterial and / or fungal infections, comprising the administration of a compound of formula (I) to a patient who needs it.

In tutte le suddette realizzazioni, i composti di formula (I) possono essere utilizzati come da soli come antibiotici oppure, come adiuvanti, in associazione con farmaci antibiotici già noti e comunemente usati in terapia. L’associazione così ottenuta presenta una marcata attività antimicrobica e/o antifungina, con frequenti evidenze di sinergie, permettendo così un trattamento efficace nell’uomo e negli animali. In all the above embodiments, the compounds of formula (I) can be used either alone as antibiotics or, as adjuvants, in association with antibiotic drugs already known and commonly used in therapy. The combination thus obtained has a marked antimicrobial and / or antifungal activity, with frequent evidence of synergies, thus allowing effective treatment in humans and animals.

Riguardo al tipo di antibiotici utilizzabili in combinazione con i presenti composti di formula (I) non vi sono limitazioni particolari ed è possibile fare riferimento agli antibiotici correntemente utilizzati nel trattamento di infezioni batteriche e/o fungine. Esempi non limitativi di antibiotici utilizzabili in combinazione sono: penicilline e inibitori delle betalattamasi, quali penicillina G, benzatina wycillina, sulbactam, acido clavulanico, tazobactam, ampicillina, amoxacillina e combinazioni con acido clavulanico, piperacillina, ecc.; cefalosporine, quali ceftriaxone, cefotaxima, ceftazidima, cefepima, cefixima, ecc.; antibiotici carbapenemici quali imipenem, meropenem, ecc.; aminoglicosidi, quali gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, neomicina, ecc.; antibiotici chinoionici, quali ciprofloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, ecc.; macrolidi, quali claritromicina, azitromicina, roxitromicina, clindamicina, telitromicina, ecc.; antibiotici imidazolici quali metronidazolo, ecc.; tetracicline, quali doxaciclina, ecc.; glicopeptidi, quali vancomicina, teicoplanina, linezolid; polipeptidi, quali colistina, ecc.; e loro derivati. With regard to the type of antibiotics that can be used in combination with the present compounds of formula (I) there are no particular limitations and it is possible to refer to the antibiotics currently used in the treatment of bacterial and / or fungal infections. Non-limiting examples of antibiotics that can be used in combination are: penicillins and beta-lactamase inhibitors, such as penicillin G, benzathine wycillin, sulbactam, clavulanic acid, tazobactam, ampicillin, amoxacillin and combinations with clavulanic acid, piperacillin, etc .; cephalosporins, such as ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime, cefepime, cefixime, etc .; carbapenem antibiotics such as imipenem, meropenem, etc .; aminoglycosides, such as gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, neomycin, etc .; quinoionic antibiotics, such as ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, etc .; macrolides, such as clarithromycin, azithromycin, roxithromycin, clindamycin, telithromycin, etc .; imidazole antibiotics such as metronidazole, etc .; tetracyclines, such as doxacycline, etc .; glycopeptides, such as vancomycin, teicoplanin, linezolid; polypeptides, such as colistin, etc .; and their derivatives.

Un gruppo di antibiotici particolarmente preferiti nelle presenti combinazioni con i composti di formula (I) è rappresentato da: colistina, amoxicillina, ampicillina, gentamicina, cipro floxacina e loro derivati. Una combinazione maggiormente preferita è quella con del composto UPAR790 con colistina, che dà luogo a un forte e consistente effetto sinergico nei confronti di tutti i microorganismi testati (Gram positivi, Gram negativi e funghi), in terreni sia poveri che ricchi in cisteina. A group of particularly preferred antibiotics in the present combinations with the compounds of formula (I) is represented by: colistin, amoxicillin, ampicillin, gentamicin, cypherloxacin and their derivatives. A more preferred combination is that with the compound UPAR790 with colistin, which gives rise to a strong and consistent synergistic effect against all the microorganisms tested (Gram positive, Gram negative and fungi), in both poor and rich soils in cysteine.

In una variante opzionale è possibile aggiungere polimixina B al composto di formula (I) da solo o ad una sua combinazione con un antibiotico come sopra descritta; si è infatti riscontrato che la polimixina B vantaggiosamente, accresce la permeazione dei suddetti composti o combinazioni attraverso la parete cellulare batterica o fungina, aumentandone così ulteriormente l’effetto di inibizione della crescita. In an optional variant it is possible to add polymyxin B to the compound of formula (I) alone or to a combination thereof with an antibiotic as described above; it has in fact been found that polymyxin B advantageously increases the permeation of the aforementioned compounds or combinations through the bacterial or fungal cell wall, thus further increasing the growth inhibition effect.

Per quanto riguarda i microorganismi verso cui è diretto il trattamento secondo rinvenzione, non vi sono limitazioni particolari. Un microorganismo trattabile ai sensi dell’invenzione può appartenere, ad esempio, ad una delle specie batteriche scelte tra: Staphylococcus spp, ad esempio , lo Staphylococcus aureus o Staphylococcus pseudìntermedius o MRSA), Enterococcus spp, ad esempio, Enterococcus faecalis; Pseudomonas spp., ad esempio Pseudomonas aeruginosa; Mycobacterium spp, ad esempio Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp; Campylobacter spp;. Salmonella spp, ad es. Salmonella Thyphimurium; Streptococcus spp, ad esempio lo Streptococcus gruppo A o B, Streptoccocus pneumoniae; Klebsiella spp, ad esempio Klebsiella pneumoniae; Helicobacter spp, ad esempio Helicobacter pylori;. Neisseria spp, ad esempio Neisseria gonorrea, Neisseria meningitidis;. Borrelia burgdorferi, Shigella spp, ad esempio, Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp ad esempio VHaemophilus influenzae; Francisella tularensis, Bacillus spp, ad esempio Bacillus anthracis; Clostridia spp, Clostridium botulinum, Yersinia spp, ad esempio, Yersinia pestis; Treponema spp; Burkholderia spp; ad esempio Burkholderia cepacia, B. mallei e B pseudomallei; Stenotrophomonas spp, ad esempio lo Stenotrophomonas maltophilia. Esempi preferiti di microorganismi trattabili sono: Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus. As regards the microorganisms towards which the treatment according to the invention is directed, there are no particular limitations. A treatable microorganism according to the invention may belong, for example, to one of the bacterial species chosen from: Staphylococcus spp, for example, Staphylococcus aureus or Staphylococcus pseudìntermedius or MRSA), Enterococcus spp, for example, Enterococcus faecalis; Pseudomonas spp., For example Pseudomonas aeruginosa; Mycobacterium spp, for example Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp; Campylobacter spp ;. Salmonella spp, e.g. Salmonella Thyphimurium; Streptococcus spp, for example Streptococcus group A or B, Streptoccocus pneumoniae; Klebsiella spp, for example Klebsiella pneumoniae; Helicobacter spp, eg Helicobacter pylori ;. Neisseria spp, e.g. Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis ;. Borrelia burgdorferi, Shigella spp, for example, Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp for example VHaemophilus influenzae; Francisella tularensis, Bacillus spp, for example Bacillus anthracis; Clostridia spp, Clostridium botulinum, Yersinia spp, for example, Yersinia pestis; Treponema spp; Burkholderia spp; for example Burkholderia cepacia, B. mallei and B pseudomallei; Stenotrophomonas spp, for example Stenotrophomonas maltophilia. Preferred examples of treatable microorganisms are: Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus.

L'attività antibatterica dei composti della presente invenzione, da soli o in associazione con antibiotici, contro un batterio bersaglio può essere determinata ad esempio, con il saggio di microdiluizione in brodo. Ad esempio, determinando la capacità di inibire la crescita e/o per uccidere E. coli in test in un terreno liquido. The antibacterial activity of the compounds of the present invention, alone or in association with antibiotics, against a target bacterium can be determined, for example, with the broth microdilution assay. For example, by determining the ability to inhibit growth and / or to kill E. coli under test in a liquid medium.

Un patogeno fungino oggetto dei presenti trattamenti può essere derivato da uno dei funghi {compresi lieviti) selezionati, ma non limitati, appartenenti ai generi Candida spp. (ad esempio C. albicane), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., (ad esempio T.rubrum e T. interdigitale), Tinea spp.„Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp. (ad esempio Cryptococcus neoformans), Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporìum spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp., (ad esempio Malassezia furfur), Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trìchoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillium spp., Wangiella spp . Un fungo preferibilmente oggetto della presente invenzione è Candida albicans. A fungal pathogen object of the present treatments can be derived from one of the selected but not limited fungi (including yeasts) belonging to the genera Candida spp. (e.g. C. albicane), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., (e.g. T. rubrum and T. interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp ., Coccidioides spp., Cryptococcus spp. (e.g. Cryptococcus neoformans), Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremadinum spp. , Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporìum spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp., e.g. Malassezia furfur), Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp. Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trìchoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilticago spp. . A fungus preferably object of the present invention is Candida albicans.

L'attività antifungina dei composti della presente invenzione, da soli o in associazione con antibiotici, può essere determinata ad esempio, con il saggio di microdiluizione in brodo. Ad esempio, determinando la capacità di inibire la crescita e/o per uccidere funghi (compresi lieviti) appartenenti al genere Candida spp. o Malassezia spp. ad esempio Candida albicans o Malassezia furfur . The antifungal activity of the compounds of the present invention, alone or in association with antibiotics, can be determined, for example, with the broth microdilution assay. For example, by determining the ability to inhibit growth and / or to kill fungi (including yeasts) belonging to the genus Candida spp. or Malassezia spp. for example Candida albicans or Malassezia furfur.

I composti di formula (I) possono essere somministrati all'uomo o all’animale entro ampie fasce di dosaggio in funzione del tipo di infezione del suo decorso e delle condizioni del paziente. A titolo non limitativo è possibile citare dosaggi compresi tra 1 e 100 mg/ Kg Diverse formulazioni farmaceutiche contenenti collettivamente o individualmente, i composti di formula (I) dell invenzione possono essere preparate mediante procedure descritte in arte e con eccipienti conosciuti e facilmente reperibili. Tali formulazioni, tipicamente ripartite in più unità di dosaggio, costituiscono parte della presente invenzione. A titolo di riferimento, ciascuna unità di dosaggio può contenere una quantità di composto di formula (I) compresa tra 70 e 7000 mg. The compounds of formula (I) can be administered to humans or animals within wide dosage ranges depending on the type of infection, its course and the patient's condition. By way of non-limiting it is possible to mention dosages comprised between 1 and 100 mg / Kg. Different pharmaceutical formulations containing collectively or individually, the compounds of formula (I) of the invention can be prepared by means of procedures described in the art and with known and easily available excipients. Such formulations, typically divided into several dosage units, form part of the present invention. By way of reference, each dosage unit can contain an amount of compound of formula (I) ranging from 70 to 7000 mg.

Nel presente documento, con il termine "eccipiente" si intende un composto o una sua miscela ottimale per l'utilizzo in una formulazione allestita per il trattamento di una specifica patologia infettiva o condizioni ad essa associate. Ad esempio, un eccipiente per l'uso in una formulazione farmaceutica non deve causare generalmente una risposta avversa in un soggetto. L'eccipiente, come precedentemente descritto, non deve inibire in modo significativo la rilevante attività biologica del composto attivo. Un eccipiente può semplicemente fornire una attività di buffering per mantenere il composto attivo a pH adatto per esercitare in tal modo la sua attività biologica, ad esempio, tampone fosfato salino. In un altro esempio, l'eccipiente può includere o essere esso stesso una molecola antimicrobica aggiuntivo e/o una molecola anti-infiammatoria. In this document, the term "excipient" means a compound or a mixture thereof that is optimal for use in a formulation prepared for the treatment of a specific infectious pathology or conditions associated with it. For example, an excipient for use in a pharmaceutical formulation should not generally cause an adverse response in a subject. The excipient, as previously described, must not significantly inhibit the relevant biological activity of the active compound. An excipient may simply provide a buffering activity to maintain the active compound at a pH suitable for thereby exerting its biological activity, e.g., phosphate buffer saline. In another example, the excipient may include or itself be an additional antimicrobial molecule and / or an anti-inflammatory molecule.

Collettivamente, o individualmente, i composti di formula (I) secondo l'invenzione possono essere formulati anche come soluzioni per una somministrazione orale o come soluzioni adeguate per la somministrazione parenterale, come esempio per via intramuscolare, sottocutanea, intraperitoneale o endovenosa. Collectively, or individually, the compounds of formula (I) according to the invention can also be formulated as solutions for oral administration or as solutions suitable for parenteral administration, for example by the intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal or intravenous route.

Le formulazioni farmaceutiche dei composti di formula (I) dell' invenzione possono anche assumere la forma di una soluzione acquosa, una forma anidra o una dispersione, o in alternativa la forma di un'emulsione, una sospensione, una pomata, una crema o un unguento. The pharmaceutical formulations of the compounds of formula (I) of the invention can also take the form of an aqueous solution, an anhydrous form or a dispersion, or alternatively the form of an emulsion, a suspension, an ointment, a cream or a ointment.

Collettivamente, o individualmente, i composti di formula (I) della presente invenzione possono essere inclusi in sospensioni, soluzioni o emulsioni oleose in veicoli o in acqua e possono contenere agenti utili per la sospensione, la stabilizzazione e/o agenti favorenti la dispersione. Collectively, or individually, the compounds of formula (I) of the present invention can be included in suspensions, solutions or oily emulsions in vehicles or in water and can contain agents useful for suspending, stabilizing and / or agents promoting dispersion.

Collettivamente, o individualmente, i composti di formula (I) della presente invenzione possono essere formulati sotto forma di polvere, ottenuta mediante isolamento asettico di solido sterile o mediante liofilizzazione di una soluzione per essere ricostituiti in forma di soluzione con l'ausilio di un veicolo adatto prima dell'uso, ad esempio, acqua per preparazioni iniettabili. Collectively, or individually, the compounds of formula (I) of the present invention can be formulated in the form of powder, obtained by aseptic isolation of a sterile solid or by lyophilization of a solution to be reconstituted in the form of a solution with the aid of a vehicle. suitable before use, for example, water for injections.

Collettivamente, o individualmente, i composti di formula (I) della presente invenzione possono anche essere somministrati per le vie respiratorie. Per la somministrazione per inalazione o insufflazione, la composizione può assumere la forma di una polvere secca, come esempio, un mix in polvere di agente terapeutico e una base di polvere adatta come il lattosio o di amido. Collectively, or individually, the compounds of formula (I) of the present invention can also be administered to the respiratory tract. For administration by inhalation or insufflation, the composition can take the form of a dry powder, for example, a powder mix of therapeutic agent and a suitable powder base such as lactose or starch.

Collettivamente, o individualmente, i composti di formula (I) della presente invenzione possono essere somministrati in una soluzione acquosa in forma di aerosol o per via inalatoria. Collectively, or individually, the compounds of formula (I) of the present invention can be administered in an aqueous solution in the form of an aerosol or by inhalation.

In tutta la descrizione e rivendicazioni di questa specifica invenzione, le parole "comprendere" e "contenere" e le variazioni delle parole, ad esempio "comprende" e "contiene", significa "compreso ma non limitato a", e non intende ad escludere altre frazioni, additivi, componenti o interi passi. Throughout the description and claims of this specific invention, the words "comprise" and "contain" and variations of the words, for example "includes" and "contains", mean "understood but not limited to", and are not intended to exclude other fractions, additives, components or entire steps.

In tutta la descrizione e nelle sottoindicate rivendicazioni di questa specifica invenzione, il singolare comprende il plurale, a meno che il contesto non richieda diversamente. Inoltre nelle parti in cui l'articolo indeterminativo è usato, la specifica è da intendersi come pluralità e singolarità, a meno che il contesto non richieda diversamente. Throughout the description and in the claims below for this specific invention, the singular includes the plural, unless the context requires otherwise. Furthermore, in the parts where the indefinite article is used, the specification is to be understood as plurality and singularity, unless the context requires otherwise.

La presente invenzione è descritta ulteriormente nei seguenti, e non limitativi, esempi. The present invention is further described in the following, non-limiting, examples.

PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART

Materiali Materials

Molecole Molecules

Sintesi dei composti adiuvanti di antibatterici oggetto dell’invenzione : Summary of the adjuvant compounds of antibacterials object of the invention:

Il composto di formula 1 è fatto reagire in presenza di sodio idruro come base e in dimetossietano come solvente a 0°C per due ore. Successivamente viene aggiunto alla miscela di reazione il composto di formula 2 e la temperatura della reazione viene portata a 60°C. Dopo 2 ore una TLC mostra che la reazione è finita. Si lava la miscela di reazione con una soluzione satura di cloruro di ammonio, e si estrae con etile acetato. La fase organica si lava con soluzione satura di cloruro di sodio e si anidrifica con sodio solfato. Successivamente il sodio solfato viene filtrato e il solvente organico viene evaporato al rotavapor. Il grezzo di reazione viene purificato con una colonna cromatografica flash con miscela eluente diclorometano/etere etilico 8:2. Si ottiene il prodotto desiderato sotto forma di olio incolore con una resa del 67%. The compound of formula 1 is reacted in the presence of sodium hydride as base and in dimethoxyethane as solvent at 0 ° C for two hours. Subsequently, the compound of formula 2 is added to the reaction mixture and the reaction temperature is brought to 60 ° C. After 2 hours a TLC shows that the reaction is finished. The reaction mixture is washed with a saturated solution of ammonium chloride, and extracted with ethyl acetate. The organic phase is washed with saturated sodium chloride solution and dried with sodium sulphate. Subsequently the sodium sulfate is filtered and the organic solvent is evaporated in the rotavapor. The reaction crude is purified with a flash chromatographic column with an eluent mixture dichloromethane / ethyl ether 8: 2. The desired product is obtained in the form of a colorless oil with a yield of 67%.

Ad una soluzione del composto 3 in dimetossietano viene aggiunto goccia a goccia n-butil litio a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, viene aggiunto alla miscela di reazione il composto 4 e si lascia reagire a 90°C. Dopo 18 ore una TLC mostra che la reazione è finita. Si aggiunge una soluzione satura di ammonio cloruro e si estrae con etile acetato. La fase organica viene lavata con una soluzione satura di sodio cloruro e anidrificata con sodio solfato. Successivamente il sodio solfato viene filtrato e il solvente organico viene evaporato al rotavapor. Il grezzo di reazione viene purificato con una colonna cromatografica flash con miscela eluente Etere di petrolio/etile acetato 95:5. Si ottiene il prodotto desiderato sotto forma di olio giallo con una resa del 75%. N-butyl lithium at room temperature is added dropwise to a solution of compound 3 in dimethoxyethane. After 30 minutes, compound 4 is added to the reaction mixture and it is left to react at 90 ° C. After 18 hours a TLC shows that the reaction is over. A saturated solution of ammonium chloride is added and extracted with ethyl acetate. The organic phase is washed with a saturated sodium chloride solution and dried with sodium sulphate. Subsequently the sodium sulfate is filtered and the organic solvent is evaporated in the rotavapor. The reaction crude is purified with a flash chromatographic column with 95: 5 petroleum ether / ethyl acetate eluent mixture. The desired product is obtained in the form of yellow oil with a yield of 75%.

Ad una soluzione del composto di formula 5 in dimetossietano/ acqua 5:1 come miscela di solventi, viene aggiunto il composto di formula 6, il catalizzatore al palladio ferrocene e cesio carbonato come base. La reazione è condotta al microonde a 140°C per 30 minuti. Una TLC fatta successivamente, mostra che la reazione è finita. Il grezzo di reazione viene filtrato su celite per eliminare il palladio. Successivamente la soluzione filtrata viene lavata con acqua e il grezzo estratto con etile acetato. La fase organica viene lavata con una soluzione satura di sodio cloruro e anidrificata con sodio solfato. Successivamente il sodio solfato viene filtrato e il solvente organico viene evaporato al rotavapor. Il grezzo di reazione viene purificato con una colonna cromatografica flash con miscela eluente Etere di petrolio/etile acetato 9:1. Si ottiene il prodotto desiderato sotto forma di olio giallo con una resa del 72%. To a solution of the compound of formula 5 in dimethoxyethane / water 5: 1 as a mixture of solvents, the compound of formula 6, the catalyst with palladium ferrocene and cesium carbonate as base is added. The reaction is carried out in the microwave at 140 ° C for 30 minutes. A TLC done later shows that the reaction is over. The reaction crude is filtered on celite to eliminate the palladium. Subsequently the filtered solution is washed with water and the crude extracted with ethyl acetate. The organic phase is washed with a saturated sodium chloride solution and dried with sodium sulphate. Subsequently the sodium sulfate is filtered and the organic solvent is evaporated in the rotavapor. The reaction crude is purified with a flash chromatographic column with 9: 1 petroleum ether / ethyl acetate eluent mixture. The desired product is obtained in the form of yellow oil with a yield of 72%.

Ad una soluzione del composto di formula 4 in toluene/metanolo/acqua 3: 1: 1 come miscela di solventi, viene aggiunto il composto di formula 8, il catalizzatore al palladio tetrakis e sodio tertbutossido come base. La reazione è condotta a 100°C per 18 ore. Una TLC fatta successivamente, mostra che la reazione è finita. Il grezzo di reazione viene filtrato su celite per eliminare il palladio. Successivamente la soluzione filtrata viene lavata con acqua e il grezzo estratto con etile acetato. La fase organica viene lavata con una soluzione satura di sodio cloruro e anidrificata con sodio solfato. Successivamente il sodio solfato viene filtrato e il solvente organico viene evaporato al rotavapor. Il grezzo di reazione viene purificato con una colonna cromatografica flash con miscela eluente diclorometano/metanolo 98:2. To a solution of the compound of formula 4 in toluene / methanol / water 3: 1: 1 as a mixture of solvents, the compound of formula 8, the palladium tetrakis catalyst and sodium tertbutoxide as base are added. The reaction is carried out at 100 ° C for 18 hours. A TLC done later shows that the reaction is over. The reaction crude is filtered on celite to eliminate the palladium. Subsequently the filtered solution is washed with water and the crude extracted with ethyl acetate. The organic phase is washed with a saturated sodium chloride solution and dried with sodium sulphate. Subsequently the sodium sulfate is filtered and the organic solvent is evaporated in the rotavapor. The reaction crude is purified with a flash chromatographic column with a 98: 2 dichloromethane / methanol eluent mixture.

Ad una soluzione del composto 3 in dimetossietano viene aggiunto goccia a goccia n-butil litio a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, viene aggiunto alla miscela di reazione il composto 9 e si lascia reagire a 90°C. Dopo 18 ore una TLC mostra che la reazione è finita. Si aggiunge una soluzione satura di ammonio cloruro e si estrae con etile acetato. La fase organica viene lavata con una soluzione satura di sodio cloruro e anidrificata con sodio solfato. Successivamente il sodio solfato viene filtrato e il solvente organico viene evaporato al rotavapor. Il grezzo di reazione viene purificato con una colonna cromatografica flash con miscela eluente Etere di petrolio /etile acetato 95:5. Si ottiene il prodotto desiderato sotto forma di olio giallo con una resa del 77%. N-butyl lithium at room temperature is added dropwise to a solution of compound 3 in dimethoxyethane. After 30 minutes, compound 9 is added to the reaction mixture and it is left to react at 90 ° C. After 18 hours a TLC shows that the reaction is over. A saturated solution of ammonium chloride is added and extracted with ethyl acetate. The organic phase is washed with a saturated sodium chloride solution and dried with sodium sulphate. Subsequently the sodium sulfate is filtered and the organic solvent is evaporated in the rotavapor. The reaction crude is purified with a flash chromatographic column with 95: 5 petroleum ether / ethyl acetate eluent mixture. The desired product is obtained in the form of yellow oil with a yield of 77%.

Batteri Bacteria

Le prove sono state effettuate sui seguenti stipiti di referenza batterici: The tests were carried out on the following bacterial reference jambs:

Batteri Gram negativi; E. coli ATCC25922, S. Typhimurium ATCC 14028, K. pneumoniae ATCC 13883. Gram negative bacteria; E. coli ATCC25922, S. Typhimurium ATCC 14028, K. pneumoniae ATCC 13883.

Batteri Gram positivi: Staphylococcus aureus ATCC 25923, MRSA ATCC 43300, S. pseudintermedius ATCC21284. Gram positive bacteria: Staphylococcus aureus ATCC 25923, MRSA ATCC 43300, S. pseudintermedius ATCC21284.

Funghi Mushrooms

Le prove sono state effettuate sui seguenti stipiti di referenza fungini: The tests were carried out on the following fungal reference jambs:

- Candida albicans ATCC 11006 - Candida albicans ATCC 11006

Metodi Methods

Microdiluizione seriale Serial microdilution

L’attività antimicrobica di ciascuna molecola è stata valutata inizialmente mediante attività Minimal Inhibitory Concentration assay. In breve, in una piastra microtiter sono stati preparati 10 pozzetti contenenti 49 μί di terreno minimo Luria-Bertani (LB) 20% (in tampone fosfato 10 mM, pH 7) o di Mueller-Hinton broth (MHB). In provette sterili sono state eseguite diluizioni seriali delle molecole UPAR in Dimetilsolfossido (DMSO), a partire dalla concentrazione di 25.6 mg/ml, fino a 0.05 mg/ml e per ogni pozzetto della piastra è stato aggiunto 1 μl di molecola opportunamente diluita. The antimicrobial activity of each molecule was initially assessed using the Minimal Inhibitory Concentration Assay activity. Briefly, 10 wells containing 49 μί of minimum 20% Luria-Bertani (LB) medium (in 10 mM phosphate buffer, pH 7) or Mueller-Hinton broth (MHB) were prepared in a microtiter plate. Serial dilutions of UPAR molecules in Dimethyl sulfoxide (DMSO) were performed in sterile test tubes, starting from the concentration of 25.6 mg / ml, up to 0.05 mg / ml and 1 μl of suitably diluted molecule was added to each well of the plate.

Preparazione dell'ìnoculum batterico Preparation of the bacterial ìnoculum

Gli stipiti batterici sono stati inoculati (4-5 colonie morfologicamente simili) in MHB a 37°C e 240 rpm fino al raggiungimento della fase logaritmica di crescita. La sospensione batterica così ottenuta è stata centrifugata a 2000 rpm per 20 minuti a 4°C, il surnatante è stato eliminato e il pellet risospeso in terreno minimo LB 20% o MHB. La sospensione è stata diluita e saggiata spettrofotometricamente (assorbanza 600 nm) fino al raggiungimento di una densità ottica di 0.08-0. 13, corrispondente ad una densità cellulare di circa 10<8 >CFU/ml. 100 μl di questa sospensione sono stati inoculati in 9.9 mi di terreno minimo o terreno ricco per ottenere una concentrazione di inoculo batterico di circa 10<6 >CFU/ml. 50 μl di sospensione batterica diluita sono stati aggiunti a tutti i pozzetti della piastra microtiter. The bacterial stems were inoculated (4-5 morphologically similar colonies) in MHB at 37 ° C and 240 rpm until the logarithmic phase of growth was reached. The bacterial suspension thus obtained was centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes at 4 ° C, the supernatant was removed and the pellet resuspended in medium at least 20% LB or MHB. The suspension was diluted and tested spectrophotometrically (absorbance 600 nm) until reaching an optical density of 0.08-0. 13, corresponding to a cell density of about 10 <8> CFU / ml. 100 μl of this suspension was inoculated into 9.9 ml of minimal medium or rich medium to obtain a bacterial inoculum concentration of approximately 10 <6> CFU / ml. 50 μl of diluted bacterial suspension was added to all wells of the microtiter plate.

La concentrazione finale di cellule batteriche per pozzetto è stata di 5* 10<5 >CFU/ml; UPAR790 e UPAR 806 sono stati saggiati in terreno minimo e in terreno ricco alle concentrazioni di 256-0,5 μg/ml. Per ogni stipite batterico sono stati allestiti 3 esperimenti indipendenti con 3 repliche e per ogni replica sono stati effettuati i controlli di crescita e di sterilità. I risultati sono riportati in Tabella 1. The final concentration of bacterial cells per well was 5 * 10 <5> CFU / ml; UPAR790 and UPAR 806 were tested in minimal medium and in rich medium at concentrations of 256-0.5 μg / ml. For each bacterial stem 3 independent experiments with 3 replicates were set up and for each replicate growth and sterility controls were performed. The results are reported in Table 1.

Checkerboard assay Checkerboard assay

Per testare l’efficacia delle molecole in esame, in associazione con antibiotici convenzionali, è stata utilizzata la metodica di checkerboard assay, adattata alle caratteristiche delle molecole stesse. Poiché esse risultano solubili solamente in solventi apolari anche a basse concentrazioni, è stato necessario diluirle in Dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione massima di 25,6 mg/ml, al fine di avere una concentrazione finale in piastra di DMSO non superiore all’1%. To test the effectiveness of the molecules in question, in association with conventional antibiotics, the checkerboard assay method was used, adapted to the characteristics of the molecules themselves. Since they are soluble only in non-polar solvents even at low concentrations, it was necessary to dilute them in Dimethylsulfoxide (DMSO) to a maximum concentration of 25.6 mg / ml, in order to have a final concentration of DMSO in plate not exceeding 1 %.

Per valutare l’attività antimicrobica di associazioni di più molecole sono state utilizzate piastre a 96 pozzetti con fondo a U. In ciascuna piastra sono stati allestiti 10 pozzetti per prova con 50 μl di terreno LB al 20% o MHB con diluizioni seriali dell’antibiotico convenzionale da testare. Le diluizioni seriali sono state effettuate utilizzando come concentrazione di partenza il valore di MIC di tale antibiotico per ciascun batterio testato e a seguire per i successivi nove pozzetti una diluizione volume su volume di tale concentrazione. Ad ogni pozzetto della prova è stato successivamente aggiunto 1 μl di UPAR diluito in DMSO a tre diverse concentrazioni fisse per tutti i pozzetti (0,8 mg/ ml; 1,6 mg/ml e 3,2 mg/ml). 96-well U-bottom plates were used to assess the antimicrobial activity of multi-molecule associations. 10 wells per test were prepared in each plate with 50 μl of 20% LB or MHB medium with serial dilutions of the antibiotic conventional to test. Serial dilutions were carried out using the MIC value of this antibiotic as a starting concentration for each bacterium tested and followed by a volume-by-volume dilution of this concentration for the next nine wells. 1 μl of UPAR diluted in DMSO at three different fixed concentrations for all wells (0.8 mg / ml; 1.6 mg / ml and 3.2 mg / ml) was subsequently added to each well of the test.

Sono state eseguiti tre esperimenti per ciascuna associazione testata e ciascun esperimento è stato eseguito in triplicato. Three experiments were performed for each association tested and each experiment was performed in triplicate.

A ciascun pozzetto della prova sono stati successivamente aggiunti 50 μΐ di batteri tarati spettrofotometricamente fino al raggiungimento di una concentrazione batterica finale in piastra di 5x10<5 >CFU/ml. 50 μΐ of spectrophotometrically calibrated bacteria were subsequently added to each well of the test until a final bacterial concentration in plate of 5x10 <5> CFU / ml was reached.

Ciascuna piastra è stata incubata a 37°C in condizioni di aerobiosi per 24 ore. Each plate was incubated at 37 ° C under aerobic conditions for 24 hours.

Per valutare l’azione antimicrobica in combinazione delle molecole è stato calcolato il Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC Index) . Si è proceduto valutando la MIC di ognuna delle due molecole testate singolarmente ed in combinazione tra loro. I risultati sono stati inseriti nella formula riportata di seguito: The Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC Index) was calculated to evaluate the antimicrobial action in combination of the molecules. We proceeded by evaluating the MIC of each of the two molecules tested individually and in combination with each other. The results were fed into the formula below:

L’attività antimicrobica è stata considerata sinergica, additiva, indifferente o antagonista in base al valore di FIC Index ottenuto. In particolare: The antimicrobial activity was considered synergistic, additive, indifferent or antagonistic based on the FIC Index value obtained. In particular:

Sinergica: FIC < 0,5 Synergistic: FIC <0.5

Additiva: 0,5 < FIC < 1 Additive: 0.5 <FIC <1

Indifferente: 1 < FIC <4 Indifferent: 1 <FIC <4

Antagonista: FIC > 4 Antagonist: FIC> 4

ESEMPI : EXAMPLES:

VALUTAZIONE DELL’ATTIVITÀ ANTIMICROBICA, DA SOLA E IN ASSOCIAZIONE, DELLA MOLECOLA UPAR 790 EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY, ALONE AND IN ASSOCIATION, OF THE UPAR 790 MOLECULE

Attività antimicrobica di UPAR790 UPAR790 antimicrobial activity

UPAR790 è stato testato in terreno minimo e in terreno ricco, sia da solo che in associazione con antibiotici convenzionali. Gli stipiti batterici testati sono stati: UPAR790 has been tested in minimal medium and rich medium, both alone and in combination with conventional antibiotics. The bacterial jambs tested were:

- E. coli ATCC25922 - E. coli ATCC25922

- Salmonella Typhimurium ATCC 14028 - Salmonella Typhimurium ATCC 14028

- Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 - Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

- Staphylococcus aureus ATCC25853 - Staphylococcus aureus ATCC25853

- MRSA ATCC43300 - MRSA ATCC43300

- Staphylococcus pseudintermedius ATCC2 1284 - Staphylococcus pseudintermedius ATCC2 1284

Preparazione dell’inoculum batterico Preparation of the bacterial inoculum

Gli stipiti batterici sono stati inoculati (4-5 colonie morfologicamente simili) in MHB a 37°C e 240 rpm fino al raggiungimento della fase logaritmica di crescita. La sospensione batterica così ottenuta è stata centrifugata a 2000 rpm per 20 minuti a 4°C, il surnatante è stato eliminato e il pellet risospeso in terreno minimo LB 20% o MHB. La sospensione è stata diluita e saggiata spettrofotometricamente (assorbanza 600 nm) fino al raggiungimento di una densità ottica di 0.08-0.13, corrispondente ad una densità cellulare di circa 10<8 >CFU/ml. 100 μl di questa sospensione sono stati inoculati in 9.9 ml di terreno minimo o terreno ricco per ottenere una concentrazione di inoculo batterico di circa 10<6 >CFU/ml. 50 μl di sospensione batterica diluita sono stati aggiunti a tutti i pozzetti della piastra microtiter. The bacterial stems were inoculated (4-5 morphologically similar colonies) in MHB at 37 ° C and 240 rpm until the logarithmic phase of growth was reached. The bacterial suspension thus obtained was centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes at 4 ° C, the supernatant was removed and the pellet resuspended in medium at least 20% LB or MHB. The suspension was diluted and spectrophotometrically tested (absorbance 600 nm) until reaching an optical density of 0.08-0.13, corresponding to a cell density of about 10 <8> CFU / ml. 100 μl of this suspension was inoculated into 9.9 ml of minimal medium or rich medium to obtain a bacterial inoculum concentration of approximately 10 <6> CFU / ml. 50 μl of diluted bacterial suspension was added to all wells of the microtiter plate.

La concentrazione finale di cellule batteriche per pozzetto è stata di 5*10<5 >CFU/ml; UPAR790 è stato saggiato in terreno minimo e in terreno ricco alle concentrazioni di 256-0,5 gg/ml. Per ogni stipite batterico sono stati allestiti 3 esperimenti indipendenti con 3 repliche per ogni esperimento e per ogni replica sono stati effettuati i controlli di crescita e di sterilità. I risultati sono riportati in Tabella 2. The final concentration of bacterial cells per well was 5 * 10 <5> CFU / ml; UPAR790 was tested in minimal medium and in rich medium at concentrations of 256-0.5 days / ml. For each bacterial stem 3 independent experiments were set up with 3 replicates for each experiment and for each replicate growth and sterility controls were performed. The results are reported in Table 2.

Preparazione della molecola Preparation of the molecule

UPAR790 è stato saggiato per la sua attività antimicrobica intrinseca mediante Minimal Inhibitory Concentration assay. In breve, in una piastra microtiter sono stati preparati 10 pozzetti contenenti 49 μl di terreno minimo LB 20% {in tampone fosfato 10 mM, pH 7) o di Mueller-Hinton broth (MHB). In provette sterili sono state eseguite diluizioni seriali di UPAR790 in DMSO, a partire dalla concentrazione di 25,6 mg/ml, fino a 0,05 mg/ml e per ogni pozzetto della piastra è stato aggiunto 1 μl di molecola opportunamente diluita. UPAR790 was tested for its intrinsic antimicrobial activity using the Minimal Inhibitory Concentration assay. Briefly, 10 wells containing 49 μl of minimum 20% LB medium (in 10 mM phosphate buffer, pH 7) or Mueller-Hinton broth (MHB) were prepared in a microtiter plate. In sterile test tubes, serial dilutions of UPAR790 in DMSO were performed, starting from the concentration of 25.6 mg / ml, up to 0.05 mg / ml and 1 μl of suitably diluted molecule was added to each well of the plate.

È stata inoltre valutata la torbidità intrinseca della molecola UPAR790 sia ad occhio nudo che mediante lettura spettrofotometrica della densità ottica, alle diverse concentrazioni testate e nei due diversi medium. Si è quindi evidenziata una precipitazione della molecola fino a concentrazioni pari a 16 μg/ml, come mostrato nella Tabella 1. The intrinsic turbidity of the UPAR790 molecule was also evaluated both with the naked eye and by spectrophotometric reading of the optical density, at the different concentrations tested and in the two different media. A precipitation of the molecule was then highlighted up to concentrations equal to 16 μg / ml, as shown in Table 1.

Tabella 1: Densità ottica di UPAR790 alle diverse concentrazioni testate e lettura ad occhio nudo della precipitazione nei pozzetti. Table 1: Optical density of UPAR790 at the different concentrations tested and reading with the naked eye of the precipitation in the wells.

Tabella 2: Inibizione della crescita dei diversi stipiti batterici testati, a contatto con UPAR790, valutata mediante lettura delle densità ottiche Table 2: Growth inhibition of the different bacterial stems tested, in contact with UPAR790, evaluated by reading the optical densities

I dati ottenuti hanno dimostrato che UPAR790, utilizzato da solo, ha una discreta attività inibitrice nei confronti delle specie testate. L’entità di inibizione varia in modo non consistente tra i test realizzati in terreno ricco (MHB) e povero (LB20%) di cisteina: ciò evidenzia che la concentrazione ambientale di cisteina non è un fattore determinante per l’attività antibatterica del composto testato. The data obtained showed that UPAR790, used alone, has a moderate inhibitory activity against the tested species. The extent of inhibition varies inconsistently between the tests carried out in medium rich (MHB) and poor (LB20%) of cysteine: this highlights that the environmental concentration of cysteine is not a determining factor for the antibacterial activity of the tested compound. .

Attività antimicrobica di UPAR790, in presenza di polimixina B a concentrazione sub-MIC UPAR790 antimicrobial activity, in the presence of polymyxin B at sub-MIC concentration

Il terreno di coltura batterica è stato qui addizionato con una concentrazione fissa e sub-MIC (PMB 0,lug/ml) al terreno di coltura e The bacterial culture medium was added here with a fixed and sub-MIC concentration (PMB 0, lug / ml) to the culture medium and

sono stati ripetuti gli esperimenti come sopra descritto, utilizzando Salmonella Typhimurium come microorganismo standard. I risultati sono riportati in Tabella 3. the experiments were repeated as described above, using Salmonella Typhimurium as the standard microorganism. The results are reported in Table 3.

Tabella 3: Attività antimicrobica di UPAR790 utilizzato come antibiotico e associato a PMB come adiuvante a 0. lug/ ml Table 3: Antimicrobial activity of UPAR790 used as an antibiotic and associated with PMB as an adjuvant at 0. lug / ml

L’inibizione è stata valutata anche mediante lettura della densità ottica dei pozzetti della prova. Le densità ottiche dei pozzetti alle diverse concentrazioni sono state aggiustate sottraendo la densità ottica della molecola alle diverse concentrazioni e nei due diversi medium. I risultati sono riportati in Tabella 4. The inhibition was also evaluated by reading the optical density of the test wells. The optical densities of the wells at the different concentrations were adjusted by subtracting the optical density of the molecule at the different concentrations and in the two different media. The results are reported in Table 4.

Tabella 4: Inibizione della crescita dei diversi stipiti batterici testati, a contatto con UPAR790 e PMB, valutata mediante lettura delle densità ottiche Table 4: Inhibition of the growth of the different bacterial stems tested, in contact with UPAR790 and PMB, evaluated by reading the optical densities

I risultati hanno dimostrato che raggiunta di PMB sub-MIC facilita l’ingresso di UPAR790 nelle cellule batteriche e permette di incrementarne l’attività antimicrobica. The results showed that the achievement of sub-MIC PMB facilitates the entry of UPAR790 into bacterial cells and allows to increase their antimicrobial activity.

Attività di UPAR790 associato ad antibiotici convenzionali Nell’ottica della formulazione di una nuova associazione ad attività antimicrobica, si è deciso di indagare l’attività di UPAR790 utilizzato in associazione ad antibiotici convenzionali con la funzione di adiuvante. Sono stati saggiati diversi antibiotici associati a UPAR790 di cui sono state eseguite checkerboard assays per valutare l’attività in combinazione con UPAR790. Gli stipiti batterici testati sono stati: UPAR790 activity associated with conventional antibiotics In order to formulate a new association with antimicrobial activity, it was decided to investigate the activity of UPAR790 used in association with conventional antibiotics with the function of adjuvant. Several antibiotics associated with UPAR790 were tested and checkerboard assays were performed to evaluate the activity in combination with UPAR790. The bacterial jambs tested were:

- Escherichia coli ATCC258855 - Escherichia coli ATCC258855

- Salmonella Typhimurium ATCC 14028 - Salmonella Typhimurium ATCC 14028

- Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 - Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

- Staphylococcus aureus ATCC25853 - Staphylococcus aureus ATCC25853

- MRSA ATCC43300 - MRSA ATCC43300

Attività di UPAR790 in associazione con colistina Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR790 e colistina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 5). UPAR790 activity in association with colistin It was decided to test the association between UPAR790 and colistin. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 5).

Per ogni batterio e ogni associazione è stato calcolato il Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC index) come: For each bacterium and each association the Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC index) was calculated as:

L’attività della molecola viene considerata sinergica con un indice < 0.5, additiva con indice compreso tra 0.5 e 1, indifferente con indice compreso tra 1 e 4, antagonistica nel caso l’indice risulti >4. The activity of the molecule is considered synergistic with an index <0.5, additive with an index between 0.5 and 1, indifferent with an index between 1 and 4, antagonistic if the index is> 4.

Tabella 5: Attività di associazioni di UPAR790 e colistina a differenti concentrazioni. Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR790 testate, le concentrazioni di MIC della colistina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 5: Association activities of UPAR790 and colistin at different concentrations. The concentrations of UPAR790 tested, the MIC concentrations of colistin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated for the different bacteria and media tested.

I risultati dimostrano una estesa attività sinergica con questo antibiotico convenzionale, sia in terreno minimo (LB al 20% in tampone fosfato) che in terreno ricco (MHB), in presenza di cisteina preformata nel medium, nei confronti di tutti gli stipiti batterici testati. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di indifferenza o di antagonismo. The results demonstrate an extensive synergistic activity with this conventional antibiotic, both in minimal medium (20% LB in phosphate buffer) and in rich medium (MHB), in the presence of preformed cysteine in the medium, against all tested bacterial stems. Furthermore, no indifference or antagonistic activity was found.

Attività di UPAR790 in associazione con amoxicillina Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR790 e amoxicillina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 6). UPAR790 activity in association with amoxicillin It was decided to test the association between UPAR790 and amoxicillin. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 6).

L’attività della molecola viene considerata sinergica con un indice < 0.5 e additiva con indice compreso tra 0.5 e 1. The activity of the molecule is considered synergistic with an index <0.5 and additive with an index between 0.5 and 1.

Tabella 6: Attività di associazioni di UPAR790 e amoxicillina a differenti concentrazioni. Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR790 testate, le concentrazioni di MIC di amoxicillina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 6: Association activities of UPAR790 and amoxicillin at different concentrations. For the various bacteria and media tested, the concentrations of UPAR790 tested, the MIC concentrations of amoxicillin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated.

I risultati dimostrano la presenza di attività sinergica con questo antibiotico convenzionale, sia in terreno minimo (LB al 20% in tampone fosfato) che in terreno ricco {MHB), in presenza di cisteina preformata nel medium, nei confronti di tutti gli stipiti batterici testati, sia Gram positivi che negativi. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di antagonismo. The results demonstrate the presence of synergistic activity with this conventional antibiotic, both in minimal medium (20% LB in phosphate buffer) and in rich medium (MHB), in the presence of preformed cysteine in the medium, against all tested bacterial stems , both Gram positive and negative. Furthermore, no antagonistic activity was detected.

Attività di UPAR790, in assocazione con ampicillina Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR790 e ampicillina. UPAR790 activity, in association with ampicillin It was decided to test the association between UPAR790 and ampicillin.

I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 7). The results of the checkerboard assays are shown below (Table 7).

L’attività della molecola viene considerata sinergica con un indice ≤ 0.5, additiva con indice compreso tra 0.5 e 1, indifferente con indice compreso tra 1 e 4, antagonistica nel caso l’indice risulti >4. The activity of the molecule is considered synergistic with an index ≤ 0.5, additive with an index between 0.5 and 1, indifferent with an index between 1 and 4, antagonistic if the index is> 4.

Tabella 7: Attività di associazioni di UPAR790 e ampicillina a differenti concentrazioni. Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR790 testate, le concentrazioni di MIC di ampicillina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 7: Association activities of UPAR790 and ampicillin at different concentrations. The concentrations of UPAR790 tested, the MIC concentrations of ampicillin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated for the different bacteria and media tested.

I risultati dimostrano la presenza di attività sinergica con questo antibiotico convenzionale per tutti i batteri testati ad eccezione di E. coli e S. Typhimurium in terreno ricco di cisteina, che mostrano attività additiva. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di antagonismo. The results demonstrate the presence of synergistic activity with this conventional antibiotic for all bacteria tested except E. coli and S. Typhimurium in cysteine-rich medium, which show additive activity. Furthermore, no antagonistic activity was detected.

Attività di UPAR790 in associazione con gentamicina UPAR790 activity in association with gentamicin

Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR790 e gentamicina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 8). It was decided to test the association between UPAR790 and gentamicin. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 8).

Per ogni batterio e ogni associazione è stato calcolato il Fractional Inhibitoiy Concentration Index (FIC index) come: For each bacterium and each association the Fractional Inhibitoiy Concentration Index (FIC index) was calculated as:

Tabella 8: Attività di associazioni di UPAR790 e gentamicina a differenti concentrazioni Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR790 testate, le concentrazioni di MIC della gentamicina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 8: Activities of associations of UPAR790 and gentamicin at different concentrations The concentrations of UPAR790 tested, the MIC concentrations of gentamicin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated.

I risultati dimostrano la presenza di attività sinergica nei confronti di S. pseudintermedius sia in terreno minimo che ricco. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di antagonismo. The results demonstrate the presence of synergistic activity against S. pseudintermedius in both minimal and rich soil. Furthermore, no antagonistic activity was detected.

Attività di UPAR790 in associazione con ciprofloxacina Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR790 e ciprofloxacina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 9). UPAR790 activity in association with ciprofloxacin It was decided to test the association between UPAR790 and ciprofloxacin. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 9).

Tabella 9: Attività di associazioni di UPAR790 e ciprofloxacina a differenti concentrazioni. Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR790 testate, le concentrazioni di MIC di ciprofloxacina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 9: Association activities of UPAR790 and ciprofloxacin at different concentrations. The concentrations of UPAR790 tested, the MIC concentrations of ciprofloxacin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated for the different bacteria and media tested.

I risultati dimostrano la presenza di attività sinergica in terreno minimo LB al 20% in tampone fosfato per tutti gli stipiti testati ad eccezione di S. aureus sia in terreno ricco che minimo, e S. Typhimurium in terreno ricco, per i quali si è osservata attività additiva. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di antagonismo. The results demonstrate the presence of synergistic activity in minimum 20% LB medium in phosphate buffer for all tested stems with the exception of S. aureus in both rich and minimal medium, and S. Typhimurium in rich medium, for which it was observed additive activity. Furthermore, no antagonistic activity was detected.

VALUTAZIONE DELL’ ATTIVITÀ ANTIMICROBICA DI UPAR 806, DA SOLO ED IN ASSOCIAZIONE CON ANTIBIOTICI CONVENZIONALI EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF UPAR 806, ALONE AND IN ASSOCIATION WITH CONVENTIONAL ANTIBIOTICS

Attività antimicrobica di UPAR806 UPAR806 antimicrobial activity

UPAR806 è stato testato in terreno minimo e in terreno ricco, sia come antibiotico e antifungino che come adiuvante. Gli stipiti batterici e lieviti testati sono stati: UPAR806 has been tested in minimal medium and rich medium, both as an antibiotic and antifungal and as an adjuvant. The bacterial and yeast stems tested were:

- E. coli ATCC25922 - E. coli ATCC25922

- Salmonella Typhimurium ATCC 14028 - Salmonella Typhimurium ATCC 14028

- Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 - Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

- Staphylococcus aureus ATCC25853 - Staphylococcus aureus ATCC25853

- MRSA ATCC43300 - MRSA ATCC43300

- Candida albicans ATCC11006 - Candida albicans ATCC11006

Preparazione dell’inoculum batterico Preparation of the bacterial inoculum

Gli stipiti batterici sono stati inoculati (4-5 colonie morfologicamente simili) in MHB a 37°C e 240 rpm fino al raggiungimento della fase logaritmica di crescita. La sospensione batterica così ottenuta è stata centrifugata a 2000 rpm per 20 minuti a 4°C, il surnatante è stato eliminato e il pellet risospeso in terreno minimo LB 20% o MHB. La sospensione è stata diluita e saggiata spettrofotometricamente (assorbanza 600 nm) fino al raggiungimento di una densità ottica di 0.08-0.13, corrispondente ad una densità cellulare di circa 10<8 >CFU/ml. 100 μl di questa sospensione sono stati inoculati in 9.9 mi di terreno minimo o terreno ricco per ottenere una concentrazione di inoculo batterico di circa 10<6 >CFU/ml. 50 μl di sospensione batterica diluita sono stati aggiunti a tutti i pozzetti della piastra microtiter. The bacterial stems were inoculated (4-5 morphologically similar colonies) in MHB at 37 ° C and 240 rpm until the logarithmic phase of growth was reached. The bacterial suspension thus obtained was centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes at 4 ° C, the supernatant was removed and the pellet resuspended in medium at least 20% LB or MHB. The suspension was diluted and spectrophotometrically tested (absorbance 600 nm) until reaching an optical density of 0.08-0.13, corresponding to a cell density of about 10 <8> CFU / ml. 100 μl of this suspension was inoculated into 9.9 ml of minimal medium or rich medium to obtain a bacterial inoculum concentration of approximately 10 <6> CFU / ml. 50 μl of diluted bacterial suspension was added to all wells of the microtiter plate.

La concentrazione finale di cellule batteriche per pozzetto è stata di 5*10<5 >CFU/ml; UPAR790 è stato saggiato in terreno minimo e in terreno ricco alle concentrazioni di 256-0,5 pg/ml. Per ogni stipite batterico sono stati allestiti 3 esperimenti indipendenti con 3 repliche ciascuna e per ogni replica sono stati effettuati i controlli di crescita e di sterilità. I risultati sono riportati in Tabella 10. The final concentration of bacterial cells per well was 5 * 10 <5> CFU / ml; UPAR790 was tested in minimal medium and in rich medium at concentrations of 256-0.5 pg / ml. For each bacterial stem 3 independent experiments were set up with 3 replicates each and for each replicate growth and sterility controls were performed. The results are reported in Table 10.

Preparazione dell’inoculum fungino Preparation of the fungal inoculum

Gli stipiti fungini sono stati inoculati (4-5 colonie morfologicamente simili) in RPMI o MHB a 37°C e 240 rpm fino al raggiungimento della fase logaritmica di crescita. La sospensione fungina così ottenuta è stata centrifugata a 2000 rpm per 20 minuti a 4°C, il surnatante è stato eliminato e il pellet ri so speso in terreno RPMI o MHB. La sospensione fungina è stata diluita e saggiata otticamente, fino al raggiungimento di una torbidità pari a 0,5 della scala McFarland, corrispondente ad una densità cellulare di circa 10<8 >CFU/ml. 100 μl di questa sospensione sono stati inoculati in 9.9 mi di terreno minimo o terreno ricco per ottenere una concentrazione di inoculo batterico di circa 10<6 >CFU/ml. 50 μl di sospensione fungina diluita sono stati aggiunti a tutti i pozzetti della piastra microtiter. The fungal stems were inoculated (4-5 morphologically similar colonies) in RPMI or MHB at 37 ° C and 240 rpm until the logarithmic phase of growth was reached. The fungal suspension thus obtained was centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes at 4 ° C, the supernatant was removed and the pellet was spent in RPMI or MHB medium. The fungal suspension was diluted and optically tested, until a turbidity of 0.5 on the McFarland scale was reached, corresponding to a cell density of about 10 <8> CFU / ml. 100 μl of this suspension was inoculated into 9.9 ml of minimal medium or rich medium to obtain a bacterial inoculum concentration of approximately 10 <6> CFU / ml. 50 μl of diluted fungal suspension was added to all wells of the microtiter plate.

Preparazione della molecola Preparation of the molecule

UPAR806 è stato saggiato per la sua attività antimicrobica e antifungina intrinseca mediante Minimal Inhibitory Concentration assay. In breve, in una piastra microtiter sono stati preparati 10 pozzetti contenenti 49 μl di terreno minimo LB 20% (in tampone fosfato 10 mM, pH 7) o di Mueller-Hinton broth (MHB) per i batteri e in RPMI o MHB per i lieviti. In provette sterili sono state eseguite diluizioni seriali di UPAR806 in DMSO, a partire dalla concentrazione di 25.6 mg/ml, fino a 0.05 mg/ml e per ogni pozzetto della piastra è stato aggiunto 1 μΐ di molecola opportunamente diluita. UPAR806 was tested for its intrinsic antimicrobial and antifungal activity using the Minimal Inhibitory Concentration assay. Briefly, 10 wells containing 49 μl of minimum 20% LB medium (in 10 mM phosphate buffer, pH 7) or Mueller-Hinton broth (MHB) for bacteria and in RPMI or MHB for bacteria were prepared in a microtiter plate. yeasts. In sterile test tubes, serial dilutions of UPAR806 in DMSO were performed, starting from the concentration of 25.6 mg / ml, up to 0.05 mg / ml and 1 μΐ of suitably diluted molecule was added to each well of the plate.

L’inibizione è stata valutata mediante lettura della densità ottica dei pozzetti della prova. Le densità ottiche dei pozzetti alle diverse concentrazioni sono state aggiustate sottraendo la densità ottica della molecola alle diverse concentrazioni e nei due diversi medium. I risultati sono riportati in Tabella 10. The inhibition was assessed by reading the optical density of the test wells. The optical densities of the wells at the different concentrations were adjusted by subtracting the optical density of the molecule at the different concentrations and in the two different media. The results are reported in Table 10.

Tabella 10 : Inibizione della crescita dei diversi stipiti batterìa. testati, a contatto con UPAR806, valutata mediante lettura delle densità ottiche Table 10: Inhibition of the growth of the different bacterial stems. tested, in contact with UPAR806, evaluated by reading the optical densities

I dati ottenuti hanno dimostrato che UPAR806 è efficace da solo neirinibire la crescita e/o uccidere sia batteri Gram negativi che positivi UPAR806 è generalmente attivo in entrambi i terreni testati. Inoltre, UPAR806 si è dimostrato un valido antifungino nei confronti di Candida albicans, attivo sia in terreno RPMI che in terreno MHB. The data obtained showed that UPAR806 alone is effective in inhibiting growth and / or killing both Gram negative and positive bacteria UPAR806 is generally active in both tested media. Furthermore, UPAR806 proved to be a valid antifungal against Candida albicans, active both in RPMI medium and in MHB medium.

Attività di UPAR806 in associazione con antibiotici convenzionali UPAR806 activity in association with conventional antibiotics

Nell’ottica della formulazione di una nuova associazione ad attività antimicrobica, si è deciso di indagare l’attività di UPAR806 utilizzato in associazione ad antibiotici convenzionali con la funzione di adiuvante. Sono stati saggiati diversi antibiotici associati a UPAR806 di cui sono state eseguite checkerboard assays per valutare l’attività in combinazione con UPAR806. Gli stipiti batterici testati sono stati: With a view to formulating a new association with antimicrobial activity, it was decided to investigate the activity of UPAR806 used in association with conventional antibiotics with the function of adjuvant. Several antibiotics associated with UPAR806 were tested and checkerboard assays were performed to evaluate the activity in combination with UPAR806. The bacterial jambs tested were:

- Escherichia coli ATCC258855 - Escherichia coli ATCC258855

- Salmonella Typhimurium ATCC 14028 - Salmonella Typhimurium ATCC 14028

- Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 - Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

- Staphylococcus aureus ATCC25853 - Staphylococcus aureus ATCC25853

- Staphylococcus pseudintermedius ATCC21284 - MRSA ATCC43300 - Staphylococcus pseudintermedius ATCC21284 - MRSA ATCC43300

Attività di UPAR806 in associazione con colistina UPAR806 activity in association with colistin

Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR806 e colistina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 11). It was decided to test the association between UPAR806 and colistin. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 11).

L’attività della molecola viene considerata sinergica con un indice < 0.5, additava con indice compreso tra 0.5 e 1, indifferente con indice compreso tra 1 e 4, antagonistica nel caso l’indice risulti >4. The activity of the molecule is considered synergistic with an index <0.5, pointed with an index between 0.5 and 1, indifferent with an index between 1 and 4, antagonistic if the index is> 4.

Tabella 1: Attività di associazioni di UPAR806 e colistina a differenti concentrazioni. Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR806 testate, le concentrazioni di MIC di colistina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 1: Association activities of UPAR806 and colistin at different concentrations. The concentrations of UPAR806 tested, the MIC concentrations of colistin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated for the different bacteria and media tested.

I risultati dimostrano una estesa attività sinergica con questo antibiotico convenzionale, sia in terreno minimo {LB al 20% in tampone fosfato) che in terreno ricco (MHB), in presenza di cisterna preformata nel medium, nei confronti di tutti gli stipiti batterici testati. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di antagonismo. The results demonstrate an extensive synergistic activity with this conventional antibiotic, both in minimum medium (20% LB in phosphate buffer) and in rich medium (MHB), in the presence of a pre-formed tank in the medium, against all the bacterial stems tested. Furthermore, no antagonistic activity was detected.

Attività di UPAR806 in associazione con amoxicillina Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR806 e amoxicillina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 12). UPAR806 activity in association with amoxicillin It was decided to test the association between UPAR806 and amoxicillin. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 12).

Tabella 12: Attività di associazioni di UPAR806 e amoxicillina a differenti concentrazioni. Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAJR806 testate, le concentrazioni di MIC di amoxicillina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 12: Association activities of UPAR806 and amoxicillin at different concentrations. The UPAJR806 concentrations tested, the MIC concentrations of amoxicillin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated for the different bacteria and media tested.

I risultati dimostrano la presenza di estesa attività sinergica con questo antibiotico convenzionale, sia in terreno minimo (LB al 20% in tampone fosfato) che in terreno ricco (MHB), in presenza di cisteina preformata nel medium, nei confronti di stipiti batterici sia Gram positivi che negativi. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di antagonismo. The results demonstrate the presence of extensive synergistic activity with this conventional antibiotic, both in minimal medium (20% LB in phosphate buffer) and in rich medium (MHB), in the presence of preformed cysteine in the medium, against bacterial stems and Gram positive rather than negative. Furthermore, no antagonistic activity was detected.

Attività di UPAR806 in associazione con gentamicìna E’ stata testata l’associazione tra UPAR806 e gentamicina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 13). UPAR806 activity in association with gentamicìna The association between UPAR806 and gentamicin was tested. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 13).

Tabella 2: Attività di associazioni di UPAR806 e gentamicina a differenti concentrazioni. Sono indicate , per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR806 testate, le concentrazioni di MIC di gentamicina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 2: Association activities of UPAR806 and gentamicin at different concentrations. The concentrations of UPAR806 tested, the MIC concentrations of gentamicin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated for the different bacteria and media tested.

I risultati dimostrano la presenza di un’estesa attività sinergica nei confronti di tutti i batteri testati, ad eccezione di S. Typhimurium in terreno minimo e E. coli in terreno ricco. Inoltre, non si è rilevata alcuna attività di antagonismo. The results demonstrate the presence of extensive synergistic activity against all the bacteria tested, with the exception of S. Typhimurium in minimal medium and E. coli in rich medium. Furthermore, no antagonistic activity was detected.

Attività di UPAR806 in associazione con ciprofloxacina Si è deciso di testare l’associazione tra UPAR806 e ciprofloxacina. I risultati delle checkerboard assays sono sotto riportati (Tabella 14). UPAR806 activity in association with ciprofloxacin It was decided to test the association between UPAR806 and ciprofloxacin. The results of the checkerboard assays are shown below (Table 14).

Tabella 14: Attività di associazioni di UPAR806 e ciprofloxacina a differenti concentrazioni. Sono indicate, per i diversi batteri e terreni testati, le concentrazioni di UPAR806 testate, le concentrazioni di MIC di ciprofloxacina e i valori di FIC index ottenuti comparando le MIC delle due molecole singolarmente e associate. Table 14: Association activities of UPAR806 and ciprofloxacin at different concentrations. The concentrations of UPAR806 tested, the MIC concentrations of ciprofloxacin and the FIC index values obtained by comparing the MICs of the two molecules individually and associated are indicated for the different bacteria and media tested.

I risultati dimostrano la presenza di attività sinergica sia in The results demonstrate the presence of synergistic activity in both

terreno minimo LB al 20% in tampone fosfato sia in terreno ricco per tutti minimum LB medium at 20% in phosphate buffer and in rich soil for all

gli stipiti testati, ad eccezione di S. TYphimurium in terreno ricco per la the jambs tested, with the exception of S. TYphimurium in rich soil for the

quale l’associazione ha mostrato un effetto additivo. Inoltre, non si è which the association has shown an additive effect. Furthermore, it is not

rilevata alcuna attività di antagonismo. no antagonistic activity was detected.

Claims

CLAIMS 1. Compound of formula (I):

or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in which: Ri is a Cr4 alkoxy group; R2 is selected from the group consisting of piperazine and pyrimidine, optionally substituted; R3 is a linear or branched C1-4 alkyl group.

Compound according to claim 1, wherein R1 is an ethoxy group.

Compound according to claims 1-2, wherein R2 is substituted with a group selected from C1-4 alkyl, linear or branched, halogen, hydroxy, amino.

4. Compound according to claims 1-3, wherein R2 is substituted with a group selected from methyl and -NH2.

5. Compound according to claims 1-4, wherein R2 is a group selected from 4-methyl piperazin-1-yl and 2-amino pyrimidin-5-yl.

6. Compound according to claims 1-5, wherein R3 is a methyl group.

7. Compound according to claims 1-6, selected from the structures (IA) and (IB):

8. Combination of a compound according to claims 1-7 with one or more antibiotic drugs.

Combination according to claim 8, wherein the antibiotic drug is selected from the group consisting of colistin, amoxacillin, ampicillin, gentamicin, ciprofloxacin and their derivatives.

10. Compound or combination according to claims 1-9, in association with polymyxin B.

Compound or combination as described in claims 1-10, for use in therapy.

Compound or combination as described in claims 1-11, for use in the treatment of bacterial and / or fungal infections.

13. Compound for use according to claim 12, where the infection is caused by Gram positive bacteria, Gram negative bacteria or fungi.

14. Compound for use according to claim 13, where bacterial infection is caused by one or more of: Escherichia coli, Salmonella Typhymurium, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, MRSA and Candida albicane.