IT201900002473A1 - Dispositivo e metodo elettroanalitico - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
“Dispositivo e metodo elettroanalitico”
DESCRIZIONE
Forma oggetto della presente invenzione un dispositivo elettroanalitico cartaceo per la rilevazione di marcatori nei fluidi corporei.
In un'ulteriore realizzazione, viene rivendicato un metodo per valutare i livelli dei marcatori nei fluidi corporei da utilizzare come dispositivo per il punto di cura.
In una forma di realizzazione preferita, almeno uno di questi marcatori è il glutatione.
Stato dell'arte
Il glutatione, un tripeptide formato da cisteina, acido glutammico e glicina, è il biotiolo antiossidante più abbondante in grado di regolare l'omeostasi redox intracellulare. La sua forma ridotta è tra gli scudi antiossidanti più sfruttati per contrastare i radicali liberi e le tossine.
Il livello di glutatione nelle cellule dei mammiferi è molto significativo: livelli anomali di glutatione nel sangue sono correlati a diverse malattie tra cui l'Alzheimer, il Parkinson, il diabete e vari tipi di cancro.
Il livello di glutatione nel siero è molto basso (μM), mentre la sua più alta concentrazione è negli eritrociti (livello mM). Il glutatione può essere rilevato in seguito alla sua ossidazione diretta sulla superficie dell'elettrodo applicando un alto sovrapotenziale, ad esempio 0,8-1 V. Tuttavia, la rilevazione diretta consente una scarsa specificità perché le matrici reali sono ricche di specie ossidabili a quel potenziale operativo. Pertanto, è stata coinvolta una reazione di scambio tiolo-disolfuro, dove il processo comporta l'attacco di un tiolo (RSH) al disolfuro (R1SSR1), rompendo il legame S-S, seguito dalla produzione di un disolfuro misto (RSSR1) e di un tiolo rilevabile (R1SH) (Eq.1):
RSH R1SSR1 ↔ RSSR1 R1SH (1).
Lo sviluppo di metodi per il punto di cura sarebbe molto utile per superare alcune limitazioni spesso legate a procedure lunghe e a lavoratori specializzati. In chimica clinica, il glutatione è stato misurato principalmente mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), cromatografia liquida - spettrometria di massa (LC-MS), cromatografia liquida - spettrometria di massa in tandem (LC-MS/MS) e gascromatografia - spettrometria di massa (GC-MS). Sebbene queste tecniche siano caratterizzate da una soddisfacente specificità e sensibilità nei fluidi biologici, sono fortemente dipendenti dal laboratorio. Inoltre, i metodi cromatografici di solito richiedono la derivatizzazione del campione.
In alternativa, sono stati proposti alcuni approcci "più leggeri" per la rilevazione del glutatione, tra cui elettrochemiluminescenza, fluorescenza, colorimetria, elettroanalisi e diffusione Raman. Tuttavia, questi metodi sono caratterizzati da alcune limitazioni: sorgenti esterne (fluorescenza), sensibilità (colorimetria), set-up sperimentale (elettrochemiluminescenza, Raman scattering).
D.M. Cate et al. 2013, in Simple, distance-based measurement for paper analytical devices, Lab Chip 13; 2397-2404 descrivono un dispositivo cartaceo distance-based per la misurazione del glutatione (e di altre specie). L'approccio si basa sull'aggregazione di nanoparticelle e l'analisi colorimetrica, ma i campioni colorati e torbidi rappresentano il limite principale di tale metodo.
La carta è stata applicata con successo per lo sviluppo di diverse piattaforme elettroanalitiche come per la rilevazione di ioni fosfato nelle acque superficiali, la rilevazione di ioni cloruro nei fluidi corporei, e anche per la rilevazione di agenti nervosi nelle acque di fiume.
S. Cinti, et al. 2018, in Low-cost e reagent-free paper-based device to detect chloride ions in serum and sweat, Talanta 179; 186-192 rivelano l'uso della carta da ufficio per rilevare lo zinco nel siero e nel sudore.
Qui viene descritto per la prima volta uno strumento completamente privo di reagenti per l'analisi minimamente invasiva in piccole quantità di campione (5 µl).
Descrizione delle figure
Figura 1: A) Rappresentazione schematica del meccanismo di rilevamento del dispositivo cartaceo. B) Un dispositivo cartaceo secondo una prima realizzazione, vista dall'alto. C) Un dispositivo cartaceo secondo una seconda forma di realizzazione, vista dall'alto. D) Un dispositivo cartaceo secondo una terza forma di realizzazione, vista dal basso.
Figura 2: A) Voltammetria ciclica eseguita in assenza (linea grigia) e in presenza (linea nera) di 10 mM di cisteamina preparata in tampone fosfato 50 mM (pH 7.4) contenente 100 mM di KCl; B) Ottimizzazione del potenziale di lavoro, 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 V. Condizioni sperimentali: pH = 7,4, [cisteamina] = 10 mM; C) Ottimizzazione del pH, da 7,4 a 10 nel tampone Britton Robinson. Condizioni sperimentali: E = 0,3 V, [cisteamina] = 10 mM; D) Ottimizzazione della concentrazione di cistamina da 0,01 a 1 M utilizzando 5 mM di glutatione. Condizioni sperimentali: E = 0,3 V; pH = 9. Tutte le misurazioni sono state effettuate pipettando una goccia di 5 μl di acqua distillata contenente l'analita sul retro della striscia a base di carta. Ogni barra è il risultato di tre diverse strisce testate in modalità cronoamperometrica.
Figura 3: rilevazione cronoamperometrica registrata in assenza (a, linea grigia) e in presenza di (b) 0,25, (c) 0,5, (d) 1, (e) 2,5, (f) 5 e (g) 10 mM di glutatione. Inserto a destra: Curva di taratura (n=3). Tutte le SPE testate sono state precaricate durante il processo di produzione con 5 µl di cistamina 0,05 M disciolta in 50 mM di tampone Britton Robinson (pH 9). Il potenziale applicato era di 0,3 V e le correnti utilizzate per costruire la curva di calibrazione sono state registrate dopo 100 s.
Figura 4: Studio di stabilità allo stoccaggio, mantenendo a temperatura ambiente i sensori cartacei caricati con tutti i reagenti necessari per la misura.
Figura 5: Istogrammi relativi alla risposta della striscia cartacea in presenza di (linea grigia) 1 mM di glutatione, (linea verde) 50 mM di acido ascorbico, (blu cielo) 50 mM di acido urico, e (arancione) 50 mM di acetaminofene. Gli istogrammi sono il risultato di tre diverse strisce, e le condizioni sperimentali sono uguali a quelle riportate nella didascalia della Figura 3. Inserto: curve cronoamperometriche.
Figura 6: rilevazione cronoamperometrica registrata nel sangue dopo il trattamento selezionato in assenza (a, linea nera) e in presenza di (b, linea rossa) 1, (c, linea verde) 2, e (d, linea blu) 3 mM glutatione. Inserto a destra: Curva di taratura (n=3). Le condizioni sperimentali sono uguali a quelle riportate nella didascalia della figura 3.
Descrizione dettagliata
In una prima realizzazione, il dispositivo cartaceo è quello rappresentato in figura 1B. Tale dispositivo (1) comprende una striscia di carta (2). Su tale striscia di carta, l'area idrofoba (3) è definita intorno all'area di prova idrofila (4). Di preferenza, detta zona idrofobica è un'area stampata in cera e vulcanizzata in forno. Su tale striscia di carta, gli elettrodi sono serigrafati, in cui tali elettrodi comprendono almeno un elettrodo di riferimento (5), preferibilmente un elettrodo Ag/AgCl, e almeno un inchiostro di grafite modificato con polvere Prussian Blu/Carbon Black nella gamma 0,5 - 10% (p/p), preferibilmente 2 - 8%, preferibilmente 5% (grafite CB/PB) elettrodo (6). In questa realizzazione, un nanocomposito CB/PB viene disperso nella % indicata nell'inchiostro e viene applicato sull'elettrodo di lavoro durante il processo di produzione.
In una forma di realizzazione, la carta da filtro è carta da filtro, preferibilmente carta da filtro sottile con un peso base compreso tra 60 -85 g/m2, preferibilmente 67 g/m2. In alternativa, tale carta è resa più resistente mediante un multistrato. Inoltre, possono essere utilizzate carte di diversa porosità, oppure substrati di carta selezionati dal gruppo delle carte cromatografiche, substrati preferiti ottenuti da Whatman o Cordenons.
In un'ulteriore forma di realizzazione, il CB/PB viene disperso nell'inchiostro e la dispersione viene applicata sull'elettrodo di lavoro dopo la fabbricazione, dove tale dispersione viene aggiunta in una quantità da 1 a 20 μl; preferibilmente da 2 a 10 μl; preferibilmente da 4 a 8 μl; goccia a goccia 2 µl passo dopo passo.
Sull'area di prova idrofila (4) vengono precaricati uno o più reagenti.
In una forma di realizzazione, in cui detto dispositivo su carta è per la valutazione del glutatione, detti reagenti comprendono cistamina da 0,01 a 2 M, preferibilmente da 0,01 a 1 M, ancora più preferibilmente circa 0,05 M, preferibilmente in una soluzione tampone pH = 9.
In una forma di realizzazione preferita, per precaricare detto dispositivo cartaceo, i reagenti vengono fatti cadere su detta area di prova idrofila in un volume compreso tra 1 e 20 µl, preferibilmente 3-10 µl, preferibilmente 5 µl. Per la valutazione del glutatione si utilizza una soluzione elettrolitica costituita da un sistema tampone, preferibilmente fosfato, borato, acetato, acetato o una miscela dei medesimi, preferibilmente un tampone in grado di mantenere il valore di pH in un intervallo compreso tra 7 e 10.
L'area cerata permette di mantenere la soluzione nell'area idrofilica/di prova. Nella valutazione del glutatione, la cisteamina, prodotta nell'area di prova, raggiunge l'elettrodo di lavoro.
In una forma di realizzazione preferita, detta striscia di carta ha una lunghezza compresa tra 20 e 50 mm e una larghezza compresa tra 6-30 mm, preferibilmente 10 -15 mm.
Il campione viene aggiunto sul retro dell'area di prova per superare l'effetto matrice durante la rilevazione del glutatione nel sangue, sfruttando le proprietà filtranti della carta.
In una seconda forma di realizzazione, il dispositivo a base di carta comprende un dispositivo elettroanalitico (1) secondo la prima incarnazione, in cui detta striscia di carta (2) comprende o è collegata ad un supporto (7) su cui è presente un canale (8) in cui i fluidi corporei devono passare prima dell'arrivo nell'area di prova idrofila (4). In un'incarnazione, detto supporto (7) è una striscia di carta e detto canale (8) è un'area idrofila definita da un'area cerata sulla stessa striscia di carta. In un'ulteriore incarnazione, detto supporto (7), preferibilmente un supporto rigido, è un dispositivo al quale è collegato il dispositivo-carta e il canale (8) è ricavato nello stesso.
In un'incarnazione, raffigurata in figura 1C, detto canale (8) si trova sullo stesso strato di detto dispositivo cartaceo, ed il sistema è un sistema microfluidico orizzontale. In un'ulteriore realizzazione, rappresentata in figura 1D, detto canale (8) si trova su uno strato diverso rispetto a quello del dispositivo cartaceo e il sistema è un sistema microfluidico verticale multistrato. Sempre in un'ulteriore forma di realizzazione, detto dispositivo cartaceo include entrambe le microfluidiche, quella orizzontale e quella verticale.
In una forma di realizzazione preferita, il canale (8) è riempito con una o più sostanze enzimatiche, ad esempio, enzimi della superfamiglia della tioredoxina, preferibilmente tioredoxina glutatione reduttasi per consentire a questi enzimi di agire sui fluidi corporei prima dell’arrivo nell'area di prova idrofila, in particolare al reagente cistammina.
In un'altra forma di realizzazione, il canale (8) comprende almeno un sistema meccanico, ad esempio uno o più filtri del sangue, e/o un sistema chimico, ad esempio un tensioattivo, per consentire la lisi delle cellule ematiche in situ prima che i fluidi corporei raggiungano l'area idrofila.
Il dispositivo secondo la presente invenzione rileva l'analita nei fluidi corporei in modo reagent-less, aggiungendo una goccia di un campione di fluido corporeo su tale dispositivo e registrando poi i dati.
Il volume di tale campione è preferibilmente compreso tra 1 - 20 µl, preferibilmente 3 - 10 µl, preferibilmente 5 µl.
In una forma di realizzazione preferita, detto fluido corporeo è sangue, ancor più preferibilmente sangue lisato.
Tale registrazione viene eseguita circa 20 secondi dopo aver messo il campione sul dispositivo, preferibilmente per mezzo di un potenziostato. Il dispositivo cartaceo secondo l'invenzione dichiarata è adatto per analisi minimamente invasive in piccole quantità di campione (5 µl). Il dispositivo consente un'analisi "senza reagenti", in cui agli utenti finali viene richiesto di depositare solo una piccola quantità di campione nell'area di prova dove tutti i reagenti sono stati precedentemente caricati durante la produzione. Il dispositivo, secondo l'invenzione dichiarata, è facile da usare, a basso costo, portatile e disponibile per i test nei punti di cura.
Sezione Sperimentale
Apparecchiature e reagenti
Cloruro di potassio, ferricianuro di potassio, cloruro ferrico, acido borico, acido acetico glaciale, acido ortofosforico 85%, diidrogeno fosfato di potassio, glutatione, cistamina e cisteamina sono stati acquistati da Sigma Aldrich. Tutte le soluzioni sono state preparate in acqua distillata.
Le misurazioni di cronoamperometria sono state effettuate utilizzando uno strumento portatile EmStat3 (PalmSens, Paesi Bassi) collegato a un computer portatile.
L'emolisi del sangue è stata effettuata con bagno ad ultrasuoni (LBS2, Falc).
Realizzazione di una striscia a base di carta
Il disegno dell'elettrodo serigrafato su carta secondo una forma di realizzazione è riportato nella Figura 1B.
Per realizzare il sensore cartaceo per la rilevazione del glutatione, sono state seguite quattro fasi (i, ii, iii, iii, iv):
i) L'area di test è stata progettata con un software di disegno (Adobe Illustrator) e stampata su carta da filtro (67 g/m2, Cordenons, Italia) utilizzando una stampante a cera per ufficio (ColorQube 8580, Xerox, USA).
ii) La carta cerata è stata stagionata in forno a 100 °C per 2 minuti, per creare specifiche aree idrofobiche intorno al semicerchio idrofilo.
iii) Dopo la definizione dell'area idrofila, gli elettrodi sono stati serigrafati manualmente con una spatola polimerica e maschere. Per l'elettrodo di riferimento è stato utilizzato l'inchiostro Ag/AgCl (Electrodag 6038 SS, Acheson, Italia), mentre l'inchiostro di grafite (Electrodag 421, Acheson, Italia) modificato al 5% (w/w) con polvere Prussian Blu/Carbon Black per l’elettrodo di lavoro e il controelettrodo.20 minuti in forno a 60°C sono stati sufficienti per polimerizzare gli inchiostri.
iv) 5 µl della soluzione di lavoro contenente cistamina disciolta nel tampone Britton Robinson sono stati pipettati nell'area di prova idrofila. La presenza di un'area cerata permette di vincolare la soluzione all'area elettrochimica delimitata della cella elettrochimica.
Rilevamento del glutatione
L'area del test idrofilo è stata bagnata con 5 µl di campione (acqua distillata o sangue sonicato) utilizzando una micropipetta. 20 secondi rappresentano il tempo di ritardo tra l'aggiunta del campione e l'inizio della misurazione. Come riportato in Figura 1A, il campione è stato aggiunto sul retro dell'area di prova per sciogliere la cistamina tamponata precaricata durante le fasi di produzione. Infine, la corrente risultante (a seconda del livello di glutatione) è stata registrata dopo 100 s utilizzando un potenziostato portatile interfacciato ad un computer portatile.
Come riportato in Figura 1A, tutti i reagenti necessari per la rilevazione di glutatione (cioè cistamina 0.05 M in soluzione tampone Britton Robinson pH = 9) sono precaricati nell'area di prova al fine di realizzare un dispositivo reagent-less. Dopo la fase di essiccazione, il campione è stato aggiunto sul retro dell'area di prova per superare l'effetto matrice durante la rilevazione del glutatione nel sangue, sfruttando le proprietà filtranti della carta. Dopo la reazione di scambio tiolo-disolfuro, la corrente risultante (a seconda del livello di glutatione) è stata registrata utilizzando un potenziostato portatile interfacciato ad un computer portatile. In dettaglio, i valori di corrente sono stati campionati a 100 s per realizzare le curve di adattamento.
Esempio 1: rilevazione del glutatione mediante reazione di scambio tiolodisolfuro di tiolo-disolfuro
La rilevazione elettrochimica dei tioli è spesso limitata dall'elevato sovrapotenziale necessario per far sì che la reazione avvenga. Tipicamente, un potenziale applicato vicino a 1 V è sufficiente per ossidare molti composti sulla superficie dell'elettrodo, diminuendo la specificità del metodo. Per superare questo problema, gli autori hanno sorprendentemente scoperto che, sfruttando un nanocomposito prodotto dalla combinazione di Prussian Blue e carbon black, la valutazione del sottoprodotto cisteamina (a seguito della reazione tiolo-disolfuro tra glutatione e cistamina) permette la rilevazione del glutatione in modo molto specifico.
In breve, la cisteamina prodotta a seguito della reazione tiolo-disolfuro tra glutatione e cistamina viene ossidata da B(PB) prussiano, che viene convertito nella sua forma ridotta, bianco prussiano (PW). Il PW è quindi ossidato di nuovo a PB dall'elettrodo serigrafato (SPE), rendendolo in grado di ossidare ulteriori molecole di cisteamina, di conseguenza le seguenti reazioni:
GSH cistamina (RSSR) ⇌ cisteamina (RSH) (GSSR)
PB RSH ⇌ PW RSSR
PW ⇌ PB e-.
Come conseguenza dell'ossidazione della cistamina, per gli studi di voltammetria ciclica, la coppia redox PB/PW rivela un miglioramento del picco attuale relativo all'ossidazione da PW a PB, accoppiato ad una diminuzione del picco relativo alla reazione opposta, che converte PB in PW, come mostrato in Figura 2A.
In una forma di realizzazione preferita, il potenziale applicato durante le misurazioni cronoamperometriche è compreso in un intervallo compreso tra 0.1 e 0.4 V, preferibilmente 0.3 V.
In una forma di realizzazione preferita, il pH è compreso tra 7 e 10, preferibilmente tra 7,4 - 9,5, preferibilmente 9.
In una forma di realizzazione preferita, l'uso di carta porosa impregnata con tutti i reagenti necessari per un determinato test, fornisce un grande vantaggio che si basa sull'aggiunta di pochi microlitri del campione, fornendo uno strumento analitico "senza reagenti".
In una forma di realizzazione preferita, la concentrazione di cistamina adsorbita sull'area di prova della striscia su carta è nell'intervallo 0,01 - 2 M, preferibilmente da 0,01 a 1 M, preferibilmente 0,05 M. Come riportato in Figura 2D, una concentrazione di cistamina 0,05 M è risultata efficace con la più bassa concentrazione, ottenendo il miglior compromesso in termini di sensibilità e ripetibilità.
L'area di prova sulla striscia a base di carta è stata bagnata con 5 µl di soluzioni di glutatione preparate in acqua distillata. Il glutatione è stato rilevato fino a 10 mM come riportato in Figura 3.
I segnali registrati sono aumentati linearmente con l'aumento della concentrazione di glutatione. La correlazione tra la corrente anodica e la concentrazione di glutatione è stata descritta dalla seguente equazione: y = (0,04 ± 0,02) (0,102 ± 0,005) x (R2 = 0,956) dove y indica la corrente in μA e x indica la concentrazione di glutatione in mM. L'intervallo lineare (R2 = 0,956) viene osservato nell'intervallo fino a 10 mM, e il limite di rilevazione (LOD), calcolato come rapporto segnale/rumore pari a (S/N=3), risulta pari a 60 μM. La deviazione standard relativa (RSD) calcolata per tre misure di 1 mM di glutatione è risultata pari al 10%. L'ampia linearità della piattaforma (nell'intervallo millimolare, cioè 1-3) rappresenta un valore aggiunto considerando il livello fisiologico nel sangue.
Esempio 2: Valutazione dell'interferenza
La presenza nel sangue di composti facilmente ossidabili come l'acido ascorbico, l'acido urico e l'acetaminofene, potrebbe essere coerente con falsi segnali positivi, perché queste specie possono essere ossidate sulla superficie dell'elettrodo oltre al glutatione. La striscia su carta è stata testata in presenza di queste specie interferenti.
Come mostrato in Figura 5, la presenza di queste specie interferenti non influisce significativamente sulla rilevazione del glutatione. Le concentrazioni considerate per questo studio sono state selezionate tenendo conto dei loro livelli fisiologici nel sangue a livello μM.
Oltre a queste specie interferenti, va notato che la reazione tiolo-disolfuro potrebbe essere sensibile alla presenza di altri tioli, cioè la cisteina: la reazione coinvolta non è specifica per il glutatione, ma interessa tutti i tioli. Tuttavia, come ampiamente riportato in letteratura, la concentrazione di eritrociti di altri tioli è inferiore di circa l'1% rispetto alla quantità di glutatione, evitando la sovrastima del contenuto di glutatione nell'eritrocita. Ciò significa che, in base alle prestazioni analitiche del metodo attuale (LOD di 60 μM), i tioli non glutatione non sono in grado di influenzare il segnale che deriva dal glutatione nel range mM.
Esempio 3: rilevamento di glutatione nel sangue
Il dispositivo cartaceo è stato applicato per la rilevazione del glutatione in campioni di sangue. Il sangue è stato trattato come segue: diluizione con acqua distillata (rapporto 1:2 v/v) o, in alternativa, sonicazione (59 kHz per 10 minuti) seguita da diluizione con acqua distillata (rapporto 1:2 v/v).
I valori di corrente osservati erano rispettivamente 110 nA (RSD%=30) e 145 nA (RSD%=15). Questi risultati dimostrano che la fase di sonicazione migliora la ripetibilità e il rilascio di glutatione da parte degli eritrociti, pertanto, il trattamento che comprende la sonicazione è stato selezionato come quello preferito.
Successivamente, il sangue è stato aggiunto con diverse quantità di glutatione, dando la concentrazione finale nell'intervallo 1-3 mM. Come riportato in Figura 6, sono stati analizzati tre livelli di glutatione aggiunti nel sangue ed è stata ottenuta una buona correlazione, dimostrando l'idoneità della striscia cartacea a rilevare il glutatione in una matrice complessa come il sangue.
La correlazione è descritta dalla seguente equazione: y = (0,19 ± 0,02) (0,119 ± 0,009)x, (R2 = 0,947), e si ottiene una buona sensibilità di 0,119 µA/mM. La ripetibilità associata alla misurazione del glutatione nel sangue è stata calcolata con un RSD pari al 10% per il glutatione 1 mM. Abbiamo osservato un importante vantaggio legato all'uso della carta come substrato di fabbricazione: la porosità della carta da filtro è molto efficace nel bloccare le impurità grossolane presenti in queste matrici complesse, riducendo così il fouling superficiale dell'elettrodo. L'accuratezza del metodo è stata valutata secondo le indicazioni riportate nella 2002/657/CE in merito alle prestazioni del metodo analitico e all'interpretazione dei risultati, mediante l'aggiunta di sangue con concentrazione nota di glutatione pari a 2 e 3 mM. I recuperi ottenuti sono stati pari a 90 ± 15% e 100 ± 16%, rispettivamente per 2 e 3 mM di glutatione (n=3). I risultati ottenuti in termini di veridicità e riproducibilità (RDS% = 10% sia nel tampone che nel sangue, calcolati utilizzando il livello di glutatione a 1 mM), hanno dimostrato l'idoneità del sensore sviluppato su carta per la rilevazione del glutatione nel sangue. Rispetto ai sensori elettrochimici sviluppati in letteratura, questo sensore è l'unico in grado di rilevare il glutatione a livello fisiologico senza ulteriori aggiunte di reagenti durante la misurazione, ma solo aggiungendo una goccia di campione diluito e sonicato sulla striscia di carta.
Stabilità di conservazione
Al fine di valutare l'applicabilità del sensore sviluppato, è stato effettuato uno studio di stabilità testando il sensore verso il glutatione entro 1 mese. In particolare, i sensori sono stati precaricati con tutti i reagenti necessari per la rilevazione del glutatione e conservati in condizioni ambientali. I sensori precaricati sono stati testati utilizzando una soluzione di glutatione 3 M a t0 e dopo 7, 21 e 30 giorni. I valori ottenuti sono riportati in Figura 4, che sono i risultati di misurazioni triplicate per ogni volta, dimostrando la preziosa stabilità del sensore a temperatura ambiente per almeno 1 mese.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo elettroanalitico su carta per la rilevazione dei marcatori nei fluidi corporei, detto dispositivo (1) comprendente una striscia di carta (2) sulla quale l'area idrofobica (3) è definita intorno all'area di prova idrofila (4), detta area di prova idrofila comprendente almeno un reagente precaricato e dove gli elettrodi (5, 6) sono serigrafati.
- 2. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui tali marcatori comprendono almeno il glutatione e detti elettrodi comprendono almeno un elettrodo di riferimento (5), preferibilmente un elettrodo Ag/AgCl, e almeno un elettrodo (grafite CB/PB) (6) a inchiostro di grafite modificato con polvere Prussian Blu/Carbon Black nella gamma 0,5 - 10% (p/p), preferibilmente 2 - 8%, preferibilmente 5%.
- 3. Il dispositivo di cui alla rivendicazione 1 o 2, in cui tale carta è carta da filtro, preferibilmente carta da filtro sottile con un peso base compreso tra 60 - 85 g/m2, preferibilmente 67 g/m2.
- 4. Il dispositivo, secondo una qualsiasi delle affermazioni 1-3, in cui almeno un reagente è la cistamina da 0,01 a 2 M, preferibilmente da 0,01 a 1 M, ancora più preferibilmente circa 0,05 M, preferibilmente in una soluzione tampone pH=9.
- 5. Il dispositivo, secondo una qualsiasi delle affermazioni 1-4, in cui almeno un reagente è precaricato in un volume compreso tra 1 e 20 µl, preferibilmente 3-10 µl, preferibilmente 5 µl.
- 6. Il dispositivo, secondo una delle affermazioni 1-5, in cui detta striscia di carta (2) comprende o è collegata ad un supporto (7) su cui è presente un canale (8) in cui i fluidi corporei devono passare prima dell'arrivo nell'area di prova idrofila (4 ).
- 7. Il dispositivo secondo la rivendicazione 6, in cui detto canale (8) è riempito con una o più sostanze enzimatiche.
- 8. Il dispositivo secondo la rivendicazione 7, in cui tali sostanze enzimatiche comprendono almeno la tioredoxina glutatione reduttasi.
- 9. Un metodo per rilevare almeno un marcatore nei fluidi corporei che comprende: - mettere a disposizione un dispositivo elettroanalitico su base cartacea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8; - aggiungere a detto dispositivo 1 - 20 µl, preferibilmente 3 - 10 µl, preferibilmente 5 µl di detti fluidi corporei; - Permettere ai reagenti di reagire; - Rilevamento tramite un potenziostato.
- 10. Un metodo secondo la rivendicazione 9, in cui almeno un marcatore è il glutatione.
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