IT201900000821A1 - Apparato per la quantificazione di componenti biologiche disperse in un fluido. - Google Patents

Description

“APPARATO PER LA QUANTIFICAZIONE DI COMPONENTI BIOLOGICHE DISPERSE IN UN FLUIDO”

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un apparato per la quantificazione di componenti biologiche, cellulari e non cellulari, disperse in un campione di fluidi biologici (sangue, urine, saliva, sudore etc.) oppure in un campione di fluidi estratti da solidi biologici (e.g. feci). Tale quantificazione avviene mediante la concentrazione e separazione magnetoforetica delle componenti di interesse dal resto del campione e la rivelazione impedenziometrica della quantità di tali componenti. Ai fini della presente descrizione, per “componenti biologiche cellulari”, o semplicemente “componenti cellulari” si intendono i corpuscoli biologici di dimensione maggiore o comparabile a quella delle cellule, come ad esempio i corpuscoli ematici (e.g. globuli rossi, globuli bianchi e piastrine), i corpuscoli contenuti nelle urine, agenti patogeni come batteri e le uova di alcuni parassiti. Per “componenti biologiche non cellulari”, o semplicemente “componenti non cellulari”, si intendono quei corpuscoli di origine biologica che sono dotati di un volume inferiore a quello delle cellule, ma maggiore di quello delle singole molecole. Tali componenti non cellulari, possono essere, ad esempio, i cristalli di alcune sostanze che si sviluppano in condizioni patologiche particolari, quali, ad esempio, i cristalli di emozoina prodotti dal plasmodio della malaria entro gli eritrociti infetti.

In generale, l’apparato della presente invenzione è finalizzato alla quantificazione di tutte quelle componenti biologiche disperse in un fluido che presentano proprietà magnetiche diverse rispetto al mezzo in cui sono sospese. Ai fini della presente descrizione, si precisa che rientrano in questa categoria quelle componenti biologiche che, a seguito di una trasformazione specifica, ad esempio dovuta ad una condizione patologica, assumono un comportamento magnetico peculiare che ne permette la separazione magnetoforetica dalle loro omologhe in condizioni fisiologiche.

Più in particolare, la presente invenzione riguarda un apparato che consente e prevede di isolare e concentrare spazialmente una o più componenti biologiche cellulari e non cellulari disperse in un fluido biologico (e.g. sangue, urine, sudore, saliva etc.) oppure in un fluido estratto da un campione biologico solido (e.g. feci), sfruttando le differenze tra le proprietà magnetiche di dette componenti e le proprietà magnetiche delle altre componenti di non interesse. Una volta avvenuta la separazione e concentrazione, l’apparato della presente invenzione, prevede, quindi, che la quantificazione, di tali componenti biologiche cellulari e non cellulari avvenga mediante la misura della variazione di impedenza tra due o più elettrodi posti in prossimità delle zone di concentrazione.

A titolo di esempio, uno dei campi di applicazione dell’apparato della presente invenzione può essere implementato e realizzato in modo tale da essere utilizzato per la rivelazione e quantificazione delle uova di parassiti (e.g. schistosoma mansoni) nelle feci infestate, in quanto tali uova presentano un comportamento paramagnetico distinto rispetto a quello tipicamente diamagnetico di una soluzione acquosa in cui possono essere risospese [S. Karl et al., PLOS Neglected Tropical Diseases, 7( 5), e2219 (2013)].

Un altro campo di applicazione della presente invenzione riguarda, poi, la diagnosi di tutte quelle patologie che causano un’alterazione delle proprietà magnetiche di uno o più tipologie di componenti cellulari ematiche e/o danno luogo alla formazione di sostanze con proprietà magnetiche diverse dal plasma, dette sostanze essendo assenti o in concentrazione differente in condizioni fisiologiche. In particolare, sono note patologie che causano l’alterazione delle proprietà magnetiche degli eritrociti, o globuli rossi, quali la malaria e gli avvelenamenti che causano aumento di metemoglobinemia. Ad esempio, nel caso della malaria è noto come il plasmodio, durante la patogenesi malarica, produca una sostanza particolare a cui si è fatto cenno sopra, che prende il nome di emozoina ed è una sostanza paramagnetica. In particolare, l’emozoina viene prodotta sotto forma di cristalli che si accumulano negli eritrociti infetti, rendendoli paramagnetici rispetto al mezzo in cui sono dispersi, cioè, il plasma. Inoltre, nelle fasi non precoci della malaria, la membrana dei globuli rossi infetti si rompe dando luogo alla liberazione dei cristalli di emozoina nel plasma, che è, invece, diamagnetico. Sono, inoltre, note patologie in cui, non sono le proprietà magnetiche delle componenti cellulari del sangue a variare, ma lo è, invece, la loro densità. Un esempio di questo tipo è dato dall’anemia falciforme, dove, pur rimanendo inalterata la diamagneticità dei globuli rossi, cambia la loro densità. In tale caso, aggiungendo una sostanza fortemente paramagnetica al plasma, quale ad esempio il gadolinio, si può pensare di sfruttare la differenza magnetica tra i globuli rossi e la soluzione di gadolinio aggiunta al plasma insieme con la differenza di densità tra globuli rossi malati e globuli rossi sani per ottenere la separazione e, quindi, effettuare il conteggio degli eritrociti patologici.

Allo stato dell’arte, sono note tecniche di separazione di componenti cellulari del sangue, basate sul differente comportamento magnetico assunto da tali componenti in condizioni fisiologiche e patologiche. In particolare, nella domanda di brevetto US5985153A è descritto un dispositivo per la separazione di cellule o altre entità biologiche magneto-sensibili comprendente: un substrato; un generatore di un campo magnetico esterno e un sistema microfluidico per il carico e scarico del sangue. Nel documento US0127222A è descritto, invece, un sistema generico per l’immobilizzazione di cellule precedentemente marcate con particelle magnetiche, in modo che possano essere attratte da strutture ferromagnetiche realizzate su un chip e poste in un campo magnetico esterno. Nella domanda WO2010091874 è descritta una particolare struttura ferromagnetica, composta di condotti magnetici, capace di attrarre particelle magnetiche in punti particolari in cui si localizzano delle pareti di dominio magnetiche. In tutti i documenti di arte nota sopra citati, nonché in una parte della letteratura scientifica elencata nella bibliografia [S. Bhakdi et al., Optimized high gradient magnetic separation for isolation of Plasmodium-infected red blood cells, Malaria Journal 2010, 9:38]; [J. Nam et al., Magnetic Separation of Malaria-Infected Red Blood Cells in Various Developmental Stages, Anal. Chem., 85, 7316−7323 (2013)]; [Ki-Ho Han and A. Bruno Frazier, Paramagnetic capture mode magnetophoretic microseparator for high efficiency blood cell separations, Lab Chip, 6, 265–273 (2006)], è descritta solamente la separazione magnetoforetica delle componenti di interesse dal resto del campione di sangue, e non è fatto cenno alcuno alla rivelazione del numero di tali componenti.

Nella domanda di brevetto US20120003687A e nelle pubblicazioni scientifiche [E. Du, et al., Electric Impedance Microflow Cytometry for Characterization of Cell Disease States, Lab Chip. 2013 October 7; 13(19): 3903–3909] e [M. Ibrahim, J. Claudel, D. Kourtiche and M. Nadi, Geometric parameters optimization of planar interdigitated electrodes for bioimpedance spectroscopy, J Electr Bioimp, vol. 4, pp. 13–22, 2013] sono, invece, descritte tecniche di quantificazione impedenziometrica di componenti cellulari. Tali tecniche non sono, però, mai state utilizzate in associazione alla separazione e concentrazione magnetoforetica. La rivelazione impedenziometrica richiede che la frazione volumetrica delle componenti in prossimità degli elettrodi sia sufficientemente elevata, al fine di ottenere un rapporto segnale-rumore nel segnale d'uscita che sia sufficiente per garantire una corretta quantificazione delle componenti separate. Tale concentrazione è usualmente ottenuta con tecniche di microfluidica finalizzate alla movimentazione del fluido ematico, che aumentano notevolmente il grado di complessità del sistema e lo rendono poco adatto ad un utilizzo da parte di un utente non specializzato, ad esempio il paziente stesso. L’apparato proposto intende superare queste difficoltà sostituendo la separazione mediante movimentazione microfluidica con un sistema di separazione e concentrazione magnetica delle componenti di interesse su zone della cella di misura in cui sono localizzati gli elettrodi di rivelazione. Sempre, con riferimento alla diagnosi di tutte quelle patologie che causano un’alterazione delle proprietà magnetiche di una o più tipologie di componenti ematiche, al fine di effettuare la misura, l’utente non specializzato può dispensare sull’apposito supporto di detta cella una goccia di sangue appena prelevata, eventualmente diluita e trattata con anticoagulante, e, quindi, porlo a contatto con il substrato di detta cella sul quale sono alloggiati gli elementi concentratori e gli elettrodi, a sua volta disposto entro un campo magnetico esterno in modo tale che una componente della forza di gravità si opponga alla forza di attrazione magnetica diretta verso i concentratori. La cella di misura può anche essere una cella di misura preassemblata, con substrato e supporto opportunamente distanziati, eventualmente integrata con un sistema microfluidico con fluidi precaricati che implementa la sola diluizione e anticoagulazione della goccia di sangue e il trasporto entro la cella di misura. E’ovvio che la cella di misura dell’apparato della presente invenzione può ulteriormente essere integrata con un sistema microfluidico che svolge non solo le funzioni di diluizione e trasporto del campione ma anche la movimentazione del sangue funzionale alla stessa separazione delle componenti, anche se tale forma di realizzazione avrebbe una maggiore complessità delle forme realizzative che prevedono che la separazione avvenga per sola magnetoforesi e rilevazione impedenziometrica. Per un volume della goccia di sangue prelevato dell’ordine di una decina di microlitri e supponendo che la cattura delle componenti di interesse avvenga al più ad una distanza massima dai concentratori compresa fra 20 e 200 micrometri, le dimensioni dell’area attiva per la cattura sul substrato devono essere dell’ordine del cm<2 >ed, in particolare, comprese tra 0.1 e 5 cm<2>. Anche il supporto e, quindi, la cella di misura, dovranno avere circa le medesime dimensioni. Su tali valori di area attiva è necessaria un’elevata concentrazione delle componenti di interesse, al fine di garantire un adeguato rapporto segnale rumore. Come sarà meglio spiegato nel seguito, tale concentrazione è quantificabile mediante un cosiddetto fattore di concentrazione Fc che è dato, in assenza di scorrimento delle componenti parallelamente al substrato e supponendo che tutte le componenti vengano catturate, dal rapporto tra l'area attiva del substrato entro la quale è confinata la goccia contenente le componenti che si vogliono quantificare, e l'area definita dagli elettrodi di rivelazione. Al fine di avere un rapporto segnale rumore adeguato nel segnale di uscita, il fattore di concentrazione Fc deve essere, preferibilmente, almeno intorno a 100.

Scopo della presente invenzione è, pertanto, quello di provvedere un apparato che consenta la quantificazione delle componenti di interesse a partire da una quantità di fluido in cui sono disperse compresa fra 5 – 500 microL (5-50 microL, nel caso in cui il fluido sia il sangue), e produca un segnale in uscita con un rapporto segnale rumore tale da consentire la rivelazione di componenti biologiche cellulari e non cellulari con limite inferiore di concentrazione fino a decine di componenti per microlitro.

Tale scopo è raggiunto dall’apparato della presente invenzione, il quale comprende:

- una cella di misura comprendente elettrodi di rivelazione ed elettrodi di riferimento;

- un'unità elettronica per la generazione dei segnali di ingresso, la misura impedenziometrica, l’amplificazione dei segnali di uscita e la comunicazione con un’interfaccia utente;

- mezzi per la generazione di un campo magnetico con opportuno gradiente modulabile nel tempo, detti mezzi di magnetizzazione essendo configurati per generare un campo magnetico in grado di causare, in combinazione con dei concentratori alloggiati nella cella di misura, la separazione delle componenti da quantificare dal resto della soluzione e la loro concentrazione sugli elettrodi di rivelazione.

L’apparato della presente invenzione può, inoltre, comprendere un sistema microfluidico con fluidi precaricati che implementa la diluizione del campione di fluido biologico e il trasporto entro la cella di misura. A tal fine, il sistema microfluidico, a sua volta, comprende:

- mezzi per la raccolta di un campione di fluido e diluizione con fluidi precaricati su una cartuccia;

- mezzi per il trasporto del campione di fluido diluito all’interno della cella di misura.

La cella di misura, a sua volta, comprende:

- una pluralità di elettrodi di rivelazione;

- almeno un concentratore, detto almeno un concentratore essendo configurato per attrarre magneticamente le componenti da quantificare e concentrare dette componenti sugli elettrodi di rivelazione, detti elettrodi di rivelazione essendo posti in prossimità di detto almeno un concentratore;

- almeno una coppia di elettrodi di riferimento, preferibilmente una coppia di elettrodi di riferimento per ogni coppia di elettrodi di rivelazione, detti elettrodi di riferimento essendo posti non in prossimità di detto almeno un concentratore;

- un substrato configurato per l’alloggiamento degli elettrodi di rivelazione, degli elettrodi di riferimento e dei concentratori, detto substrato comprendendo una prima superficie affacciata all’esterno di detta cella e una seconda superficie affacciata all’interno di detta cella;

- un supporto comprendente una prima superficie affacciata all’esterno di detta cella e una seconda superficie affacciata all’interno di detta cella e contrapposta alla seconda superficie del substrato; - almeno un elemento distanziatore, configurato per confinare il campione e distanziare detto substrato da detto supporto ;

- un alloggiamento meccanico configurato per alloggiare la cella e per realizzare il contatto elettrico fra gli elettrodi e;

- una scheda elettronica per la connessione verso l’unità elettronica esterna.

Detto almeno un concentratore può essere un cilindro o un parallelepipedo o un elemento di altra forma posto sul substrato, posto in corrispondenza degli elettrodi di rivelazione ed è costituito da materiale ferromagnetico. Il concentratore genera un intenso gradiente di campo locale che attira le componenti da quantificare, facendo sì che queste si concentrino in prossimità di detto concentratore, e quindi, in prossimità degli elettrodi di rivelazione. In tale modo, dimensionando opportunamente sia il concentratore che gli elettrodi di rivelazione, il fattore di concentrazione può aumentare fino al valore necessario per ottenere un adeguato rapporto segnale rumore.

Gli elettrodi di rivelazione sono posti in prossimità degli elementi concentratori, mentre quelli di riferimento sono posti non in prossimità degli elementi concentratori. In altre parole gli elettrodi di riferimento sono posti in aree prive di detti concentratori. Ai fini della presente descrizione, con l’espressione “gli elettrodi di rivelazione sono posti in prossimità di concentratori” si intende che gli elettrodi di rivelazione sono posti rispetto ai concentratori in modo tale che la loro distanza nella direzione perpendicolare al substrato non superi i 5 µm e che la proiezione degli elettrodi di rivelazione sul piano del substrato sia contenuta all’interno della proiezione dei concentratori su detto piano del substrato oppure, pur essendo non contenuta all’interno della proiezione dei concentratori sul piano del substrato, non sia distante dalla proiezione dei concentratori sul substrato nella direzione della larghezza (e.g. la dimensione maggiore) dei concentratori, per un valore non superiore a due volte la larghezza degli elettrodi. Con l’espressione “gli elettrodi di riferimento sono posti non in prossimità dei concentratori” si intende, invece, che gli elettrodi di rivelazione sono posti rispetto ai concentratori in modo tale che la distanza tra la proiezione dei concentratori sul substrato e la proiezione degli elettrodi di rivelazione sul substrato nella direzione della larghezza dei concentratori, sia pari ad almeno due volte la larghezza caratteristica dei concentratori.

In tal modo, le componenti separate si accumulano selettivamente sugli elettrodi di rivelazione ma non su quelli di riferimento, causando una variazione specifica dell'impedenza tra gli elettrodi di rivelazione rispetto a quella spuria eventualmente registrata fra gli elettrodi di riferimento. Il segnale di uscita del sistema di quantificazione impedenziometrica è, quindi, proporzionale alla differenza fra la variazione d’impedenza registrata tra gli elettrodi di rivelazione e quella tra gli elettrodi di riferimento. Da tale segnale di uscita, si può, poi, stimare, per confronto con opportuna curva di calibrazione, effettuato mediante processore, il numero delle componenti di interesse o, equivalentemente, la loro concentrazione.

I mezzi di generazione del campo magnetico sono configurati per realizzare una modulazione del campo e relativo gradiente in corrispondenza del substrato che alloggia gli elementi concentratori, cioè a produrre variazioni nel tempo dell’intensità del campo magnetico da un valore minimo pari a circa il 10% del campo di saturazione dei concentratori ad un valore massimo che deve essere superiore al campo di saturazione dei concentratori magnetici. Come sarà spiegato più dettagliatamente nel seguito, qualora i mezzi di magnetizzazione siano realizzati mediante magneti permanenti, tale modulazione può essere semplicemente ottenuta mediante un moto lineare di avvicinamento/allontanamento dal substrato dei magneti. In particolare, quando i magneti vengono portati in prossimità del substrato avviene la cattura delle componenti, mentre quando i magneti vengono allontanati le componenti si staccano dai concentratori e dagli elettrodi. Nell’ipotesi di componenti con resistenza maggiore di quella del liquido, in fase di avvicinamento si ha un incremento positivo della resistenza misurata ai capi degli elettrodi di rivelazione, con un tempo caratteristico

A seguito di un allontanamento repentino del magnete, invece, la resistenza ritorna

al suo livello iniziale per il distacco delle componenti, con un altro tempo caratteristico

L’attivazione selettiva di cattura e rilascio mediante la modulazione del campo magnetico sul substrato consente di effettuare una misura più accurata di variazione di impedenza associata alle componenti. In questo modo, grazie all’attivazione selettiva di cattura e rilascio le variazioni spurie, ovvero non sincrone con l’avvicinamento/allontanamento dei magneti, possono essere facilmente individuate ottenendo così una misura più accurata della variazione di impedenza effettivamente associata alle componenti, nonché una migliore sottrazione del fondo e delle derive ad esso associate.

Il miglioramento della sensibilità del test, collegato ad un aumento del rapporto fra il segnale vero e quello dovuto ai falsi positivi, e la possibilità di discriminare fra corpuscoli diversi è ulteriormente garantito dal fatto che la cella di misura può essere inclinata rispetto al piano orizzontale, cioè rispetto al piano normale al vettore di accelerazione di gravità.

La separazione delle componenti dalla matrice in cui sono disperse, infatti, avviene grazie alla competizione fra la forza gravitazionale e la forza attrattiva magnetica secondo modalità che dipendono dalle caratteristiche dei componenti e dall’angoloα formato tra il vettore accelerazione di gravità e la normale al substrato.

Come sarà maggiormente evidente dall’esempio descritto nel seguito, l’efficienza di cattura delle componenti catturate varia in base all’angolo α formato dalla normale al substrato e dal vettore accelerazione di gravità. Per α = 0° (figura 3a), cioè quando la cella di misura è parallela al piano orizzontale, la forza magnetica FM è antiparallela alla risultante della forza peso (mg) e di quella di Archimede (Fb), cosicché, per evitare la sedimentazione delle componenti sul supporto e promuovere invece un moto verso l’alto, è necessario un elevato gradiente del campo creato dai mezzi per la generazione di un campo magnetico. Per valori di α compresi fra 0° e 90°, come mostrato in figura 3b, la forza magnetica deve contrastare solo la proiezione lungo la normale n della risultante di forza peso e forza di Archimede, ovvero (mg+Fb)cos � α. Aumentando l’angolo α diminuisce la soglia di forza magnetica oltre la quale avviene la cattura di una data componente. E’ quindi possibile scegliere un angolo ottimo per discriminare la cattura di componenti diverse presenti nel campione senza agire sul campo magnetico generato. In questa modalità le componenti cadono verso il basso entro la camera, posta inclinata rispetto alla verticale, ma durante il loro moto di scorrimento vengono attratti verso il substrato, fino a sentire il campo dei concentratori e quindi essere da loro catturati. Il caso estremo si ha per α = 90° (figura 3c), quando la forza peso e la forza magnetica non sono in competizione, ma agiscono secondo assi ortogonali. Le componenti cadono verso il basso ma nel contempo sono attratte orizzontalmente verso il substrato dal campo del magnete. In questa configurazione qualunque componente paramagnetica viene attratta verso il substrato, senza alcuna soglia che permetta di discriminare fra componenti con diverso momento magnetico. Ciò che varia comunque è l’efficienza di cattura, visto che la quantità di componenti catturate dipende dall’intensità della forza orizzontale attrattiva che li fa deviare dal moto di caduta verticale. Per i motivi sopra descritti, la cella di misura è fissata in una posizione inclinata di un angolo α�fra la normale al substrato di detta cella e il vettore accelerazione di gravità compreso tra 0° e 180°.

L’efficienza di cattura globale quando α� >� 0 ° ,�inoltre, non dipende solo dalla cattura locale delle componenti presenti entro un volume di cattura in prossimità di ogni concentratore. Lo stesso moto di scorrimento verso il basso indotto dalla gravità fa gradualmente transitare in prossimità dei concentratori le componenti che si trovano al di sopra, consentendo quindi di aumentare l’efficienza di cattura, definita come numero di componenti catturate per unità di volume di liquido in cui sono sospese. Sagomando l’anello di contenimento, nonché la geometria di concentratori ed elettrodi, in modo da convogliare in modo geometrico le componenti sull’area attiva di cattura durante il loro moto di scorrimento indotto dalla gravità, si può, pertanto ulteriormente migliorare l’efficienza di cattura.

Un secondo scopo della presente invenzione è, poi, quello di provvedere un apparato per la quantificazione di componenti cellulari e non cellulari che sia in grado di discriminare fra componenti diverse.

A tal fine, la cella di misura può avere un’inclinazione variabile anziché fissa, e l’apparato della presente invenzione può comprendere un sistema meccanico configurato per far variare tale inclinazione tra 0° e 180°.

In altre parole, l’apparato della presente invenzione può comprendere un sistema meccanico configurato per far variare tra 0° e 180° l’angolo α ,�formato tra la normale al substrato della cella di misura in cui è raccolto il campione di fluido e il vettore accelerazione di gravità.

Inoltre, anche la stessa modulazione nel tempo del campo magnetico prima menzionata e la conseguente misura dei tempi di cattura e di rilascio, che sono caratteristici delle componenti da quantificare, fornisce un’informazione aggiuntiva per l’identificazione della natura delle stesse componenti catturate.

Anche se, come sopra accennato, l’apparato della presente invenzione è applicabile alla diagnosi di qualsiasi patologia che sia causa di una variazione delle proprietà magnetiche di una o più componenti biologiche, tra le varie patologie per la diagnosi delle quali è possibile utilizzare l’apparato della presente invenzione, la malaria risulta essere di particolare interesse, in quanto i dispositivi diagnostici per tale tipo di patologia, presenti oggi sul mercato presentano alcune limitazioni che li rendono di non sempre facile utilizzo in contesti particolarmente svantaggiati, quali quelli tipici delle zone endemiche, spesso localizzate nei paesi in via di sviluppo. Il metodo più sensibile attualmente disponibile per la diagnosi della malaria si basa, infatti, sul riconoscimento genico dei vari ceppi del plasmodio mediante PCR (Polymerase Chain Reaction). Tale tipo di metodica è particolarmente complessa e delicata e, pertanto, difficilmente applicabile in contesti non tecnologicamente avanzati. Inoltre, la PCR non è un metodo pan-plasmodico, ma è indirizzata a ceppi specifici e soggetta, pertanto, ai problemi derivanti dalle continue mutazioni del plasmodio. Il metodo, invece, dello “striscio sottile e/o goccia spessa”, che consiste nel contare al microscopio ottico i globuli rossi infettati dal plasmodio in una goccia di sangue, pur non necessitando di strumentazione complessa, necessita di personale molto esperto, comporta una certa variabilità nell’interpretazione dei risultati, nonché tempi di analisi lunghi. I test rapidi (RDT) basati sull’interazione anticorpo-antigene, sono, invece, caratterizzati da una sensibilità talmente bassa da impedirne l’utilizzo per la diagnosi precoce. Inoltre, a causa della presenza latente dell’antigene nel corpo dei pazienti in zona endemica, i metodi basati sull’interazione anticorpo-antigene, danno luogo ad un elevato numero di falsi positivi.

Un terzo scopo della presente invenzione è, pertanto, quello di provvedere un apparato che consenta anche la diagnosi precoce della malaria, sia pan-plasmodico, che abbia una adeguata sensibilità e sia di una semplicità ed economicità tale da poter essere usata anche in quelle zone dove i mezzi economici disponibili non consentono l’impiego di strumentazioni complesse e personale specializzato.

Tale scopo è raggiunto dall’apparato della presente invenzione, in quanto quest'ultimo è in grado di effettuare la separazione magnetica e la quantificazione sia degli eritrociti infetti che la separazione magnetica e rivelazione diretta dei cristalli di emozoina liberi nel plasma. La quantificazione degli eritrociti infetti consente di ottenere una valutazione diretta della parassitemia, che normalmente è quantificata calcolando il rapporto tra eritrociti infetti ed eritrociti sani, eventualmente anche in fase precoce della malattia, prima del compimento del primo ciclo di riproduzione del plasmodio (48-72 ore). La rivelazione diretta dei cristalli di emozoina è, invece, particolarmente utile, nelle fasi non iniziali della malattia, come ad esempio, in concomitanza del primo attacco febbrile, poiché, in tali fasi, gli eritrociti hanno già subito la rottura della membrana, e l'unica cosa effettivamente quantificabile in circolo è l'emozoina libera. Questi ed ulteriori scopi della presente invenzione saranno resi più chiari dalla lettura della descrizione dettagliata seguente di alcuni modi preferiti di realizzare la presente invenzione da intendersi a titolo esemplificativo e non limitativo dei più generali concetti rivendicati, nonché dagli esempi riguardanti test sperimentali effettuati sulla presente invenzione.

La descrizione che segue fa riferimento alle figure allegate, in cui:

- la figura 1 è una vista frontale di un particolare dell’apparato secondo la presente invenzione, detto particolare comprendendo la cella di misura e i mezzi di magnetizzazione;

- la figura 2 è una vista laterale dell’apparato secondo la presente invenzione; - la figura 3a è una vista frontale di un particolare dell’apparato della presente invenzione, detto particolare comprendendo la parte centrale della cella di misura e i mezzi di magnetizzazione, con un diagramma vettoriale delle forze per α=0°;

- la figura 3b è una vista frontale di un particolare dell’apparato della presente invenzione, detto particolare comprendendo la parte centrale della cella di misura e i mezzi di magnetizzazione, con un diagramma vettoriale delle forze per un angolo generico α�compreso fra 0 e 90°;

- la figura 3c è una vista frontale di un particolare dell’apparato della presente invenzione, detto particolare comprendendo la parte centrale della cella di misura e i mezzi di magnetizzazione, con un diagramma vettoriale delle forze per α=90°;

- la figura 4a è uno schema esemplificativo della modalità di misura implementata dall’apparato della presente invenzione mediante modulazione del campo generato dai mezzi per la generazione di detto campo, che mostra l’avvicinamento dei mezzi alla cella di misura;

- la figura 4b è uno schema esemplificativo della modalità di misura implementata dall’apparato della presente invenzione mediante modulazione del campo generato dai mezzi per la generazione di detto campo, che mostra l’allontanamento dei mezzi alla cella di misura;

- la figura 5 mostra la forma del segnale relativo alla variazione percentuale della componente resistiva dell’impedenza dopo l’avvicinamento e allontanamento dei mezzi di magnetizzazione;

- la figura 6 è uno schema esemplificativo del posizionamento degli elettrodi di rivelazione e di riferimento rispetto ai concentratori, in una prima realizzazione della presente invenzione;

- la figura 7a mostra una sezione della cella di misura in una prima realizzazione dell’apparato della presente invenzione, detta sezione essendo lungo un piano perpendicolare alla dimensione maggiore di detto almeno un concentratore; - la figura 7b mostra un particolare della sezione mostrata nella figura 7a, relativo a detto almeno un concentratore;

- la figura 7c mostra un particolare della sezione mostrata nella figura 7a, relativo a detta almeno una coppia di elettrodi di rivelazione;

- la figura 8 è una vista dall'alto del particolare di una prima realizzazione dell’apparato della presente invenzione, detto particolare essendo costituito dal substrato della cella di misura;

- la figura 9 è una vista dall'alto di un particolare costituito dalla cella di misura di una seconda realizzazione della presente invenzione;

- la figura 10 mostra l'andamento della variazione percentuale differenziale della componente resistiva dell’impedenza, tra gli elettrodi di rivelazione e gli elettrodi di riferimento, in una seconda realizzazione della presente invenzione, per δ=40 micron e α=90° (i) in funzione del livello di parassitemia equivalente di un campione di globuli rossi trattati in modo da renderli paramagnetici rispetto al plasma (simboli pieni e linea continua) e (ii) per un campione di soli globuli rossi sani che fornisce indicazione del segnale dovuto a falsi positivi (linea tratteggiata);

- la figura 11 mostra l’andamento del segnale per una parassitemia equivalente dello 0.5% nel caso di α=90° e al variare dell’altezza ( δ) della cella di misura; - la figura 12 mostra l’andamento del rapporto fra segnale vero (nel caso di una parassitemia equivalente di 0.5%, δ=40 micron) e spurio (dovuto a falsi positivi o fluttuazioni), per diversi valori dell’angolo α.

Con riferimento alle figure 1, 2, 3a, 3b e 3c, una prima realizzazione dell’apparato della presente invenzione (100), destinata alla quantificazione degli eritrociti infettati dal plasmodio della malaria e dei cristalli di emozoina, comprende:

- una cella di misura (1) comprendente:

● una pluralità di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’); ● almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’), detto almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’) essendo configurato per attrarre magneticamente le componenti (3, 3’, 3’’) da quantificare e concentrare dette componenti sugli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’), detti elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, ‘6, 34, 34’) essendo posti in prossimità di detto almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’);

● almeno una coppia di elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) per ogni coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’ 6, 6’, 34, 34’), detti elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) essendo posti non in prossimità di detto almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’);

● un substrato (11) configurato per l’alloggiamento degli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’), degli elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) e dei concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’), detto substrato (11) comprendendo una prima superficie (11’) affacciata all’esterno di detta cella (1) e una seconda superficie (11’’) affacciata all’interno di detta cella (1);

● un supporto (12) comprendente una prima superficie (12’) affacciata all’esterno di detta cella (1) e una seconda superficie (12’’) affacciata all’interno di detta cella (1) e contrapposta alla seconda superficie (11’’) del substrato (11);

● almeno un elemento distanziatore (13, 13’), configurato per confinare il campione e distanziare detto substrato (11) da detto supporto (12); e

● un alloggiamento meccanico (600) configurato per alloggiare la cella (1) e per realizzare il contatto elettrico fra gli elettrodi (4, 4’, 5, 5’ 6, 6’, 34, 34’, 7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) e una scheda elettronica (202);

- un'unità elettronica (201) connessa a detta scheda (202), detta unità elettronica (201) essendo configurata per la generazione dei segnali di ingresso, l’amplificazione dei segnali di uscita, la misura dell’impedenza tra gli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’), dell’impedenza tra gli elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) o della loro differenza e la comunicazione con un’interfaccia verso l’utente; e

- mezzi per la generazione di un campo magnetico (101, 102, 103) con gradiente modulabile nel tempo, detti mezzi essendo configurati per generare un campo magnetico in grado di causare, in combinazione con i concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’):

● la separazione delle componenti (3, 3’, 3’’) da quantificare dal resto della soluzione; e

● la concentrazione sugli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’) delle componenti da quantificare (3, 3’, 3’’);

- un sistema microfluidico con fluidi precaricati che implementa la diluizione e l’anticoagulazione del sangue e il trasporto entro la cella di misura (1), detto sistema microfludico essendo integrato con la cella di misura (1), ed almeno parzialmente contenuto nell’alloggiamento meccanico (600).

- un sistema meccanico configurato per far variare l’angolo ��formato fra la normale al substrato della cella di misura in cui è raccolto il campione di sangue e il vettore accelerazione di gravità, tra 0° e 180°.

Il sistema microfluidico, a sua volta, comprende

- mezzi per la raccolta del campione di sangue (500) e diluizione con fluidi precaricati (501) su una cartuccia (503); e

- mezzi (504) per il trasporto del campione di sangue (500) diluito all’interno della cella di misura (1).

Per poter effettuare l’analisi, la goccia di sangue del paziente è, pertanto, posta a contatto con l’ingresso del sistema microfluidico. Essa viene quindi risucchiata, diluita con fluidi precaricati e convogliata nella cella di misura contenente il substrato con gli elettrodi.

La cella di misura può essere realizzata con tecniche di microfabbricazione su silicio, vetro o altri materiali polimerici, accoppiato a un opportuno sistema microfluidico realizzato in materiale plastico.

Nella prima realizzazione dell’apparato della presente invenzione, destinata specificatamente all’uso per la malaria, i mezzi (101, 102, 103) per la generazione di un campo magnetico, devono essere in grado di generare un campo che, preferibilmente, ha un’intensità di almeno 10<4 >A/m e un gradiente macroscopico del suo modulo quadro di almeno 5·10<14 >A<2>/m<3 >diretto verso il substrato o uscente da esso, rispettivamente nel caso di componenti paramagnetiche o diamagnetiche rispetto al mezzo liquido nel quale sono disperse. Detti mezzi (101, 102, 103) possono, ad esempio, essere realizzati con una pluralità di magneti permanenti (101, 102) posizionati in modo che il campo generato da detti magneti (101, 102) eserciti una forza sufficiente a contrastare la risultante della forza peso e di quella di Archimede agente sulle componenti di interesse a grande distanza dal substrato (11), attraendole pertanto verso la superficie dello stesso.

Con riferimento alle figure 4a e 4b, i mezzi per la generazione del campo magnetico (101, 102, 103) sono, in particolare, costituiti da due magneti permanenti (101, 102) di NdFeB N52, a forma di parallelepipedo a base quadrata e dimensioni 20x20x5 mm, magnetizzati perpendicolarmente alle facce quadrate e disposti con i poli nord affacciati. Fra di essi è posto un lamierino (103) di materiale ferromagnetico dolce con elevata permeabilità magnetica (ad esempio Mumetal) che convoglia e concentra le linee di campo nel piano di simmetria dell’insieme dei due magneti (101, 102). In corrispondenza dell’interfaccia fra il lamierino (103) e l’aria si genera quindi un campo magnetico simmetrico rispetto al piano di separazione dei magneti (101, 102), con elevato gradiente avente componente prevalente diretta ortogonalmente alle facce rettangolari dei magneti (101, 102) poste in contatto o in prossimità con il retro del substrato (11). Il campo prodotto risulta avere, così, intensità e gradiente adeguati alla cattura delle componenti (3, 3’, 3’’), in un’area di forma rettangolare, avente larghezza pari a circa 2 mm e altezza di circa 16 mm, per non includere gli effetti di bordo dei magneti (101, 102).

Con riferimento alle figure 4a, 4b e 5, e come sopra accennato, i mezzi per la generazione del campo magnetico (101, 102, 103) sono configurati per realizzare una modulazione del campo e relativo gradiente in corrispondenza del substrato (11) che reca gli elementi concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’), ovvero a produrre variazioni nel tempo dell’intensità del campo magnetico da un valore minimo non superiore al 10% del campo di saturazione dei concentratori magnetici, ad un valore massimo che deve essere superiore al campo di saturazione dei concentratori magnetici (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’). Nella prima realizzazione della presente invenzione, i concentratori magnetici sono realizzati, per esempio, in Ni e tale modulazione può essere, ottenuta mediante un moto lineare di avvicinamento/allontanamento dal substrato (11) dei magneti (101, 102). Quando i mezzi per la generazione del campo magnetico (101, 102, 103) vengono portati in prossimità del substrato (11), il campo sui concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’) di Ni è sufficiente a saturare la loro magnetizzazione e quindi permette la cattura delle componenti (3, 3’, 3’’). Quando i mezzi per la generazione del campo magnetico (101, 102, 103) vengono allontanati il campo diventa trascurabile e i concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’) si smagnetizzano, cosicché le componenti (3, 3’, 3’’) si staccano dai concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’) e dagli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’). Come già accennato, l’andamento della componente resistiva dell’impedenza misurata ai capi degli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’) in fase di avvicinamento/allontanamento è riportata nella figura 5. In fase di avvicinamento si ha un incremento �R positivo, nell’ipotesi di componenti (3, 3’, 3’’) con resistenza maggiore di quella del liquido, che si sviluppa su un tempo caratteristico di cattura A seguito di un allontanamento repentino dei mezzi per la generazione del campo magnetico (101, 102, 103), la resistenza ritorna al suo livello iniziale per il distacco delle componenti dagli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’), con un tempo caratteristico

Con riferimento alle figure 6, 7a, 7b e 7c, nella prima realizzazione della presente invenzione è previsto che ogni coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4', 5, 5', 6, 6') della cella di misura (1) comprenda un primo elettrodo (4, 5, 6) atto a ricevere un primo segnale in ingresso (V<+>) e un secondo elettrodo (4’, 5’, 6’). Ogni coppia di elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’) comprende un primo elettrodo (7, 8, 9) atto a ricevere un secondo segnale in ingresso (V-) di polarità opposta al primo segnale di ingresso (V<+>) e un secondo elettrodo (7’, 8’, 9’) connesso al secondo elettrodo (4', 5', 6') di ogni coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’), in un punto comune da cui viene prelevato il segnale d’uscita (Out). E’ altresì possibile, con ovvie modifiche dell’unità elettronica (201), invertire il ruolo degli elettrodi ed utilizzare il punto comune del secondo elettrodo (4’, 5’, 6’) di rivelazione e del secondo elettrodo (7’, 8’, 9’) di riferimento come segnale di ingresso e il primo elettrodo (4, 5, 6) della coppia di elettrodi di rivelazione come primo segnale di uscita e il primo elettrodo (7, 8, 9) della coppia di elettrodi di riferimento come secondo segnale di uscita. In tutti i casi l’unità elettronica (201) sarà realizzata per fornire all’utente la differenza tra l’impedenza della coppia di elettrodi di rivelazione e l’impedenza della coppia di elettrodi di riferimento in forma opportunamente elaborata.

Nella prima realizzazione della presente invenzione, atta alla diagnosi della malaria, i concentratori (10, 10', 10'') sono fatti di materiale ferromagnetico, quale Ni, Fe, Co, NiFe, CoFe, etc., e hanno la forma di un parallelepipedo con la dimensione maggiore che si estende perpendicolarmente al piano rappresentato in figura 3a. Al fine di garantire un fattore di concentrazione sufficiente per ottenere un adeguato rapporto segnale rumore, le dimensioni dei concentratori (10, 10', 10'') e degli elettrodi di rivelazione (4, 4', 5, 5', 6, 6') devono essere, preferibilmente, comprese negli intervalli elencati nella tabella 1.

Tabella 1: hF è la dimensione minore della base di un concentratore, wF è la dimensione maggiore della base di un concentratore e dF è la distanza tra un concentratore e il concentratore adiacente. hE è la dimensione minore della base di un elettrodo di rivelazione, wF è la dimensione maggiore della base di un elettrodo di rivelazione e dE la distanza tra due elettrodi adiacenti in corrispondenza del medesimo concentratore.

Nella prima riga della tabella 1, sono mostrati gli intervalli delle dimensioni dei concentratori e degli elettrodi di rivelazione necessari per una corretta rivelazione degli eritrociti infettati (i-RBC) dal plasmodio della malaria; mentre nella seconda riga della tabella 1, sono mostrati gli intervalli delle dimensioni dei concentratori e degli elettrodi di rivelazione necessari per una corretta rivelazione dei cristalli liberi di emozoina (HC).

Il substrato (11) e, quindi, la stessa cella (1) della presente invenzione, la struttura degli elettrodi di rivelazione (4, 4', 5, 5', 6, 6') e degli elettrodi di riferimento (7, 7', 8, 8', 9, 9'), può essere replicata in quattro zone in cui è suddiviso il substrato (11), ciascuna divisa in due zone rettangolari di base pari a 2 mm ed altezza pari a 4 mm. La larghezza di 2 mm è commensurata all’estensione dell’elevato campo magnetico prodotto dai magneti in direzione perpendicolare al piano di simmetria. La parte di sinistra reca gli elettrodi sui concentratori, ed è centrata rispetto al piano di simmetria dei magneti descritti, mentre la parte di destra ha solo gli elettrodi di riferimento per la sottrazione del segnale di modo comune. La suddivisione dell’area attiva in più regioni con letture indipendenti permette di aumentare il rapporto tra la variazione di impedenza prodotta da una singola componente attratta sugli elettrodi di rivelazione e l’impedenza complessiva tra gli elettrodi, migliorando il rapporto segnale-rumore nel caso di basse concentrazioni di componenti da rilevare. Poiché per ogni zona serve un contatto di uscita verso l’amplificatore da cui emettere il segnale di uscita (Out), mentre tutti i segnali di ingresso (V<+>) e (V-) per elettrodi di rivelazione ed elettrodi riferimento necessitano solo di due contatti, il numero minimo di contatti da realizzare sul chip è pari a 4+2=6. Al fine di minimizzare l’impatto di possibili corti circuiti fra gli elettrodi in fase di fabbricazione, si possono utilizzare tre contatti distinti per ogni zona. Di conseguenza, il numero totale di contatti è pari a 12.

Con riferimento alle figure 8 e 9, una seconda realizzazione dell’apparato della presente invenzione, sempre destinata specificatamente all’uso per la malaria, prevede che l’apparato (100) comprenda tutti i medesimi componenti sopra descritti con un’unica differenza relativa alla configurazione della cella di misura (1). Nella seconda realizzazione della presente invenzione, la cella di misura (1) comprende, infatti, una matrice di concentratori ferromagnetici di forma cilindrica (14, 14’, 14’’) uniformemente distribuiti sul substrato (11) secondo un reticolo quadrato. In alternativa, la matrice di concentratori può essere disposta secondo un reticolo esagonale che massimizza l’impaccamento. Nella figura 9, sono, in particolare, mostrate sei coppie di elettrodi di rivelazione (34, 34’) e sei coppie di elettrodi di riferimento (37, 37’). Il primo elettrodo (34) di ogni coppia di elettrodi di rivelazione (34, 34’) è collegato ad un primo ingresso configurato per la ricezione del primo segnale di ingresso (V<+>) mediante una prima pista di collegamento (44). Gli elettrodi possono essere paralleli, come mostrato nella figura 9, oppure di forma anulare, come nell’esempio descritto nel seguito, per sfruttare la tendenza alla cattura, rilevata sperimentalmente, sui bordi dei cilindri e quindi massimizzare l’occupazione della zona sensibile al di sopra degli elettrodi. Il primo elettrodo (37) di ogni coppia di elettrodi di riferimento (37, 37’) è collegato a un secondo ingresso configurato per la ricezione del secondo segnale di ingresso (V-) mediante una seconda pista di collegamento (47). Analogamente, il secondo elettrodo (34’) di ogni coppia di elettrodi di rivelazione (34, 34’) è collegato al nodo da cui viene emesso il segnale di uscita (Out) mediante una terza pista di collegamento (44’) ed il secondo elettrodo (37’) di ogni coppia di elettrodi di riferimento (37, 37’) è collegato al nodo da cui viene emesso detto segnale di uscita (Out) mediante una quarta pista di collegamento (47’).

Al di sopra della prima pista di collegamento (44), della seconda pista di collegamento (47), della terza pista di collegamento (44’) e della quarta pista di collegamento (47’) è deposto uno strato isolante (40, 40’, 50, 50’) per ogni pista, detto strato isolante (40, 40’, 50, 50’) avendo costante dielettrica e spessore tali da rendere molto elevata l’impedenza fra dette piste di collegamento (44, 44’, 47, 37’) in modo che l’effetto di tale impedenza sia trascurabile.

La configurazione dei concentratori prevista dalla seconda realizzazione, permette di ottenere un fattore di concentrazione, almeno per α=0, ancora più elevato rispetto a quello ottenibile rispetto alla prima realizzazione. A tal fine le dimensioni dei concentratori (14, 14’, 14’’) e degli elettrodi di rivelazione (34, 34’, 35, 35’) devono essere, preferibilmente, comprese negli intervalli elencati nella tabella 2.

Tabella 2: hF è l’altezza di un concentratore, wF è il diametro della base di un concentratore e dF è la distanza tra un concentratore e il concentratore adiacente. hE è la dimensione minore della base di un elettrodo di rivelazione, wF è la dimensione maggiore della base di un elettrodo di rivelazione e dE è la distanza il primo dito di un elettrodo di rivelazione e il secondo dito di detto elettrodo di rivelazione.

Nella tabella 2, sono mostrati gli intervalli delle dimensioni dei concentratori e degli elettrodi di rivelazione necessari per una corretta rivelazione sia degli eritrociti infettati (i-RBC) dal plasmodio della malaria sia dei cristalli liberi di emozoina (HC). Con tali dimensioni, supponendo una lunghezza L degli elettrodi rettilinei mostrati in figura 9, pari a 6 µm, ed un’efficienza di cattura del 100% nelle condizioni di spaziatura ottima, si ottiene un fattore geometrico di concentrazione pari a circa 400.

ESEMPIO

L’esempio descritto qui di seguito riguarda la caratterizzazione di un apparato secondo la seconda realizzazione sopra descritta, destinata specificatamente all’uso per la malaria. Il substrato, secondo la struttura descritta in figura 8, prevede una disposizione di concentratori di Ni (con diametro di 40 micron e altezza di 20 micron) disposti secondo un reticolo esagonale con distanza centro-centro pari a 160 micron. Gli elettrodi sono di forma anulare, realizzati in oro con spessore pari a 300 nm, larghezza di 3 micron e spaziatura di 3 micron. L’elettrodo esterno ha diametro esterno di 40 micron ed è perfettamente sovrapposto al concentratore di Ni, in modo da massimizzare la probabilità di cattura delle componenti in corrispondenza degli elettrodi, dato che proprio sui bordi dei cilindri si ha il massimo valore del campo magnetico e del suo gradiente. Fra gli elettrodi e la sommità dei concentratori è interposto uno strato isolante di SiO2 con spessore di 3 micron. La distanza fra il substrato ed il supporto è determinata da un anello contenitore polimerico (50) con spessore variabile fra 40 e 500 micron.

La goccia di campione contenente le componenti da analizzare è dispensata sul supporto sul quale è prefabbricato l’anello di contenimento, inizialmente disposto orizzontalmente, faccia in su. Il substrato viene quindi fatto scendere fino a premere sull’anello di contenimento, realizzando la tenuta che consente di definire la cella fluidica. La cella è alloggiata entro un apparato meccanico che consente di variare l’angolo α, tra la normale alla faccia del substrato e il vettore accelerazione di gravità, fra 0 e 180°. Un moto lineare motorizzato permette di avvicinare ed allontanare dal substrato i magneti in modo controllato e misurare in corrispondenza le variazioni di resistenza che risultano essere proporzionali alla concentrazione delle componenti. I magneti di NdFeB, configurati come mostrato nella figura 1, sono in grado di produrre un campo magnetico H in prossimità della superficie del substrato verso la cella di misura, ovvero a una distanza di 0.5 mm dalla superficie dei magneti, nel piano di simmetria dei due magneti affacciati, con modulo e gradiente del modulo quadro pari rispettivamente a 6·10<5 >A·m<-1 >e 7·10<14 >A<2>·m<-3>.

Per la specifica applicazione della diagnostica della malaria, le componenti di interesse con proprietà paramagnetiche rispetto al plasma sono i cristalli di emozoina e i globuli rossi infetti dal plasmodio, che contengono alcuni cristalli di emozoina. Tanto i cristalli di emozoina quanto i globuli rossi si comportano come isolanti per segnali di tensione di ingresso ad essi applicati nel campo di qualche MHz, quali quelli considerati per la rilevazione impedenziometrica. Mentre l’emozoina ha una suscettività magnetica volumetrica assoluta positiva, pari a 4.1·10<-4 >in unità del S.I., [M. Giacometti et al. APPLIED PHYSICS LETTERS 113, 203703 (2018)] i globuli rossi infetti hanno un comportamento globalmente ancora diamagnetico. La suscettività volumetrica risulta però meno negativa di quella del plasma, cosicché la differenza di suscettività fra globulo infetto e plasma è dell’ordine di 1.8·10<-6>, inferiore a quella dei cristalli di emozoina ma sufficiente per produrne la cattura in un opportuno gradiente di campo magnetico H applicato. La differenza di suscettività fra le due componenti permette di discriminare fra di essi, scegliendo opportunamente il valore del gradiente di campo magnetico e l’angolo α sulla base di una stima delle forze in gioco.

Assumendo un volume dei globuli rossi VRBC = 9.1·10<-11 >cm<-3>, una densità dei globuli ρRBC =1.15 g·cm<-3 >e una densità del plasma ρP = 1.025 g·cm<-3>, la somma della forza peso e della forza di Archimede sul singolo globulo, (figura 3a), risulta pari a 1.1·10<-13 >N. Secondo l’espressione della forza magnetica su una particella superparamagnetica, assumendo una differenza di suscettività ra globulo e plasma, [K. Han and A. B. Frazier, J. Appl. Phys. 96(10), 5797 (2004)] il valore del gradiente di H<2 >necessario per bilanciare Fgb nel caso di α=0° è dell’ordine di 1·10<15 >A<2>·m<-3>.

Analoga stima può essere effettuata per singolo cristallo di emozoina sospeso in plasma. Assumendo un volume medio VHC = 2.2·10<-14 >cm<-3>, una densità ρHC =1.15 g·cm<-3>, e una differenza di suscettività ∆ x =4.1·10<-4 >rispetto al plasma, si ottiene che per l’emozoina il valore del gradiente di H<2 >necessario per bilanciare Fgb è dell’ordine di 1.7·10<13 >A<2>·m<-3>.

Da queste stime risulta pertanto che, per angolo α=0, laddove la forza magnetoforetica è antiparallela alla risultante di quella gravitazionale e di Archimede, il gradiente di H<2 >prodotto dai particolari magneti considerati (7·10<14 >A<2>·m<-3 >in corrispondenza della superficie degli elettrodi del substrato nel caso in cui il magnete sia appoggiato al retro del substrato spesso 0.5 mm) è in grado di attrarre i cristalli di emozoina ma non i globuli rossi infetti da malaria.

Esperimenti condotti con angolo α=0 su sospensioni di cristalli di emozoina in plasma diluito 1:10 con PBS, per simulare la diluizione del sangue prevista nel test diagnostico, hanno infatti mostrato la possibilità di misurare una variazione netta di resistenza fra gli elettrodi del substrato, distinguibile dal rumore, fino a concentrazioni di emozoina pari a 1 ng/ml. Nell’ipotesi di considerare che entro un globulo rosso infetto da malaria ci siano circa 18 cristalli di emozoina, la concentrazione rilevata corrisponde a una parassitemia (rapporto percentuale fra globuli rossi malati e sani) dello 0.2%, tipica di un paziente che ha appena avuto un attacco febbrile malarico.

Nelle stesse condizioni (angolo α=0) misure su campioni di globuli rossi trattati con NaNO2 in modo da indurre la trasformazione di emoglobina in metemoglobina paramagnetica che permette di ottenere un modello di globulo rosso infetto da malaria, non hanno mostrato alcun segnale distinguibile dal rumore. Anche se i globuli rossi trattati (t-RBC) hanno una differenza di suscettibilità magnetica rispetto al plasma doppia rispetto a quella dei globuli infetti (∆ x =3.6·10<-6>), [Nam, Jeonghun, Hui Huang, Hyunjung Lim, Chaeseung Lim, Sehyun Shin. Analytical Chemistry 85, n. 15, 7316-23 (2013)], il gradiente di H<2 >necessario a bilanciare la forza gravitazionale e di galleggiamento (5·10<14 >A<2>·m<-3>) è molto simile a quello prodotto dai magneti (7·10<14 >A<2>·m<-3>), cosicchè ogni non idealità o scostamento dai valori tabulati per le proprietà dei globuli rossi può ampiamente giustificare l’assenza di cattura e quindi di segnale elettrico.

La situazione cambia per angoli α prossimi a 90°, laddove la componente di forza peso e galleggiamento che si oppone all’attrazione magnetica è praticamente nulla. Non esistendo più una vera soglia, tanto l’emozoina quanto i globuli rossi sono attratti dal gradiente di campo macroscopico verso il substrato, e quindi concentrati sui concentratori dal gradiente locale, durante il loro moto di scorrimento verso il basso. Per l’emozoina i valori dei segnali rilevati in funzione delle concentrazioni non variano in modo sensibile, dato che l’attrazione e concentrazione era già molto efficace per α=0. Si ottiene pertanto, per α=90°, un limite di detezione molto simile a quello trovato per α=0, dell’ordine di 1 ng/ml.

Per i globuli rossi trattati, invece, si ottengono segnali molto più rilevanti, che permettono di ottenere un limite di detezione (LOD) nell’ordine di 0.005%, corrispondente a circa 250 parassiti per μl di sangue. Alla frequenza dei segnali di ingresso (V<+ >e V-) di 1 MHz i globuli rossi hanno un comportamento isolante e pertanto la variazione della componente resistiva dell’impedenza misurata ΔR/R è proporzionale alla frazione volumetrica da essi occupata al di sopra degli elettrodi concentratori. E’ quindi evidente come il maggior volume dei globuli rossi rispetto all’emozoina possa condurre a segnali di maggiore entità.

Nella figura 10, è riportata con punti e linea continua la variazione percentuale di resistenza misurata a seguito dell’allontanamento dei magneti dal substrato, ovvero durante il rilascio dei globuli rossi attratti sugli elettrodi, in funzione del livello di parassitemia equivalente del campione. Considerato che il test diagnostico prevede una diluizione del sangue del paziente in PBS (1:10 vol-vol), il campione era costituito da una sospensione di globuli rossi trattati con NaNO2 in una soluzione di plasma e PBS (1:10), a concentrazioni decrescenti e correlabili alla parassitemia nel modo seguente. Poiché in un sangue diluito 1:10 l’ematocrito è dell’ordine del 4%, detta x la frazione volumetrica percentuale di t-RBC nel campione, la parassitemia equivalente è pari a x/4.

Sempre in Figura 10, la linea tratteggiata corrisponde al segnale ΔR/R misurato con un campione di globuli rossi non trattati risospesi in plasma e PBS (1:10 vol-vol) avente ematocrito pari allo 0.4%. Tale segnale è associato in parte ai falsi positivi ed in parte alle fluttuazioni spurie indotte dal moto dei magneti, ma costituisce il limite inferiore di segnale al di sotto del quale non è possibile effettuare misure significative. Come si può notare, il segnale ΔR/R misurato segue un andamento sostanzialmente lineare con la parassitemia del campione su più di tre decadi, consentendo pertanto una quantificazione della parassitemia stessa. Il limite di detezione, risultante dall’intersezione delle due curve è dell’ordine di 0.05%, ovvero circa 250 parassiti per μl di sangue, e corrisponde al LOD degli attuali test diagnostici rapidi per la malaria. A differenza di questi però, il test oggetto della presente domanda di brevetto permette una valutazione quantitativa della parassitemia, utile in fase di diagnosi e di monitoraggio della malattia a seguito di trattamento farmacologico.

L’influenza dell’angolo α sul limite di detezione è stata studiata in esperimenti condotti per angoli di 75°, 90° e 105°, come riportato in Figura 12. In essa si mostra il rapporto fra il segnale �R/R misurato in corrispondenza di un campione di t-RBC con una parassitemia equivalente dello 0.5% e quello misurato con un campione di globuli rossi non trattati risospesi in plasma e PBS (1:10 vol-vol) avente ematocrito pari allo 0.4%, associabile ai falsi positivi. Tale rapporto, associabile al rapporto segnale vero/ segnale aspecifico del test, è massimo per 90°, mentre diminuisce per angoli maggiori e minori. A 75° la gravità ha ancora una componente che si oppone alla forza magnetica, cosicchè diminuisce il segnale dei falsi positivi ma anche il segnale vero associabile ai trattati e in definitive il rapporto decresce. A 105° la gravità contribuisce a portare tutti i globuli, sani e trattati, verso gli elettrodi del substrato, in modo che aumenta il segnale vero ma anche quello aspecifico; anche in questo caso però il rapporto segnale/rumore diminuisce. In definitiva, dall’analisi condotta emerge come l’angolo di 90° sia preferibile per massimizzare il rapporto fra segnale vero ed aspecifico.

L’altezza della cella fluidica di misura ( δ), definita dallo spessore dell’elemento distanziatore, deve essere essa stessa ottimizzata per aumentare il rapporto fra segnale vero e aspecifico. In figura 11 è riportata l’ampiezza del segnale in corrente misurata dopo il secondo movimento di allontanamento dei magneti, per altezze della cella di 40, 80 e 500 micron. Come si può osservare il segnale netto diminuisce all’aumentare dello spessore, nonostante nella cella siano presenti più globuli. Ciò deriva dal fatto che, nell’esempio qui riportato, il caricamento del campione avviene con la cella in orizzontale ( α=0), cosicchè i globuli fanno in tempo a sedimentare sul substrato entro il tempo tipico (3 minuti) necessario per effettuare la chiusura della cella, realizzare i contatti elettrici, stabilizzare il segnale e dare inizio alla misura avvicinando i magneti. Considerando infatti una tipica velocità di sedimentazione di 2 micron/s, anche nel caso di δ=500 micron, uno spessore di almeno 360 micron dal substrato viene svuotato di globuli. Ciò significa che al momento dell’avvicinamento del campione i globuli sono più distanti di quanto non siano nel caso di δ=40 micron, e quindi la loro cattura durante il moto di scorrimento risulta meno efficiente. Da questa analisi risulta pertanto che, secondo il protocollo adottato in questo esempio, le condizioni migliori per aumentare il segnale corrispondono δ=40 micron.

L’aumento dello spessore della cella, e quindi del numero di globuli in esso contenuti, potrebbe invece essere sfruttato se si evitasse la sedimentazione iniziale dei globuli, mediante opportune agitazione o disponendo inizialmente il dispositivo ad un angolo α=180°. In tal modo si potrebbero concentrare i globuli in prossimità del substrato e sfruttare il moto di scorrimento indotto dalla gravità per allontanare dai concentratori i globuli rossi sani catturando invece quelli malati.

Infine è da notare come la dinamica stessa dei segnali sia ricca di informazioni che permettono di discriminare la natura dei segnali stessi. Per α=90° e δ=40 micron, la dinamica del segnale a seguito dell’avvicinamento dei magneti, corrispondente al tempo di cattura τC, vale 80 s nel caso del segnale da falsi positive associato ad un campione con ematocrito del 4% dovuto a globuli sani (non trattati) e 150 s nel caso di un campione con globuli rossi trattati con frazione volumetrica corrispondente ad una parassitemia dello 0.5%. Tale differenza permane anche nel caso dei tempi di rilascio τR, pari a 20 s e 60 s, rispettivamente. Conoscendo le dinamiche caratteristiche è pertanto possibile identificare una variazione di impedenza spuria, ad esempio dovuta a dei falsi positivi o ad altre fluttuazioni del sistema.

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 5 1. Apparato (100) per la quantificazione di componenti biologiche (3, 3’, 3’’) in un fluido comprendente: - una cella di misura (1) comprendente: ● una pluralità di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’); ● almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’), detto almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’) essendo configurato per attrarre magneticamente le componenti (3, 3’, 3’’) da quantificare e concentrare dette componenti sugli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’), detti elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, ‘6, 34, 34’) essendo posti in prossimità di detto almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’); ● almeno una coppia di elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) detti elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) essendo posti non in prossimità di detto almeno un concentratore (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’); ● un substrato (11) configurato per l’alloggiamento degli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’), degli elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) e dei concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’), detto substrato (11) comprendendo una prima superficie (11’) affacciata all’esterno di detta cella (1) e una seconda superficie (11’’) affacciata all’interno di detta cella (1); ● un supporto (12) comprendente una prima superficie (12’) affacciata all’esterno di detta cella (1) e una seconda superficie (12’’) affacciata all’interno di detta cella (1) e contrapposta alla seconda superficie (11’’) del substrato (11); ● almeno un elemento distanziatore (13, 13’), configurato per confinare il campione e distanziare detto substrato (11) da detto supporto (12); e ● un alloggiamento meccanico (600) configurato per alloggiare la cella (1) e per realizzare il contatto elettrico fra gli elettrodi (4, 4’, 5, 5’ 6, 6’, 34, 34’) e una scheda elettronica (202); - un'unità elettronica (201) connessa a detta scheda (202), detta unità elettronica (201) essendo configurata per la generazione dei segnali di ingresso, l’amplificazione dei segnali di uscita, la misura dell’impedenza tra gli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’), dell’impedenza tra gli elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) o della loro differenza, e la comunicazione con un’interfaccia utente; e - mezzi per la generazione di un campo magnetico (101, 102, 103) con intensità e gradiente modulabile nel tempo, detti mezzi essendo configurati per generare un campo magnetico in grado di causare, in combinazione con i concentratori (10, 10’, 10’’, 14, 14’, 14’’): - la separazione delle componenti (3, 3’, 3’’) da quantificare dal resto della soluzione; e - la concentrazione sugli elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’) delle componenti (3, 3’, 3’’) da quantificare.
2. 2. Apparato (100) secondo la rivendicazione 1, in cui detta cella di misura (1) comprende almeno una coppia una coppia di elettrodi di riferimento (7, 7’, 8, 8’, 9, 9’, 37, 37’) per ogni coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, ‘6, 34, 34’).
3. 3. Apparato (100) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la cella di misura (1) è fissata in una posizione inclinata tale per cui l’angolo tra la normale al substrato (11) di detta cella (1) e il vettore accelerazione di gravità è compreso tra 0° e 180°.
4. 4. Apparato (100) secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente un sistema meccanico configurato per far variare tra 0° e 180°, l’angolo tra la normale al substrato (11) della cella di misura (1) e il vettore accelerazione di gravità.
5. 5. Apparato (100) secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 4, comprendente un sistema microfluidico con fluidi precaricati (501) configurato per la diluizione del campione biologico e il trasporto entro la cella di misura (1).
6. 6. Apparato secondo la rivendicazione 5 in cui detto sistema microfluidico comprende: - mezzi per la raccolta del campione di fluido (500) e diluizione con fluidi precaricati (501) su una cartuccia (503); e - mezzi (504) per il trasporto del campione di fluido (500) diluito all’interno della cella di misura (1).
7. 7. Apparato secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui detto sistema microfluidico è configurato per la anticoagulazione del campione biologico, detto campione biologico contenendo sangue.
8. 8. Apparato secondo la rivendicazione 4 o 5 in cui il sistema microfluidico è integrato con la cella di misura (1), detto sistema microfluidico essendo almeno parzialmente contenuto nell’alloggiamento meccanico (600).
9. 9. Apparato (100) secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui detto almeno un elemento distanziatore (13, 13’) può essere a forma di anello opportunamente sagomato in modo da convogliare le componenti (3, 3’, 3’’) nella zona degli elettrodi.
10. 10. Apparato (100) secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui detti mezzi (101, 102, 103) per la generazione di un campo magnetico sono configurati per produrre variazioni nel tempo fino ad un valore massimo dell’intensità del campo, detto valore massimo essendo superiore al campo di saturazione dei concentratori (10, 10’,10”, 14, 14’, 14’’).
11. 11. Apparato (100) secondo la rivendicazione precedente, in cui detti mezzi (101, 102, 103) per la generazione di un campo magnetico sono configurati per produrre variazioni nel tempo di detto campo mediante un moto lineare di avvicinamento/allontanamento di detti mezzi (101, 102, 103) per la generazione di un campo magnetico a detto substrato (11).
12. 12. Apparato (100) secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui detti mezzi (101, 102, 103) per la generazione di un campo magnetico comprendono: - due magneti permanenti (101, 102) a forma di parallelepipedo a base quadrata o poligonale magnetizzati perpendicolarmente alle basi; e - un lamierino (103) di materiale ferromagnetico dolce posto tra detti due magneti permanenti (101, 102), fra le basi di detti magneti aventi la medesima polarità, detto lamierino (103) essendo configurato per concentrare le linee di campo nel piano di simmetria dell’insieme dei due magneti (101, 102).
13. 13. Apparato (100) secondo una qualunque delle rivendicazioni da 2 a 12, in cui: - il primo elettrodo (34) di ogni coppia di elettrodi di rivelazione (34, 34’) della cella di misura (1) è collegato al primo ingresso mediante una prima pista di collegamento (44); - il primo elettrodo (37) di ogni coppia di elettrodi di riferimento (37, 37’) è collegato al secondo ingresso mediante una seconda pista di collegamento (47); - il secondo elettrodo (34’) di ogni coppia di elettrodi di rivelazione (34, 34’) è collegato al nodo da cui viene emesso il segnale di uscita (Out) mediante una terza pista di collegamento (44’); e - il secondo elettrodo (37’) di ogni coppia di elettrodi di riferimento (37, 37’) è collegato al nodo da cui viene emesso detto segnale di uscita (Out) mediante una quarta pista di collegamento (47’); al di sopra di ognuna di dette piste di collegamento (44, 44’, 47, 47’) essendo posto uno strato isolante (40, 40’, 50, 50’) con costante dielettrica e spessore tali da rendere elevata l’impedenza fra dette piste di collegamento (44, 44’, 47, 47’) in modo tale da rendere trascurabile l’effetto di detta impedenza.
14. 14. Apparato (100) secondo la rivendicazione 13, in cui detto almeno un concentratore (14, 14’, 14’’) è di forma cilindrica, il diametro della superficie di base di detti concentratori (14, 14’, 14’’) essendo compreso tra 10 e 50 µm, l’altezza di detti concentratori (14, 14’, 14’’) essendo compresa tra 10 e 50 µm e la distanza tra detti concentratori (14, 14’, 14’’) essendo compresa tra 50 e 150 µm.
15. 15. Apparato (100) secondo la rivendicazione 13 o 14, in cui il primo elettrodo (4, 5, 6, 34) di detta almeno coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’) e il secondo elettrodo (4’, 5’, 6’, 34’) di detta almeno una coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’) sono a sezione rettangolare, con base compresa tra 10 e 300 nm e altezza compresa tra 1 e 3 µm.
16. 16. Apparato (100) secondo la rivendicazione precedente, in cui la distanza tra il primo elettrodo (4, 5, 6, 34) di detta almeno una coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’) e il secondo elettrodo (4’, 5’, 6’, 34’) di detta almeno una coppia di elettrodi di rivelazione (4, 4’, 5, 5’, 6, 6’, 34, 34’) è compresa tra 1 e 5 µm.