IT201800020812A1 - Applicazione di acido shikimico in formulazioni cosmetiche e dispositivi medici dedicati al cavo orale - Google Patents

Description

TITOLO: “Applicazione di acido shikimico in formulazioni cosmetiche e dispositivi medici dedicati al cavo orale”

DESCRIZIONE

CAMPO DELL’INVENZIONE

L’invenzione concerne l’uso di acido shikimico come antimicrobico del cavo orale.

STATO DELL’ARTE

La cavità orale ospita una popolazione microbica molto diversificata: sono presenti infatti più di 700 specie batteriche a cui si aggiungono protozoi, lieviti e micoplasmi.

La convivenza tra microrganismi e ospite è regolata da un rapporto di simbiosi e, quando questo rapporto muta come conseguenza a fattori esterni o legati all’ospite, possono insorgere fenomeni patologici.

La crescita di microrganismi nel cavo orale può essere favorita da diversi fattori quali le difese dell’ospite, la genetica, il pH, i farmaci, ma soprattutto una cattiva igiene orale che causa fenomeni di adesione batterica alle pareti dentali, specialmente nella zona subgengivale.

Affinché una colonia batterica patogena possa essere in grado di danneggiare l’ospite deve aderire alla superficie orale. La componente batterica infatti in presenza di glicoproteine, zuccheri ed enzimi, normalmente presenti nella saliva, può generare un biofilm che promuove l’adesività batterica, che a sua volta innesca lo sviluppo della placca. Il saccarosio, ad esempio, reagendo con la GTF (glucotrasferasi) dello Streptococcus Mutans produce glucano, un composto insolubile che aumenta l’adesività batterica.

La placca favorisce dunque il manifestarsi di patologie orali, come la carie e la parodontite. La carie dentale è una malattia degenerativa dei tessuti duri del dente. I batteri, adesi al dente attraverso la placca, intaccano la matrice minerale che costituisce il dente, metabolizzano gli zuccheri e producono acidi che consumando lo smalto, permettono la formazione di varchi, tramite i quali i batteri possono arrivare alla dentina e successivamente, ancora più in profondità, fino alla polpa del dente.

La parodontite è un’infiammazione dei tessuti parodontali che provoca una separazione progressiva ed irreversibile dei denti rispetto all’alveolo con conseguente formazione di tasche parodontali, mobilità dentale, sanguinamento gengivale, ascessi e suppurazioni, fino alla definitiva perdita di uno o più denti. L'eziopatogenesi della parodontite è complessa e non ancora del tutto chiara; comunque si ritiene che il periodonto, strutturalmente debole per cause ereditarie, sia recettivo a diversi fattori patogeni, quali malformazioni dentarie, diatesi artritica, disendocrinie, ipovitaminosi, emopatie, tartaro, ecc.

La presenza della placca può indurre un fenomeno infiammatorio a carico delle gengive che può espandersi fino ai tessuti sottostanti, degenerando in parodontite. L’equilibrio del microbioma orale è fondamentale per la salute dentale e per questo un suo squilibrio può provocare l’insorgere di varie patologie.

Infatti, un’alterazione del microbioma orale è anche responsabile dell’alitosi, del manifestarsi della candidosi orale e dell’insorgenza di ricorrenti stomatiti aftose<1>.

L’afta è un’ulcera dolorosa presente nel cavo orale dovuta ad una risposta immunitaria linfocita T mediata. Le cause non sono del tutto chiare, ma si ritiene che l’eziologia sia multifattoriale. Gli eventi scatenanti variano a seconda degli individui ed includono carenze nutrizionali, traumi locali, stress, influenze ormonali, allergie, predisposizione genetica e componenti virali. Esiste tuttavia una correlazione tra uno squilibrio del microbioma orale e la comparsa di stomatiti aftose. La stomatite è provocata dall’azione di microorganismi patogeni (virus, batteri, funghi), i più comuni dei quali sono i virus erpetici, gli stafilococchi e la candida.

In particolare, le persone affette da afte presentano una popolazione più numerosa di Bacteriodes fragilis (Gram negativi anaerobi come Prevotella Intermedia ) e di bacilli (come Staphylococcaceae e Streptococcaceae)<1>.

Nel cavo orale sono numerose le interazioni fra batteri che possono fungere da commensali o da antagonisti. Dunque, per un corretto equilibrio orale, è fondamentale che i ceppi batterici benefici, che fungono da antagonisti rispetto a ceppi patogeni, non vengano “estirpati” con l’utilizzo di dentifrici o collutori non selettivi.

L’acido shikimico (Figura 8), la cui nomenclatura IUPAC è acido (3R, 4S, 5R)-3,4,5-triidrossi-1-cicloesencarbossilico, è un intermedio biochimico, precursore di aminoacidi aromatici in piante e microrganismi, nonché precursore del noto farmaco antinfluenzale per il trattamento del virus dell’aviaria H5N1, Oseltamivir.

La sua fonte naturale è l’anice stellato cinese (Illicium verum) dal quale viene estratto sotto forma di polvere bianca microcristallina.

Il brevetto italiano N.0001392474, a nome della Richiedente, concerne l’uso di acido shikimico per il trattamento e la prevenzione di acne e forfora, per il controllo dell’odore corporeo e come agente esfoliante. Con particolare riferimento all’attività antiforfora, il brevetto insegna che l’acido shikimico è in grado di inibire la crescita batterica di Malassetia furfur, lievito coinvolto nello sviluppo della forfora del cuoio capelluto, in concentrazioni superiori al 5%.

In US20060018867 si descrive una composizione cosmetica contenente come agente antibatterico principale un addotto poliorganosilossano-epsilon-polilisina. Questa composizione cosmetica può eventualmente contenere anche bassi contenuti di un antibatterico scelto tra una lunga lista di principi attivi tra cui è contemplato anche l’acido shikimico.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La Richiedente ha ora individuato una nuova ed interessante applicazione di acido shikimico in formulazioni dedicate all’igiene del cavo orale.

L’acido shikimico, ad opportune concentrazioni d’uso, è in grado di inibire la proliferazione di microrganismi patogeni senza intaccare i batteri commensali benefici presenti nel cavo orale e senza irritare la mucosa orale. Viene quindi garantito l’equilibrio del microbioma orale che, come tale, ha un ruolo importante nel mantenimento della salute dentale e nella prevenzione di patologie del cavo orale.

Oggetto della presente invenzione è una composizione comprendente acido shikimico, in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti, per uso nel mantenimento dell’igiene del cavo orale in cui l’acido shikimico ha una concentrazione [c] compresa tra 0,1% ≤ [c] ≤ 2%.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1 (a, b, c, d): Ceppi, condizioni di crescita e inoculo dei batteri utilizzati per la determinazione della MIC (minima concentrazione inibente) di acido shikimico nei confronti di: patogeni periodontali a) Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans; b) Porphyromonas gingivalis; ceppi benefici c) Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri e Lactobacillus rhamnosus; d) Streptococcus salivarius e Lactobacillus reuteri.

Figura 2 (a, b, c, d): Determinazione della MIC di acido shikimico nei confronti di: patogeni periodontali a) Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans; b) Porphyromonas gingivalis; ceppi benefici c) Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri e Lactobacillus rhamnosus; d) Streptococcus salivarius e Lactobacillus reuteri.

Figura 3: Ceppo e inoculo utilizzato per la determinazione dell’efficacia antimicrobica di acido shikimico nei confronti di Prevotella intermedia.

Figura 4: Conte microbiche totali di Prevotella intermedia a differenti concentrazioni di acido shikimico (CFU/ml).

Figura 5: Abbattimento della crescita microbica di Prevotella intermedia a diverse concentrazioni di acido shikimico.

Figura 6: Dati relativi ai requisiti di accettabilità del test di vitalità cellulare MTT. I criteri di accettabilità del test sono soddisfatti.

Figura 7: Risultati del test di valutazione del potenziale di irritazione cutanea di acido shikimico sull’epitelio orale (in vitro).

Figura 8: Rappresentazione di una molecola di acido shikimico

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Il cavo orale comprende i due terzi anteriori della lingua, le gengive, la superficie interna delle guance e delle labbra, la parte inferiore della bocca sotto la lingua (il pavimento orale), la parte superiore ossea della bocca (il palato duro) e la zona oltre i denti del giudizio (il trigono retro molare).

La composizione oggetto della presente invenzione è finalizzata al mantenimento dell’igiene del cavo orale, dove per mantenimento dell’igiene si intende l’insieme delle operazioni volte alla prevenzione ed al ripristino di questa, in condizioni di disbiosi orale.

Nelle disbiosi l'equilibrio finemente sintonizzato del microbioma orale viene interrotto, permettendo ai batteri patogeni di promuovere l’insorgenza di patologie.

I microorganismi (il microbiota) che costituiscono il microbioma umano non sono solo organismi unicellulari che vivono l'uno accanto all'altro, ma formano comunità altamente regolamentate, strutturalmente e funzionalmente collegate alle superfici dei tessuti sotto forma di biofilm, con collaborazioni inter-specie e antagonismi che contribuiscono alla stabilità del microbioma.

I batteri all'interno di un biofilm possono comunicare tra loro producendo, rilevando e rispondendo a piccole molecole segnale diffusibili. Le attività sensoriali nei biofilm sono anche coinvolte nella virulenza e nel potenziale patogeno dei batteri e sono quindi un fattore importante nella comprensione e nel controllo delle infezioni batteriche, poiché consentono ai microrganismi nei biofilm di diventare più tolleranti alle difese dell'ospite e agli agenti antimicrobici<3>.

In questo senso i lattobacilli svolgono un’importante funzione nel microbioma orale: è stato dimostrato che questi batteri sono “colonizzatori” benefici del cavo orale e che ’utilizzo di probiotici riduce la patogenicità e la cariogenicità potenziale dei microrganismi presenti sul biofilm.

Nel network microbico del biofilm, i lattobacilli sono coinvolti nell’antagonismo verso patogeni, nell’aggregazione con i batteri orali nel biofilm, con conseguente modulazione dello stesso, e nell’aumento della resistenza alle infezioni, con conseguente regolazione della risposta immunitaria.

Modulando pertanto la composizione del biofilm, i lattobacilli sono in grado di afforzare la funzione barriera dell’epitelio buccale.

n particolare, il Lactobacillus Reuteri favorisce la co-aggregazione ed il Lactobacillus Rhamnosus modula la risposta immunitaria. Uno studio riporta che, in un cavo orale sano, è presente una notevole popolazione di Lactobacilli Gasseri e Fermentum, a differenza di quello affetto da parodontite, in cui tale popolazione risulta del tutto assente<4>. Studi recenti consigliano l’inserimento di probiotici nei dentifrici per la prevenzione delle carie<5>.

noltre, alcune specie di lactobacilli, come il Lactobacillus Rhamnosus, possono antagonizzare la colonizzazione dell’ospite da parte di Candida Albicans. Sono infatti documentati una serie di meccanismi inibitori che conferiscono a questi Lattobacilli probiotici attività fungicida sulla Candida, supportandone la loro utilità nella terapia delle infezioni orali indotte da Candida<6>.

È noto che i principali batteri direttamente coinvolti nella formazione delle carie, parodontiti, afte ed altre principali infezioni del cavo orale sono Streptococcus Mutans, Prevotella Intermedia, Stafilococcus Aureus.

Anche il Porphyromonas gingivalis, un batterio Gram-negativo di tipo anaerobico che colonizza l’epitelio orale, ha un ruolo nella patogenesi delle periodontiti, dove sembra agire quale promotore della disbiosi del microbiota<7>. È stato inoltre osservato che la amiglia batterica di Porphyromonadaceae associate a disturbi periodontali e quella di Veillonellaceae predominano nelle regioni ulcerose di soggetti affetti da afte rispetto a soggetti sani; non è stata osservata alcuna differenza di crescita significativa di tali amiglie nelle regioni intatte della mucosa, tra soggetti sani e individui affetti da afte buccali<1>.

Alla luce della notevole importanza che il microbioma riveste nell’igiene del cavo orale e della necessità di mantenerlo inalterato per garantire un generale stato di benessere, la Richiedente ha individuato un’efficace azione di acido shikimico nell’inibire in maniera selettiva la crescita microbica di ceppi patogeni, mantenendo inalterata la vitalità dei ceppi benefici.

In particolare, l’acido shikimico, a concentrazioni d’uso comprese tra 0,1-2% (p/p), rispetta il microbioma orale proteggendolo dall’azione dei ceppi patogeni, quali Streptococcus Mutans, Prevotella Intermedia e Stafilococcus Aureus e nello stesso tempo non interferisce sulla proliferazione dei ceppi benefici (Lactobacillus Gasseri, L. Fermentum, L. Rhamnosus e L. Reuteri), dimostrandosi un valido aiuto per contrastare la problematica, mantenendo inalterata la flora naturale (benefica) presente nel cavo orale.

La composizione oggetto dell’invenzione comprende quindi una concentrazione di acido shikimico maggiore e uguale a 0,1% e minore e uguale a 2,0% (p/p).

Come risulterà meglio dalla sezione della domanda dedicata ai dati sperimentali, tale quota di attivo (0,1% ≤ [c] ≤ 2,0% p/p) corrisponde preferibilmente alla minima concentrazione di acido shikimico inibente (MIC) la crescita microbica dei ceppi batterici patogeni Prevotella intermedia, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus.

Negli scopi dell’invenzione, per MIC (minima concentrazione inibente) si intende la concentrazione (%) più bassa di prodotto in grado di inibire almeno il 90% della crescita microbica. La MIC viene preferibilmente determinata con metodo turbidimetrico, diluendo il campione a dosi scalari, in presenza di inoculo microbico e valutando la capacità della sostanza di inibire la proliferazione microbica dopo un tempo di contatto di 24 o 72 ore.

Secondo una forma di realizzazione preferita, la composizione comprende una concentrazione di acido shikimico compresa tra 0,1% e 1,0% (p/p).

Si noti che l’acido shikimico ha vantaggiosamente una MIC compresa tra 0,1% e 0,5% (p/p) nei confronti dei ceppi batterici Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans.

L’acido shikimico ha vantaggiosamente una MIC compresa tra 0,5% e 1% (p/p) nei confronti del ceppo batterico Prevotella intermedia.

La composizione dell’invenzione è preferibilmente realizzata in forma di prodotto cosmetico o di dispositivo medico.

Ai sensi del regolamento Regolamento (CE) n.1223/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio del 30 novembre 2009, per prodotto cosmetico si intende qualsiasi sostanza o miscela, destinata ad essere applicata sulle superfici esterne del corpo umano (epidermide, sistema pilifero e capelli, unghie, labbra, organi genitali esterni) oppure sui denti e sulle mucose della bocca allo scopo, esclusivamente o prevalentemente di pulirli, profumarli, modificarne l’aspetto, proteggerli, mantenerli in buono stato o correggere gli odori corporei.

Per dispositivo medico si intende un qualunque prodotto, utilizzato da solo o in combinazione, destinato ad essere impiegato sull’uomo a fini di:

- diagnosi, prevenzione, controllo, trattamento o attenuazione di malattie,

- diagnosi, controllo, trattamento, attenuazione o compensazione di una ferita o di un handicap,

- studio, sostituzione o modifica dell’anatomia oppure di un processo fisiologico,

che non eserciti nel o sul corpo umano l’azione principale cui è destinato con mezzi farmacologici, immunologici o mediante processi metabolici, ma la cui funzione possa essere coadiuvata da tali mezzi (Direttiva 2007/47/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 5 settembre 2007).

Secondo la forma di realizzazione preferita, la composizione, quando in forma di dispositivo medico, può essere un dispositivo medico di classe I, di classe II, preferibilmente classe IIa, o di classe III, così come da Direttiva 93/42/CEE del Consiglio, del 14 giugno 1993.

La composizione secondo l’invenzione, sia essa un prodotto cosmetico o un dispositivo medico, è preferibilmente realizzata in forma di composizione liquida, fluida, semi-fluida o consistente.

La composizione secondo l’invenzione, quando in forma di prodotto cosmetico, è preferibilmente realizzata in forma di collutorio, dentifricio, gel o pasta.

La composizione secondo l’invenzione, quanto in forma di dispositivo medico, è preferibilmente realizzata in forma di collutorio o gel.

Si noti che, negli scopi della presente invenzione composizioni in forma di gel o in forma di pasta possono essere sia composizioni idonee all’applicazione topica su aree specifiche della mucosa orale (ad esempio gengive e afte), sia composizioni dentifricie in forma di gel o di pasta, idonee alla pulizia, alla manutenzione dell'estetica ed alla salute dei denti.

La composizione secondo l’invenzione è preferibilmente impiegata nella prevenzione e nel trattamento di disturbi del cavo orale scelti nel gruppo costituito da alitosi, stomatiti aftose, placca, candidosi, carie e parodontiti.

Dai risultati ottenuti nei test sperimentali presentati di seguito, si evince che per ottenere un abbattimento di carica microbica patogena (S. mutans, S. Aureus, P. Intermedia) è necessaria una minima quota di acido shikimico (0,1-1,0%), mentre relativamente all’abbattimento della carica batterica benefica (L. Fermentum, L.Gausseri, L. Rhamnosus, L. Reuteri) è necessaria una sua concentrazione da 5 a 10%. Pertanto, alla concentrazione d’uso consigliata (0,1-2%) l’acido shikimico ha un’azione selettiva esclusivamente sulla componente batterica patogena.

Si noti che, per quanto concerne l’inibizione della Candida Albicans, la MIC di acido shikimico è determinata essere del 5%, e quindi al di sopra delle concentrazioni d’uso raccomandate. Senza voler essere vincolati ad alcuna teoria, la Richiedente ritiene tuttavia che l’acido shikimico ad una concentrazione ≥ 0,1% e ≤ 2,0% (p/p) sia comunque attivo nella prevenzione e nel trattamento delle candidosi orali, poiché la candidosi orale si sviluppa spesso in presenza di un microbioma alterato.

In tal senso, si ritiene che l’azione protettiva di acido shikimico sui ceppi benefici orali si vada a sommare all’azione diretta sul fungo, rendendo l’attivo efficace anche su questo ceppo.

La determinazione sperimentale delle MIC di acido shikimico nei confronti di ceppi batterici patogeni ha inoltre rilevato come tale molecola non mostri un’attività inibente della crescita di Porphyromonas gingivalis alle concentrazioni d’uso raccomandate (0,1% ≤ [c] ≤ 2,0 % p/p). Si è notato altresì che ad una concentrazione di acido shikimico pari a 10% (p/p) si osserva un aumento della crescita di P.gingivalis. In tal senso, è opportuno segnalare come un aumento della concentrazione dell’attivo non abbia efficacia dose-dipendente sull’inibizione della specie batterica di interesse.

Si noti inoltre che, la determinazione della MIC su ceppi batterici di Streptococcus salivarius (ceppo benefico colonizzante il cavo orale) ha rivelato che l’inibizione di almeno il 90% della crescita di tale batterio è ottenuta già a concentrazioni di acido shikimico di 1% (p/p), ossia entro l’intervallo di concentrazioni di acido shikimico raccomandate per la realizzazione della composizione di interesse.

La Richiedente in ogni caso ritiene che questo dato non infici l’efficacia antibatterica della composizione oggetto dell’invenzione nel mantenimento dell’igiene del cavo orale.

Altresì, preso atto di questo dato, il tecnico del settore potrà impiegare acido shikimico a concentrazioni inferiori a 1% (p/p) qualora intenda indirizzare l’attività antibatterica dell’attivo verso specifici patogeni sensibili allo stesso, combinandolo con altri antibatterici noti che abbiano MIC idonee all’abbattimento della carica batterica patogena delle specie insensibili all’acido shikimico a concentrazioni inferiore a 1% (p/p). Tale procedura può essere talvolta utile nel caso di sviluppo di resistenze dei patogeni verso specifici antibatterici.

DATI SPERIMENTALI

1. Determinazione della MIC (Minima Concentrazione Inibente) – Metodo turbidimetrico

1.1.Scopo del test

Nel presente studio l’efficacia antimicrobica di una sostanza viene indagata mediante la determinazione della sua MIC (Minima Concentrazione Inibente), ossia la sua capacità di inibire la proliferazione microbica nei confronti di uno o più ceppi microbici. La capacità della sostanza di inibire la proliferazione microbica viene saggiata diluendo il campione a dosi scalari in presenza dell’inoculo microbico.

Nel caso specifico la sostanza è acido shikimico su cui viene valutata l’efficacia antimicrobica nei confronti di:

alcuni patogeni periodontali

a) Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans;

b) Porphyromonas gingivalis;

alcuni ceppi benefici del cavo orale

c) Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri e Lactobacillus rhamnosus;

d) Streptococcus salivarius e Lactobacillus reuteri.

La crescita microbica è misurata come assorbanza a 650 nm e convertita in CFU/ml utilizzando una curva standard predeterminata per ciascun ceppo testato; la MIC viene determinata calcolando l’abbattimento della crescita microbica dopo 24 ore di contatto rispetto all’inoculo. Il test è condotto in triplicato in microdiluizione.

1.2. Ceppi utilizzati e metodica

Il ceppo liofilizzato originale è stato fatto crescere in opportuno terreno di crescita liquido e piastrato su terreno solido isolando singole colonie che sono poi state amplificate e congelate a -30°C, in aliquote a titolo noto. La preparazione dei ceppi per il test è stata effettuata partendo da un’aliquota scongelata, ripresa in terreno liquido, isolata e quindi lasciata crescere incubando nelle corrispettive condizioni di crescita del ceppo (Si vedano Figure 1a, 1b, 1c, 1d).

Il campione viene testato alle seguenti concentrazioni:

10% – 5% – 1% – 0,5% – 0,1%.

Il campione è stato diluito in

a) Tryptic Soy Broth per i batteri e Saboraud Dextrose Broth per C.albicans;

b) Supplemented Tryptic Soy Broth;

c) MRS Broth;

d) Tryptic Soy Broth per Streptococcus salivarius e in De Man, Rogosa and Sharpe Broth per Lactobacillus reuteri;

ciascuna diluizione viene inoculata con 10<3 >- 10<5 >CFU/ml del ceppo microbico di interesse e posta ad incubare per 24 ore nelle opportune condizioni di crescita. Il test viene eseguito in microdiluizione, in un volume finale di 200 μl.

Dopo il periodo di incubazione, viene valutata la torbidità delle brodocolture attraverso una misura dell’assorbanza a 650 nm tramite spettrofotometro. Nel saggio vengono inseriti opportuni controlli: brodocoltura inoculata con i ceppi in assenza del campione come controllo positivo e campione diluito in brodo alle diverse concentrazioni come controllo negativo (bianco).

Nel caso (c) è stato misurato il pH a ciascuna delle concentrazioni testate in entrambi i terreni.

1.3. Interpretazione dei risultati

La media dei dati registrati dallo spettrofotometro per ciascuna concentrazione testata e per i controlli viene interpolata con la curva standard del ceppo microbico in esame al fine di convertire il valore di assorbanza in CFU/ml.

L’inibizione della crescita microbica viene calcolata in percentuale attraverso la seguente formula:

Inibizione (%) = 100 - ((B/A) *100 ) ;;dove ;A: numero di cellule vitali (CFU/ml) nel controllo ;;B: numero di cellule vitali (CFU/ml) nel campione alla concentrazione testata ;La MIC viene considerata la concentrazione più bassa di prodotto in grado di dare un’inibizione della crescita di almeno il 90%. ;;1.4. RISULTATI ;;Si rimanda alle Figure 2a, 2b e 2c e 2d per i risultati ottenuti dal test. ;;1.5. Conclusioni ;;Sulla base dei risultati sopra riportati, l’acido shikimico mostra le seguenti MIC nei confronti dei ceppi testati: ;;;CEPPO MIC ;Candida albicans 5% Staphylococcus aureus 0,1% Streptococcus mutans 0,5% Porphyromonas gingivalis / ;Lactobacillus fermentum 5% ;Lactobacillus gasseri 10% ;Lactobacillus rhamnosus 5% ;Lactobacillus reuteri >10% Streptococcus salivarius 1% ;;Tabella 1.5.1 ;;Si noti che alla concentrazione di campione più alta (10%) si osserva un aumento della crescita di P.gingivalis. Il prodotto, alle concentrazioni testate non mostra attività inibente verso Porphyromonas gingivalis, pertanto non è stato possibile determinare una MIC. ;;2. Valutazione dell’efficacia antimicrobica ;;2.1. Scopo del test ;;Lo scopo del test è valutare l’efficacia antimicrobica di materie prime o prodotti finiti nei confronti di uno o più ceppi microbici. ;;Nel caso specifico la materia prima è acido shikimico su cui viene valutata l’efficacia antimicrobica nei confronti di Prevotella intermedia, patogeno periodontale. L’attività antimicrobica del campione viene valutata, calcolando l’abbattimento della crescita microbica dopo 72 ore di contatto rispetto all’inoculo, in medium liquido. Il test è condotto in duplicato. ;;2.2. Ceppi utilizzati e metodica ;;Il ceppo liofilizzato originale è stato fatto crescere in opportuno terreno di crescita liquido e piastrato su terreno solido isolando singole colonie che sono poi state amplificate e congelate a -30°C, in aliquote a titolo noto. La preparazione dei ceppi per il test è stata effettuata partendo da un’aliquota scongelata, ripresa in terreno liquido, isolata e quindi lasciata crescere incubando nelle corrispettive condizioni di crescita del ceppo (Si veda la Figura 3). ;;Il campione viene testato in 10 ml di brodocoltura alle seguenti concentrazioni: ;;;10% – 5% – 1% – 0,5% – 0,1% ;;Ciascuna diluizione viene inoculata con 10<4 >- 10<5 >CFU/ml del ceppo microbico di interesse e posta ad incubare per 72 ore nelle opportune condizioni di crescita. ;;Si procede con il metodo della conta in piastra per determinare il numero di CFU/ml presenti a ciascuna concentrazione dopo il periodo di incubazione prelevando 1 ml di brodocoltura e diluendolo in 9 ml della soluzione neutralizzante (Tabella 2.2.2) per arrestare l’effetto antimicrobico del campione; ciascuna diluizione viene quindi piastrata per inclusione e posta ad incubare nelle opportune condizioni di crescita (la Tabella 2.2.1 riassume terreni e condizioni di crescita di ciascun ceppo microbico). ;Nel saggio vengono inseriti opportuni controlli: brodocoltura inoculata con i ceppi in assenza del campione come controllo positivo e brodocoltura in assenza di ceppi come controllo di sterilità. ;;Tabella 2.2.2 ;;Polysorbate 80 30 g/L ;Lecithin 3 g/L ;L-histidine 1 g/L ;Sodium thiosulphate 5 g/L ;Peptone 9 g/L ;Sodium chloride 9 g/L ;;2.3. Interpretazione dei risultati ;L’inibizione della crescita microbica viene calcolata in percentuale attraverso la seguente formula: ;;Inibizione (%) = 100 - ( (B/A) *100 )

dove

A: numero di cellule vitali (CFU/ml) nel controllo

B: numero di cellule vitali (CFU/ml) nel campione alla concentrazione testata

Il campione viene considerato efficace quando mostri un abbattimento della carica microbica di almeno 1 log rispetto all’inoculo, ossia un’inibizione della crescita di almeno il 90%.

2.4. Risultati

Si rimanda alla Figura 4 per i risultati relativi alla conta microbica totale a differenti concentrazioni del campione (CFU/mL) ed alla Figura 5 per l’abbattimento della crescita microbica.

2.5. Conclusioni

Sulla base dei risultati sopra riportati, l’acido shikimico mostra un abbattimento della carica microbica > 90% nei confronti di Prevotella intermedia alla concentrazione 1%.

Riferimenti bibliografici

Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices.2009. Clin Infect Dis. 49(11):1749-55.

ISO 21148 – International Standard: Cosmetics – Microbiology – General instructions for microbiological examination, 2009

ISO 21149 – International Standard: Cosmetics – Microbiology – Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria, 2006

ISO 16212 – International Standard: Cosmetics – Microbiology – Enumeration of yeast and mould, 2008

3. VALUTAZIONE IN VITRO DEL POTENZIALE DI IRRITAZIONE DI UNA MATERIA PRIMA SU EPITELIO ORALE

3.1. Materie prime

Campione Descrizione

Acido Shikimico Polvere bianca

Il campione è stato testato diluito al 2% in acqua distillata.

Controlli Lotto

Sodio lauril solfato (SLS) [151-21-3] BCBQ8381V

Controllo positivo (PC)

Acqua distillata

Acqua distillata

Controllo negativo (CN)

3.2 Scopo del test:

I metodi in vitro costituiscono un'interessante alternativa ai metodi classici in vivo per la valutazione delle caratteristiche biologiche di ingredienti e prodotti finiti cosmetici o per uso topico, in accordo con quanto stabilito dalle normative correnti che richiedono ai produttori cosmetici di verificare la sicurezza d'uso dei prodotti evitando l'impiego di animali (Basic Council Directive N° 76/768/ EEC del 27/07/76, EC L.

262 del 27/09/1976; VI Amendment Council Directive 93/35 EEC del 14/06/1993 ECL.151 del 23/06/1993).

Il saggio di citotossicità può essere eseguito al fine di valutare la potenziale irritazione di un prodotto o di un ingrediente o miscela di ingredienti utilizzando colture di cellule di epitelio orale di origine umana ricostituite in vitro a formare un tessuto. Il test in vitro condotto su tessuti ricostituiti in genere risulta essere un metodo sperimentale semplificato, ma in grado di dare molte informazioni sulle reazioni che possono verificarsi in vivo. I prodotti cosmetici sono applicati direttamente sulla cute, spesso a contatto con le mucose, e dovrebbero quindi avere impatto tossicologico nullo o molto basso nei confronti delle cellule di derivazione cutanea.

L'obiettivo di questo test è stabilire quantitativamente gli effetti del prodotto testato sulla proliferazione cellulare attraverso il test di vitalità cellulare con colorazione con MTT. Questo metodo colorimetrico si basa sulla misura indiretta della vitalità cellulare attraverso la capacità di un enzima mitocondriale, la succinato deidrogenasi, di metabolizzare un substrato quale i sali di tetrazolio.

3.3. Esecuzione del test

Il modello cellulare utilizzato per il test in vitro è rappresentato da epitelio orale umano ricostituito in vitro. Questo modello cellulare tridimensionale è costituito da unità di 0,5 cm<2 >di diametro di colture di cellule epiteliali della mucosa orale normali, mantenute per 5 giorni in terreno di coltura chimicamente definito e in

contatto con l’aria su filtri di policarbonato inerti. Il modello è stato acquistato da Sterlab (Vallauris, Lotto 1710BUC01).

Il prodotto finito è stato applicato diluito al 2% in acqua distillata correggendo il pH a 5,16 su ogni campione di epitelio, in duplicato. Il controllo positivo SLS (Sodium Lauryl Sulfate) è stato sciolto allo 0,5% in acqua distillata mentre cellule trattate con solo acqua distillata sono state utilizzate come controllo negativo.

L’esposizione è stata effettuata per 1, 4 e 16 ore a 37°C, 5% CO2. Al termine dell’esposizione si è proceduto ad effettuare lavaggi con PBS per asportare il prodotto e valutare la vitalità cellulare tramite il test MTT.

3.4. Test di vitalità cellulare MTT

L’epitelio è stato incubato per 3h a 37°C con una soluzione 1mg/ml di MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide). Quindi la soluzione è stata rimossa e sostituita con isopropanolo con successive 2 h di incubazione a temperatura ambiente. Due aliquote di ogni campione vengono trasferite in una piastra da 96 pozzetti per la lettura dell’assorbanza, che viene eseguita alla lunghezza d’onda di 570 nm, con un colorimetro (Tecan modello Sunrise remote) equipaggiato con un lettore di piastre.

3.5. Espressione dei risultati

I dati di citotossicità ottenuti con il test MTT sono messi in grafico contro i tempi di esposizione, creando una curva dose-risposta, che permette di determinare il valore teorico di ET50 ovvero il tempo in minuti che induce una riduzione della vitalità cellulare del 50% nell’epitelio rispetto alle cellule non trattate.

Il valore ET50 indica il tempo in minuti necessario per inibire la vitalità cellulare del 50% dopo esposizione ad un composto.

3.6. Criteri di accettabilità del metodo

Per il controllo negativo (CN): il valore medio di OD delle tre repliche deve essere ≥ 1,0 e ≤ 2,5;

la deviazione standard deve essere ≤ 18%.

Per il controllo positivo (CP): il valore medio di vitalità (espresso come % rispetto al CN) deve essere < 20%;

la deviazione standard deve essere ≤ 18%.

Per il campione: la deviazione standard deve essere ≤ 18%.

3.7. Interpretazione dei risultati

L’interpretazione del risultato viene effettuata paragonando l’ET50 del campione con quella di un leggero irritante, SLS allo 0,5%.

3.8. RISULTATI

Si rimanda alla Figura 6 per la valutazione dei valori di accettabilità del test, ed alla Figura 7 per i risultati emersi dalla valutazione del potenziale di irritazione cutanea.

I criteri di accettabilità del test (vedi § 3.6) sono conformi, quindi il test è considerato valido.

3.9. Conclusioni

Sulla base dei risultati sopra riportati, l’acido shikimico è risultato essere privo di potenziale irritante per la mucosa orale.

Riferimenti bibliografici

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- Liebsch M., Traue D., Barabas C., Spielmann H., Uphill P., Wilkins S., McPherson D., Wiemann C., Kaufmann T., RammeleM., HolzhutterH.G., Brantom P., Aspin P., Southee J.A. (2000). Prevalidation of EpiDermTM skin corrivity test. ATLA 28: 371-401.

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ESEMPI

Si riportano di seguito, a scopo illustrativo e non limitativo, esempi di composizioni comprendenti acido shikimico secondo la presente invenzione.

COLLUTORIO

Miscela Tensioattiva/Solubilizzante 0.5-2.0%

Sistema conservante e chelante 0.5-1.0%

Additivo reologico (eventuale) 0.2-0.5%

Alcol (eventuale) 2.0-5.0%

Sistema funzionale 4.0-8.0%

Principio attivo (Acido shikimico) 0.1-0.5%

Principi attivi complementari 0.01-0.2%

Aromi e coloranti 0.0002-0.2%

Regolatore di pH q.b. a pH desiderato

Aqua q.b.

GEL DENTIFRICIO (idrogel)

Miscela Tensioattiva/Solubilizzante 1.0-4.0%

Sistema conservante e chelante 0.5-1.0%

Additivo reologico 0.3-1.0%

Agente abrasivo 10.0-15.0%

Umettanti 60.0-70.0%

Principio attivo (Acido shikimico) 0.5-1.5%

Aromi e coloranti 0.1-1.5%

Regolatore di pH q.b. a pH desiderato

Aqua q.b.

PASTA DENTIFRICIA (preparazione ad alto contenuto di polveri sbiancanti e opacanti)

Miscela Tensioattiva 1.0-3.0%

Sistema conservante e chelante 0.5-1.0%

Additivo reologico 0.5-2.0%

Umettanti 62.0-70.0%

Principio attivo (Acido shikimico) 0.5-1.5%

Polveri sbiancanti e abrasive 1.0-15.0%

Aromi e coloranti 0.1-1.0%

Regolatore di pH q.b. a pH desiderato

Aqua q.b.

BIBLIOGRAFIA

1. K. Hijazi, T. Lowe, C. Meharg, S.H. Berry, J. Foley and G.L. Hold Mucosal Microbiome in patients with recurrent Aphthous stomatitis. JDR Clinical Research Supplement, 2015, 94, issue 3, suppl no.1

2. https://www.medeco.de/it/odontostomatologia/anatomia/cavita-orale/strutturadella-cavita-orale/

3. The oral microbiome – an update for oral healthcare professionals M. Kilian, I. L. C. Chapple, M. Hannig, P. D. Marsh, V. Meuric, A. M. L. Pedersen, M. S. Tonetti, W. G. Wade & E. Zaura, BDJ volume 221, pages 657–666 (18 November 2016).

4. S.A. Mahasneh, and A. M. Mahasneh. Probiotics: A Promising Role in Dental Health. Dentistry Journal, 2017, 5(4) , 26

5. M. G. Cagetti, S. Mastroberardino, E. Milia, F. Cocco, P. Lingström and G. Campus. The Use of Probiotic Strains in Caries Prevention: A Systematic Review. Nutrients, 2013, 5, 2530-2550

6. W.Y. Matsubara VH, B. HM, MP Mayer, L.P. Samaranayake , Probiotic lactobacilli inhibit early stages of Candida albicans biofilm development by reducing their growth, cell adhesion, and filamentation. Applied Microbiology Biotechnology. 2016; 100 (14), 6415-26

7. J. Mysak, S. Podzimek, P. Sommerova, Y. Lyuya-Mi, J. Bartova, T. Janatova, J. Prochazkova, J. Duskova. Porphyromonas gingivalis: Major Periodontopathic Pathogen Overview. Journal of Immunology Research.2014; 2014: 476068.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI: 1. Composizione comprendente acido shikimico, in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti, per uso nel mantenimento dell’igiene della cavità orale in cui l’acido shikimico ha una concentrazione ≥ 0,1% e ≤ 2,0% (p/p).
2. 2. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 1 in cui l’acido shikimico ha una concentrazione ≥ 0,1% e ≤1,0% (p/p).
3. 3. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui la minima concentrazione inibente (MIC) di acido shikimico è ≥ 0,1% e ≤ 2,0% (p/p) nei confronti di Prevotella intermedia, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus.
4. 4. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 3, in cui la MIC di acido shikimico è ≥ 0,1% e ≤ 0,5% (p/p) nei confronti di Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus.
5. 5. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 3 in cui la MIC di acido shikimico è ≥ 0,5% e ≤ 1,0% (p/p) nei confronti di Prevotella intermedia.
6. 6. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in forma di prodotto cosmetico o di dispositivo medico.
7. 7. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 6 in cui il prodotto cosmetico è in forma di collutorio, dentifricio, gel o pasta.
8. 8. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 6 in cui il dispositivo medico è in forma di collutorio o gel.
9. 9. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 nella prevenzione e nel trattamento di disturbi del cavo orale scelti nel gruppo costituito da alitosi, stomatiti aftose, placca, candidosi, carie e parodontiti.