IT201800008192A1

IT201800008192A1 - Microsfere di acido ialuronico reticolato con urea e contenenti almeno un agente attivo o farmaco

Info

Publication number: IT201800008192A1
Application number: IT102018000008192A
Authority: IT
Inventors: Arianna Fallacara; Silvia Vertuani; Stefano Manfredini; Ugo Raffaello Citernesi
Original assignee: Ira St Ricerche Applicate Spa
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2018-08-27
Publication date: 2020-02-27

Description

Descrizione di Brevetto di Invenzione Industriale avente per titolo:

“Microsfere di acido ialuronico reticolato con urea e contenenti almeno un agente attivo o farmaco”

CAMPO TECNICO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce a microsfere di acido ialuronico reticolato con urea e comprendenti almeno un agente attivo o farmaco, alla modalità per l’ottenimento di queste microsfere e alle loro applicazioni medicali, farmaceutiche e/o cosmetiche, in particolare per la pelle, gli annessi cutanei e/o le mucose, o alle loro applicazioni dietetico-alimentari.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

L’acido ialuronico è un glicosaminoglicano di origine naturale, ovvero un polisaccaride lineare prodotto dalla condensazione di migliaia di unità disaccaridiche formate a loro volta da residui di acido glucuronico e N-acetilglucosammina, legati tra loro da legami glicosidici nonché da legami a idrogeno intramolecolari.

Spesso l’acido ialuronico è presente come un suo sale (ad esempio sale di sodio, di potassio o di calcio). Nella presente trattazione, si indicherà con HA sia l’acido ialuronico che un suo sale e ciò sarà considerato indistintamente, a meno che non venga espressamente indicato il contrario.

L’HA è diffuso in numerosi distretti del corpo umano ed è, infatti, uno dei componenti fondamentali dei tessuti connettivi dell’uomo e degli altri mammiferi.

L’HA si trova, ad esempio, nella matrice extracellulare, nel derma cutaneo, nel vitreo acquoso, nella cartilagine ialina, nei fluidi sinoviali, nel cordone ombelicale, eccetera. Tra le numerose funzioni biologiche note dell’HA e tra le sue proprietà si possono ricordare, ad esempio, le seguenti: biocompatibilità, biodegradabilità, muco-adesività, proprietà idratanti, lubrificanti, azione come riempitivo, come agente per la cura o il trattamento delle ferite e dei processi infiammatori, eccetera.

Grazie a queste sue caratteristiche, l’HA è stato utilizzato in svariate applicazioni nel settore medico, farmaceutico e cosmetico, oltre a rappresentare un interessante materiale - frequentemente associato ad altri ingredienti attivi o eccipienti - usato nel settore dell’ingegneria tissutale, per il rilascio di farmaci o per la visco-supplementazione (es. mediante iniezioni sottocutanee).

Al fine di migliorarne le proprietà, spesso l’HA viene reticolato con molecole bifunzionali di origine sintetica, quali ad esempio il sulfone divinilico (divinyl sulfone) e l’etere diglicilico (diglycidyl ether) ma - di recente - si è preferito reticolare tale polimero con sostanze aventi una bassa tossicità ed un’attività intrinseca a favore della salute dell’uomo.

In particolare, il richiedente della presente domanda ha precedentemente messo a punto una metodica di reticolazione di HA con urea, e tale composto reticolato trova applicazioni in ambito estetico come riempitivo dermico o per iniezioni sottocutanee di riempimento.

L’urea (o carbammide o ancora carbonildiammide - si tratta infatti della diammide dell'acido carbonico) è una molecola naturalmente presente nel corpo umano ed è spesso utilizzata come sostanza attiva. In quanto tale, viene ampiamente utilizzata in formulazioni farmaceutiche o cosmetiche, e risulta non tossica per i tessuti, oltre che provvista di proprietà cheratolitiche e idratanti. L’urea viene dunque solitamente utilizzata per favorire la rigenerazione e la riparazione cellulare, per trattare disturbi quali quelli legati a secchezza della pelle, annessi cutanei danneggiati, cheratopatie non infettive, epitelio corneale danneggiato, eccetera.

La presente invenzione si prefigge pertanto l’obiettivo di proporre un composto polimerico a base di HA reticolato (con urea) avente la capacità di agire come molecola multifunzionale e/o di rilasciare agenti attivi o farmaci al fine di svolgere un’azione positiva sulla salute dell’uomo.

A tal fine, la presente invenzione ha lo scopo di proporre un composto a base di HA reticolato con urea con particolare riferimento alle sue applicazioni in campo medico, farmaceutico e/o cosmetico, in particolare mediante trattamento topico, quali quelle che richiedono, ad esempio, effetti contemporanei di riepitelizzazione e idratazione per la risoluzione di problemi estetici e/o funzionali della pelle e delle mucose, oltre a quelle relative all’azione di rilascio di farmaci per target dermici, o ancora alle sue applicazioni dietetico-alimentari.

SCOPI DELL’INVENZIONE

Uno scopo della presente invenzione è migliorare lo stato della tecnica.

Un altro scopo della presente invenzione è mettere a punto una formulazione comprendente un composto formato da HA e reticolato con urea che sia sicuro, non tossico e non scateni reazioni avverse nel corpo umano.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è mettere a punto una formulazione comprendente un composto a base di HA reticolato con urea in grado di avere proprietà biocompatibili adatte all’applicazione medica, farmaceutica e/o cosmetica per il corpo umano e/o dietetico-alimentare.

Conformemente ad un aspetto dell’invenzione è prevista una formulazione comprendente un composto a base di HA reticolato con urea secondo la rivendicazione indipendente 1. Conformemente ad un aspetto dell’invenzione è previsto un metodo per la realizzazione di microsfere di acido ialuronico reticolato con urea secondo la rivendicazione indipendente 6.

Le rivendicazioni dipendenti si riferiscono a forme di realizzazione preferite e vantaggiose dell’invenzione.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione di una forma di realizzazione di una formulazione a base di microsfere (dette anche MS) di HA reticolato con urea, illustrata a titolo indicativo negli uniti disegni in cuiμ

la figura 1 illustra un grafico relativo alla viscosità (o Viscosity, in ordinata, misurata in Pa.s) rispetto al gradiente di velocità (o Shear Rate, in ascissa, misurata in 1/s), in particolare il comportamento delle soluzioni di HA indicate (n=3; ± SD). Le misure di flusso di scorrimento (viscosità) sono state effettuate in condizioni stazionarie mediante un test definito “shear rate sweep” (vale a dire un “test in gradiente di velocità”. Si tratta di un test con cui si varia il gradiente di velocità.)μ dopo 1 minuto di equilibramento, il gradiente di velocità o shear rate è stato progressivamente aumentato da 0.01 a 1000 s<-1>, e la viscosità è stata analizzata in funzione di tale incremento. I gel sono stati comparati con la loro viscosità a gradiente di velocità nullo (η0) che è stato calcolato fittando le curve di viscosità secondo l’equazione di Cross (1968) (1):

in cui η è la viscosità ad un dato gradiente di velocità (Pa.s), è il gradiente di velocità (s<-1>), η0 è la viscosità a gradiente di velocità nullo (Zero-Shear Rate Viscosity, Pa.s), η∞ è la viscosità a gradiente di velocità infinito (Pa.s), C è un parametro moltiplicativo (s) e n è un esponente adimensionale;

la figura 2 illustra la distribuzione della misura delle particelle di microsfere di ialuronano (HA o HA-CL) prodotte dopo 60 minuti di emulsificazione (n = 3, ± SD);

la figura 3 illustra delle microfotografie al SEM (Scanning Electron Microscopy o microscopio elettronico a scansione) di microsfere di ialuronano prodotte dopo 60 minuti di emulsificazioneμ HA (a), HA-SAP (b), HA-CL (c), HA-CL-SAP (d). La morfologia (forma e superficie) delle microsfere HA e HA-CL contenenti o meno SAP è stata osservata utilizzando un microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo (Zeiss EVO 40XVP, Carl Zeiss Pty Ltd., Oberkochen, Germania), con un voltaggio di accelerazione di 20 kV. Campioni di materiale in polvere sono stati depositati su nastri adesivi di carbonio e rivestiti per spruzzamento con uno strato sottile di oro-palladio, in un’atmosfera di argon, prima dell’analisi. I campioni sono stati quindi digitalizzati e fotografati;

la figura 4 illustra il pattern di diffrazione ai raggi X diμ SAP (a), microsfere di HA (b), microsfere di HA-CL (c), microsfere di HA-SAP (d), microsfere di HA-CL-SAP (e). Le misurazioni di diffrazione dei raggi X su SAP e microsfere caricate o meno con SAP sono state eseguite a 40 kV, 40 mA, con il contatore Bruker AXS D8 Advance Geiger dotato di un rilevatore multiwire a due dimensioni (2D) sigillato contenente gas (risoluzione dell’angolo di dispersione di 0,02° s<-1>). È stata utilizzata la radiazione monocromatizzata Cu Kα (λ = 1,54 Å). Le analisi sono state eseguite in un intervallo di 5-45° 2ϑ, a temperatura ambiente. Gli spettri dell'intensità (in ordinata) rispetto all'angolo di scattering (in ascissa) sono stati ottenuti dopo la media radiale dei pattern di diffrazione isotropica 2D misurati. I picchi di Bragg sono stati rilevati nella regione di diffrazione dei raggi X grandangolare (WAXD); la figura 5 illustra i profili termici DSC (vale a dire Differential Scanning Calorimetry o Calorimetria a Scansione Differenziale) diμ SAP (a), microsfere di HA (b), microsfere di HA-CL (c), microsfere di HA-SAP (d), microsfere di HA-CL-SAP (e). I profili termici di SAP e delle formulazioni delle microsfere sono stati studiati utilizzando la calorimetria differenziale a scansione (DSC823e, Mettler-Toledo, Schwerzenbach, Svizzera). Circa 5 mg di campioni sono stati pesati e sigillati in portacampioni di alluminio standard DSC da 40 microlitri. I campioni sono stati quindi analizzati a temperature crescenti da -20°C a 300°C, con incrementi di 10°C/min. I picchi endotermici ed esotermici sono stati determinati utilizzando il software STARe V.11.0x (Mettler Toledo, Greifensee, Svizzera);

la figura 6 illustra i termogrammi TGA (vale a dire Thermal Gravimetric Analysis o Analisi Gravimetrica Termica) diμ SAP (a), microsfere di HA (b), microsfere di HA-CL (c), microsfere di HA-SAP (d), microsfere di HA-CL-SAP (e). La stabilità alla temperatura e l’umidità residua di ciascun campione sono state determinate mediante analisi gravimetriche termiche (TGA, Mettler-Toledo, Schwerzenbach, Svizzera). Circa 5 mg di campioni sono stati collocati in portacampioni in alluminio. Le perdite di peso dei campioni sono state valutate in seguito ad un incremento di temperatura da 20°C a 400°C, con una velocità di 5°C/min, sotto gas di azoto costante. I dati sono stati analizzati utilizzando il software STARe V.11.0x (Mettler Toledo, Greifensee, Svizzera) ed espressi come percentuale della perdita di peso rispetto al peso iniziale del campione;

la figura 7 illustra le isoterme DVS (vale a dire Dinamic Vapour Sorption o Assorbimento dinamico al vapore) del primo ciclo di assorbimento/desorbimento perμ SAP (a), microsfere di HA e di HA-SAP (b), microsfere di HA-CL e HA-CL-SAP (c). L’assorbimento di umidità relativa (RH) e la stabilità di SAP e delle formulazioni di microsfere, rispetto all'umidità, sono stati analizzati mediante un Dynamic Vapor Sorption (DVS). I portacampioni di alluminio sono stati caricati con 10 mg circa dei campioni e quindi collocati nella camera di campionamento del DVS (DVS-1, Surface Measurement Systems Ltd., Londra, Regno Unito). Ogni campione è stato asciugato con umidità relativa (RH) pari allo 0% prima di essere esposto a incrementi di RH del 10% per due cicli 0-λ0% di RH (25°C). L'equilibrio di assorbimento di umidità ad ogni incremento di umidità è stato determinato da un cambiamento della massa in rapporto al tempo (dm/dt) di 0.0005% min<-1>;

la figura 8 illustra il profilo di diffusione di SAP come farmaco libero e il profilo di rilascio di SAP da parte delle microsfere HA e HA-CL investigati mediante dialisi (a) e celle di diffusione di Franz (b). La solubilità di SAP nel mezzo di rilascio (soluzione tampone fosfato, PBS, pH = 7,4) è stata valutata in triplicato mediante il metodo di saturazione del solvente. Una quantità in eccesso di SAP è stata aggiunta in provette contenenti 2.5 mi di PBS. Le provette sono state sottoposte ad ultrasuoni in un sonicatore a bagno termostatato a 32 KHz e 32°C per 1 ora, e quindi agitate su un agitatore orbitale termostatato a 120 rpm e 32°C per 24 ore. Le provette sono state poi centrifugate a 2000 rpm per 5 minuti. I surnatanti sono stati prelevati, filtrati usando filtri per siringa in poliammide da 0.22 μm, diluiti con PBS e analizzati mediante spettroscopia UV.

FORME DI ATTUAZIONE DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un composto polimerico a base di HA reticolato con urea comprendente almeno un agente attivo o farmaco.

Con agente attivo si intende un principio attivo o una sostanza attiva, vale a dire che svolge una funzione specifica sui tessuti del corpo umano con i quali entra in contatto. In particolare, il composto polimerico comprende microsfere di HA reticolato con urea, comprendenti e/o incorporanti e/o legate a almeno un agente attivo o farmaco.

La presente invenzione si riferisce dunque ad una formulazione medicale, farmaceutica e/o cosmetica comprendente microsfere di acido ialuronico reticolato con urea, in cui tali microsfere comprendono e/o incorporano e/o sono legate a almeno un agente attivo o farmaco e sono atte a rilasciare in uso l’almeno un agente attivo o farmaco stesso.

In alternativa o in aggiunta, la presente invenzione si riferisce dunque ad una formulazione dietetico-alimentare comprendente microsfere di acido ialuronico reticolato con urea, in cui tali microsfere comprendono e/o incorporano e/o sono legate a almeno un agente attivo o farmaco e sono atte a rilasciare in uso l’almeno un agente attivo o farmaco stesso.

Nella presente trattazione, se non viene espressamente indicato il contrario, i termini microsfere e microparticelle possono essere usati in modo indifferente l’uno dall’altro. Secondo la presente invenzione, dunque, l’acido ialuronico reticolato con urea (HA-CL) è un biopolimero con il quale si ottengono delle microsfere (di seguito anche MS) caricate con almeno un agente attivo o farmaco.

Le microsfere secondo la presente invenzione, come verrà meglio dettagliato e dimostrato nel prosieguo, presentano una distribuzione della dimensione e/o taglia e/o misura sostanzialmente unimodale (valori di Span inferiori a 3), aventi un diametro medio compreso tra 5,0 e 150,0 μm o tra 5,0 e 25,0 μm.

Secondo un esempio di tale versione le microsfere non sono aggregate tra loro.

In particolare, secondo un esempio della presente invenzione, le microsfere hanno un diametro medio di 13,0 ± 0,7 μm (ad esempio per le microsfere di HA-CL non comprendenti un agente attivo o farmaco) e 9,9 ± 0,8 μm (ad esempio per le microsfere di HA-CL comprendenti un agente attivo o farmaco).

Secondo un ulteriore esempio della presente invenzione, le microsfere possono presentare un diametro medio compreso tra 1 e 400 μm o che arriva anche a 1000 μm. Tali microsfere sono più grandi di quelle sopra indicate e/o sono formate da più microsfere aggregate tra loro. In questo caso, tali aggregati di microsfere non si scindono tra loro, secondo una versione dell’invenzione.

Tale diametro medio è idoneo per l’applicazione cutanea e/o dietetico alimentare.

Le microsfere secondo la presente invenzione presentano una forma sostanzialmente sferica e/o una superficie sostanzialmente ruvida.

Tale composto e/o tale formulazione, grazie alla presenza delle microsfere secondo la presente invenzione, presenta la capacità di agire come molecola multifunzionale e/o di rilasciare ingredienti o agenti attivi o farmaci al fine di svolgere un’azione positiva sulla salute e/o sull’aspetto estetico dell’uomo.

Il composto e/o la formulazione secondo la presente invenzione è dunque applicabile e/o iniettabile e/o impiantabile nel corpo umano, in particolare in corrispondenza della pelle, delle mucose e/o degli annessi cutanei, eventualmente mediante ingestione.

Il composto e/o la formulazione di cui sopra può essere utilizzato in applicazioni in campo medico, farmaceutico e/o cosmetico e/o dietetico alimentare. Il composto in questione, secondo almeno una versione della presente invenzione, presenta effetti contemporanei di riepitelizzazione e idratazione ad esempio della cute e/o delle mucose e/o degli annessi cutanei, ad esempio per la risoluzione di problemi estetici e/o funzionali della pelle, delle mucose e/o degli annessi cutanei.

La presente invenzione presenta, in almeno una sua versione, proprietà atte a permettere il rilascio di agenti attivi o farmaci per target dermici, come verrà meglio descritto nel prosieguo.

Il composto e/o la formulazione secondo la presente invenzione, almeno in una versione dell’invenzione, può essere applicato mediante applicazione topica sulla pelle e/o sulle mucose e/o sugli annessi cutanei.

La presente invenzione presenta, in almeno una sua ulteriore versione, proprietà atte a permettere il rilascio di agenti attivi o farmaci per target interni, quali quelli per effetti sistemici attraverso l’apparato digerente, ed è assunta ad esempio mediante ingestione. Grazie alla reticolazione, l’HA acquisisce la capacità di fungere da agente strutturante per la pelle, le mucose e/o gli annessi cutanei, migliorando rispetto all’HA naturale o nativo, il quale si presenta in forma non reticolata. Quest’ultimo, infatti, viene rapidamente degradato - in modo naturale - una volta inserito o applicato nel corpo umano.

I polimeri a base di HA reticolato sono ottenuti mediante la formazione di legami forti (covalenti e/o ionici) tra le catene di HA che si dispongono secondo un reticolo ordinato. Inoltre, a seconda delle modalità di produzione, è possibile avere polimeri di HA con vari gradi di reticolazione, a seconda anche del grado di struttura e consistenza del composto che si desidera ottenere per una specifica applicazione.

Secondo la presente invenzione, l’HA reticolato con urea risulta resistente alla degradazione chimica e/o enzimatica che può avvenire una volta che lo stesso sia stato applicato e/o impiantato e/o iniettato nel corpo umano.

Una delle metodiche per la realizzazione di HA reticolato con urea è descritta nella domanda internazionale WO2015/007773, depositata a nome dello stesso richiedente, cui si fa riferimento per interezza nella presente trattazione.

Ad esempio, tale metodica prevede di fornire acido ialuronico (HA) o un suo sale (ad esempio sale di sodio, di potassio o di calcio) in soluzione acquosa ed urea in soluzione acquosa e di miscelare e far reagire tali soluzioni in condizioni di catalisi acida. La reazione di reticolazione avviene dunque grazie all’urea che funge da agente reticolante, la quale è eventualmente disciolta in una soluzione acida. Il biopolimero risultante risulta omogeneo e presenta un grado di reticolazione uniforme.

L’agente attivo o farmaco presente nell’invenzione in oggetto, come detto, è compreso e/o inserito e/o incapsulato all’interno delle microsfere. In tal modo, grazie alla presenza delle microsfere secondo l’invenzione, è possibile prolungare il tempo di rilascio dell’agente attivo o farmaco stesso.

L’agente attivo o farmaco secondo la presente invenzione, secondo almeno una versione, è una sostanza idratante e/o antiossidante, e/o antimicrobica, e/o antinfiammatoria e/o cicatrizzante. Inoltre, tale almeno un agente attivo o farmaco è inserito e/o incorporato all’interno delle microsfere durante il processo di cross-linking o reticolazione dell’HA, e/o durante il processo di formazione delle microsfere e/o successivamente alla formazione delle microsfere.

Ancora, l’agente attivo o farmaco può essere inserito all’interno delle microsfere e/o legato alle stesse, a seconda delle specifiche versioni dell’invenzione.

L’agente attivo o farmaco può comprendere, ad esempioμ sodio ascorbil fosfato (SAP), vitamina C, vitamina E, vitamina B, una vitamina in generale o un derivato di una vitamina, dexpantenolo, nicotinammide, glicerolo, carnosina, taurina, acido lattobionico, uno o più amminoacidi, glicina, arginina, cisteina, N-acetilcisteina, un polifenolo in generale in particolare almeno un flavonoide, almeno un alignina, almeno un acido fenolico e/o almeno uno stilbene, almeno un acido nucleico (DNA o RNA), almeno un peptide, quale ad esempio un peptide anti-età, capsaicina, mentolo, eccetera.

Il SAP è una forma stabile della vitamina C, in grado di proteggere la pelle, promuoverne lo sviluppo e migliorarne l’aspetto.

Il SAP è stato scelto come molecola modello grazie alla sua alta idrofilicità, grazie al fatto che presenta buona stabilità fisico-chimica e grazie alle sue proprietà biologiche, quali neutralizzatore dei radicali liberi (radical scavenger), riduzione del danni causati da fotoossidazione e perossidazione dei lipidi, attività antimicrobica non antibiotica nei confronti di P. acnes (il maggior batterio responsabile dell’acne volgare), non è irritante ed è un pre-farmaco convertito dagli enzimi della pelle in acido ascorbico, che stimola la sintesi del collagene e, quindi, aumenta l’elasticità della pelle e promuove la guarigione delle ferite.

Il dexpantenolo è un precursore alcolico stabile dell’acido pantotenico, un componente delle vitamine del complesso B (vitamina B5). È facilmente assorbito dalla pelle e convertito enzimaticamente in acido pantotenico, un costituente del coenzima A, essenziale per mantenere la fisiologia dell’epitelio. Tale sostanza migliora la rigenerazione epidermica promuovendo la differenziazione delle cellule e la sintesi dei lipidi, agisce come agente di guarigione della ferita e come idratante per la pelle e/o le mucose in grado di migliorare le funzioni barriera, ridurre la perdita di acqua transepiteliale (TEWL), mantenendo così l’elasticità cutanea. Il dexpantenolo è usato pertanto per il trattamento diμ dermatite atopica, secchezza cutanea, eritema (eventualmente causato dall’esposizione UV), gambe e piedi diabetici, ragadi, cicatrici ipertrofiche, ustioni, ecc.

La nicotinammide, nota anche come 3-piridinecarbossamide o vitamina PP, è una forma ammidica di vitamina B3, una vitamina idrosolubile essenziale. La nicotinamide è un agente attivo ampiamente disponibile, poco costoso e ben tollerato, che svolge un ruolo terapeutico in diverse condizioni della pelle e/o delle mucose. Infatti, può essere usato come trattamento topico per l’acne vulgaris, ha proprietà antinfiammatorie, sebosoppressive e/o curative viene usata come agente anti-invecchiamento per la pelle, migliorandone l’aspetto esteriore, ne migliora l’elasticità e/o ne riduce i segni, le rughe, le macchie iper-pigmentate e le macchie rosse.

Il glicerolo è una piccola molecola polare e igroscopica naturalmente presente nello strato corneo della pelle. È un componente del fattore idratante naturale (NMF), una miscela di umettanti che include anche aminoacidi liberi e loro derivati, urea, acido lattico e sali inorganici. Il glicerolo presenta proprietà idratanti per la pelle, mantiene e stabilizza le proprietà fisiche delle strutture a doppio strato di fosfolipidi in condizioni asciutte, aumenta l’umidità dello strato corneo, la levigatezza e/o la flessibilità della pelle. Presenta inoltre effetti anti-irritanti, di riparazione della desquamazione e di migliorare la xerosi del piede nei pazienti diabetici.

La carnosina è un dipeptide naturale idrosolubile costituito da due aminoacidi, L-istidina e ß-alanina, collegati tra loro tramite un legame ammidico. È presente in diversi distretti del corpo umano, come i muscoli scheletrici, e svolge numerosi ruoli biologici come quella di fungere da tampone per il pH, la neuro-protezione, attività antiossidante, anche per combattere gli effetti dell’invecchiamento, per prevenire e trattare le rughe e come protezione contro le specie radicaliche dell’ossigeno (ROS) e carboniliche (RCS).

La taurina è un beta aminoacido ubiquitario, coinvolto in svariate azioni biologiche ed è efficace in diverse malattie legate all’invecchiamento. Ha inoltre proprietà per migliorare la guarigione delle ferite della pelle, di protezione delle membrane e dei tessuti biologici nei confronti dei danni causati dai ROS. Inoltre, la taurina è in grado di neutralizzare l’acido ipocloruro, che distrugge le membrane cellulari portando ad esempio alla formazione prematura di rughe nella pelle.

L'acido lattobionico è un poliidrossiacido con attività idratante e antiossidante; si tratta di una molecola molto idrofila. Tel sostanza è in grado di inibire la produzione di radicali idrossilici grazie alle proprietà chelanti del ferro, ed è un inibitore della metalloproteinasi della matrice, un enzima coinvolto nel processo di foto-invecchiamento. Pertanto, i trattamenti topici contenenti acido lattobionico sono adatti, ad esempio, per il trattamento e la prevenzione del foto-invecchiamento della pelle, in quanto contribuiscono al mantenimento e al miglioramento del tono della pelle e alla riduzione dei segni dell’invecchiamento come rughe e macchie pigmentate.

La glicina è il più semplice amminoacido in natura e, essendo un costituente principale del collagene e dell’elastina, è uno degli amminoacidi più abbondanti nel corpo umano. La glicina ha azioni citoprotettive (osservate per esempio nel fegato, nei reni, nei polmoni, nei muscoli scheletrici e nell’intestino), correlate al turnover delle proteine e alla stimolazione della sintesi del glutatione che determina effetti antiossidanti. Per questi motivi, l'assunzione di glicina nella dieta è importante. Inoltre, la glicina agisce come agente idratante e di trattamento per la pelle. Trova applicazione in modo sicuro alla zona degli occhi, alle mucose, alla pelle, anche del bambino.

L'arginina è un amminoacido essenziale per bambini e adolescenti, mentre negli adulti è prodotta dal corpo umano. È uno degli aminoacidi metabolicamente più attivi e versatili, poiché è impegnato in diverse vie metaboliche ed è un precursore per la sintesi di urea, poliammine, prolina, glutammato, creatina e agmatina. L'arginina è ampiamente utilizzata, ad esempio, nei prodotti cosmetici e per la cura personale (ad esempio il dentifricio e altri prodotti per la cura dentale contenenti fluoro in quanto agisce come agente preventivo di carie). Inoltre, l’arginina stimola e migliora la cicatrizzazione delle ferite, promuove la riepitelizzazione e agisce sinergicamente con l’acido ialuronico. L’arginina può migliorare la funzione delle cellule immunitarie in corrispondenza di una ferita diminuendo la risposta infiammatoria nel sito. Utilizzata in combinazione con altri principi attivi come l’urea idratante e la carnosina antiossidante, l‘arginina aumenta l’idratazione della pelle, allevia la secchezza della pelle, ad esempio nei pazienti diabetici di tipo 2, può agire come agente farmaceutico o nutraceutico con benefici antiinvecchiamento.

La cisteina è un amminoacido polare non essenziale, necessario per la biosintesi di composti essenziali tra cui la metionina, la biotina di tiamina e il coenzima A. Il suo gruppo sulfidrilico è responsabile della sua attività di scavenging radicale. Inoltre, la cisteina è coinvolta nel ripiegamento delle proteine, nell’assemblaggio e nella stabilità attraverso la formazione del legame disolfuro, svolge un ruolo chiave nella protezione delle cellule dallo stress ossidativo. È usato inoltre, ad esempio, come ingrediente funzionale cosmetico con effetti antiossidanti e rivitalizzanti, per la formulazione di prodotti per la cura della pelle o per la cura dei capelli.

La sua forma acetilata (N-acetilcisteina) ha dimostrato di contribuire al mantenimento della struttura sana della pelle prevenendo il foto-invecchiamento.

Al fine di ottenere l’HA reticolato con urea (HA-CL), incorporante e/o comprendente e/o legato all’almeno un agente attivo o farmaco, il metodo secondo la presente invenzione prevede le seguenti fasiμ

i) predisporre una soluzione di HA reticolato con urea (ad esempio ad una concentrazione dell’1% (p/v)). Tale fase può avvenire, almeno secondo una versione dell’invenzione, miscelando l’HA-CL in una soluzione comprendente acqua o una soluzione salina; ii) predisporre una soluzione acquosa contenente l’agente attivo o farmaco. Tale fase può avvenire, almeno secondo una versione dell’invenzione, miscelando l’agente attivo o farmaco in una soluzione comprendente acqua o una soluzione salina;

iii) miscelare la soluzione di HA reticolato con urea e la soluzione contenente l’agente attivo o farmaco in modo che tale agente attivo o farmaco sia incorporato e/o inserito all’interno della matrice di HA reticolato con urea e/o si leghi con HA reticolato con urea. In una versione di realizzazione, si prevede una fase di fornire microsfere di HA reticolato con urea, in modo che l’agente attivo o farmaco sia incorporato e/o inserito all’interno delle microsfere di HA reticolato con urea e/o si leghi con tali microsfere di HA reticolato con urea.

Le microsfere di HA, come verrà meglio descritto nel prosieguo, si formano in seguito alla tecnica di lavorazione (emulsionamento/evaporazione del solvente, spray drying, liofilizzazione o essiccamento seguiti da macinazione e micronizzazione, ecc.).

Ad esempio, con la tecnica dell'emulsionamento/evaporazione del solvente la soluzione di acido ialuronico e agente attivo o farmaco viene miscelata ad una fase olio per ottenere prima un'emulsione, e poi con l'evaporazione dell'acqua, una sospensione di microsfere di ialuronico ed agente attivo o farmaco che vengono separate dall'olio secondo quanto descritto.

Ancora, a titolo d'esempio, con la tecnica dello spray-drying le microsfere si ottengono per atomizzazione di una soluzione di ialuronico ed agente attivo o farmaco.

In almeno una versione dell'invenzione, al termine dei processi di emulsionamento/evaporazione del solvente, spray drying, liofilizzazione o essiccamento seguiti da macinazione e micronizzazione, ecc. si ottengono le microsfere di acido ialuronico, che possono incapsulare l'agente attivo o farmaco (qualora la soluzione acquosa di acido ialuronico sia stata miscelata alla soluzione dell'agente attivo o farmaco, prima dei processi di lavorazione sopra menzionati.

Nel caso della tecnica emulsionamento/evaporazione del solvente, nel momento in cui la soluzione acquosa di cui sopra viene miscelata alla fase olio, e l'acqua viene poi fatta evaporare, si forma una sospensione di microsfere (che si formano in questa maniera) che risultano sospese nella fase olio, e poi separate come indicato: le microsfere sono alla fine ottenute in forma secca.

Le microsfere, terminato qualsiasi dei suddetti processi di lavorazione, sono sempre in forma secca.

In una versione dell’invenzione, la fase i) è ottenuta predisponendo una soluzione di acido ialuronico ed una soluzione di urea, miscelando le due soluzioni e facendo reticolare l’HA con l’urea.

In una versione dell’invenzione, la soluzione di almeno un agente attivo o farmaco è miscelata alla soluzione di HA durante la fase di reticolazione con la soluzione di urea. In tale versione, i gruppi carbossilici dell’acido ialuronico subiscono una ammidazione con l’urea e con l’agente attivo o farmaco. In questa versione, l’agente attivo o farmaco può comprendere o essere costituito da un amminoacido (quale ad esempio arginina) dissolto in una soluzione acquosa.

L’acido ialuronico (nativo) o il suo sale si dissolve gradualmente in acqua o in una soluzione salina. Una seconda soluzione può essere preparata separatamente sciogliendo l’urea in HCl.

Le tre soluzioni (quella contenente HA, quella contenente urea e quella contenente almeno un agente attivo o farmaco) vengono miscelate fino alla formazione di una miscela omogenea. Il pH viene misurato e mantenuto nell'intervallo 3-6.8.

La reazione può avvenire sotto catalisi acida. Il risultato finale è che l’acido ialuronico è sia reticolato con l’urea sia funzionalizzato con l’almeno un agente attivo o farmaco (quale ad esempio l’amminoacido o l’arginina). Nel prosieguo, questo tipo di ialuronato può essere indicato con HA-CL.

Secondo una versione alternativa, dopo aver predisposto una soluzione omogenea di HA (nativo) o di un suo sale, si aggiungono 1-etil-3- [3- (dimetilammino) -propil] -carbodiimmide (EDC) e 1-idrossibenzotriazolo (HOBt).

La soluzione acquosa omogenea di acido ialuronico in questa versione ha un pH di 6.8. I gruppi carbossilici ialuronici vengono attivati dall’EDC e formano un intermedio stabile con HOBt. Si ottiene dunque una miscela di reazione.

Si predispongono separatamente una soluzione di urea ed una soluzione di almeno un agente attivo (quale ad esempio un amminoacido o l’arginina), le quali vengono poi miscelate insieme e quindi aggiunte alla miscela di reazione per reagire con l’intermedio stabile. Si verifica una sostituzione nucleofila, la quale porta alla formazione di un prodotto (HA-CL) che è sia reticolato con urea che funzionalizzato con almeno un agente attivo (quale ad esempio l’amminoacido o l’arginina).

Secondo una ulteriore versione dell’invenzione, si utilizza una miscela solvente con acqua e acetonitrile (in rapporto 3μ2). In tale versione, viene predisposta una soluzione di HA (nativo) e/o di un suo sale dissolvendo il polimero in acqua; a tale soluzione viene aggiunto acetonitrile (nella forma della suddetta miscela solvente). La miscela risultante viene raffreddata (ad esempio a 4°C e/o in un bagno di ghiaccio) e viene aggiunta 2-clorodimetossi-1,3,5-triazina (CDMT). La CDMT reagisce con i gruppi carbossilici dell’HA per formare un intermedio HA-triazina. Alla miscela viene aggiunto N-metilmorfolino (NMM) per neutralizzare l’acido cloridrico generato. Successivamente si aggiungono l’urea e l’almeno un agente attivo o farmaco (quale ad esempio un amminoacido o l’arginina) e si formano legami ammidici con l’intermedio di HA-triazina. In tal modo, l’acido ialuronico è reticolato con urea e funzionalizzato con l’agente attivo o farmaco (HA-CL).

In ogni caso, il polimero sintetizzato (HA-CL) viene termostatato a 35°C (+/- 2°C) per 20-24 ore; l’eccesso di reagenti viene quindi eliminato, ad esempio mediante incubazione con resine a scambio ionico (Dowex-H<+ >e poi Dowex-Na<+>) e dialisi; una volta purificato, il pH del prodotto ottenuto viene misurato ed eventualmente regolato con HCl o NaOH per portarlo nell’intervallo 5,5-7,5.

Le versioni sopra indicate possono essere variamente combinate tra loro, qualora ne sussistano le condizioni, ed in tal modo è possibile ottenere delle molecole di HA reticolato con urea e incorporante e/o contenente e/o legante uno, due o più principi attivi o farmaci.

Tale ultimo risultato può essere ottenuto, secondo una ulteriore possibilità, dissolvendo due o più principi attivi o farmaci all’interno della stessa soluzione e/o predisponendo due o più soluzioni ciascuna contenente un diverso agente attivo o farmaco. Si ottiene così un prodotto analogo che consiste in molecole di HA reticolato con urea e incorporante e/o contenente e/o legante due o più principi attivi o farmaci.

Le molecole così ottenute sono multi-funzionali, in quando una stessa molecola contiene più principi attivi o farmaci e quindi svolge più funzioni differenti. In una variante, in queste situazioni i principi attivi o farmaci saranno simili dal punto di vista della solubilità e/o della idrofilicità e/o della lipofilicità e saranno diversi dal punto di vista delle loro proprietà o effetti applicativi.

Secondo una variante alternativa, i principi attivi o farmaci saranno dissimili dal punto di vista della solubilità e/o della idrofilicità e/o della lipofilicità oltre che diversi dal punto di vista delle loro proprietà o effetti applicativi.

Secondo diverse forme di realizzazione, il prodotto purificato può essere ridotto in particelle passandolo attraverso un filtro o schermo avente una dimensione dei pori adatta (ad esempio, non limitativo, da 5 a 150 ȝm).

Secondo una versione dell’invenzione, il prodotto risultante può essere mantenuto sotto forma di un idrogel o può essere liofilizzato (freeze-dried).

Secondo una versione, il metodo secondo l’invenzione prevede di preparare microparticelle (o microsfere) di HA che incorporano almeno un agente attivo o farmaco. In tal caso, l’agente attivo o farmaco secondo questa versione è idrosolubile. Secondo un esempio di tale versione, l’agente attivo o farmaco è SAP. Questa modalità avviene mediante spruzzatura a secco (spray-drying); l’applicazione di questa versione dell’invenzione è una formulazione per applicazione inalatoria.

Le formulazioni inalabili contenenti HA e almeno un agente attivo (ad es. SAP) in forma di polvere secca possono essere ad esempio preparate con un essiccatore Buchi (Buchi B-290 Mini Spray Dryer, Buchi, Flawil, Svizzera).

Secondo un ulteriore esempio di tale versione, le formulazioni contenenti ialuronico e almeno un agente attivo (ad es. SAP) in forma di polvere secca possono essere, ad esempio, preparate tramite liofilizzazione o, alternativamente, essiccazione (ad esempio, non limitativo, in stufa da vuoto), e successiva macinazione (ad esempio, non limitativo, tramite mulino planetario a sfere o mulino a coltelli) e micronizzazione.

Le soluzioni di acido ialuronico-agente attivo o farmaco (es. SAP) sono preparate sciogliendo progressivamente il polimero (ad esempio, non limitativo, 0,15% (p/v) di HA o di HA-CL) e l’agente attivo o farmaco (ad esempio, non limitativo, 0,45% (p/v) di agente attivo o farmaco o SAP) in acqua deionizzata, con costante e delicata agitazione magnetica.

La soluzione di HA o HA-CL può essere realizzata, ad esempio, non limitativo, con i polimeri presenti all’1% (p/v) distribuendo progressivamente i polimeri in acqua deionizzata, sotto continua agitazione magnetica.

Le soluzioni di acido ialuronico-agente attivo o farmaco (es. SAP 1% (p/v), eventualmente in rapporto 1μ1 con l’acido ialuronico) possono essere preparate disperdendo il polimero in una soluzione acquosa di agente attivo o farmaco (es. di SAP), sotto costante (ed eventualmente moderata) agitazione magnetica.

Il polimero viene lasciato idratare e gonfiarsi completamente durante la notte (o per 12 ore), a temperatura ambiente. Si forma così un idrogel omogeneo.

I gel possono essere lasciati a riposo per 12 ore prima dell’analisi o del loro utilizzo come fasi acquose per la formulazione di microsfere.

Una volta raggiunta l’omogeneità, le soluzioni di ialuronano (intendendo con tale termine sia HA che HA-CL, a meno che espressamente indicato) e agente attivo o farmaco, quale ad esempio il SAP, vengono essiccate a spruzzo. I parametri di processo che possono essere utilizzati sono almeno uno traμ temperatura di ingresso 150°C, portata 3,0 mL/min, velocità di aspirazione 100% e diametro dell’ugello di 1,4 mm. In queste condizioni, la temperatura di uscita potrebbe essere compresa, ad esempio, non limitativo, tra 78°C e 82°C. Un deumidificatore B-296, a titolo d’esempio, potrebbe essere utilizzato per controllare l’umidità dell’aria del sistema.

Il presente brevetto prevede anche la preparazione delle microparticelle di HA ed HACL, in associazione ad un ingrediente attivo o farmaco quale ad esempio il SAP, attraverso liofilizzazione (condotta in condizioni opportune di temperatura e pressione) o essiccazione sottovuoto degli idrogel. I prodotti secchi vengono successivamente macinati e tagliati - ad esempio, non limitativo, mediante mulino planetario a sfere o mulino a coltelli - e micronizzati.

Secondo una ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione prevede un metodo per preparare microparticelle (o microsfere) di HA (reticolato con urea) e di un agente attivo o farmaco (es. SAP) secondo la tecnica della incapsulazione e/o incorporazione dell’agente attivo o farmaco in una emulsione acqua in olio (a/o) seguita dalla tecnica dell’evaporazione del solvente.

In tal caso, questa fase comprendeμ far gocciolare la soluzione acquosa contenente acido ialuronico reticolato con urea, ed eventualmente comprendente almeno un agente attivo o farmaco, in una fase oleosa, ad esempio comprendente un olio minerale, in cui detta fase oleosa comprende un agente emulsionante; sotto agitazione, emulsionare la soluzione acquosa nella fase oleosa mediante un miscelatore o un emulsionatore per un tempo compreso tra 10 min e 60 min; miscelare il tutto con un agitatore e/o riscaldare il tutto a una temperatura di 37 ± 2°C, in modo da far evaporare la fase acquosa dispersa e ottenendo in tal modo una sospensione oleosa di microsfere.

Eventualmente è poi presente una fase di centrifugazione in modo da separare la fase oleosa dalle microsfere, eventualmente risospendere le microsfere in esano e filtrare il tutto sottovuoto, in modo da raccogliere le microsfere.

Anche secondo queste forme realizzative, è possibile ottenere delle microsfere multifunzionali quando sono presenti due o più agenti attivi o farmaci, sia che siano incorporati e/o legati e/o contenuti nella matrice di HA reticolato, sia che siano aggiunti in tempi diversi, ad esempio uno durante la reticolazione dell’HA e uno durante la preparazione delle microsfere o ancora se entrambi (o più) agenti attivi o farmaci sono forniti durante e/o dopo la fase di preparazione delle microsfere.

Le microsfere secondo la presente invenzione, dunque, in una versione dell’invenzione, comprendono e/o incorporano almeno un primo agente attivo o farmaco ed un secondo o un agente attivo o farmaco, in cui il primo e/o il secondo agente attivo o farmaco èμ - incorporato e/o legato alle microsfere e/o compreso all’interno delle stesse e/o

- incorporato e/o compreso all’interno dell’acido ialuronico reticolato con urea o di una matrice formata da acido ialuronico reticolato con urea e/o legato con tale componente. Quando sono presenti un primo ed un secondo agente attivo o farmaco, le microsfere sono in grado di veicolare tali componenti e dunque una eventuale formulazione che le comprende riesce a trasmettere ai tessuti del corpo umano sui quali viene applicata, o con i quali viene a contatto, entrambi gli effetti prodotti da tali primo e secondo agente attivo o farmaco. Lo stesso dicasi quando fossero presenti più di due agenti attivi o farmaci.

ESEMPIO 1

1.1 Materiali e metodi

Ialuronato di sodio (peso molecolare 1,2 MDa) e ialuronato di sodio reticolato con urea (peso molecolare 3,0 MDa – materiale grezzo stabilizzato con glicole pentilenico), forniti da IRAlab (Usmate Velate, Monza-Brianza, Italia).

Il glicole pentilenico, essendo un eccipiente idrofilico, deve essere considerato per il calcolo successivo della resa di microsfere a base di HA-reticolato. In particolare, una soluzione contenente 1% (p/v) HA-CL contiene 0,75% (p/v) di glicole pentilenico. Sodio ascorbil fosfato – commercializzato con il nome STAY-C°50 - fornito da DSM Nutritional Products Ltd (Segrate, Milano, Italia).

Olio minerale ottenuto da Fagron (Quarto Inferiore, Bologna, Italia).

Esano fornito da Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Germania).

Sorbitano monooleato (Span 80) fornito da Acef (Fiorenzuola D’Arda, Piacenza, Italia). In tale esempio è stato utilizzato, come agente attivo o farmaco, il sodio ascorbil fosfato (Sodium Ascorbyl Phosphate o SAP): tale molecola attiva è stata incapsulata con successo all’interno delle microsfere di HA e poi rilasciata liberamente dalle stesse.

Tuttavia, resta inteso che i dati che seguono ed i risultati ottenuti possono essere applicati a qualsiasi agente attivo o farmaco (o anche a più di uno di essi) indicato nella presente invenzione.

1.2 Preparazione delle soluzioni di ialuronano e di ialuronano-SAP (fase acquosa) Le soluzioni di HA e di HA reticolato con urea (HA-CL) 1% (p/v) sono state realizzate disperdendo progressivamente i polimeri in acqua deionizzata, in condizioni di agitazione continua mediante magnete.

Con il termine ialuronano si intende, ove non espressamente indicato il contrario, l’acido ialuronico nativo (o un suo sale) o l’acido ialuronico reticolato con urea.

Allo stesso modo, le soluzioni di ialuronano-SAP 1% (p/v), in rapporto 1μ1 sono state realizzate disperdendo i polimeri in una soluzione acquosa di SAP, in condizioni di agitazione continua mediante magnete.

I polimeri sono stati idratati completamente formando degli idrogel, i quali sono stati lasciati gonfiarsi in condizioni di miscelazione moderata, per 12 ore a temperatura ambiente, al fine di ottenere un’apparenza omogenea.

I gel sono stati lasciati riposare per 12 ore prima di essere analizzati o di essere utilizzati come fase acquosa per la realizzazione delle microsfere.

1.3 Caratterizzazione delle soluzioni di ialuronano e ialuronano-SAP: pH e reologia Il pH di ciascuna soluzione acquosa è stato inizialmente misurato.

Successivamente, sono state analizzate le proprietà reologiche degli idrogel ottenuti e le condizioni di analisi sono state ad una temperatura di 23 ± 2°C, con un reometro rotazionale AR2000 (TA instruments, New Castle, Delaware, USA - dati analizzati mediante Rheology Advantage software, version V7.20), dotato di una geometria cono/piatto di alluminio avente un diametro di 40 mm, un angolo di 2° e un troncamento di 64 μm.

Si è provveduto ad evitare la deidratazione dei campioni mediante una trappola per il solvente.

Le misurazioni di flusso di scorrimento sono state effettuate mediante test di shear rate sweep, in condizioni stazionarie.

Le misure oscillatorie sono state eseguite ad un valore costante di stress pari a 0.2 Pa, appartenente al regime viscoelastico di linearità (definito da un test strain sweep) in cui gli idrogel di ialuronico in questione non subiscono una modifica strutturale irreversibile. Le frequenze di oscillazione utilizzate variano da 0.01 a 100 Hz.

Il modulo elastico (G’) ed il modulo viscoso (G”), misurati come funzione della frequenza dello stress applicato, hanno permesso di valutare il comportamento viscoelastico dei gel. Più precisamente, i campioni sono stati comparati per i loro moduli elastici ad 1 Hz (G’1Hz, indice quantitativo di elasticità, vale a dire Elastic modulus at 1 Hz), e per la loro frequenza di crossover (Cf, frequenza in cui G’ è uguale a G’’).

1.4 Realizzazione delle microsfere di HA e di HA-CL contenenti o meno SAP

Le microsfere di HA e di HA-CL contenenti o meno SAP sono state prodotte mediante una emulsificazione acqua-in-olio (a/o) affiancata dalla tecnica di evaporazione del solvente, come sopra indicato.

La fase acquosa è stata aggiunta goccia a goccia ad una velocità di flusso pari a 0,λ1 mL/min in 100 g di olio minerale (fase oleosa) contenente 1% (p/p) di sorbitano monooleate come agente emulsionante, con miscelazione moderata mediante agitatore magnetico (200 rpm). La fase acquosa è stata quindi emulsionata a 1000 rpm nella fase oleosa, usando un miscelatore Silverson L5M A Laboratory Mixer (Silverson Machines, Buckinghamshire, United Kingdom), dotato di una testa emulsionante fine (fine emulsor screen workhead). Sono stati testati diversi tempi di emulsificazione, in particolare di 10, 30 e 60 min.

Dopodiché, sono stati mantenuti costantemente per 12 ore sia una miscelazione moderata con magnete (200 rpm) che un tenue riscaldamento (37 ± 2°C) per garantire la completa evaporazione della fase acquosa dispersa.

Le microsfere così formate sono state separate dalla fase oleosa attraverso centrifugazione a 4000 rpm per 30 min (ALC Centrifuge PK110, OPTO-LAB, Concordia sulla Secchia, Modena, Italia).

Per rimuovere l’eccesso di olio minerale e surfattante, il pellet è stato risospeso in esano e filtrato in vuoto usando un sistema di filtrazione (Millipore) dotato di una membrana di poliammide avente pori di diametro pari a 0,22 µm (Sartorius, Muggiò, Monza-Brianza, Italia).

Le microsfere raccolte sono state infine essiccate in stufa ad una temperatura pari a 37 ±2°C per 12 ore.

1.5 Analisi delle microsfere ottenute

La quantità di agente attivo o farmaco (ad es. SAP) incapsulato all’interno delle microsfere è stata determinata dissolvendo completamente 30 mg di microsfere caricate con SAP in 300 mL di un mezzo di erogazione. La concentrazione del farmaco è stata determinata mediante spettroscopia a raggi UV (SHIMADZHU UV-2600 spectrophotometer, Kyoto, Japan), a 258 nm (lunghezza d’onda corrispondente al valore di λmax di SAP), sulla base di una curva di calibrazione precedentemente determinata. Sono state testate le microsfere di HA non caricate e quelle di HA-CL.

La dimensione delle particelle delle microsfere di HA e di HA-CL contenenti o meno SAP è stata calcolata mediante diffrazione laser (Malvern Mastersizer 2000, Malvern Instruments Ltd., UK).

La morfologia (forma e superficie) delle microsfere di HA e di HA-CL contenenti o meno SAP è stata osservata mediante un microscopio elettronico a scansione (Zeiss EVO 40XVP, Carl Zeiss Pty Ltd., Oberkochen, Germany).

1.6 Studio del rilascio dell’agente attivo o farmaco in vitro

Per i micro-carriers topici, come le microsfere della presente invenzione, non esistono metodi standard per la valutazione del rilascio di un agente attivo o farmaco. Pertanto, nella presente invenzione sono state utilizzate le seguenti due metodiche.

1.6.1 Dialisi

I profili di rilascio di SAP sono stati valutati mediante dialisi. Una quantità calcolata di ciascuna formulazione contenente circa 10 mg di SAP è stata posta in una borsa da dialisi pre-condizionata (Slide-A-Lyzer G2, 10kDa MWCO (vale a dire Molecular Weight Cutoff), Thermo Fisher Scientific, Rodano, Milano, Italia), e sottoposta a dialisi rispetto a 300 mL di PBS (Phosphate Buffered Saline, pH = 7,4) in agitazione a 150 rpm.

Il tutto è stato mantenuto ad una temperatura di 32 ± 1 °C al fine di riflettere le condizioni fisiologiche della pelle.

Ad intervalli prestabiliti di tempo, è stato prelevato 1 mL di campione e sostituito con un volume uguale di PBS caldo (32 ± 1 °C). Il rilascio di SAP è stato quantificato mediante spettroscopia UV.

1.6.2 Celle di Franz

I profili di rilascio di SAP delle microsfere di ialuronano sono stati investigati mediante le celle di Franz (25 mm diametro interno, PermeGear Inc., Hellertown, PA, USA). Dei filtri di membrana in poliammide aventi pori di 0,45 µm (Sartorius Biolab Products, Goettingen, Germany) sono stati idratati mediante sonicazione in acqua deionizzata per 30 minuti e poi montati tra i compartimenti ricevente e donatore delle cellule di diffusione di Franz.

Il tutto è stato posto in un bagno termostatato alla temperatura di 32 ± 1°C; le formulazioni da testare sono state poste nel compartimento donatore al fine di avere circa 2 mg di SAP sulla superficie della membrana, la quale è stata chiusa mediante un foglio di cera (Parafilm M, Bemis Company Inc., Oshkosh, WI, USA) al fine di prevenirne l’evaporazione.

Il compartimento ricevente è stato riempito con 23 mL di PBS (pH = 7,4) e mantenuto in agitazione continua a 150 rpm. A tempi prestabiliti, 0,5 mL di campione è stato prelevato dal compartimento ricevente e sostituito con un ugual volume di PBS caldo.

I campioni sono stati quindi testati usando la spettroscopia UV.

I risultati delle misure sopra indicate dimostrano che tutte le soluzioni di ialuronano testate presentano un comportamento reofluidificante e viscoelastico, come illustrato in figura 1 e in tabella 1.

Tuttavia, come illustrato nella tabella 1 seguente, l’analisi statistica ha rivelato che ciascuna soluzione è significativamente differente dalle altre (P < 0,05) in termini di pH, zero-shear rate viscosity (η0), modulo elastico a 1 Hz (G’1Hz), e frequenza di crossover (Cf). Dunque, la tipologia di HA e la presenza o meno di SAP influenza i valori di pH, η0, G’1Hz, e Cf.

Tabella 1

Proprietà principali delle soluzioni di HAμ pH, η0, G’1Hz, Cf (n = 3, ± SD).

In particolare, come si evince dalla tabella 1, la presenza di un polimero costituito da HA reticolato con urea determina proprietà meccaniche implementate rispetto al polimero naturale, vale a dire valori maggiori di η0 e G’1Hz e valori minori di Cf. Questo può essere determinato anche dal diverso peso molecolare dei due polimeri (come detto: 1,2 MDa per l’HA nativo e 3,0 MDa per HA reticolato con urea) e dagli effetti della reticolazione.

Questo risulta in linea con il fatto che la viscosità e la viscoelasticità delle soluzioni di HA aumentano con l’aumentare del peso molecolare del polimero e con la sua reticolazione.

Per quanto riguarda i dati della tabella 2 sottostante, è visibile che per tempi bassi di emulsificazione (10 e 30 minuti), le proprietà reologiche delle soluzioni di HA e HA-CL sembrano influenzare la dimensione media delle particelle risultanti.

Tabella 2. Effetti del tempo di emulsificazione, del tipo di polimero e della presenza di SAP sulle proprietà delle microsfere (n = 3, ± SD).

La resa (Y%) delle microsfere è calcolata come percentuale del peso delle microsfere recuperate sul peso del polimero e dell’agente attivo o farmaco utilizzati inizialmente (considerando come detto l’eventuale presenza di glicole pentilenico); la percentuale di caricamento dell’agente attivo o farmaco (DL% o Drug Loading) è calcolata come percentuale del peso del farmaco nelle microsfere sul peso delle microsfere recuperate e l’efficienza di incapsulazione (EE%) dell’agente attivo o farmaco è calcolata come percentuale del peso del farmaco nelle microsfere sul peso del farmaco impiegato inizialmente.

L’analisi della dimensione delle particelle delle microsfere di HA e HA-CL contenenti o meno SAP è stata effettuata usando la diffrazione laser (Malvern Mastersizer 2000, Malvern Instruments Ltd., UK). I campioni in polvere (circa 10 mg) sono stati dispersi usando l’unità di dispersione a secco Scirocco con una pressione di alimentazione pari a 4 bar e ad una velocità di alimentazione del 100%. Il valore di oscuramento è tra 0,1% e 15% e l’indice rifrattivo di riferimento è 1,33.

Il diametro medio pesato sul volume (D[4,3] o Volume Weighted Mean Diameter) e la dimensione media delle particelle sul volume Dv50 (vale a dire Median Particle Size by Volume) è stato usato per descrivere la dimensione delle microsfere.

La distribuzione delle misure è stata valutata calcolando lo span dei campioni come rapporto tra (Dv90 - Dv10) e Dv50, in cui Dv90, Dv10 e Dv50 sono rispettivamente la distribuzione cumulativa del volume al 90%, 10% e 50%. Lo span dà quindi una misura del range della distribuzione del volume rispetto al diametro medio.

Come si evince dalla tabella 2, i valori Dv50 e D[4,3] sono significativamente più alti (P < 0.05) per le microsfere HA-CL rispetto a quelle di HA prodotte dopo lo stesso tempo di miscelazione o emulsificazione.

Questi dati richiamano quanto presente in letteratura, vale a dire che particelle più grandi sono generalmente prodotte da gocce più grandi della emulsione precursore a/o, formata incrementando la viscosità della soluzione.

Per quanto riguarda l’influenza del SAP sulle proprietà delle soluzioni di HA e di HA-CL, esso fa aumentare il pH, causando quindi una riduzione statisticamente rilevante (P < 0.05) dei valori di η0 e G’1Hz, ed un aumento dei valori di Cf (Tabella 1).

Anche in questo caso, la reologia delle soluzioni iniziali appare correlata alle proprietà dimensionali delle particelle. Inoltre, per lo stesso tipo di HA e di tempo di emulsificazione, le microsfere incapsulanti SAP si sono rivelate più piccole delle microsfere vuote (Tabella 2).

Questo effetto si verifica per tempi di emulsificazione di 10 min e 30 min mentre per tempi di 60 min risulta trascurabile. Dunque, dopo 60 min, l’effetto sulla dimensione causato dalle differenze reologiche delle soluzioni di ialuronano è livellato da un emulsionamento più significativo. Di conseguenza, il diametro medio delle microsfere e la distribuzione dimensionale delle misure sembrano influenzati non solo dalle proprietà reologiche della soluzione di partenza, ma anche dal tempo di emulsionamento.

Per ciascuna formulazione di microsfere, il diametro delle particelle è inversamente proporzionale al tempo di emulsificazione nel range tra 10 e 60 min. Questa correlazione, come indicato, è statisticamente rilevante.

In conclusione, un tempo più alto di miscelazione riduce la dimensione delle gocce della soluzione polimerica durante l’emulsificazione, diminuendo così il diametro delle microsfere.

Al contrario, un tempo inferiore di emulsificazione, risulta in generale in una emulsione a/o (o w/o) meno fine, con le gocce acquose che tendono ad aggregare insieme.

Secondo la presente invenzione, microsfere di dimensioni maggiori e minor uniformità, con una resa minore, si formano per aggregazione delle gocce, che si suppone avvenga per circa 10 minuti di emulsificazione. Questo potrebbe essere causato dalla bioadesività del polimero, che quando è meno disperso, aderisce maggiormente alla testa di lavoro dell’omogeneizzatore. Comunque, incrementando il tempo di emulsificazione da 10 a 60 minuti, la dimensione media delle microsfere diminuisce in modo significativo, mentre la resa e l’efficienza di incapsulazione aumenta.

Considerando il parallelo aumento della resa e dell’efficienza di incapsulazione, il caricamento di agente attivo o farmaco rimane sostanzialmente costante nonostante il tempo di incapsulazione (circa 40% per microsfere di HA contenenti SAP e circa 33% per microsfere HA-CL contenenti SAP).

Considerando dunque i risultati sopra riportati, la metodica secondo la presente invenzione ha selezionato un tempo di emulsificazione di almeno 60 minuti come condizione standard per produrre microsfere ottimali. Tutte le microsfere prodotte dopo 60 min di emulsificazione sono caratterizzate dalla resa maggiore e da risultati soddisfacenti (anche se statisticamente differenti per HA o HA-CL) di incapsulazione ed efficienza dell’agente attivo o farmaco.

Le particelle aventi dimensioni in cui i valori di Dv50 variano da 2,5 ± 0,1 a 13,0 ± 0,7 µm, e quelli di D[4,3] variano da 3,1 ± 0,2 a 21,6 ± 4,0 µm (Tabella 2) sono adatti, ad esempio, al target dermatologico e/o dietetico-alimentare.

In ogni caso, al fine di non avvertire la presenza di microsfere durante l’applicazione, la dimensione media è preferibilmente inferiore a 50 µm. Tale parametro risulta di particolare importanza per l’applicazione cosmetica e/o farmaceutica delle microsfere secondo la presente invenzione. La misura delle microsfere, infatti, determina la setosità del prodotto, una migliore gradevolezza e facilità di applicazione aumentando così l’efficacia del prodotto e dunque l’aderenza alla terapia. In tal modo, il consumatore, gradendo maggiormente il prodotto, non ne evita l’applicazione, ma anzi lo utilizza volentieri.

Infine, il confronto statistico non rivela differenze significative nella misura media delle microsfere ottimizzate e dunque tutte le formulazioni ottimizzate mostrano una distribuzione delle dimensioni quasi unimodale (Fig.2), con valori di Span più bassi di 3 (Tabella 2).

Nel prosieguo della presente trattazione, per microsfere ottimizzate si intendono quelle microsfere realizzate con almeno 60 minuti di emulsificazione.

Tali microsfere ottimizzate sono state caratterizzate dal punto di vista chimico-fisico medianteμ analisi morfologica, stato fisico e molecolare, proprietà termiche, assorbimento e stabilità relativi dell’umidità, proprietà di rilascio in vitro e meccanismo cinetico.

L’analisi morfologica è stata effettuata con microscopia SEM e si è rilevato che tutte le microsfere contenenti HA e incapsulate o meno con un principio attivo o farmaco (es. SAP) presentano una conformazione sferica. La tipologia del polimero (HA o HA-CL) influenza le proprietà superficiali delle microsfere in quanto le microsfere contenenti HA (sia caricate che non con il principio attivo o farmaco quale ad es. SAP) presentano una superficie regolare e liscia mentre le microsfere contenenti HA-CL (sia caricate che non con il principio attivo o farmaco quale ad es. SAP) presentano una superficie irregolare e rugosa, come visibile in figura 3.

Al fine di investigare lo stato molecolare delle microsfere rispetto a SAP, è stata effettuata una analisi diffrattometrica ai raggi X grandangolare. I pattern o andamenti di diffrazione WAXD sono visibili in figura 4 e si può notare che quelli delle microsfere di HA (b) e di HA-CL (c) mostrano i picchi/le curve tipici delle strutture disordinate, vale a dire dei materiali amorfi. L’andamento del SAP (a) è tipico e presenta 4 picchi ad intensità bassa e più alta che emergono dal fondo (in corrispondenza di 2ϑ = 7,30, 20,00, 27,32, and 33,12°, i quali possono essere ascritti a piccoli tratti cristallini. Infatti, l’intensità di diffrazione è data dalla struttura cristallina: più alto è il grado cristallino, maggiore è l’intensità del picco.

I pattern di diffrazione delle microsfere caricate con SAP (d, e) mostrano entrambi gli andamenti, sia quelli del farmaco che quelli del carrier, indicando la permanenza dei tratti cristallini nella matrice amorfa di HA e HA-CL.

Inoltre, l’analisi termica e lo studio DVS confermano che la cristallinità delle microsfere caricate con SAP è così bassa da essere trascurabile.

L’analisi termica (relativa a DSC e TGA) ha permesso di caratterizzare il comportamento termico e la stabilità dell’agente attivo o farmaco e delle formulazioni di microsfere secondo la presente invenzione, fornendo informazioni circa le loro proprietà di idratazione e il loro stato fisico.

In figura 5 sono illustrati i profili termici di SAP e delle formulazioni delle microsfere. Il termogramma del SAP (a) è caratterizzato da un ampio picco endotermico attorno a 67°C e 100°C, il quale può essere associate alla perdita di umidità dopo una iniziale procedura di essiccazione, e da un acuto picco esotermico a 233°C, dovuto al punto di fusione con decomposizione termica. L’ultimo piccolo picco a 287°C è probabilmente causato da impurità (in quando il SAP presenta un livello di purezza del 95% p/p).

I profili termici DSC di fig. 5 delle microsfere di HA (b) presentano un ampio picco endotermico, suggerendo un processo di deidratazione attorno a 103°C, ed un ampio picco esotermico a 240°C ascrivibile alla decomposizione termica del polimero e alla formazione di un residuo carbonizzato.

Il tracciato DSC delle microsfere di HA-CL (c) mostra un ampio picco endotermico a 200°C, attribuibile all’evaporazione del glicole pentilenico (punto di ebollizione 198-200°C) ed è compatibile con il tracciato DSC di questo componente (non illustrato). Inoltre, questa curva mostra un ampio picco esotermico di degradazione termica del polimero, a 250°C (spostato rispetto a quello delle microsfere di HA), che indica una struttura alterata causata dalla reticolazione. I termogrammi delle microsfere di HA-SAP (d) e HA-CL-SAP (e) presentano lo stesso profilo delle corrispondenti microsfere non caricate, ma i picchi sono spostati ad una temperatura inferiore (di circa 10-15°C).

Questo, oltre alla ridotta intensità del picco esotermico, suggerisce una microstruttura alterata della matrice polimerica causata dalla presenza di SAP (probabile dispersione molecolare del SAP nelle microsfere e sovrapposizione dei fenomeni di degradazione termica di SAP e del ialuronano).

I profili termici TGA (illustrati in figura 6) mostrano che SAP (a) presenta una prima regione di perdita di peso (9,6% p/p) tra temperatura ambiente e 223°C (perdita di umidità) ed una seconda regione (20,5% p/p) da 223°C e 400°C (fusione e decomposizione con rilascio di prodotti volatili di degradazione).

Le curve TGA delle microsfere di HA (b) presentano tre distinte fasi di degradazioneμ la prima (20-223°C), caratterizzata dall’evaporazione dell’acqua (6,2% p/p di perdita di acqua), la seconda (223-269°C) e la terza (269-400°C), tipiche della degradazione polisaccaridica a due fasi. Nella seconda fase, il 37,3% p/p di peso è stato perso per la rottura parziale della struttura molecolare. I residui di ialuronano sono poi degradati nella terza fase, caratterizzata dal 12,0% p/p di perdita di peso.

Un profilo TGA comparabile caratterizza anche le microsfere HA-SAP (d), con 10,8% p/p di perdita di peso nella prima regione (20-208°C), 26,2% p/p nella seconda (208-258°C), e 12,0 % p/p nella terza (258-400°C). Per queste microsfere la decomposizione del polimero e quella dell’agente attivo o farmaco sembra avvenire insieme. I termogrammi TGA delle microsfere di HA-CL (c) e di HA-CL-SAP (e) presentano la degradazione in due fasi del polimero osservata per le microsfere di HA (b e d), con una fase aggiuntiva per l’evaporazione del glicole pentilenico e più fasi di perdita d’acqua. Il fatto che avvenga una perdita d’acqua più graduale deriva dal fatto che il glicole pentilenico ha una azione di legante per l’acqua, che determina la presenza di un umettante contenuto nella matrice di HA-CL. In dettaglio, i tracciati TGA delle microsfere di HA-CL (c) mostrano le seguenti regioni di perdita di pesoμ tre fasi per l’evaporazione dell’acqua e poi del glicole pentilenico (20-97°C, 97-158°C, 158-223°C -perdita totale di pesoμ 26.2% p/p), e due fasi per la degradazione di HA (223-265°C, 223-400°C - perdita totale di pesoμ 29.5% p/p). Il profilo termico TGA delle microsfere HA-CL-SAP (e) è caratterizzato da due regioni per la perdita di acqua e poi di glicole pentilenico (20-154°C, 154-212°C - perdita totale di peso: 21.5% p/p), e due regioni per la decomposizione di HA e SAP (212-254°C, 254-400°C - perdita totale di peso: 30.3% p/p).

È noto che HA sia una macromolecola altamente igroscopica, e quindi intrinsecamente suscettibile ad assorbire l’umidità e dall’umidità relativa (RH) elevata.

Al fine di caratterizzare le microsfere di ialuronano e per valutare l’effetto dell’incapsulamento dell’agente attivo o farmaco, il farmaco e le formulazioni sono state sottoposte a due cicli di RH 0-λ0% usando la tecnica DVS. In figura 7 sono illustrate le isoterme di assordimento (sorption) e desorbimento (desorption) di acqua per il primo aumento di umidità (1° ciclo) in funzione della percentuale RH%.

Secondo i dati di assorbimento di SAP (pannello a) si vede un aumento lineare del contenuto di acqua a partire dalla polvere secca fino ad una percentuale di RH del 40%, in cui l’assorbimento di acqua è stato 6,6%. Un aumento brusco dell’assorbimento di acqua (+ 9,6%) è osservato in corrispondenza di un range di RH tra 40 e 50%. L’umidità finale totale assorbita da SAP è del 27,8%. La curva di desorbimento di umidità del SAP è molto diversa e presenta una pronunciata isteresi. Alla fine del processo di desorbimento, l’umidità trattenuta è del 15,4%. questo significa che il SAP non ha un comportamento reversibile in fatto di assorbimento/desorbimento di umidità e le molecole di acqua non sono facilmente staccate dal composto, probabilmente a causa della loro condensazione nello scheletro idrofobico della molecola.

D’altro canto, le microsfere (pannelli b e c) mostrano (come avviene per HA, dati non mostrati) trend simili per le curve di assorbimento e desorbimento ed una alta capacità di legame con l’acqua (a causa dei legami a idrogeno e all’interazione elettrostatica con i gruppi idrossilico e carbossilico dell’HA rispettivamente).

Il processo di assorbimento dell’umidità avviene in due fasi. Dunque, in risposta all’aumento di RH da 0 a 60%, l’assorbimento di acqua aumenta lentamente fino a 20,9% per le microsfere di HA, 14,2% per le microsfere di HA-SAP, 16,4% per le microsfere di HA-CL e 23,0% per le microsfere di HA-CL-SAP, con variazioni nella massa simili a quelle intervenute nel SAP (+ 17,8%) in corrispondenza di 60% RH. Comunque, il trattenimento finale dell’acqua alla fine del processo di assorbimento è maggiore per le formulazioni di microsfere rispetto a SAP, in quanto l’assorbimento di acqua o umidità è favorito in modo marcato per tutte le formulazioni di microsfere nel range di RH da 60 a 90%. A 90% di RH, il contenuto di acqua è 48,5% per le microsfere di HA, 41,9% per le microsfere di HA-SAP, 73,8% per le microsfere di HA-CL, 78,4% per le microsfere do HA-CL-SAP.

L’assorbimento maggiore di umidità osservato per le formulazioni in cui l’HA è reticolato rispetto alle formulazioni di HA nativo è dovuto alla presenza di urea e glicole e alle loro proprietà di legante con l’acqua.

Tutte le formulazioni contenenti microsfere mostrano il fenomeno dell’isteresiμ per lo stesso valore di RH, durante il processo di desorbimento, i campioni sono caratterizzati da un alto livello di umidità rispetto al processo di assorbimento. In ogni caso, l’isteresi è ridotta rispetto a SAP, così come il livello finale di umidità alla fine del processo di desorbimento (0% RH), che ammonta a 0,8% per le microsfere di HA, 4,9% per le microsfere di HA-SAP, 7,8% per le microsfere di HA-CL, 8,7% per le microsfere di HA-CL-SAP. Dunque, l’incapsulazione di SAP nelle microsfere di ialuronano determina un assorbimento/desorbimento di acqua più reversibile rispetto al farmaco puro, anche se più suscettibile ad alte percentuali di RH.

La solubilità di SAP in PBS (pH = 7,4) a 32°C è di 425,0 ± 0,9 mg/ml. Questo risultato mostra che le condizioni di sink vengono garantite durante gli studi in vitro di rilascio di farmaci, in quanto la concentrazione di SAP in caso di rilascio completo raggiunge valori di 0,033 mg/ml nelle prove di dialisi, e di 0,087 mg/ml nei test con le celle di diffusione di Franz.

Studio di rilascio dell’agente attivo o farmaco in vitro e analisi della cinetica di rilascio Per ogni metodo di rilascio utilizzato, la diffusione di agente attivo o farmaco (quale ad es. il SAP) tra le membrane e i profili di rilascio di agente attivo o farmaco da microsfere di HA e HA-CL sono stati analizzati statisticamente e confrontati utilizzando i fattori di adattamento (Fit Factors) descritti da Moore and Flanner (1996) e adottati dalla Food and Drug Administration per i test di dissoluzione nel settore industriale. I fattori di adattamento sono modelli usati per confrontare direttamente la differenza tra la percentuale di farmaco rilasciata per unità di tempo tra un riferimento e una formulazione di prova. Il fattore di differenza (f1) e il fattore di somiglianza (f2) sono stati calcolati utilizzando le equazioni (6) e (7), rispettivamenteμ

in cui Rt e Tt sono percentuali di farmaco rilasciato ad un certo tempo sperimentale (t) dalla formulazione di riferimento (controllo) e dalla formulazione da testare, rispettivamente; n è il numero di tempi di campionamento del test di dissoluzione. Il fattore di differenza (f1) calcola la differenza percentuale tra il controllo e la formulazione test in ciascun tempo sperimentale, misurando quindi l’errore relativo tra le due curve. Il fattore di similarità (f2) è una misura della somiglianza in percentuale tra il rilascio delle due curve. Per l’analisi dei dati sono stati scelti descrittori arbitrari di differenza e similaritàμ le curve sono state considerate diverse con (f1) ≥ 10 e (f2) ≤ 50.

Secondo la presente invenzione, il rilascio di SAP da microsfere di HA e di HA-CL è stato valutato con due diversi metodi in vitro: la dialisi e le celle di diffusione di Franz. Come controllo è stato considerato un test di diffusione di SAP libero.

Per quanto riguarda la dialisi, le microsfere vengono trattenute in una membrana, mentre il farmaco rilasciato si diffonde prima dalle microsfere (carrier) al mezzo all'interno della membrana, e poi verso un compartimento esterno. Inevitabilmente, la membrana oppone una resistenza alla diffusione delle molecole del farmaco. Questa resistenza può essere limitata utilizzando una membrana con un MWCO più piccolo della dimensione del carrier, ma significativamente più grande del peso molecolare del farmaco. Considerando le dimensioni delle microsfere di ialuronano e il peso molecolare di SAP (358,08 g/mol), in questa analisi sono state impiegate cassette per dialisi da 10 kDa MWCO. Come ci si poteva aspettare dagli studi in letteratura, la cinetica di rilascio misurata sembra essere diminuita rispetto alla realtàμ il tasso di diffusione di SAP libero, un farmaco altamente idrofilo, appare estremamente lento (dopo 420 minuti, solo il 68,3 ± 3,1% del farmaco è diffuso (fig.8a)). Inoltre, i profili di rilascio di SAP dalle microsfere sembrano controllati dalla membrana piuttosto che dalle microsfere, poiché sono risultati quasi identici al profilo di diffusione di SAP libero (Figura 8a). In effetti, il confronto statistico dei dati di dialisi ha confermato che tutte le curve erano simili, mostrando f1 <10 e f2> 50 (Tabella 3). Pertanto, in questa analisi, il preciso processo di rilascio e il comportamento cinetico non possono essere studiati utilizzando il metodo di rilascio della dialisi.

Tabella 3. Fattori (f2) e (f1) per il SAP libero e per le formulazioni delle microsfere.

Al contrario, le celle di diffusione di Franz hanno mostrato risultati importanti per la presente invenzione. Questo metodo, infatti, riproduce le condizioni presenti sulla superficie della pelle, degli annessi cutanei e/o delle mucose, consentendo una lenta idratazione del carrier (vale a dire delle microsfere) in un ambiente umido.

I profili di rilascio in vitro ottenuti con il metodo delle celle di diffusione di Franz sono illustrati in Fig. 8b. La diffusione di SAP libero è più veloce del rilascio di SAP da microsfere di HA e HA-CL. Più precisamente, il rilascio di SAP da microsfere di HA-CL risulta significativamente esteso non solo rispetto al SAP libero, ma anche rispetto alle microsfere di HA, come dimostrano anche i fattori di similitudine e di differenza f1> 10 e f2 <50 (Tabella 3). Ad esempio, dopo 30 minuti, la quantità di farmaco rilasciata è 97,4 ± 2,4% per SAP libero, rispetto a 81,9 ± 0,4% e il 66,4 ± 4,2% per le microsfere di HA e HA-CL, rispettivamente (Fig.8b).

Risulta dunque un rilascio più lento dell’agente attivo o farmaco da parte delle microsfere reticolare con urea (HA-CL) a causa del peso molecolare più elevato e delle proprietà meccaniche implementate rispetto del polimero reticolato rispetto all’acido ialuronico nativo (HA)

In seguito all’analisi dei modelli matematici usati per analizzare la cinetica di rilascio di un agente attivo o farmaco (es. SAP) dalle microsfere di ialuronano, è emerso che il rilascio di tale agente attivo o farmaco (es. SAP) da parte dalle microsfere di ialuronano è governato non solo dalla diffusione dell’agente attivo o farmaco, ma anche dal rigonfiamento (swelling) e dalla dissoluzione del polimero.

Le microsfere di ialuronano contenenti un agente attivo o farmaco (es. SAP) secondo la presente invenzione risultano essere, dunque, dei dispositivi atti al rigonfiamento composti da matrici polimeriche idrofiliche in cui un agente attivo o farmaco idrosolubile è dispersoμ l’acqua penetra nella matrice polimerica, causandone il districamento e/o l’allentamento e quindi il rigonfiamento. Questi fenomeni riducono la concentrazione di ialuronano, migliorando quindi la sua dissoluzione all’interfaccia nonché la “bagnabilità” e la diffusione di agente attivo o farmaco (es. SAP).

I dati dimostrano inoltre che, per entrambe le formulazioni di microsfere, il rilascio di agente attivo o farmaco (es. SAP) è stato completato in un arco di tempo di circa un’ora (Fig. 8).

Si evince così come la presente invenzione permetta una resa per la produzione di microsfere di HA-CL (contenenti o meno almeno un agente attivo o farmaco) ad alto rendimento e paragonabile a quella delle microsfere di HA non reticolato. Tale resa è infatti superiore o uguale a 85%.

Inoltre, le microsfere di HA reticolato permettono una incapsulazione più efficiente rispetto a quelle delle microsfere di HA nativo o non reticolato (ad esempio rispettivamente 78,8 ± 2,6% rispetto a 69,7 ± 4,6%). Dai dati indicati si evince, invece, che lo stato fisico e molecolare, le proprietà termiche, la stabilità all’umidità relativa delle microsfere di HA-CL sono paragonabili a quelli delle microsfere di HA (indipendentemente dalla presenza o meno di almeno un agente attivo o farmaco). Pertanto, la reticolazione non influisce negativamente su tali proprietà delle microsfere ottenute secondo la presente invenzione.

Infine, le microsfere di HA-CL rilasciano l’almeno un agente attivo o farmaco in modo più efficiente ed ampio rispetto ad analoghe microsfere di HA non reticolato, nonostante presentino lo stesso meccanismo cinetico di diffusione. Anche da questo punto di vista, dunque, la presente invenzione presenta vantaggi effettivi.

Infatti, ciò dimostra che le proprietà meccaniche implementate delle microsfere di HA-CL determinano per le stesse un’ottimale (e migliorata rispetto ad analoghe microsfere non reticolate) efficienza di rilascio dell’almeno un agente attivo o farmaco.

La presente invenzione dunque, è relativa all’uso della formulazione secondo la presente invenzione per l’applicazione topica su pelle e/o annessi cutanei e/o membrane per il trattamento cosmetico ad esempio dell’invecchiamento, del foto-invecchiamento, per il trattamento della secchezza della pelle, per la riduzione di rughe, segni o macchie, per favorire la riepitelizzazione della pelle e/o degli annessi cutanei, eccetera.

La presente invenzione, inoltre, è relativo all’uso medicale o farmaceutico della formulazione secondo la presente invenzione per il trattamento di patologie o disfunzioni connesse alla pelle e/o agli annessi cutanei e/o alle membrane e/o per il trattamento delle ferite e/o delle cicatrici e/o dei processi infiammatori connessi alla pelle e/o agli annessi cutanei e/o alle membrane e/o per l’uso nel trattamento della rigenerazione e riparazione cellulare, dei disturbi legati a secchezza della pelle e/o degli annessi cutanei e/o delle membrane, di cheratopatie, di cheratopatie non infettive, per la neutralizzazione dei radicali liberi, nel trattamento di dermatite atopica, secchezza cutanea, eritema, gambe e piedi diabetici, ragadi, cicatrici ipertrofiche, ustioni, eccetera.

La presente invenzione dunque, secondo una qualsiasi delle versioni sopra indicate, presenta almeno una delle seguenti applicazioni: cosmetica, farmaceutica, come dispositivo medico, o dietetico-alimentare.

In quest’ultimo caso, l’indicazione utilizzata di “formulazione medicale, farmaceutica e/o cosmetica” è da intendersi come anche formulazione per uso dietetico e/o alimentare e/o come integratore alimentare.

HA ha infatti dimostrato interessanti capacità anche quando ingerito e rappresenta quindi un ingrediente interessante per il cibo arricchito e per gli integratori alimentari. In questo senso, l’HA può essere definito un nutri-cosmetico, in quanto è in grado di migliorare l'apparenza della pelle, facendola apparire più giovane (anche quando assunto oralmente). È stato dimostrato infatti che l’acido ialuronico, o una porzione dello stesso ottenuta in seguito alla sua idrolisi nell'intestino, è in grado di attraversare la barriera intestinale e raggiungere la pelle.

Studi recenti hanno valutato la degradazione e l’assorbimento di HA (300 kDa e 2 kDa) dopo ingestione orale dimostrando una qualche degradazione intestinale e l’escrezione così come la sua traslocazione nel sangue e nella pelle.

Inoltre, lo studio suggerisce che l’HA somministrato per via orale è degradato ad oligosaccaridi dai batteri intestinali, e tali oligosaccaridi sono assorbiti nell’intestino crasso e successivamente distribuiti in tutti i tessuti, compresa la pelle (es. somministrazione orale di HA ad alto peso molecolare (300 kDa, 200 mg/kg/die).

In particolare, ulteriori studi hanno dimostrato che l’HA ad alto peso molecolare, somministrato per via orale, può raggiungere le articolazioni e la pelle, anche se in piccole quantità.

La presente invenzione, infatti, prevede che l’HA presenti una sua funzionalità quando utilizzato in integratori alimentari aventi effetti benefici per la salute di articolazioni e/o pelle.

La presente invenzione, dunque, presenta i seguenti effetti (in combinazione o considerati singolarmente), dopo assunzione orale di microsfere reticolate di HA: miglioramento della forza e/o della resistenza dei muscoli nell’uomo, trattamento dei dolori articolari, trattamento di rughe, miglioramento dell’idratazione della pelle, riduzione della secchezza della pelle indotta da esposizione ai raggi UV, fumo, agenti inquinanti (ad esempio mediante somministrazione orale di un integratore alimentare contenente una quantità di HA compresa tra 37.52-240 mg al giorno in un periodo di 4-6 settimane).

Un possibile meccanismo di azione consiste nel fatto che, nonostante il suo peso molecolare (MW), l’HA parzialmente digerito sia assorbito nell'intestino mentre l’HA non digerito (vale a dire intatto) sia assorbito dal sistema linfatico; entrambi i tipi di HA sono quindi distribuiti alla pelle (e qui fungere ad esempio da induttore di proliferazione dei fibroblasti).

Molto interessante è un risultato che ha dimostrato che l’HA somministrato oralmente (MW meno di 10 kDa) stimoli l’espressione di HAS2 (hyaluronan syntase 2) indicando così un ruolo complessivo dell’acido ialuronico a basso MW nella prevenzione del fotoinvecchiamento cutaneo secondo diversi meccanismi di azione.

Secondo la presente invenzione, al fine di ottenere un risultato efficace e duraturo nel tempo, ad esempio per il controllo dell'invecchiamento cutaneo o per altre applicazioni quali il trattamento di dolori articolari, il miglioramento della forza muscolare o il trattamento dell’effusione sinoviale o dell’infiammazione articolare, ecc., sarebbe possibile combinare la somministrazione dell’HA reticolato sia per via orale, che topica e/o iniettabile.

Secondo la presente invenzione, l’integratore alimentare a base di acido ialuronico qui descritto può essere sotto forma di compressa o capsula, in forma di gel rigido o morbido. La compressa o la capsula è da somministrare per via orale.

La compressa o la capsula può comprendereμ 0,5-50% (p/p) di microsfere di acido ialuronico o di un suo sale, almeno un antiossidante ed almeno un eccipiente. Inoltre, la compressa comprende anche un rivestimento mentre la capsula comprende anche una capsula, ad esempio in gelatina.

L’antiossidante può comprendere una vitamina quale la vitamina C, ad esempio ad una concentrazione del 5%.

L’eccipiente può comprendere ad esempio un amido di riso o di mais.

Tutti gli ingredienti devono essere ben amalgamati e successivamente compressi per ottenere una compressa. Se una miscela sufficientemente omogenea dei componenti non può essere ottenuta con semplici processi di miscelazione, gli ingredienti possono essere, ad esempio, granulati prima della compressione per assicurare una distribuzione uniforme del composto attivo nella compressa finale.

Le polveri che possono essere mescolate bene non richiedono la granulazione e possono essere trasformate in compresse attraverso la compressione diretta.

Secondo l'invenzione, può essere presente un eccipiente additivo, ad esempio selezionato dal gruppo che comprende: un monosaccaride, un disaccaride, un oligosaccaride, un polisaccaride, un alcool dello zucchero, e talco. Secondo un esempio, l’eccipiente e/o l’eccipiente supplementare comprende amido di mais pre-gelatinoso.

Inoltre, può essere presente e/o applicato un rivestimento per rendere la compressa o la capsula più liscia e più facile da inghiottire, per controllare il tasso di rilascio del principio attivo o farmaco e/o per rendere la compressa o la capsula più resistente all'ambiente (per esempio resistenza gastrica). Il rivestimento per le compresse e/o le capsule sono utili anche per estendere la conservabilità o il periodo di conservazione dei componenti presenti sensibili all'umidità o all'ossidazione.

In una versione dell’invenzione, il rivestimento è un polimero, ad esempio un polimero gastro resistente (ad esempio resistente all'acido). In una versione dell’invenzione, il polimero è un composto derivato della cellulosa come ipromelloso o un acrilato, in particolare acido metacrilico o metilmetacrilato.

Nel caso della formulazione del gel molle in capsule di gelatina, l'eccipiente può comprendere un olio vegetale (ad esempio olio di crusca di riso) e l'antiossidante può essere l'acido ascorbico (5%) tal quale o nella sua forma esterificata.

La presente invenzione così concepita è suscettibile di numerose modifiche e varianti tutte rientranti nell’ambito del concetto inventivo.

Inoltre, tutti i dettagli sono sostituibili da altri elementi tecnicamente equivalenti. In pratica, i materiali impiegati, nonché le forme e le dimensioni contingenti, potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze senza per questo uscire dall’ambito di protezione delle seguenti rivendicazioni.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Formulazione medicale, e/o farmaceutica, e/o cosmetica, e/o dietetico-alimentare, quale ad esempio nella forma di un integratore alimentare, comprendente microsfere di acido ialuronico reticolato con urea, caratterizzata dal fatto che dette microsfere comprendono e/o incorporano e/o sono legate a almeno un agente attivo o farmaco e sono atte a rilasciare in uso detto almeno un agente attivo o farmaco.
2. Formulazione secondo la rivendicazione 1, in cui dette microsfere presentano una distribuzione dimensionale sostanzialmente unimodale e/o un diametro medio compreso tra 1 e 400 μm o tra 5 e 25 μm o tra 1 e 1000 μm e/o una forma sostanzialmente sferica e/o una superficie sostanzialmente ruvida, e/o in cui dette microsfere sono in forma secca e/o comprendono microsfere e/o microcapsule.
3. Formulazione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta formulazione è applicabile e/o iniettabile e/o impiantabile nel corpo umano, in particolare in corrispondenza della pelle, delle mucose e/o degli annessi cutanei, e/o ingeribile per via orale.
4. Formulazione secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto almeno un agente attivo o farmaco è una sostanza idratante e/o antiossidante e/o comprende almeno una delle seguenti sostanze: sodio ascorbil fosfato (SAP), vitamina C, vitamina E, vitamina B, una vitamina in generale o un derivato di una vitamina, dexpantenolo, nicotinammide, glicerolo, carnosina, taurina, acido lattobionico, uno o più amminoacidi, glicina, arginina, cisteina, N-acetilcisteina, polifenoli, flavonoidi, lignine, acidi fenolici e stilbeni, peptidi, quali ad esempio i peptidi anti-età, acidi nucleici (DNA e/o RNA), capsaicina, mentolo eccetera.
5. Formulazione secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui dette microsfere comprendono e/o incorporano almeno un primo agente attivo o farmaco ed un secondo o un agente attivo o farmaco, in cui detto primo e/o detto secondo agente attivo o farmaco è incorporato e/o legato e/o compreso in dette microsfere e/o in detto acido ialuronico reticolato con urea o in una matrice formata da detto acido ialuronico reticolato con urea.
6. Metodo per la realizzazione di microsfere di acido ialuronico reticolato con urea di una formulazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente le seguenti fasi: i) predisporre una soluzione di acido ialuronico reticolato con urea, la quale è ottenuta miscelando acido ialuronico reticolato con urea in una soluzione acquosa comprendente acqua o una soluzione salina, ii) predisporre una soluzione acquosa contenente almeno un agente attivo o farmaco, la quale è ottenuta miscelando detto agente attivo o farmaco in una soluzione comprendente acqua o una soluzione salina, iii) miscelare detta soluzione di acido ialuronico reticolato con urea e la soluzione contenente detto agente attivo o farmaco in modo che detto agente attivo o farmaco sia incorporato e/o inserito all’interno di detto acido ialuronico reticolato con urea e/o si leghi con detto acido ialuronico reticolato con urea.
7. Metodo secondo la rivendicazione 6, in cui detta fase i) è ottenuta predisponendo una soluzione di acido ialuronico ed una soluzione di urea, miscelando dette due soluzioni, in modo che detto acido ialuronico reticoli con detta urea.
8. Metodo secondo una delle rivendicazioni 6 o 7, in cui detta soluzione di detto almeno un agente attivo o farmaco è addizionata a detta soluzione di acido ialuronico durante la fase di reticolazione con detta soluzione di urea.
9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 8, in cui detta reticolazione di detto acido ialuronico con urea avviene in ambiente acido e/o miscelando l’urea in una soluzione contenente HCl.
10. Metodo secondo la rivendicazione 6, in cui detta fase i) è ottenuta predisponendo una soluzione di acido ialuronico, a cui si aggiungono 1-etil-3- [3-(dimetilammino) -propil] -carbodiimmide (EDC) e 1-idrossibenzotriazolo (HOBt), in modo da formare un intermedio stabile con HOBt e dunque una miscela di reazione, predisporre una soluzione di urea ed una soluzione contenente l’almeno un agente attivo o farmaco, addizionare dette soluzioni alla miscela di reazione, ottenendo infine una soluzione di acido ialuronico reticolato con urea e contenente e/o incorporante e/o legato a detto almeno un principio attivo o farmaco.
11. Metodo secondo la rivendicazione 6, in cui detta fase i) è ottenuta predisponendo una soluzione di acido ialuronico, predisporre una miscela con acqua e acetonitrile in rapporto 3:2, addizionare tale soluzione di acido ialuronico e detta miscela ottenendo una miscela risultante, raffreddare la miscela risultante, aggiungere 2-cloro-dimetossi-1,3,5-triazina (CDMT) in modo che quest’ultima reagisca con i gruppi carbossilici dell’acido ialuronico per formare un intermedio HA-triazina, aggiungere N-metilmorfolino (NMM), aggiungere urea o una soluzione di urea e detto almeno un agente attivo o farmaco o una soluzione contenente detto agente attivo o farmaco, in modo da reagire con intermedio di HA-triazina, ottenendo così acido ialuronico reticolato con urea e contenente e/o incorporante e/o legato a detto almeno un principio attivo o farmaco.
12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 11, comprendente una fase di portare il pH di detto acido ialuronico reticolato con urea nell’intervallo 5.5-7.5.
13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 12, comprendente una fase di ottenere acido ialuronico reticolato con urea e incorporante e/o contenente e/o legante due o più principi attivi o farmaci, in cui detta fase è ottenuta dissolvendo due o più principi attivi o farmaci all’interno della stessa soluzione e/o predisponendo due o più soluzioni ciascuna contenente un diverso agente attivo o farmaco.
14. Metodo, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 13, comprendente una fase di ottenere dette microsfere facendo passare detto acido ialuronico reticolato con urea, eventualmente incorporante e/o contenente e/o legante almeno uno o più principi attivi o farmaci, attraverso un filtro o schermo avente una dimensione dei pori, ad esempio, non limitativo, compresa tra 5 e 150 μm, o mediante spruzzatura a secco (spray-drying), o mediante emulsificazione acqua in olio seguita da una fase di evaporazione del solvente, o mediante liofilizzazione o mediante essiccazione (ad esempio, non limitativo, in una stufa da vuoto), e/o mediante successive macinazione e/o micronizzazione in modo tale da ottenere dette microsfere o microparticelle con un diametro medio compreso tra 1 e 1000 μm.
15. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 14, comprendente una fase di fornire una soluzione e/o una sospensione atta ad ottenere microsfere di acido ialuronico reticolato con urea, e/o ottenere una soluzione e/o una sospensione atta ad ottenere microsfere di acido ialuronico reticolato con urea aventi un diametro medio compreso tra 1 e 1000 micron, e miscelare detta soluzione e/o sospensione con detta soluzione acquosa contenente almeno un agente attivo o farmaco, in modo tale da ottenere, dopo passaggio attraverso un filtro o schermo o dopo spruzzatura a secco (spray-drying), o emulsificazione acqua in olio seguita da una fase di evaporazione del solvente, o liofilizzazione o essiccazione e/o successive macinazione e/o micronizzazione, microsfere che comprendono e/o incorporano e/o sono legate a almeno un agente attivo o farmaco e sono atte a rilasciare in uso detto almeno un agente attivo o farmaco.
16. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 6 a 15, in cui detta fase di predisporre detto acido ialuronico e detta fase di predisporre detto almeno un agente attivo o farmaco sono realizzate predisponendo una unica soluzione contenente detto acido ialuronico e detto almeno un agente attivo o farmaco.
17. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 6 a 16, comprendente una fase di emulsificazione acqua in olio seguita da una fase di evaporazione del solvente per l’ottenimento di dette microsfere, in cui detta fase comprende: far gocciolare detta soluzione acquosa contenente acido ialuronico reticolato con urea, ed eventualmente comprendente almeno un agente attivo o farmaco, in una fase oleosa, ad esempio comprendente un olio minerale, in cui detta fase oleosa comprende un agente emulsionante, sotto agitazione, emulsionare detta soluzione acquosa in detta fase oleosa mediante un miscelatore o un emulsionatore per un tempo compreso, ad esempio, tra 10 min e 60 min, miscelare il tutto con un agitatore e/o riscaldare il tutto a una temperatura di 37 ± 2°C, in modo da far evaporare detta fase acquosa dispersa e ottenendo in tal modo un residuo contenente dette microsfere.
18. Metodo secondo la rivendicazione precedente, comprendente una fase di centrifugare detto residuo in modo da separare detta fase oleosa da dette microsfere, eventualmente risospendere dette microsfere in esano e filtrare il tutto sottovuoto, in modo da raccogliere o collezionare dette microsfere.
19. Uso della formulazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 per l’applicazione topica su pelle e/o annessi cutanei e/o membrane o per l’ingestione per via orale per il trattamento cosmetico ad esempio dell’invecchiamento, del foto-invecchiamento, per il trattamento della secchezza della pelle, per la riduzione di rughe, segni o macchie, per favorire la riepitelizzazione della pelle e/o degli annessi cutanei, eccetera.
20. Formulazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 per l’uso nel trattamento di patologie o disfunzioni connesse alla pelle e/o agli annessi cutanei e/o alle membrane e/o per il trattamento delle ferite e/o delle cicatrici e/o dei processi infiammatori connessi alla pelle e/o agli annessi cutanei e/o alle membrane.
21. Formulazione secondo la rivendicazione precedente per l’uso nel trattamento della rigenerazione e riparazione cellulare, dei disturbi legati a secchezza della pelle e/o degli annessi cutanei e/o delle membrane, di cheratopatie, di cheratopatie non infettive, per la neutralizzazione dei radicali liberi, nel trattamento di dermatite atopica, secchezza cutanea, eritema, gambe e piedi diabetici, ragadi, cicatrici ipertrofiche, ustioni, eccetera.
22. Uso della formulazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 come formulazione dietetica e/o alimentare e/o come integratore alimentare.
23. Formulazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 e/o 22, in cui detta formulazione è sotto forma di compressa o capsula, ad esempio una compressa in forma di gel rigido o morbido, atta ad essere somministrata per via orale.
24. Formulazione secondo la rivendicazione precedente, in cui detta compressa o capsula comprende: 0,5-50% (p/p) di dette microsfere di acido ialuronico reticolato con urea, comprendenti e/o incorporanti e/o legate ad almeno un agente attivo o farmaco, almeno un agente antiossidante, almeno un eccipiente ed, eventualmente, almeno un rivestimento e/o una capsula, ad esempio in gelatina.
25. Formulazione secondo la rivendicazione precedente, in cui detto almeno un antiossidante comprende una vitamina quale la vitamina C o acido ascorbico tal quale o nella sua forma esterificata, ad esempio ad una concentrazione del 5% e/o in cui detto almeno un eccipiente comprende un amido di riso o di mais o un amido di mais pre-gelatinoso o un olio vegetale, ad esempio olio di crusca di riso e/o comprendente almeno un eccipiente additivo , ad esempio selezionato dal gruppo che comprende: un monosaccaride, un disaccaride, un oligosaccaride, un polisaccaride, un alcool dello zucchero, talco e un amido di mais pre-gelatinoso.
26. Formulazione secondo la rivendicazione 24, in cui detto rivestimento è un polimero, ad esempio un polimero gastro resistente, ad esempio resistente all'acido, o un polimero derivato della cellulosa, quale ad esempio ipromelloso o un acrilato, o acido metacrilico o metilmetacrilato.