IT201800008035A1 - INNOVATIVE FUNCTIONALIZATION ON LIQUID PHASE SENSORS FOR THE DETECTION OF BIOACTIVE LIPIDS - Google Patents
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Classifications
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Description
“FUNZIONALIZZAZIONE INNOVATIVA SU SENSORI IN FASE LIQUIDA “INNOVATIVE FUNCTIONALIZATION ON LIQUID PHASE SENSORS
PER LA RILEVAZIONE DI LIPIDI BIOATTIVI” FOR THE DETECTION OF BIOACTIVE LIPIDS "
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Campo tecnico dell’invenzione Technical field of the invention
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di elettrodi funzionalizzati per la rivelazione di lipidi mediante voltammetria ciclica, agli elettrodi ottenibili con tale procedimento e all’uso di tali elettrodi in un metodo di rivelazione di lipidi in un campione, in particolare nel sangue The present invention relates to a process for the preparation of functionalized electrodes for the detection of lipids by cyclic voltammetry, to the electrodes obtainable with this process and to the use of such electrodes in a method of detecting lipids in a sample, in particular in the blood
Stato della tecnica anteriore State of the prior art
La determinazione accurata della concentrazione dei lipidi presenti in un campione, in particolare nel sangue è estremamente importante data la rilevanza chimico-clinica di queste classi di molecole. Le metodiche attualmente utilizzate per la quantificazione lipidica prevedono principalmente tecniche cromatografiche (in fase liquida, o gassosa) accoppiate alla spettrometria di massa (MS). La MS è usata soprattutto accoppiata alla cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) o all’ultra cromatografia liquida ad alta prestazione (UHPLC) con un'interfaccia di ionizzazione a pressione atmosferica (API) tra la MS e LC. Tali tecniche, sebbene molto sensibili ed accurate, richiedono procedure laboriose per la preparazione del campione e l’analisi di massa deve essere effettuata da operatori con elevata competenza scientifica ed esperienza operativa. Da un punto di vista economico, l’acquisto di uno spettrometro di massa rappresenta un investimento importante e difficilmente sostenibile. The accurate determination of the concentration of lipids present in a sample, particularly in the blood, is extremely important given the chemical-clinical relevance of these classes of molecules. The methods currently used for lipid quantification mainly involve chromatographic techniques (in liquid or gas phase) coupled to mass spectrometry (MS). MS is mainly used in conjunction with high performance liquid chromatography (HPLC) or ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) with an atmospheric pressure ionization interface (API) between the MS and LC. These techniques, although very sensitive and accurate, require laborious procedures for sample preparation and the mass analysis must be carried out by operators with high scientific competence and operational experience. From an economic point of view, the purchase of a mass spectrometer represents an important and hardly sustainable investment.
Uno scopo della presente invenzione è quello di fornire mezzi e metodi per una quantificazione accurata delle diverse famiglie di lipidi che sia accessibile ad operatori meno specializzati con un costo trascurabile rispetto a quelli della strumentazione usata attualmente. Inoltre, un ulteriore scopo degli inventori è fornire una soluzione con dimensioni ridotte che rendano la stessa utilizzabile non solo in laboratori specializzati ma anche in presidi mobili. An object of the present invention is to provide means and methods for an accurate quantification of the different families of lipids which is accessible to less specialized operators with a negligible cost compared to those of the instrumentation currently used. Furthermore, a further object of the inventors is to provide a solution with reduced dimensions that make it usable not only in specialized laboratories but also in mobile devices.
Sommario dell’invenzione Summary of the invention
L’invenzione qui descritta vuole risolvere il problema sopra presentato mediante l’impiego di una tecnica di analisi elettrochimica, nello specifico la voltammetria ciclica, accoppiandola all’utilizzo di elettrodi, in particolare elettrodi screen-printed, funzionalizzati con materiali biologici. Tali materiali biologici, selezionati per la loro affinità per i lipidi bioattivi di interesse, avranno la capacità di legare specificatamente gli analiti presenti in soluzione anche a concentrazioni fisiologicamente rilevanti. The invention described here aims to solve the problem presented above by using an electrochemical analysis technique, specifically cyclic voltammetry, by coupling it to the use of electrodes, in particular screen-printed electrodes, functionalized with biological materials. These biological materials, selected for their affinity for the bioactive lipids of interest, will have the ability to specifically bind the analytes present in solution even at physiologically relevant concentrations.
Un primo oggetto della presente invenzione è un procedimento secondo la rivendicazione 1. A first object of the present invention is a process according to claim 1.
Un secondo oggetto della presente invenzione è un elettrodo funzionalizzato per la rivelazione di lipidi mediante voltammetria ciclica secondo la rivendicazione 13. A second object of the present invention is a functionalized electrode for the detection of lipids by cyclic voltammetry according to claim 13.
Un terzo oggetto della presente invenzione è un metodo per la determinazione di lipidi in un campione liquido secondo la rivendicazione 20. A third object of the present invention is a method for the determination of lipids in a liquid sample according to claim 20.
Caratteristiche preferite dell'invenzione sono oggetto delle rivendicazioni dipendenti. Alcuni dei vantaggi della presente invenzione sono riassunti qui di seguito: Preferred features of the invention are the subject of the dependent claims. Some of the advantages of the present invention are summarized below:
-realizzazione di sensori miniaturizzati; -realization of miniaturized sensors;
-possibilità di essere adattato a qualsiasi sistema di voltammetria ciclica che utilizzi sistemi di sensori micro fabbricati o screen-printed; -possibility to be adapted to any cyclic voltammetry system that uses micro fabricated or screen-printed sensor systems;
- possibilità di rilevare concentrazioni molto basse di lipidi bioattivi in volumi di campione ridotto. - possibility of detecting very low concentrations of bioactive lipids in small sample volumes.
Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata. Other advantages and features of the present invention will become apparent from the following detailed description.
Descrizione delle figure Description of the figures
Figura 1: La figura 1 è una rappresentazione schematica del procedimento per la preparazione degli elettrodi funzionalizzati per la misura di lipidi in voltammetria ciclica secondo una forma di realizzazione preferita. Figure 1: Figure 1 is a schematic representation of the process for the preparation of functionalized electrodes for the measurement of lipids in cyclic voltammetry according to a preferred embodiment.
Figura 2: La figura 2 mostra la quantificazione della molecola AEA (arachidoniletanolammide o anandamide) in soluzione acquosa con un errore inferiore ai 3 nM, ottenuta con gli elettrodi funzionalizzati secondo la presente invenzione. Figure 2: Figure 2 shows the quantification of the AEA molecule (arachidonylethanolamide or anandamide) in aqueous solution with an error of less than 3 nM, obtained with the functionalized electrodes according to the present invention.
Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention
Coerentemente con la terminologia consolidata nel settore, nel presente contesto è fornita la definizione dei seguenti termini: Consistent with the established terminology in the sector, the definition of the following terms is provided in this context:
Voltammetria ciclica: sistema di analisi basato sull’impiego di potenziali elettrici a frequenze e ampiezze note applicati su sistemi di rilevamento generalmente a tre elettrodi. Cyclic voltammetry: analysis system based on the use of electrical potentials at known frequencies and amplitudes applied on detection systems generally with three electrodes.
Funzionalizzazione: processo di immobilizzazione di uno o più materiali sensibili sulla superfice di un sensore conferenti proprietà di riconoscimento ed interazione con uno specifico analita. Lipidi bioattivi: composti organici non solubili in acqua in grado di causare un effetto sui tessuti viventi. Functionalization: process of immobilization of one or more sensitive materials on the surface of a sensor conferring recognition and interaction properties with a specific analyte. Bioactive Lipids: Water-insoluble organic compounds capable of causing an effect on living tissues.
LC: cromatografia liquida, tecnica di separazione delle componenti di una miscela basata sulla distribuzione dei suoi componenti tra due fasi di cui una liquida. LC: liquid chromatography, a technique for separating the components of a mixture based on the distribution of its components between two phases, one of which is liquid.
MS: spettrometria di massa, tecnica analitica che consente l’identificazione di sostanze sconosciute basata sulla possibilità di separare una miscela di ioni in funzione del loro rapporto massa/carica generalmente tramite campi magnetici statici o oscillanti. MS: mass spectrometry, analytical technique that allows the identification of unknown substances based on the possibility of separating a mixture of ions according to their mass / charge ratio generally through static or oscillating magnetic fields.
Endocannabinoidi: lipidi endogeni capaci di legare ed attivare i recettori cannabici. Endocannabinoids: endogenous lipids capable of binding and activating cannabis receptors.
Eicosanoidi: famiglia di lipidi derivanti dall’acido arachidonico. Eicosanoids: family of lipids deriving from arachidonic acid.
Resolvine: famiglia di lipidi derivanti dagli acidi grassi omega-3 coinvolta nei processi infiammatori. Resolvine: family of lipids deriving from omega-3 fatty acids involved in inflammatory processes.
Fitocannabinoidi: famiglia di lipidi presenti nella Cannabis sativa o indica. Phytocannabinoids: family of lipids found in Cannabis sativa or indica.
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di elettrodi funzionalizzati per la rivelazione di lipidi mediante voltammetria ciclica, agli elettrodi ottenibili con tale procedimento e all’uso di tali elettrodi per la rivelazione di lipidi bioattivi in un campione, in particolare nel sangue. La voltammetria ciclica è una metodica di analisi elettrochimica basata sull'applicazione di un potenziale a forma di onda triangolare a un elettrodo stazionario immerso in una soluzione non agitata. Il potenziale dell'elettrodo di lavoro varia linearmente nel tempo fino al raggiungimento di un valore prefissato e poi l’andamento è invertito. Questa inversione può avvenire per numerose volte durante un singolo esperimento. Tale tecnica è generalmente impiegata per studiare le proprietà di uno o più analiti in soluzione. Il potenziale viene misurato tra l'elettrodo di riferimento, a potenziale costante, e l'elettrodo di lavoro, mentre la corrente viene misurata tra l'elettrodo di lavoro e il controelettrodo. Al variare del potenziale per ogni analita che può essere ridotto (o ossidato) vi è uno scambio di elettroni con l'elettrodo di lavoro, così da dare una variazione della corrente misurata che produce un picco nel voltammogramma. L'analita in studio tramite ciclovoltammetria deve essere una specie elettroattiva all'interno dell'intervallo di potenziale sperimentale. Gli elettrodi sono statici e sono posizionati in una soluzione non agitata durante la ciclovoltammetria, e il metodo è così caratterizzato da picchi controllati dalla diffusione nel caso di specie in soluzione. The present invention refers to a process for the preparation of functionalized electrodes for the detection of lipids by cyclic voltammetry, to the electrodes obtainable with this process and to the use of such electrodes for the detection of bioactive lipids in a sample, in particular in the blood. . Cyclic voltammetry is an electrochemical analysis method based on the application of a potential in the shape of a triangular wave to a stationary electrode immersed in a non-stirred solution. The potential of the working electrode varies linearly over time until a predetermined value is reached and then the trend is reversed. This inversion can occur numerous times during a single experiment. This technique is generally used to study the properties of one or more analytes in solution. The potential is measured between the reference electrode, at constant potential, and the working electrode, while the current is measured between the working electrode and the counter electrode. As the potential varies for each analyte that can be reduced (or oxidized) there is an exchange of electrons with the working electrode, so as to give a variation in the measured current which produces a peak in the voltammogram. The analyte under study by cyclovoltammetry must be an electroactive species within the experimental potential range. The electrodes are static and are placed in a non-stirred solution during the cyclovoltammetry, and the method is thus characterized by diffusion-controlled peaks in the present case in solution.
Il procedimento per la preparazione dell’elettrodo secondo la presente invenzione comprende un passaggio in cui si prepara una miscela liquida in soluzione, di una sostanza gelificante ed una proteina legante lipidi. The process for the preparation of the electrode according to the present invention comprises a step in which a liquid mixture in solution, of a gelling substance and a lipid binding protein is prepared.
La sostanza gelificante in detta miscela sarà ad esempio scelta tra agarosio, acrilammide, gelatine animali, pectine, xantano o altre sostanze vanti potere gelificante. La concentrazione della sostanza gelificante sarà preferibilmente compresa tra l’1 ed il 10% in peso a seconda del potere gelificante della molecola utilizzata. La proteina legante i lipidi in detta miscela sarà ad esempio scelta tra albumina sierica umana o bovina (BSA), varie heat shock protein, varie fatty acid binding protein o più in generale una proteina in grado di legare selettivamente i lipidi bioattivi di interesse presenti in soluzione. La concentrazione della proteina sarà preferibilmente compresa tra lo 0.01 ed il 10% in peso. The gelling substance in said mixture will for example be chosen from agarose, acrylamide, animal gelatins, pectins, xanthan or other substances having gelling power. The concentration of the gelling substance will preferably be between 1 and 10% by weight depending on the gelling power of the molecule used. The lipid-binding protein in said mixture will for example be chosen from human or bovine serum albumin (BSA), various heat shock proteins, various fatty acid binding proteins or more generally a protein capable of selectively binding the bioactive lipids of interest present in solution. The protein concentration will preferably be between 0.01 and 10% by weight.
Secondo una forma di realizzazione la miscela è preparata miscelando una prima soluzione comprendente detta sostanza gelificante con una seconda soluzione comprendente detta proteina legante lipidi, preferibilmente in rapporto 1:1. According to an embodiment, the mixture is prepared by mixing a first solution comprising said gelling substance with a second solution comprising said lipid binding protein, preferably in a 1: 1 ratio.
Il procedimento prevede che una volta preparata la miscela sia depositata sulla superficie dell’elettrodo di lavoro. Potrà essere usato qualsivoglia sensore che lavori in modalità di voltammetria ciclica ed offre un vantaggio nel potenziamento del potere risolutivo di tali sensori. Preferibilmente saranno funzionalizzati elettrodi in cui i tre elettrodi coinvolti nelle analisi ciclovoltammetriche, cioè l’elettrodo di lavoro, l’elettrodo di riferimento ed il contro elettrodo sono realizzati su un unico supporto isolante ed inerte mediante processi di micro-fabbricazione o screen-printing The procedure requires that once the mixture is prepared it is deposited on the surface of the working electrode. Any sensor that works in cyclic voltammetry mode can be used and offers an advantage in enhancing the resolving power of such sensors. Preferably, electrodes will be functionalized in which the three electrodes involved in the cyclovoltammetric analysis, i.e. the working electrode, the reference electrode and the counter electrode are made on a single insulating and inert support by means of micro-manufacturing or screen-printing processes
Gli elettrodi potranno essere di materiali differenti a seconda della specifica molecola di interesse da analizzare e in ogni caso saranno funzionalizzati con materiali biologici, come ad esempio l’albumina serica bovina, al fine di aumentare sensibilità e specificità dell’analisi. L’elettrodo di lavoro potrà ad esempio essere in carbonio vitreo, grafite pirolitica, platino, oro e ossidi semiconduttori di metalli, direttamente immersi nelle soluzioni o incastonati in cannule isolati e inerti (spesso di teflon) con una superficie esposta ad una estremità. Il raggio medio di un elettrodo di lavoro è ad esempio intorno a 1 mm. The electrodes may be of different materials depending on the specific molecule of interest to be analyzed and in any case they will be functionalized with biological materials, such as bovine serum albumin, in order to increase the sensitivity and specificity of the analysis. The working electrode may, for example, be made of vitreous carbon, pyrolytic graphite, platinum, gold and metal semiconductor oxides, directly immersed in the solutions or embedded in insulated and inert cannulas (often made of Teflon) with an exposed surface at one end. The average radius of a working electrode is for example around 1 mm.
Una volta depositata la miscela sull’elettrodo di lavoro sarà lasciata gelificare e, quindi, essiccata, ad esempio a temperatura ambiente per almeno 10 ore, preferibilmente per 12 ore. Once the mixture has been deposited on the working electrode it will be left to gel and then dried, for example at room temperature for at least 10 hours, preferably for 12 hours.
Il procedimento di funzionalizzazione secondo la presente invenzione è, quindi, basato sull’intrappolamento della molecola biologica interattiva all’interno di una matrice gel successivamente depositata sulla superficie dell‘elettrodo ed ivi lasciata ad essiccare. Gli autori della presente invenzione usano la voltammetria ciclica analizzando l’intero profilo elettrochimico delle soluzioni esaminate mediante tecniche di analisi multivariata piuttosto che studiare il comportamento reversibile degli analiti prendendo in considerazione solamente il potenziale formale della coppia redox. Un aspetto rilevante del procedimento risiede nella possibilità di funzionalizzare sensori a dimensioni ridotte. Questi sensori potranno, mediante tale metodologia di funzionalizzazione (oggetto dell’invenzione), avere una sensibilità elevata verso molecole bioattive. Il processo di deposizione può essere automatizzato per ottenere sistemi di sensori standard. Questo garantisce un basso costo di produzione a fronte di un’elevata risoluzione del sistema. Sotto il profilo commerciale, la seguente metodologia avrebbe un vantaggio economico nei confronti delle tecniche analitiche comunemente utilizzate in quanto avrebbe costi considerevolmente più contenuti e tempi di analisi minori. The functionalization process according to the present invention is, therefore, based on the entrapment of the interactive biological molecule within a gel matrix subsequently deposited on the electrode surface and left there to dry. The authors of the present invention use cyclic voltammetry by analyzing the entire electrochemical profile of the solutions examined using multivariate analysis techniques rather than studying the reversible behavior of the analytes taking into consideration only the formal potential of the redox pair. An important aspect of the process lies in the possibility of functionalizing sensors with reduced dimensions. These sensors will be able, by means of this functionalization methodology (object of the invention), to have a high sensitivity towards bioactive molecules. The deposition process can be automated to obtain standard sensor systems. This guarantees a low production cost with a high resolution of the system. From a commercial point of view, the following methodology would have an economic advantage compared to the analytical techniques commonly used as it would have considerably lower costs and shorter analysis times.
Gli elettrodi ottenibili con il procedimento qui descritto trovano applicazione ad esempio in: The electrodes obtainable with the procedure described here can be used for example in:
-settori industriali a carattere farmaceutico per la standardizzazione del contenuto lipidico di nuovi preparati farmaceutici; - industrial sectors of a pharmaceutical nature for the standardization of the lipid content of new pharmaceutical preparations;
-quantificazione accurata di lipidi bioattivi in un qualsiasi campione liquido, come ad esempio un campione biologico, preferibilmente sangue, ma anche urina, saliva, liquido cerebrospinale, mediante procedure real-time. - accurate quantification of bioactive lipids in any liquid sample, such as a biological sample, preferably blood, but also urine, saliva, cerebrospinal fluid, by means of real-time procedures.
In questo contesto l’invenzione potrebbe avere un interesse sia clinico/diagnostico sia ad esempio per il test di sostanze stupefacenti. In this context, the invention could have both clinical / diagnostic interest and, for example, for the testing of drugs.
Il metodo potrà ad esempio essere usato per lipidi quali Endocannabinoidi, Eicosanoidi, Resolvine, Fitocannabinoidi, Arachidonoiletanolammide o loro miscele. The method can for example be used for lipids such as Endocannabinoids, Eicosanoids, Resolvines, Phytocannabinoids, Arachidonoylethanolamide or their mixtures.
Il metodo di misura prevede un primo passaggio in cui mettere in contatto il campione liquido contenente il lipide d’analizzare con un elettrodo funzionalizzato secondo quanto qui descritto, il campione sarà quindi lasciato in contatto con l’elettrodo per un tempo sufficiente alla reidratazione della sostanza gelificante, ad esempio per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Il metodo prevede quindi un successivo passaggio di misura voltammetrica, in particolare una misura di soluzioni all'interno di un intervallo di potenziale sperimentale fissato tra -1 Volt ed 1 Volt, con una frequenza di analisi variabile tra 0.1 Hz e 0.01 Hz. The measurement method provides a first step in which to put the liquid sample containing the lipid to be analyzed in contact with a functionalized electrode as described here, the sample will then be left in contact with the electrode for a time sufficient to rehydrate the substance. gelling agent, for example for 5-10 minutes at room temperature. The method therefore provides for a subsequent voltammetric measurement step, in particular a measurement of solutions within an experimental potential range set between -1 Volt and 1 Volt, with a variable analysis frequency between 0.1 Hz and 0.01 Hz.
ESEMPI EXAMPLES
ESEMPIO 1 Funzionalizzazione dell’elettrodo EXAMPLE 1 Functionalization of the electrode
La procedura di funzionalizzazione dell’elettrodo screen-printed si basa sulla preparazione di una soluzione di agarosio al 4% (peso/volume) in acqua bidistillata e di una soluzione di BSA o altre proteine leganti i lipidi. La soluzione contenente agarosio viene portata alla temperatura di circa 100°C allo scopo di solubilizzare il polisaccaride. Non appena si ottiene una soluzione limpida, questa viene allontanata dalla sorgente di calore e viene lasciata raffreddare in aria ambiente sino al raggiungimento della temperatura di circa 40°C. Raggiunta la temperatura di 40°C, la soluzione di agarosio al 4% viene miscelata con la soluzione di proteine leganti i lipidi con un rapporto di volumetrico 1:1. Una goccia della nuova soluzione viene depositata sull’elettrodo di lavoro e lasciata gelificare. La superficie dell’elettrodo funzionalizzato così ottenuto è lasciata essiccare a temperatura ambiente per circa 12 ore o fino alla completa disidratazione. La procedura di analisi di un campione contenente lipidi bioattivi prevedere l’utilizzo di elettrodi funzionalizzati secondo la procedura di sopra riportata. In particolare, l’elettrodo funzionalizzato viene lasciato immerso nella soluzione da analizzare per circa 10 minuti, o comunque fino alla completa reidratazione del gel contenente le proteine leganti i lipidi, prima di effettuare la misura voltammetrica. In figura 1 è riportata una rappresentazione schematica del procedimento di funzionalizzazione dell’elettrodo. The functionalization procedure of the screen-printed electrode is based on the preparation of a 4% (weight / volume) agarose solution in double distilled water and a solution of BSA or other lipid-binding proteins. The solution containing agarose is brought to a temperature of about 100 ° C in order to solubilize the polysaccharide. As soon as a clear solution is obtained, this is removed from the heat source and allowed to cool in ambient air until a temperature of about 40 ° C is reached. Once the temperature of 40 ° C is reached, the 4% agarose solution is mixed with the solution of lipid-binding proteins with a 1: 1 volumetric ratio. A drop of the new solution is deposited on the working electrode and left to gel. The surface of the functionalized electrode thus obtained is left to dry at room temperature for about 12 hours or until complete dehydration. The procedure for analyzing a sample containing bioactive lipids requires the use of functionalized electrodes according to the procedure described above. In particular, the functionalized electrode is left immersed in the solution to be analyzed for about 10 minutes, or in any case until the gel containing the lipid-binding proteins is completely rehydrated, before carrying out the voltammetric measurement. Figure 1 shows a schematic representation of the electrode functionalization procedure.
ESEMPIO 2 misura della concentrazione di AEA in soluzione EXAMPLE 2 measurement of the concentration of AEA in solution
Soluzioni contenenti lo standard chimico dell’arachidoniletanolammide (AEA) alle concentrazioni di 10 µM, 5 µM, 1 µM, 0.5 µM, 0.1 µM e 0.05 µM sono state analizzate mediante voltammetria ciclica accoppiata ad elettrodi funzionalizzati con BSA realizzati come descritto nell’esempio 1. I risultati ottenuti sono stati analizzati mediante tecniche di analisi multivariata quali Partial Least Square Discriminant Analysis utilizzando in cross-validation il metodo Leave-One-Out. I risultati ottenuti sono riportati in forma di grafico in figura 2, di seguito una tabella con i parametri usati: Solutions containing the chemical standard of arachidonylethanolamide (AEA) at concentrations of 10 µM, 5 µM, 1 µM, 0.5 µM, 0.1 µM and 0.05 µM were analyzed by cyclic voltammetry coupled to electrodes functionalized with BSA made as described in example 1 The results obtained were analyzed by means of multivariate analysis techniques such as Partial Least Square Discriminant Analysis using the Leave-One-Out method in cross-validation. The results obtained are shown in the form of a graph in figure 2, below is a table with the parameters used:
Il modello di regressione ottenuto consente la quantificazione della molecola AEA in soluzione acquosa con un errore inferiore ai 3 nM. The obtained regression model allows the quantification of the AEA molecule in aqueous solution with an error of less than 3 nM.
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