IT201800006968A1

IT201800006968A1 - Emoderivato in forma di gel comprendente fibrina, piastrine e leucociti

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Publication number: IT201800006968A1
Application number: IT102018000006968A
Authority: IT
Priority date: 2018-07-05
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2020-01-05

Description

EMODERIVATO IN FORMA DI GEL COMPRENDENTE FIBRINA, PIASTRINE E

LEUCOCITI

CAMPO TECNICO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda la preparazione di un emoderivato in forma di gel, comprendente fibrina, piastrine, leucociti di matrice autologa ed un sostituto osseo, ed utilizzato nelle rigenerazione dei tessuti ossei, in ambito odontoiatrico. Tale emoderivato può essere modellato, compattato suturato e, quindi, applicato nella zona da trattare ottimizzando ed accelerando in forma naturale il processo di riparazione dei tessuti.

SFONDO TECNICO DELL’INVENZIONE

In medicina ed in odontoiatria la mancanza di osso, può verificarsi per svariate cause, quali ad esempio: traumi, malformazioni, riassorbimento osseo, infezioni, predisposizione genetica o avulsioni dentarie.

La realizzazione di una corretta strategia terapeutico-funzionale è necessaria per garantire una buona prognosi al paziente. La messa a punto di tecniche di rigenerazione ossea ha permesso di trattare difetti ossei più o meno estesi, risolvere problemi di scarsa guarigione o qualità ossea insufficiente. Queste tecniche prevedono l’utilizzo di sostituti ossei, di varia natura: autologa, omologa eterologa e sintetica, che vengono utilizzati per la rigenerazione e come guida di guarigione nei confronti della linea cellulare osteoblastica-osteoclastica.

La continua ricerca del sostituto osseo ideale ha portato alla commercializzazione di numerosi materiali anche se, ad oggi, nessuno di essi può essere considerato o definito il “materiale perfetto”, poiché nessuno è scevro da limiti e difetti.

In medicina rigenerativa, il gold standard è rappresentato dall’uso di materiali autologhi che sono gli unici ad avere caratteristiche osteoinduttive; essi infatti, mantenendo le naturali caratteristiche superficiali e biologiche dell’osso nativo, stimolano direttamente la guarigione ossea. I grandi svantaggi sono rappresentati dalla necessità di avere una sede di prelievo, con aumento della morbilità e la possibile insorgenza di complicanze legate alla presenza di due siti operatori.

Per ovviare a questi inconvenienti, vengono impiegati innesti eterologhi e tra questi i più utilizzati, sono: l'osso bovino e quello equino, in cui la componente organica viene eliminata per ridurne l'immunogenicità ed il rischio di trasmissione di malattie infettive.

Questi innesti possono essere utilizzati sotto forma di polveri o blocchi da modellare; nella pratica odontoiatrica, ad esempio, il materiale osseo viene imbibito con soluzione fisiologica, posizionato nel sito da rigenerare e quindi protetto da una membrana.

Le membrane commercializzate vengono usate come barriere contro l'invaginazione dei tessuti molli e per stabilizzare il coagulo, pur presentando il rischio di esposizione ed infezione.

La necessità di ovviare a problematiche inerenti la mancanza di osteoinduttività e lunghi tempi di guarigione, hanno portato alla messa a punto di nuove tecniche basate sullo sfruttamento delle grandi potenzialità degli emocomponenti autologhi.

La guarigione epiteliale è un processo che coinvolge mediatori chimici, matrici extra-cellulari e cellule emopoietiche; quest’ultime includono piastrine e infiltrati di leucociti, che partecipano in diversa maniera alle tre fasi della guarigione della ferita: infiammazione, formazione e rimodellamento tissutale.

Gli emoconcentrati appartengono ad una categoria di presidi medicali in grado di migliorare la guarigione fornendo al sito ricevente una grande quantità di fattori di crescita ed elementi cellulari che stimolano un’accelerata guarigione

Il Platelet Rich Plasma (PRP) ed il Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) tradizionali, in quanto emoconcentrati, incorporano nel network di fibrina una quantità di piastrine e leucociti circa cinque volte maggiore rispetto ad un coagulo naturale. Una maggiore concentrazione di elementi cellulari si traduce in un’aumentata produzione di citochine e chemochine che migliorano la guarigione epitelioconnettivale, in termini di velocità e di qualità dei tessuti.

In odontoiatria i concentrati piastrinici vengono utilizzati per favorire la rigenerazione ossea intorno agli impianti, stabilizzare gli innesti ossei e stimolare la proliferazione e differenziazione delle linee cellulari epiteliali e connettivali accelerando i processi di guarigione.

Studi in vitro ed in vivo hanno dimostrato un più rapido consolidamento e una mineralizzazione dell’innesto ed un miglioramento della densità ossea, accelerando la mitogenesi e l’angiogenesi nonché l’attivazione macrofagica

Non appena le piastrine vengono attivate ha inizio la coagulazione e i granuli alfa delle piastrine cominciano quindi a rilasciare fattori di crescita e citochine in grado di supportare l'emostasi, stimolare la migrazione e la proliferazione cellulare all'interno della matrice di fibrina accelerando le fasi della guarigione.

R.M. Eldibany et al., (Tanta Dental Journal, Vol. 11, Issue 2, August 2014, p. 100-108) riporta l'effetto di Nanobone® (un sostituto osseo particolato di origine sintetica) in combinazione con fibrina ricca di piastrine per rigenerazione ossea a seguito di enucleazione di grandi cisti mandibolari.

La domanda di brevetto US 2009/0304807 riporta la preparazione di una polvere di osso bovino, attraverso un trattamento atto a rimuovere le proteine residue nella polvere di osso bovino ed inattivare il prione che provoca l'encefalopatia spongiforme bovina (par. 19). Si prevede che tale polvere possa essere compresa in una composizione di tipo gel per la sostituzione di innesti ossei (par. 24), preferibilmente contenente anche una sostanza biologicamente attiva, come ad esempio una fibrina (par.26).

I metodi descritti in letteratura per la preparazione di gel a base di PRP o L-PRF prevedono una elementare miscelazione a mano, che avviene dopo la formazione del coagulo e che quindi distrugge la struttura del network di fibrina, sfruttando esclusivamente le caratteristiche fisiche di gel del coagulo per inglobare i granuli di sostituto osseo, ma non rispettando le sue caratteristiche fisiologiche e biologiche.

Ad oggi nessun protocollo per la preparazione di un emoconcentrato a base di PRP o L-PRF riesce nell’intento di ottimizzare la sinergia tra componente cellulare, fattori di crescita e sostituto osseo in un unico prodotto allo scopo di accelerare la guarigione epiteliale e garantire una migliore riossificazione degli alveoli necessaria alla stabilizzazione degli impianti.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Il prodotto emoderivato ottenuto con il processo dell'invenzione presenta una struttura molto elastica, che risulta essere un'ottima matrice per gli elementi cellulari della linea leucocitaria e delle piastrine. Inoltre esso è in grado di fornire i fattori di crescita e le citochine proinfiammatorie dando, al prodotto caratteristiche di osteoinduttività; il sostituto osseo eterologo fornisce la funzione di guida cellulare, la rigidità e le caratteristiche di osteoconduttività.

Il prodotto emoderivato presenta infine sia un’eccellente plasticità, che consente una facile manipolazione e capacità di adattamento a differenti aree ricoprendole e proteggendole, che una buona stabilità nel sito ricevente, riuscendo anche ad evitare l’utilizzo di membrane.

L’oggetto principale dell’invenzione è quindi un emoderivato comprendente fibrina, piastrine e leucociti di origine autologa, un sostituto osseo e calcio gluconato.

Con l’espressione “di origine autologa” si intende qui riferirsi a cellule che derivano o appartengono allo stesso essere vivente, al quale poi sarà somministrato il prodotto che li contiene, cioè, nel caso di fibrina, piastrine e leucociti di origine autologa, si intende riferirsi a tali emocomponenti che provengono, ad esempio, da un campione di sangue dello stesso paziente, a cui si somministrerà l’emoderivato dell’invenzione.

Con l’espressione “sostituto osseo” si intende qui riferirsi a materiali di origine naturale (autologa o eterologa) in forma di polvere, come ad esempio polvere ottenuta dalla macinazione di tessuto osseo animale (generalmente equino o bovino), o a materiali di origine sintetica (o alloplastici), come ad esempio l'idrossiapatite e i fosfati di calcio, o i compositi, come l'acido polilattico, e i metalli. Esempi del primo tipo di sostituto osseo (materiali di origine animale) sono i prodotti commerciali Bio-Oss®, NuOss®, MinerOss®, bioXEN™. Esempi del secondo tipo di sostituto osseo (materiali di origine sintetica) sono i prodotti commerciali MBCP+™, Actifuse™, chronOS®, OssiMend®, OssiFil®. La parola “emoderivato” si riferisce ad un prodotto che si ottiene a partire da un campione di sangue e che, pertanto, contiene emocomponenti e che viene successivamente sottoposto ad ulteriori trattamenti di tipo chimico meccanico e/o termico.

La parola “emocomponente” o componente ematico, si riferisce ad un prodotto ricavato dal frazionamento del sangue con mezzi fisici semplici o con aferesi.

(Per le definizioni sopra riportate si prega di far riferimento anche alla Legge del Parlamento Italiano del 21 ottobre 2005, n.219, "Nuova disciplina delle attività trasfusionali e della produzione nazionale degli emoderivati", pubblicata nella Gazzetta Ufficiale n.251 del 27 ottobre 2005).

La parola “emoconcentrato” si riferisce ad prodotto ricavato dal sangue intero, ma che contiene una concentrazione di alcuni suoi componenti (ad esempio le piastrine) maggiore di quella fisiologica. Generalmente gli emoconcentrati si ottengono a partire dal sangue intero per centrifugazione e separazione delle frazioni di interesse.

Il calcio gluconato (o gluconato di calcio) è un sale, la cui soluzione acquosa è autorizzata per uso parenterale ed è in vendita come farmaco generico.

L'emoderivato dell'invenzione viene preparato secondo il processo descritto qui di seguito.

In generale, il processo per la preparazione di un prodotto emoderivato, comprendente fibrina, piastrine e leucociti di origine autologa, un sostituto osseo e calcio gluconato, comprende i seguenti step:

a) dispensazione di un campione di sangue intero in una provetta contenente un anticoagulante; b) centrifugazione del campione di sangue contenuto nella provetta a 270 giri al minuto per 30 minuti a 10°C;

c) prelievo di tutta la fase liquida (plasma) e di una parte della fase corpuscolata, contenente fibrina, piastrine e leucociti di origine autologa;

d) aggiunta di una soluzione di calcio gluconato alla frazione (emoconcentrato) prelevata nello step (c);

e) aggiunta di sostituto osseo alla sospensione cellulare risultante dallo step (d);

f) incubazione sotto rotazione costante alla velocità di 4 giri al minuto per 40 minuti, a 37°C, 5% CO2.

Tale processo è un ulteriore oggetto dell'invenzione,

In particolare, sangue autologo viene raccolto in provette contenenti un anticoagulante (ad esempio ACD - sodio citrato, acido citrico anidro e glucosio (destrosio) anidro) e centrifugato a 270 giri per 30 minuti a 10°C; al termine del processo di centrifugazione viene prelevata e trasferita in provette sterili, tutta la fase liquida, la parte corpuscolata all’interfaccia tra plasma e globuli rossi e ulteriori 500 �l al di sotto di quest’ultima

Tale emoconcentrato viene quindi gelificato mediante l’aggiunta di una soluzione di calcio gluconato, preferibilmente ad 1 ml di emoconcentrato in vial conico sterile, viene aggiunta una soluzione acquosa di calcio gluconato (1g/10 ml), preferibilmente in un rapporto emoconcentrato/soluzione calcio gluconato 2:1 (v/v); di seguito viene aggiunto il sostituto osseo in quantità di 50 mg/ml di emoconcentrato ed il vial viene messo ad incubare sotto rotazione costante, preferibilmente alla velocità di 4 giri al minuto, a 37°C, 5% CO2, per 40 minuti.

L’aggiunta del sostituto osseo deve essere eseguita entro 30 sec dall’aggiunta del calcio gluconato all’emoconcentrato per garantire che il processo di gelificazione si inneschi sotto rotazione costante, a velocità e temperatura controllate, al fine di consentire un’omogenea distribuzione del sostituto osseo nella matrice cellulare.

Tale processo è stato messo a punto dopo numerose prove ed analisi che hanno permesso di valutare l’uso di diversi rapporti in volume tra sangue e soluzione di calcio gluconato (5:1, 2:1 e 1:1); tra tutti i rapporti presi in considerazione il preferito è risultato il 2:1 in quanto, pur presentando una plasticità uguale al rapporto 5:1, ci permette di ottenere una quantità di emoderivato maggiore a parità di prelievo ematico. Inoltre tali prove hanno permesso di ottimizzare condizioni di centrifugazione, tempi di incubazione, allo scopo di non danneggiare leucociti e piastrine, inglobare le particelle di osso e ottenere un gel con plasticità e malleabilità idonee all’uso.

Tale processo di preparazione permette, durante la coagulazione, di inglobare nella matrice di fibrina tutti gli emocomponenti che manterranno intatta la loro struttura e quindi svolgeranno le loro funzioni solo al sito di applicazione.

L’anticoagulante è presente all'inizio del processo nella provetta contenente il sangue intero per evitare l’aggregazione cellulare, cioè la formazione di coaguli che impedirebbero alle cellule di essere separate efficientemente ed essere raccolte nel prodotto finale; la sua presenza comunque non impedisce al calcio gluconato di formare l'emoconcentrato nei tempi e alle condizioni qui descritte. Un ulteriore oggetto dell'invenzione è un prodotto emoderivato, come descritto prima, come agente rigenerante del tessuto osseo.

L’invenzione viene qui di seguito ulteriormente descritta facendo ricorso a degli Esempi, che a loro volta fanno riferimento a delle Figure, e che vengono qui riportati a scopo illustrativo e non limitativo dell’invenzione.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1. La Figura 1 mostra una provetta contenente sangue intero alla fine dello stadio di centrifugazione a 270 giri per 30 minuti a 10°C. La sezione rettangolare indica la parte liquida in alto (plasma) e la frazione all’interfaccia tra sedimento di globuli rossi e plasma, ricca in leucociti, piastrine e fibrina (emoconcentrato), che viene raccolta (fino a 500 �l sotto l’interfaccia) per la preparazione dell'emoderivato dell'invenzione.

Figura 2. La Figura 2 riporta l’immagine di un emoderivato ottenuto alla fine del processo in accordo con l'invenzione.

Figura 3. La Figura 3 riporta i risultati dell'analisi citofluorimetrica per determinare le componenti cellulari nell'emoderivato ottenuto alla fine del processo descritto nell'Esempio 1. Tali risultati mostrano che l'emoderivato era ricco in (A) monociti CD14+/CD45+, (B) linfociti T CD3+/CD45+, (C) linfociti B CD19+/CD45+; (D) piastrine CD42+/CD45.

Figura 4. La Figura 4 mostra i risultati dell'analisi citofluorimetrica derivata da 100�l di un campione prelevato dalla fase non gelificata dopo l’incubazione con il calcio gluconato. Le immagini riportate mostrano che in esso non risultano presenti le componenti cellulari, potenzialmente coinvolte nella rigenerazione tissutale (cioè (A) monociti CD14+/CD45+, (B) linfociti T CD3+/CD45+, (C) linfociti B CD19+/CD45+; (D) piastrine CD42+/CD45).

ESEMPI

Facendo riferimento agli adempimenti in materia di invenzioni biotecnologiche in accordo all’Art.170-bis del Codice della Proprietà Industriale (CPI) e Art. 21 e 22 del Regolamento CPI, si afferma che il materiale biologico di origine animale utilizzato è un prodotto commerciale e il materiale biologico di origine umana utilizzato nell’invenzione descritta è stato acquisito con il consenso libero e informato, al prelievo e all’utilizzazione, della persona a cui è stato prelevato, in base alla normativa vigente.

Esempio 1 – Preparazione dell’emoderivato

Un campione di sangue umano raccolto in provette contenenti anticoagulante (ACD - sodio citrato, acido citrico anidro e glucosio (destrosio) anidro) (venduto da Fresenius Kabi Italia S.r.l.) viene centrifugato a 270 giri per 30 minuti a 10°C. Al termine del processo di centrifugazione, sono state raccolti e trasferiti in provette sterili la parte liquida (plasma), la frazione all’interfaccia tra sedimento di globuli rossi e plasma, ricca in leucociti, piastrine e fibrina (emoconcentrato) ed ulteriori 500�l al di sotto di quest’ultima. (Figura 1). Un campione (100 microlitri) di tale emoconcentrato, venne sottoposto ad analisi citofluorimetrica per determinare le componenti cellulari in esso presenti. I risultati di tale analisi sono riportati in Figura 3 e mostrano che tale frazione era ricca in (A) monociti CD14+/CD45+, (B) linfociti T CD3+/CD45+, (C) linfociti B CD19+/CD45+; (D) piastrine CD42+/CD45. Tali componenti cellulari erano esattamente quelli che si voleva facessero parte dell’emoderivato dell’invenzione.

Tale emoconcentrato fu quindi gelificato mediante l’aggiunta di calcio gluconato (soluzione acquosa per infusione alla concentrazione di 1.000 mg/10 ml) (venduto da S.A.L.F. S.p.A.) in rapporto emoconcentrato/calcio gluconato 2:1 (v/v) in vial conico sterile. A seguire venne aggiunto il sostituto osseo bovino Bio-Oss® (venduto da Geistlich Biomaterials Italia S.r.l.), in quantità di 50 mg/ml di L-PRP, ed il vial venne messo ad incubare sotto rotazione costante alla velocità di 4 rpm /minuto, a 37°C, 5% CO2, per 40 minuti per ottenere il prodotto emoderivato dell'invenzione.

L’aggiunta del sostituto osseo fu eseguita entro 30 secondi dall’aggiunta del calcio gluconato all’emoderivato per garantire che il processo di gelificazione si inneschi sotto rotazione costante, a velocità e temperatura controllate.

L’emoderivato ottenuto alla fine di tale processo aveva l’aspetto riportato in Figura 2.

Al termine del processo di gelificazione la fisiologica sineresi porta alla formazione di una frazione liquida che viene eliminata; 100�l di quest’ultima sono stati analizzati mediante citometria a flusso utilizzando gli stessi marcatori cellulari impiegati per la fenotipizzazione della frazione liquida. Tali risultati sono riportati in Figura 4 e mostrano che tutte le componenti cellulari isolate dopo centrifugazione vengono trattenute nel prodotto oggetto dell’invenzione.

Esempio comparativo 1

Il processo descritto all’Esempio 1 fu ripetuto utilizzando diversi rapporti tra volume (in ml) della frazione comprendente gli emocomponenti del sangue e volume della soluzione di calcio gluconato. In particolare furono utilizzati i rapporti 5:1 e 1:1. Con il rapporto 5:1 l’emoderivato ottenuto alla fine del processo di preparazione presentava una plasticità uguale a quella ottenuta con il rapporto 2:1. Quando si utilizzò il rapporto 1:1, invece, l’emoderivato ottenuto alla fine del processo di processo di preparazione non presentava le caratteristiche di resistenza e di malleabilità desiderate.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un prodotto emoderivato comprendente fibrina, piastrine e leucociti di origine autologa, un sostituto osseo e calcio gluconato.
2. Il prodotto emoderivato secondo la rivendicazione 1, in cui il sostituto osseo è scelto fra un materiale di origine naturale (autologa o eterologa) in forma di polvere, opzionalmente polvere ottenuta dalla macinazione di tessuto osseo animale, e un materiale di origine sintetica o alloplastica.
3. Un processo per la preparazione di un prodotto emoderivato, comprendente fibrina, piastrine e leucociti di origine autologa, un sostituto osseo e calcio gluconato, che comprende i seguenti step: a) dispensazione di un campione di sangue intero in una provetta contenente un anticoagulante; b) centrifugazione del campione di sangue contenuto nella provetta a 270 giri al minuto per 30 minuti a 10°C; c) prelievo di tutta la fase liquida (plasma) e di una parte della fase corpuscolata, contenente fibrina, piastrine e leucociti di origine autologa; d) aggiunta di una soluzione di calcio gluconato alla frazione (emoconcentrato) prelevata nello step (c); e) aggiunta di sostituto osseo alla miscela risultante dallo step (d); f) incubazione della miscela risultante dallo step (e) sotto rotazione costante alla velocità di 4 giri al minuto per 40 minuti, a 37°C, 5% CO2.
4. Il processo secondo la rivendicazione 3, in cui l’aggiunta del sostituto osseo allo step (e) viene eseguita entro 30 secondi dall’aggiunta del calcio gluconato.
5. Il processo secondo le rivendicazioni 3 o 4, in cui l'anticoagulante è ACD (sodio citrato, acido citrico anidro e glucosio (destrosio) anidro).
6. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 5, in cui la soluzione acquosa di calcio gluconato ha una concentrazione di 1g/10 ml.
7. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 6, in cui il rapporto fra la frazione (emoconcentrato) prelevata nello step (c) e la soluzione calcio gluconato è di 2:1 (v/v).
8. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 7, in cui il sostituto osseo viene aggiunto in una quantità di 50 mg/ml.
9. Un prodotto emoderivato ottenuto tramite il processo secondo le rivendicazioni da 3 a 8.
10. Un prodotto emoderivato secondo le rivendicazioni 1-2 o 9, come agente rigenerante del tessuto osseo.