IT201800006418A1 - Procedure for determining the risk of preeclampsia in pregnancy through the analysis of free fetal DNA circulating in the maternal blood. - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: “Procedimento per la determinazione del rischio di preeclampsia in gravidanza attraverso l'analisi di DNA fetale libero circolante nel sangue materno” DESCRIPTION of the industrial invention entitled: "Procedure for the determination of the risk of preeclampsia in pregnancy through the analysis of free fetal DNA circulating in the maternal blood"
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione riguarda in generale l'ambito della bioinformatica e più specificamente un procedimento per la determinazione del rischio di preeclampsia in gravidanza. The present invention generally relates to the field of bioinformatics and more specifically to a procedure for determining the risk of preeclampsia in pregnancy.
E' di estrema importanza poter disporre di una procedura di analisi integrata per valutare il rischio di insorgenza di preeclampsia in gravidanza, stato patologico con gravi conseguenze, anche letali, per la madre e/o per il feto. It is extremely important to have an integrated analysis procedure to assess the risk of onset of preeclampsia in pregnancy, a pathological state with serious consequences, even lethal, for the mother and / or the fetus.
L'importanza dei test per la determinazione del rischio di preeclampsia in gravidanza e del relativo campo di indagine sono dimostrati da un recente studio multicentrico Europeo [Rolnik D.L.,NEJM 2017,377(7):613-622], compiuto su 27.000 donne gravide al primo trimestre di gravidanza, che ha stimato un rischio teorico di preeclampsia precoce nell’11% della popolazione generale, quindi una maggiore percentuale d'incidenza della malattia rispetto a quella calcolata in precedenti studi epidemiologici (contenuta nell'intervallo 1-8%). The importance of tests for determining the risk of preeclampsia in pregnancy and the related field of investigation are demonstrated by a recent European multicentre study [Rolnik D.L., NEJM 2017,377 (7): 613-622], carried out on 27,000 pregnant women in the first trimester of pregnancy, which estimated a theoretical risk of early preeclampsia in 11% of the general population, therefore a higher incidence rate of the disease compared to that calculated in previous epidemiological studies (contained in the range 1-8%) .
Poter calcolare il più precocemente possibile i rischi di una gestante di sviluppare preeclampsia permetterebbe di attuare tutte le strategie di prevenzione possibili e/o le terapie atte ad impedire l'instaurarsi del danno vascolare o l'insorgenza stessa della condizione patologica. Being able to calculate the risks of a pregnant woman developing preeclampsia as early as possible would allow the implementation of all possible prevention strategies and / or therapies aimed at preventing the onset of vascular damage or the onset of the pathological condition itself.
Fino ad oggi la determinazione del rischio di preeclampsia si è basata sulla valutazione della storia clinica, di parametri biofisici della madre e del feto (i.e. MAP: mean arterial pressure; UTPI: uterine arterial pulsatily index; crescita fetale) durante la gravidanza oltre che di marcatori biochimici circolanti nel sangue materno (PlGF e sFTL1). Until now, the determination of the risk of preeclampsia has been based on the evaluation of the clinical history, biophysical parameters of the mother and the fetus (i.e. MAP: mean arterial pressure; UTPI: uterine arterial pulsatily index; fetal growth) during pregnancy as well as biochemical markers circulating in maternal blood (PlGF and sFTL1).
FTL1 è un recettore transmembrana che media angiogenesi legandosi a VEGFA e PlGF. In gravidanza, FTL1 è espresso dalle cellule del trofoblasto, soprattutto come forma solubile sFTL1, la quale agisce antagonizzando l'angiogenesi mediante il legame ed il sequestro dei fattori VEGF-A e PlGF. L'eccessivo rilascio della forma solubile sFTL1 nel circolo sanguineo materno è associato all'insorgenza della preeclampsia, in quanto induce disfunzioni dell'endotelio materno e, quindi, della placenta. FTL1 is a transmembrane receptor that mediates angiogenesis by binding to VEGFA and PlGF. In pregnancy, FTL1 is expressed by trophoblast cells, especially as a soluble form sFTL1, which acts by antagonizing angiogenesis by binding and sequestrating the factors VEGF-A and PlGF. The excessive release of the soluble form sFTL1 into the maternal bloodstream is associated with the onset of preeclampsia, as it induces dysfunction of the maternal endothelium and, therefore, of the placenta.
Il rapporto tra i livelli di sFTL1 e PlGF nel sangue materno è considerato marcatore plasmatico di preeclampsia precoce, ma la sua capacità predittiva è confinata nel secondo trimestre di gravidanza. The relationship between sFTL1 and PlGF levels in maternal blood is considered a plasma marker of early preeclampsia, but its predictive ability is confined to the second trimester of pregnancy.
Nonostante le massive ricerche effettuate con i più avanzati metodi di studio del genoma umano, fino ad oggi non sono state evidenziate varianti geniche materne, ossia varianti geniche, che possano influenzare o provocare l'insorgenza della preeclampsia. Despite the massive research carried out with the most advanced methods of studying the human genome, up to now no maternal gene variants have been highlighted, i.e. gene variants, which can influence or cause the onset of preeclampsia.
La presente invenzione si prefigge quindi lo scopo di fornire un procedimento per una determinazione di un indice di rischio di preeclampsia in gravidanza maggiormente attendibile ed accurata rispetto alla tecnica nota, ed allo stesso tempo in un periodo gestazionale più precoce. The present invention therefore has the aim of providing a process for determining a risk index of preeclampsia in pregnancy that is more reliable and accurate than the known technique, and at the same time in an earlier gestational period.
Secondo la presente invenzione tale scopo viene raggiunto grazie ad un procedimento attuato mediante elaboratore per la determinazione di un indice di rischio di preeclampsia in una gestante, avente le caratteristiche richiamate nella rivendicazione 1. According to the present invention, this object is achieved thanks to a process implemented by means of a computer for the determination of a risk index of preeclampsia in a pregnant woman, having the characteristics referred to in claim 1.
Modi particolari di realizzazione formano oggetto delle rivendicazioni dipendenti, il cui contenuto è da intendersi come parte integrale o integrante della presente descrizione. Particular embodiments form the subject of the dependent claims, the content of which is to be understood as an integral or integral part of the present description.
Formano ulteriore oggetto della presente invenzione un sistema di elaborazione programmato per attuare un procedimento per la determinazione di un indice di rischio di preeclampsia in una gestante, ed un programma di elaborazione, o gruppo di programmi, eseguibile da un sistema di elaborazione e comprendente uno o più moduli di codice per l'attuazione di un procedimento per la determinazione di un indice di rischio di preeclampsia in una gestante quando il programma è eseguito da un processore, come rivendicato. A further object of the present invention is a processing system programmed to carry out a process for determining a risk index of preeclampsia in a pregnant woman, and a processing program, or group of programs, executable by a processing system and comprising one or more a plurality of code modules for implementing a method for determining a risk index of preeclampsia in a pregnant woman when the program is executed by a processor, as claimed.
In sintesi, la presente invenzione si fonda sui risultati di uno studio effettuato su bambini nati da madri affette da preeclampsia rispetto a un'ampia coorte di casi controllo sani, che ha dimostrato per la prima volta che nel genoma del bambino due specifici loci fiancheggianti il gene FTL1 sono significativamente associati con il rischio di sviluppo di preeclampsia. Specificatamente, due varianti geniche (o SNP, polimorfismi a singolo nucleotide) denominate rs4769613 e rs12050029 e contenute in due loci fiancheggianti FTL1 (regioni dimensionalmente più grandi del singolo gene FTL1), sito nel cromosoma 13, sono localizzati nella regione enhancer placentare ad indicare che tali varianti geniche potrebbero regolare o influenzare la funzionalità placentare. E' la forma fetale di queste due varianti geniche situate in due loci fiancheggianti il gene FTL1, e non quelle materne, ad essere legata all'insorgenza della patologia della preeclampsia. In summary, the present invention is based on the results of a study carried out on children born to mothers with preeclampsia compared to a large cohort of healthy control cases, which demonstrated for the first time that two specific loci flanking the FTL1 gene are significantly associated with the risk of developing preeclampsia. Specifically, two gene variants (or SNPs, single nucleotide polymorphisms) named rs4769613 and rs12050029 and contained in two FTL1 flanking loci (regions dimensionally larger than the single FTL1 gene), located on chromosome 13, are located in the placental enhancer region indicating that such gene variants could regulate or influence placental function. It is the fetal form of these two gene variants located in two loci flanking the FTL1 gene, and not the maternal ones, to be linked to the onset of the pathology of preeclampsia.
Mentre ad oggi il rischio di sviluppare qualsiasi forma di preeclampsia (precoce, intermedia, tardiva) viene stimato con ampi margini di inesattezza nel primo trimestre di gravidanza basandosi sul rilevamento di due parametri fisici della madre, quali MAP e UTPI, e sulla determinazione della concentrazione del marcatore plasmatico circolante PlGF, secondo l'invenzione si propone di considerare il valore di un fattore genetico del genoma del feto, un fattore presente in omozigosi o in eterozigosi o non presente nel genoma dello zigote, ossia le varianti geniche localizzate nei due loci genici fiancheggianti FTL1. While to date the risk of developing any form of preeclampsia (early, intermediate, late) is estimated with wide margins of inaccuracy in the first trimester of pregnancy based on the detection of two physical parameters of the mother, such as MAP and UTPI, and on the determination of the concentration of the circulating plasma marker PlGF, according to the invention it is proposed to consider the value of a genetic factor of the fetus genome, a factor present in homozygosity or in heterozygosity or not present in the genome of the zygote, i.e. the gene variants located in the two gene loci flanking FTL1.
Sulla base di questa considerazione, oggetto dell'invenzione è un nuovo procedimento per valutare tale valore già nel primo trimestre di gravidanza ed includerlo nella determinazione di un indice di rischio di insorgenza di preeclampsia. On the basis of this consideration, the object of the invention is a new procedure for evaluating this value already in the first trimester of pregnancy and including it in the determination of a risk index for the onset of preeclampsia.
Più specificamente, oggetto dell'invenzione è un procedimento di esame preferibilmente basato su tecnologie di sequenziamento genico, ad esempio tecnologie di sequenziamento note come “Next Generation Sequencing”,“NGS”, quali la tecnologia di Microarray a DNA o SNP array (chip contenenti sonde specifiche per polimorfismi a nucleotide singolo (SNP) distribuiti nel genoma, che si utilizzano sia per analisi citogenetiche di alta risoluzione sia per studi di popolazione) o Deeparray, per mezzo delle quali è effettuata l'analisi di regioni specifiche del DNA fetale (partendo dal sangue materno o da altra metodica di estrazione del DNA fetale, o partendo dall'isolamento di singole cellule fetali presenti nel sangue materno o partendo da un veicolante diverso) e individuata la sequenza genica presente nei loci sopra descritti. More specifically, the object of the invention is an examination process preferably based on gene sequencing technologies, for example sequencing technologies known as "Next Generation Sequencing", "NGS", such as DNA Microarray or SNP array technology (chips containing specific probes for single nucleotide polymorphisms (SNPs) distributed in the genome, which are used both for high resolution cytogenetic analyzes and for population studies) or Deeparray, by means of which the analysis of specific regions of fetal DNA is carried out (starting from maternal blood or from other method of extraction of fetal DNA, or starting from the isolation of single fetal cells present in maternal blood or starting from a different carrier) and identified the gene sequence present in the loci described above.
Per l'elaborazione di tali dati, l'indice di significatività di preeclampsia ottenuto (indice T o indice di rischio di preeclampsia) è valutato attraverso il confronto tra controlli interni ed esterni. For the elaboration of these data, the index of significance of preeclampsia obtained (index T or index of risk of preeclampsia) is evaluated through the comparison between internal and external controls.
Come controlli interni sono utilizzate regioni target (geni housekeeping) non corrispondenti ai loci di interesse (in numero vantaggiosamente non inferiore a 10), le cui posizioni sono selezionate, ad esempio in fase di validazione del procedimento, a partire da una coorte più ampia di regioni, identificando le regioni che mostrano una maggiore “stabilità”, ovvero una minore variabilità di conteggi tra campioni diversi e tra repliche dello stesso campione. As internal controls, target regions (housekeeping genes) not corresponding to the loci of interest are used (advantageously in number not less than 10), whose positions are selected, for example during the validation phase of the procedure, starting from a larger cohort of regions, identifying the regions that show greater “stability”, ie a lower variability of counts between different samples and between replicates of the same sample.
Come controlli esterni è utilizzata una popolazione di donatori che non abbiano DNA fetale circolante (il numero esatto di donatori è stabilito in fase di validazione e può includere anche donatori maschi e/o donne che non hanno avuto gravidanze o comunque non in tempi “prossimi” alla donazione, cioè che abbiamo partorito da almeno 6 mesi). In questi donatori è determinata sia la presenza delle suddette due varianti geniche fiancheggianti FTL1 denominate anche regioni target, sia l'espressione dei geni housekeeping. A population of donors who do not have circulating fetal DNA is used as external controls (the exact number of donors is established during the validation phase and can also include male and / or female donors who have not had pregnancies or in any case not in "near" times to the donation, that is, that we have given birth for at least 6 months). In these donors both the presence of the aforementioned two gene variants flanking FTL1, also called target regions, and the expression of housekeeping genes are determined.
Il primo dato che si ricava è la presenza o assenza delle due varianti geniche di interesse (rs4769613 e rs12050029) site nei due loci fiancheggianti il gene FTL1 nel sangue materno, quindi sia quelli di origine fetale sia quelli di origine materna. Il dato di presenza/assenza delle varianti geniche di interesse è rappresentato da un indice di significatività di preeclampsia (T) che è: The first data obtained is the presence or absence of the two gene variants of interest (rs4769613 and rs12050029) located in the two loci flanking the FTL1 gene in the maternal blood, therefore both those of fetal origin and those of maternal origin. The presence / absence data of the gene variants of interest is represented by an index of significance of preeclampsia (T) which is:
i) un valore massimo prestabilito, qualora le due varianti di interesse siano presenti in omozigosi nella madre e nel feto; i) a maximum predetermined value, if the two variants of interest are present in homozygosity in the mother and fetus;
ii) un valore minimo prestabilito, qualora le due varianti di interesse risultino assenti nella madre e nel feto (Caso A); ii) a minimum pre-established value, if the two variants of interest are absent in the mother and fetus (Case A);
iii) un valore compreso tra detto valore massimo prestabilito e detto valore minimo prestabilito per tutte le altre combinazioni possibili di espressione delle due varianti nella madre e nel feto. iii) a value comprised between said predetermined maximum value and said predetermined minimum value for all other possible combinations of expression of the two variants in the mother and fetus.
Se il valore dell'indice di significatività, che terrà conto anche delle variabili sperimentali (i.e. la qualità del campione) risulterà compreso tra il valore massimo ed il valore minimo prestabilito, sarà possibile migliorare l'accuratezza del risultato con un procedimento accessorio, collegato al precedente, che tenga conto del valore di ogni singolo parametro utilizzato fino ad oggi per calcolare il rischio di preeclampsia (caso B). If the value of the significance index, which will also take into account the experimental variables (i.e. the quality of the sample) is between the maximum value and the minimum predetermined value, it will be possible to improve the accuracy of the result with an accessory procedure, connected to the previous, which takes into account the value of each single parameter used to date to calculate the risk of preeclampsia (case B).
Quindi nello specifico, il procedimento secondo l'invenzione prevede: So specifically, the process according to the invention provides:
(caso A) (case A)
- Valutazione della presenza delle varianti geniche di interesse nei due loci genici fiancheggianti il gene FTL1 del DNA fetale. - Evaluation of the presence of the gene variants of interest in the two gene loci flanking the FTL1 gene of the fetal DNA.
(caso B) (case B)
- Valutazione della presenza delle varianti geniche di interesse nei due loci genici fiancheggianti il gene FTL1 del DNA fetale e di ogni singolo dato supplementare che ne aumenti l'accuratezza finale, eventualmente pesato, quale almeno uno tra: - Evaluation of the presence of the gene variants of interest in the two gene loci flanking the FTL1 gene of the fetal DNA and of any single additional data that increases the final accuracy, possibly weighted, such as at least one of:
1. Fattori di rischio della storia clinica della gestante (peso, altezza, età, etnia, epoca gestazionale, anamnesi); 1. Risk factors of the clinical history of the pregnant woman (weight, height, age, ethnicity, gestational period, anamnesis);
2. Misurazione della pressione arteriosa e calcolo della pressione media della gestante (MAP); 2. Measurement of blood pressure and calculation of the mean pressure of the pregnant woman (MAP);
3. Misurazione delle dimensioni del feto (Crown Lenght); 3. Measurement of the size of the fetus (Crown Lenght);
4. Misurazione dell'indice di pulsatilità medio (UAPI) delle due arterie uterine; 4. Measurement of the mean pulsatility index (UAPI) of the two uterine arteries;
5. Misurazione dei livelli plasmatici dei marcatori PlGF (placental growth factor) e PAPP-A (pregnancy associated protein); 5. Measurement of plasma levels of PlGF (placental growth factor) and PAPP-A (pregnancy associated protein) markers;
6. Valutazione della quantità di sFTL1 circolante. 6. Evaluation of the quantity of sFTL1 in circulation.
Preferibilmente, la significatività dei dati supplementari sopra citati è definita secondo l'algoritmo descritto nella pubblicazione di Dahiana M. Gallo et al., in American Journal of Obstetric and Gynecology, 2016, volume 214, numero 5, pagine 619.e1-619e17. Preferably, the significance of the additional data mentioned above is defined according to the algorithm described in the publication by Dahiana M. Gallo et al., In the American Journal of Obstetric and Gynecology, 2016, volume 214, number 5, pages 619.e1-619e17.
In tal modo il procedimento oggetto dell'invenzione considera la capacità del sequenziamento dei due loci genici rs4769613 e rs12050029 di predire il “rischio di preeclampsia” sia da solo, sia associato ad almeno un altro marcatore supplementare tra quelli indicati nei punti 1-6 sopra riportati, singolarmente o nelle diverse combinazioni. In this way, the process object of the invention considers the ability of the sequencing of the two gene loci rs4769613 and rs12050029 to predict the "risk of preeclampsia" both alone and associated with at least one other additional marker among those indicated in points 1-6 above reported, individually or in different combinations.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell'invenzione verranno più dettagliatamente esposti nella descrizione particolareggiata seguente di una sua forma di attuazione, data a titolo di esempio non limitativo, con riferimento al disegno allegato, nel quale la figura 1 mostra un diagramma di flusso delle fasi del procedimento oggetto dell'invenzione. Further characteristics and advantages of the invention will be set out in more detail in the following detailed description of an embodiment thereof, given by way of non-limiting example, with reference to the attached drawing, in which Figure 1 shows a flow diagram of the steps of the process. object of the invention.
Il procedimento prevede un prelievo di sangue (campione ematico) della gestante (passo 100 in figura) che dovrà essere effettuato idealmente tra la decima e la quattordicesima settimana di gravidanza (primo trimestre di gravidanza), ma anche successivamente se fosse ritenuto comunque utile alla salvaguardia della gestante e del feto. Il prelievo è eseguito utilizzando provette commercialmente idonee per ricavare il plasma e/o mantenere il DNA integro nel tempo. The procedure involves a blood sampling (blood sample) from the pregnant woman (step 100 in the figure) which should ideally be carried out between the tenth and fourteenth week of pregnancy (first trimester of pregnancy), but also subsequently if it is still considered useful for safeguarding of the pregnant woman and the fetus. The collection is performed using commercially suitable tubes to obtain the plasma and / or keep the DNA intact over time.
Dal prelievo ematico, mediante centrifugazioni differenziali, si isola il plasma al passo 110. Specificamente, dopo aver effettuato un prelievo di sangue periferico alla gestante, mediante centrifugazioni differenziali, è eseguito l'isolamento del plasma. From the blood sampling, by means of differential centrifugations, the plasma is isolated at step 110. Specifically, after having carried out a peripheral blood sampling from the pregnant woman, by means of differential centrifugations, the plasma isolation is performed.
Dal plasma al passo 120 viene estratto il DNA libero circolante, comprendente sia DNA materno sia DNA fetale. Ciò è realizzato, ad esempio, utilizzando kit commerciali che sfruttano una procedura nota basata sul legame altamente selettivo tra il DNA contenuto nel campione plasmatico e una membrana di silice capace di legarlo ad alta affinità. Vantaggiosamente, è previsto l'impiego di RNA carrier, necessario per consentire di recuperare il DNA frammentato di provenienza materna e fetale. Qualsiasi procedimento che consenta un recupero ottimale del DNA circolante frammentato quindi, sia del DNA di provenienza materna sia di provenienza fetale, può essere utilizzato per gli scopi della presente invenzione. Free circulating DNA, comprising both maternal and fetal DNA, is extracted from the plasma at step 120. This is achieved, for example, by using commercial kits that exploit a known procedure based on the highly selective binding between the DNA contained in the plasma sample and a silica membrane capable of binding it with high affinity. Advantageously, the use of carrier RNA is envisaged, necessary to allow the recovery of the fragmented DNA of maternal and fetal origin. Any procedure that allows an optimal recovery of the fragmented circulating DNA, therefore, both of the DNA of maternal origin and of fetal origin, can be used for the purposes of the present invention.
Ottenuto il DNA materno e fetale, tra loro non distinguibili, al passo 130 sono amplificate le regioni geniche di FTL1 e i due loci fiancheggianti, e le regioni target di controllo (un predeterminato gruppo di geni housekeeping), ad esempio mediante PCR. L'amplificazione delle regioni di interesse è effettuata con l'ausilio di coppie di primer specificatamente studiate e disegnate ed il prodotto di amplificazione è successivamente sequenziato mediante NGS o altre metodiche di sequenziamento. Having obtained the maternal and fetal DNA, which are indistinguishable from each other, in step 130 the gene regions of FTL1 and the two flanking loci are amplified, and the target control regions (a predetermined group of housekeeping genes), for example by PCR. The amplification of the regions of interest is carried out with the aid of specifically designed and designed primer pairs and the amplification product is subsequently sequenced by NGS or other sequencing methods.
Per la determinazione del rischio di preeclampsiaè necessario conoscere le caratteristiche delle regioni geniche FTL1 e dei due loci fiancheggianti nel solo DNA fetale, senza la contaminazione del DNA materno. Per questa ragione, contemporaneamente al prelievo di sangue, viene raccolto un campione di materiale biologico materno al passo 200, ad esempio un tampone buccale sublinguale, un prelievo di pelle materna, oppure il bulbo di un capello materno, o ancora qualsiasi altro campione di DNA materno purché non derivi da un prelievo di sangue, dal quale, attraverso una specifica procedura, utilizzando kit di estrazione si ottiene al passo 210 DNA materno idoneo per effettuare al successivo passo 220 il sequenziamento genico di FTL1, e dei loci rs4769613 e rs12050029 che lo fiancheggiano. To determine the risk of preeclampsia, it is necessary to know the characteristics of the FTL1 gene regions and the two flanking loci in the fetal DNA alone, without contamination of the maternal DNA. For this reason, at the same time as the blood sampling, a sample of maternal biological material is collected at step 200, for example a sublingual buccal swab, a maternal skin sample, or the bulb of a maternal hair, or any other DNA sample. maternal as long as it does not derive from a blood sample, from which, through a specific procedure, using an extraction kit, maternal DNA is obtained in step 210 suitable for carrying out the gene sequencing of FTL1 in the following step 220, and of the loci rs4769613 and rs12050029 which flank.
Vantaggiosamente, una seconda aliquota di sangue (circa 3 ml) viene prelevata alla gestante al passo 140, per una eventuale determinazione della quantità relativa di almeno uno dei biomarcatori: PlGF, PAPP-A, sFTL1. Advantageously, a second aliquot of blood (about 3 ml) is taken from the pregnant woman at step 140, for a possible determination of the relative quantity of at least one of the biomarkers: PlGF, PAPP-A, sFTL1.
Di seguito, per meglio descrivere l'idea alla base dell'analisi oggetto dell'invenzione è utile una descrizione del processo di identificazione delle regioni target e del sequenziamento. In order to better describe the idea behind the analysis object of the invention, a description of the process of identifying the target regions and of the sequencing is useful.
Il genoma umano è diploide, ovvero ha due copie di ogni cromosoma. Dato un locus genico per il quale sono presenti due varianti alleliche (ad esempio A o G) si possono avere tre casi: genoma eterozigote A/G (un cromosoma ha l'allele A e l'altro l'allele G), omozigote A/A (entrambi i cromosomi hanno l'allele A), omozigote G/G (entrambi i cromosomi hanno l'allele G). The human genome is diploid, meaning it has two copies of each chromosome. Given a gene locus for which there are two allelic variants (for example A or G) there can be three cases: heterozygous A / G genome (one chromosome has the A allele and the other the G allele), homozygous A / A (both chromosomes have the A allele), homozygous G / G (both chromosomes have the G allele).
Nel processo di amplificazione del DNA per identificare le regioni target, ossia i due loci in studio, vengono teoricamente amplificate e sequenziate un egual numero di molecole corrispondenti ai due cromosomi. Ne consegue che – in teoria – nel caso di un eterozigote il 50% dei risultati del sequenziamento (read) contiene un allele e il 50% l'altro, nel caso di un omozigote il 100% dei risultati di sequenziamento (read) contiene lo stesso allele. In the DNA amplification process to identify the target regions, ie the two loci under study, an equal number of molecules corresponding to the two chromosomes are theoretically amplified and sequenced. It follows that - in theory - in the case of a heterozygote 50% of the sequencing results (read) contain one allele and 50% the other, in the case of a homozygote 100% of the sequencing results (read) contain the same allele.
Un problema da affrontare è che i dati reali mostrano scostamenti rispetto al valore atteso. Tali scostamenti sono dovuti alle procedure sperimentali, ad esempio errori della DNA polimerasi impiegata per l'amplificazione o errori di sequenziamento per cui sono inserite mutazioni non presenti nel DNA e vengono indicati come “rumore” se inferiori ad una soglia percentuale predefinita. One problem to be addressed is that the real data show deviations from the expected value. These deviations are due to experimental procedures, for example errors in the DNA polymerase used for amplification or sequencing errors for which mutations not present in the DNA are inserted and are indicated as "noise" if lower than a predefined percentage threshold.
Nel caso in esame, il DNA libero circolante estratto dal prelievo ematico della gestante contiene sia DNA materno sia DNA fetale in una proporzione che dipende dalla frazione fetale. Questo comporta che i genotipi da considerare sono sia quello materno, sia quello fetale, quest'ultimo oggetto di interesse dell'analisi descritta. Ne consegue che il rapporto osservato tra le read che contengono un allele e quelle che contengono la variante è influenzato da tre fattori: il “rumore”, la frazione del DNA fetale, i genotipi materno e fetale. In the case under examination, the free circulating DNA extracted from the pregnant woman's blood sample contains both maternal and fetal DNA in a proportion that depends on the fetal fraction. This implies that the genotypes to be considered are both the maternal and the fetal one, the latter object of interest in the analysis described. It follows that the observed relationship between the reads containing an allele and those containing the variant is influenced by three factors: the “noise”, the fraction of fetal DNA, the maternal and fetal genotypes.
Per una corretta identificazione del genotipo fetale è necessario dunque valutare correttamente il “rumore” dovuto alle procedure sperimentali per distinguerlo dal segnale vero dovuto alla quantità di DNA fetale, presente in misura ridotta rispetto al DNA materno. For a correct identification of the fetal genotype it is therefore necessary to correctly evaluate the "noise" due to the experimental procedures to distinguish it from the true signal due to the quantity of fetal DNA, present in a reduced extent compared to the maternal DNA.
Per una valutazione del rumore è effettuata una fase di sperimentazione su campioni ematici di controllo (come quello proveniente dalla donna in gravidanza che si sottopone all'esame) privi di DNA fetale, quindi provenienti da donne non gravide o da maschi, ossia il sequenziamento delle regioni geniche di FTL1 e dei due loci fiancheggianti. For an evaluation of the noise, an experimentation phase is carried out on control blood samples (such as that coming from the pregnant woman who undergoes the examination) without fetal DNA, therefore coming from non-pregnant women or males, i.e. the sequencing of the gene regions of FTL1 and of the two flanking loci.
Il risultato del sequenziamento (read) verrà quindi analizzato al passo 150 mediante una prima analisi bioinformatica di base che prevede l'allineamento delle read a sequenze genomiche di riferimento (rappresentative delle sequenze genomiche non mutate) per l'identificazione di tutte le varianti geniche, tra cui le varianti rs4769613 e rs12050029 mutate in un singolo nucleotide. Le sequenze di riferimento sono ad esempio estratte dalle banche dati genomiche universalmente riconosciute dalla comunità scientifica (in particolare da NCBI, National Certer for Biotechnology Information o UCSC, University of California, Santa Cruz). The result of the sequencing (read) will then be analyzed in step 150 by means of a first basic bioinformatics analysis which involves the alignment of the reads to reference genomic sequences (representative of the non-mutated genomic sequences) for the identification of all gene variants, including the rs4769613 and rs12050029 variants mutated to a single nucleotide. The reference sequences are for example extracted from genomic databases universally recognized by the scientific community (in particular by NCBI, National Certer for Biotechnology Information or UCSC, University of California, Santa Cruz).
Tale analisi produce un elenco con il nome della variante identificata, il numero di read che presentano tale variante e il numero totale di letture ottenute per tale posizione genomica. La proporzione tra tali valori indica la frequenza con la quale tale variante è osservata nel campione. This analysis produces a list with the name of the identified variant, the number of reads that have that variant, and the total number of reads obtained for that genomic location. The proportion between these values indicates the frequency with which this variant is observed in the sample.
In una fase successiva, al passo 160 è valutato il rumore presente nei due elenchi. In a subsequent step, at step 160 the noise present in the two lists is evaluated.
In una fase ancora successiva - al passo 170 -si considerano solo le due varianti geniche di interesse (loci). Sotto un modello di Poisson generalizzato in cui la sovradispersione è stimata in funzione del rumore, si procede ad effettuare un test non-parametrico di differenza di medie (per la distribuzione in oggetto) attraverso la statistica T= (P_1-P_2)/Phi In a still later phase - at step 170 - only the two gene variants of interest (loci) are considered. Under a generalized Poisson model in which the overdispersion is estimated as a function of the noise, we proceed to perform a non-parametric test of the difference of means (for the distribution in question) through the statistic T = (P_1-P_2) / Phi
dove: where is it:
P_1 è la proporzione di varianti geniche nel solo DNA materno; P_1 is the proportion of gene variants in maternal DNA alone;
P_2 è la proporzione di varianti geniche nel DNA libero circolante, ossia comprendente DNA fetale e materno; P_2 is the proportion of gene variants in free circulating DNA, i.e. comprising fetal and maternal DNA;
Phi è un parametro di normalizzazione che dipende dalla stima della sovradispersione e del rumore nei due campioni, per standardizzare la statistica. Phi is a normalization parameter that depends on the estimate of the overspersion and noise in the two samples, to standardize the statistics.
Il valore T risultato del test è l'indice di significatività e rappresenta un indice di rischio di preeclampsia. The test result T value is the index of significance and represents a risk index of preeclampsia.
Tale test permette di decidere se nei due campioni ci sono differenze significative di rumore indicative di mutazioni nel DNA fetale. This test makes it possible to decide whether there are significant differences in noise in the two samples indicative of mutations in fetal DNA.
La significatività dei risultati nel test nonparametrico di differenza di medie è valutata tramite il livello di significatività osservato o valore p, il quale indica se è corretto e forte il dato. Per convenzione la significatività del pvalue è <= 0,05. La valutazione della robustezza è fatta mediante stima della probabilità di riproducibilità. La probabilità di riproducibilità di un risultato statisticamente significativo è la sua vera potenza, e la sua stima è un indicatore della stabilità del risultato stesso. Nel caso di test non-parametrici, tale stima è calcolata con metodi Monte Carlo. The significance of the results in the nonparametric difference of means test is assessed by the observed significance level or p-value, which indicates whether the data is correct and strong. By convention, the significance of the pvalue is <= 0.05. Robustness is assessed by estimating the probability of reproducibility. The probability of reproducibility of a statistically significant result is its true power, and its estimate is an indicator of the stability of the result. In the case of non-parametric tests, this estimate is calculated with Monte Carlo methods.
Per valutare il solo genotipo materno tale analisi è effettuata separatamente per il DNA materno usando un campione ad esempio proveniente da un tampone buccale. Questo permette di adattare il test in funzione al genotipo materno che influenza i risultati ottenuti. To evaluate the maternal genotype alone, this analysis is carried out separately for the maternal DNA using a sample for example from a buccal swab. This allows to adapt the test according to the maternal genotype that influences the results obtained.
In una forma di realizzazione alternativa, il test in oggetto, realizzato con la procedura di analisi sopradescritta, ha una maggiore potenza e quindi maggiore accuratezza conoscendo il valore della frazione fetale (% cFF) del DNA libero circolante nel campione. E' possibile ottenere il valore di frazione fetale del DNA libero circolante nel campione utilizzando una procedura di quantificazione, ad esempio la quantificazione del DNA totale e fetale libero circolante è eseguita mediante digestione enzimatica metilazione sensibile seguita da quantificazione mediante Digital Droplet PCR o qPCR. Il marcatore utilizzato per la determinazione della frazione fetale è il gene oncosoppressore il cui promotore risulta ipermetilato nella placenta e ipometilato nella madre. Questa modifica epigenetica consente, mediante l'utilizzo di una digestione metilazione sensibile, di eliminare il contributo materno e di identificare e quantificare solo la sequenza di gene fetale presente nel plasma materno. La frazione fetale viene calcolata mediante il rapporto tra le copie/µl di gene(fetale)/gene housekeeping (materno più fetale). In an alternative embodiment, the test in question, carried out with the above described analysis procedure, has a greater power and therefore greater accuracy by knowing the value of the fetal fraction (% cFF) of the free DNA circulating in the sample. It is possible to obtain the fetal fraction value of circulating free DNA in the sample using a quantification procedure, e.g. quantification of circulating free fetal and total DNA is performed by methylation-sensitive enzymatic digestion followed by quantification by Digital Droplet PCR or qPCR. The marker used for the determination of the fetal fraction is the tumor suppressor gene whose promoter is hypermethylated in the placenta and hypomethylated in the mother. This epigenetic modification allows, through the use of a sensitive methylation digestion, to eliminate the maternal contribution and to identify and quantify only the fetal gene sequence present in the maternal plasma. The fetal fraction is calculated by the ratio of gene copies / µl (fetal) / housekeeping gene (maternal plus fetal).
In alternativa, il test oggetto della presente invenzione può essere associato ad un test NIPT (Non Invasive Prenatal Testing), che abbia tra i suoi risultati evidenti la frazione fetale del DNA libero circolante, naturalmente da effettuare sul sangue del medesimo soggetto prelevato nello stesso periodo di gestazione. Il risultato finale di questa ultima associazione è una elaborazione che utilizza lo stesso algoritmo previsto nel caso che l'estrapolazione della frazione fetale del DNA totale circolante sia fatta con procedura specifica (ossia nel caso della valutazione dei due loci genici fiancheggianti il gene FTL1 del DNA fetale). La conoscenza della percentuale di frazione fetale (%FF) permette di definire un test esatto di tipo binomiale con parametri stimati sul campione del solo DNA materno. Alternatively, the test object of the present invention can be associated with a NIPT test (Non Invasive Prenatal Testing), which has among its evident results the fetal fraction of free circulating DNA, naturally to be carried out on the blood of the same subject taken in the same period. of gestation. The final result of this last association is a processing that uses the same algorithm foreseen in the case that the extrapolation of the fetal fraction of the total circulating DNA is done with a specific procedure (i.e. in the case of the evaluation of the two gene loci flanking the FTL1 gene of the DNA fetal). The knowledge of the percentage of fetal fraction (% FF) allows to define an exact binomial type test with parameters estimated on the maternal DNA sample only.
A titolo esplicativo, se le numerosità fossero sufficienti per applicare le consuete approssimazioni per grandi campioni, la statistica di test sopra descritta si modificherebbe come: By way of explanation, if the numbers were sufficient to apply the usual approximations for large samples, the test statistic described above would change as:
T=(Q_1-Q_2) / Phi T = (Q_1-Q_2) / Phi
dove: where is it:
Q_1 è la stima della proporzione di varianti geniche nel DNA materno basato sia sul DNA materno estratto dal tampone buccale, sia sul DNA libero circolante comprendente DNA fetale e materno (il valore di DNA materno circolante è stimato attraverso il calcolo della percentuale della frazione fetale); e Q_1 is the estimate of the proportion of gene variants in maternal DNA based both on maternal DNA extracted from the buccal swab and on free circulating DNA including fetal and maternal DNA (the value of circulating maternal DNA is estimated by calculating the percentage of the fetal fraction) ; And
Q_2 è la stima della proporzione di varianti geniche nel DNA fetale circolante (il valore del DNA fetale circolante è stimato attraverso il calcolo della percentuale della frazione fetale; Q_2 is the estimate of the proportion of gene variants in circulating fetal DNA (the value of circulating fetal DNA is estimated by calculating the percentage of the fetal fraction;
Phi è un parametro di normalizzazione, termine di standardizzazione. Phi is a standardization parameter, standardization term.
Vantaggiosamente, il procedimento di analisi oggetto dell'invenzione consente di raggiungere una attendibilità e accuratezza maggiore nella determinazione di un indice di rischio di preeclampsia in gravidanza, in un periodo gestazionale precoce rispetto ai test ad oggi in uso. Inoltre, esso consente di utilizzare un riferimento genetico legato al feto, ossia il DNA fetale presente nel DNA libero circolante, superando il limite della tecnica nota legato all'utilizzo di dati e percorsi di analisi riguardanti soltanto la madre e/o la sua condizione fisiologica, e - come unico parametro del feto - la misura del suo accrescimento. Advantageously, the analysis procedure object of the invention allows to achieve greater reliability and accuracy in determining a risk index of preeclampsia in pregnancy, in an early gestational period with respect to the tests currently in use. Furthermore, it allows the use of a genetic reference linked to the fetus, i.e. the fetal DNA present in the free circulating DNA, overcoming the limit of the known technique linked to the use of data and analysis paths concerning only the mother and / or her physiological condition. , and - as the only parameter of the fetus - the extent of its growth.
Il procedimento oggetto dell'invenzione descritto in precedenza può essere attuato per mezzo di un sistema di elaborazione comprendente, ad esempio, una stazione di lavoro computerizzata (workstation) di tipo noto, avente un sottosistema elaboratore (modulo base), dispositivi di interfaccia quali un dispositivo di visualizzazione (display), una tastiera, un dispositivo di puntamento (mouse), e un dispositivo per la connessione ad una rete locale (bus di rete), in cui la workstation è predisposta per elaborare gruppi o moduli di programmi di elaborazione memorizzati su disco o accessibili in rete che realizzano il procedimento secondo l'invenzione. The process object of the invention described above can be implemented by means of a processing system comprising, for example, a computerized workstation of a known type, having a processing subsystem (base module), interface devices such as a display device (display), a keyboard, a pointing device (mouse), and a device for connection to a local network (network bus), in which the workstation is set up to process groups or modules of stored processing programs on disk or accessible on the network which carry out the process according to the invention.
Il sistema secondo l'invenzione comprende inoltre un sottosistema atto a contenere memorizzate banche dati di sequenze genomiche di riferimento. The system according to the invention further comprises a subsystem adapted to contain memorized databases of reference genomic sequences.
Inoltre, il sistema può essere predisposto per il collegamento ad altri dispositivi periferici di ingresso/uscita, locali o remoti, o può consistere in un sistema di elaborazione di tipo distribuito, ma tali soluzioni qui richiamate sono considerate ben note nella tecnica e non saranno ulteriormente descritte in questa sede perché di per sé non rilevanti ai fini dell'attuazione e della comprensione della presente invenzione. Furthermore, the system can be set up for connection to other peripheral input / output devices, local or remote, or it can consist of a distributed processing system, but these solutions referred to here are considered well known in the art and will not be further described here because they are not relevant in themselves for the purposes of implementing and understanding the present invention.
Infine, l'invenzione ha anche per oggetto un programma per elaboratore, in particolare un programma per elaboratore su o in un supporto di informazioni o memoria, atto ad attuare il procedimento oggetto dell'invenzione. Questo programma può utilizzare qualsiasi linguaggio di programmazione, ed essere sotto forma di codice sorgente, codice oggetto, o codice intermedio tra codice sorgente e codice oggetto, ad esempio in una forma parzialmente compilata, o in qualsiasi altra forma desiderata per attuare un procedimento secondo l'invenzione. Finally, the invention also relates to a computer program, in particular a computer program on or in an information or memory medium, suitable for carrying out the process object of the invention. This program can use any programming language, and be in the form of source code, object code, or intermediate code between source code and object code, for example in a partially compiled form, or in any other form desired to implement a process according to the 'invention.
Il supporto di informazioni può essere qualsiasi entità o dispositivo in grado di memorizzare il programma, ovvero un supporto leggibile da elaboratore o utilizzabile da un elaboratore che può contenere, memorizzare, comunicare, propagare o trasportare il programma per un utilizzo da parte di un dispositivo, una apparecchiatura o un sistema di esecuzione delle istruzioni o congiuntamente ad essi. Ad esempio, il supporto può comprendere un dispositivo di memoria di massa come una ROM, ad esempio un CD ROM, un DVD ROM o una ROM di circuito microelettronico, o ancora una memoria flash di massa quale una unità USB, o un mezzo di registrazione magnetica, ad esempio un disco rigido, o un mezzo di registrazione a semiconduttore, ad esempio una unità a stato solido. The information carrier may be any entity or device capable of storing the program, i.e. a computer readable or computer usable medium which may contain, store, communicate, propagate or transport the program for use by a device, an instruction execution equipment or system or in conjunction with them. For example, the support may comprise a mass memory device such as a ROM, for example a CD ROM, a DVD ROM or a microelectronic circuit ROM, or a mass flash memory such as a USB drive, or a recording medium. magnetic, such as a hard disk, or a semiconductor recording medium, such as a solid state drive.
D'altra parte, il supporto di informazioni può essere un supporto che può essere trasmesso, come un segnale elettrico o ottico, che può essere instradato attraverso un cavo elettrico o ottico, attraverso segnali radio o mediante altri mezzi. Il programma secondo l'invenzione può essere in particolare scaricato su una rete di tipo Internet. On the other hand, the information carrier can be a carrier which can be transmitted, such as an electrical or optical signal, which can be routed through an electrical or optical cable, through radio signals or by other means. The program according to the invention can in particular be downloaded on an Internet-type network.
Le forme realizzative dell’invenzione descritti in precedenza con riferimento a illustrazioni operative del procedimento possono verificarsi al di fuori dell’ordine rappresentato. Per esempio, due blocchi rappresentati in successione in realtà possono essere eseguiti sostanzialmente in modo concorrente oppure i blocchi talvolta possono essere eseguiti nell'ordine inverso, a seconda delle funzionalità/azioni coinvolte. The embodiments of the invention described above with reference to operational illustrations of the process may occur outside the order represented. For example, two blocks represented in succession can actually be executed substantially concurrently or the blocks can sometimes be executed in the reverse order, depending on the functionalities / actions involved.
Naturalmente, fermo restando il principio dell'invenzione, le forme di attuazione ed i particolari di realizzazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto è stato descritto ed illustrato a puro titolo di esempio non limitativo, senza per questo allontanarsi dall'ambito di protezione dell'invenzione definito dalle rivendicazioni allegate. Naturally, the principle of the invention remaining the same, the forms of embodiment and details of construction may be widely varied with respect to what has been described and illustrated purely by way of non-limiting example, without thereby departing from the scope of protection of the invention defined by the appended claims.
Claims (10)
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130311107A1 (en) * | 2012-05-21 | 2013-11-21 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Processes for calculating phased fetal genomic sequences |
WO2016132136A1 (en) * | 2015-02-18 | 2016-08-25 | Aston University | Diagnostic assay and treatment for preeclampsia |
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2018
- 2018-06-18 IT IT102018000006418A patent/IT201800006418A1/en unknown
Patent Citations (2)
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