IT201800005455A1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF A BIOCOMPATIBLE MATERIAL FOR USE IN SURGERY - Google Patents
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Description
PROCESSO PER LA PREPARAZIONE DI UN MATERIALE PROCESS FOR THE PREPARATION OF A MATERIAL
BIOCOMPATIBILE PER L’USO IN CHIRURGIA BIOCOMPATIBLE FOR USE IN SURGERY
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Campo dell’Invenzione Field of the Invention
La presente invenzione riguarda il campo dei nuovi biomateriali per l’uso in campo medico, e più in particolare si riferisce a un processo di preparazione di materiali a base di collagene e polisaccaridi solubili in acqua per l’uso in chirurgia, in particolare in chirurgia ortopedica nel trattamento delle lesioni articolari. The present invention relates to the field of new biomaterials for use in the medical field, and more particularly it relates to a process of preparation of materials based on collagen and water-soluble polysaccharides for use in surgery, in particular in surgery. orthopedic in the treatment of joint injuries.
Stato della tecnica State of the art
Le lesioni della superficie articolare rappresentano una condizione sempre più diffusa, dovuta spesso a patologie di tipo infiammatorio, come l’osteoartrite. Tali patologie sono caratterizzate dall’erosione progressiva della cartilagine, a cui può anche essere associata una alterazione del sottostante osso subcondrale. Articular surface lesions represent an increasingly widespread condition, often due to inflammatory pathologies, such as osteoarthritis. These pathologies are characterized by the progressive erosion of the cartilage, which can also be associated with an alteration of the underlying subchondral bone.
Queste lesioni, se non trattate per tempo, possono degenerare in patologie croniche invalidanti, per far fronte alle quali diventano indispensabili trattamenti chirurgici fortemente invasivi per il paziente, basati sul trapianto di tessuti autologhi o eterologhi. In particolare in caso di lesioni condrali di grandi dimensioni, l’osso subcondrale, che è anch’esso coinvolto, necessita di trattamento per ottenere il corretto ripristino degli strati articolari più superficiali. In queste situazioni si ricorre in genere a un innesto osteocondrale bioingegnerizzato o matrici polimeriche, pronto per l’uso e immediatamente disponibile, in modo da poter effettuare il trattamento in un medesimo intervento chirurgico. La quantità di scaffolds attualmente in uso per la riparazione condrale ed osteocondrale è molto ampia; essi differiscono non solo per il tipo di materiali usati per la loro realizzazione, ma anche per la presenza di promotori di una o più linee cellulari, su base condrogenica o osteogenica. These lesions, if not treated in time, can degenerate into chronic disabling diseases, to cope with which highly invasive surgical treatments for the patient, based on the transplantation of autologous or heterologous tissues, become indispensable. In particular in the case of large chondral lesions, the subchondral bone, which is also involved, needs treatment to obtain the correct restoration of the more superficial articular layers. In these situations, a bioengineered osteochondral graft or polymer matrices is generally used, ready for use and immediately available, so that the treatment can be carried out in the same surgery. The amount of scaffolds currently in use for chondral and osteochondral repair is very large; they differ not only in the type of materials used for their realization, but also in the presence of promoters of one or more cell lines, on a chondrogenic or osteogenic basis.
Le tecniche di innesto osteocondrale con questi materiali danno però generalmente luogo a complicanze dovute all’applicazione dei diversi materiali, con reazioni infiammatorie conseguenti a una prolungata permanenza in sito del materiale impiantato; ciò è vero in particolare per dispositivi biocompatibili ma non biodegradabili. Inoltre, i dispositivi bioassorbibili durante la loro degradazione possono portare al rilascio di sostanze infiammatorie, e ciò rimane tuttora una delle più gravi complicanze operatorie di numerose procedure chirurgiche, compresa la chirurgia ortopedica. Tali metodi chirurgici hanno quindi dei difetti non secondari, ed è questo il motivo per cui il trattamento delle lesioni osteocondrali rappresenta tuttora una sfida per il chirurgo ortopedico, in considerazione dell’alta specializzazione e del basso potere di guarigione del tessuto cartilagineo. However, osteochondral grafting techniques with these materials generally give rise to complications due to the application of the different materials, with inflammatory reactions resulting from a prolonged stay in site of the implanted material; this is especially true for biocompatible but non-biodegradable devices. Furthermore, bioabsorbable devices during their degradation can lead to the release of inflammatory substances, and this still remains one of the most serious operative complications of numerous surgical procedures, including orthopedic surgery. These surgical methods therefore have non-secondary defects, and this is the reason why the treatment of osteochondral lesions still represents a challenge for the orthopedic surgeon, given the high specialization and low healing power of cartilage tissue.
Un metodo alternativo di trattamento dell’osteoartrosi e di patologie similari è la viscosupplementazione, che consiste nell’infiltrazione endoarticolare di un materiale iniettabile a base di acido ialuronico, al fine di ripristinare la composizione del liquido sinoviale e migliorarne la funzionalità. Scopo della viscosupplementazione è cercare di limitare l’azione erosiva a carico delle superfici articolari indotta da una degenerazione in termini di elasticità e viscosità del liquido sinoviale mediante iniezione intra-articolare di acido ialuronico esogeno. È stato oramai dimostrato come questo prodotto eserciti un’azione multifattoriale che va oltre la funzione semplicemente lubrificante e riempitiva nello spazio extra-cellulare, ma abbia un effettivo impatto sulla progressione dell’osteoartrite. Inoltre, è un ottimo supporto per la rigenerazione cellulare sia come barriera protettiva per le cellule, stimolandone la proliferazione. Pertanto, esistono attualmente in commercio diverse formulazioni di acido ialuronico iniettabili, approvate per il trattamento dell’osteoartrite. An alternative method of treating osteoarthritis and similar pathologies is viscosupplementation, which consists of the intraarticular infiltration of an injectable material based on hyaluronic acid, in order to restore the composition of the synovial fluid and improve its functionality. The purpose of viscosupplementation is to try to limit the erosive action on the joint surfaces induced by a degeneration in terms of elasticity and viscosity of the synovial fluid by intra-articular injection of exogenous hyaluronic acid. It has now been shown that this product exerts a multifactorial action that goes beyond the merely lubricating and filling function in the extra-cellular space, but has an effective impact on the progression of osteoarthritis. Furthermore, it is an excellent support for cell regeneration and as a protective barrier for cells, stimulating their proliferation. Therefore, there are currently several injectable formulations of hyaluronic acid on the market, approved for the treatment of osteoarthritis.
L’acido ialuronico come tale è però caratterizzato da tempi di riassorbimento molto rapidi, incompatibili con il tempo di residenza necessario per poter esplicare le funzioni rigenerative richieste. Inoltre, l’acido ialuronico nativo non è processabile e come tale non può essere trasformato in forma di biomateriali. Di conseguenza, l’acido ialuronico deve essere modificato e/o formulato con altri componenti allo scopo di ottenere una struttura tridimensionale e controllarne il giusto grado di riassorbimento. Allo stesso tempo, inoltre, la modificazione apportata alla molecola di acido ialuronico non deve impedirne o rallentare troppo il rilascio in situ dal biomateriale, né la sua efficacia. However, hyaluronic acid as such is characterized by very rapid resorption times, incompatible with the residence time necessary to perform the required regenerative functions. Furthermore, native hyaluronic acid is not processable and as such cannot be transformed into the form of biomaterials. Consequently, hyaluronic acid must be modified and / or formulated with other components in order to obtain a three-dimensional structure and control the right degree of reabsorption. At the same time, moreover, the modification made to the hyaluronic acid molecule must not prevent or slow down too much its release in situ from the biomaterial, nor its effectiveness.
Sono noti da tempo materiali biocompatibili a base di acido ialuronico e altri polisaccaridi, anche modificati o derivatizzati e dotati di un grado più o meno elevato di biodegradabilità, oppure a base di miscele polisaccaridiche, per l’impiego in una vasta gamma di applicazioni mediche e in particolare in chirurgia. A seconda del tipo di utilizzo previsto, questi materiali possono essere resi “specializzati” per l’uso, ad esempio tramite funzionalizzazione o formulazione con prodotti diversi. Biocompatible materials based on hyaluronic acid and other polysaccharides, also modified or derivatized and endowed with a more or less high degree of biodegradability, or based on polysaccharide mixtures, have been known for some time, for use in a wide range of medical and especially in surgery. Depending on the type of intended use, these materials can be made "specialized" for use, for example through functionalization or formulation with different products.
L'utilizzo di questi materiali a base di polisaccaridi biocompatibili e/o biodegradabili, sotto forma di spugne, garze (o reti) e gel, da soli o in associazione ad altri biomateriali copre una vasta gamma di prodotti con caratteristiche diverse a seconda del tipo di utilizzo a cui sono destinati. Esempi di tali materiali a base di polisaccaridi, principalmente di acido ialuronico e suoi derivati, sono le medicazioni nel settore del wound-healing oppure i materiali utilizzati in chirurgia come barriera per evitare l’insorgere di infezioni o adesioni chirurgiche o ancora i materiali utilizzati per supportare e/o veicolare cellule laddove ci sia bisogno di ripristinare o rigenerare un tessuto. The use of these materials based on biocompatible and / or biodegradable polysaccharides, in the form of sponges, gauze (or nets) and gels, alone or in combination with other biomaterials, covers a wide range of products with different characteristics depending on the type of use for which they are intended. Examples of such polysaccharide-based materials, mainly hyaluronic acid and its derivatives, are dressings in the wound-healing sector or materials used in surgery as a barrier to prevent the onset of infections or surgical adhesions or materials used for support and / or convey cells where there is a need to restore or regenerate a tissue.
Come i polisaccaridi, anche il collagene, principale proteina del tessuto connettivo negli animali, è molto utilizzato in chirurgia ortopedica, ad esempio sotto forma di membrane per la rigenerazione tissutale oppure di miscele fluide iniettabili per la riparazione della cartilagine articolare. Like polysaccharides, collagen, the main connective tissue protein in animals, is also widely used in orthopedic surgery, for example in the form of membranes for tissue regeneration or injectable fluid mixtures for repair of joint cartilage.
Sono noti anche materiali compositi, contenenti sia polisaccaridi sia collagene e utili in applicazioni chirurgiche. Un esempio è il materiale multistrato a base di molecole di collagene di tipo I e nanocristalli di magnesio-idrossiapatite coprecipitati all’interno delle fibre del collagene stesso, commercializzato con il nome MaioRegen<®>da Fin-Ceramica Faenza come sostituto osteocondrale per il trattamento delle lesioni cartilaginee e osteocartilaginee della cartilagine articolare. Questo derivato del collagene ha mostrato limiti relativamente al rischio di delaminazione della struttura, in quanto costituita da strati che vengono assemblati l’uno sull’altro prima del processo di liofilizzazione. Inoltre il prodotto, sulla cui cinetica di degradazione dopo impianto si ha una scarsa conoscenza, ha dato risultati clinici non sempre favorevoli o limitati a una sola indicazione chirurgica Composite materials are also known, containing both polysaccharides and collagen and useful in surgical applications. An example is the multilayer material based on type I collagen molecules and nanocrystals of magnesium-hydroxyapatite coprecipitated within the fibers of the collagen itself, marketed under the name MaioRegen <®> by Fin-Ceramica Faenza as an osteochondral substitute for the treatment of cartilage and osteocartilaginous lesions of the articular cartilage. This collagen derivative has shown limits in relation to the risk of delamination of the structure, as it consists of layers that are assembled on top of each other before the freeze-drying process. Furthermore, the product, on whose degradation kinetics after implantation there is little knowledge, has given clinical results that are not always favorable or limited to a single surgical indication.
Altri esempi di preparazione di materiali a base di collagene e acido ialuronico sono stati ad esempio descritti in Yan Guo et al., J. Mater Sci: Mater Med. 2012 23:2267-2279, e in Chang-qing Li et al., J. Mater Sci: Mater Med. 2010 21:741-751. Tali processi noti di preparazione sono sempre condotti tra miscele di soluzioni o sospensioni acquose dei due componenti, tipicamente in condizioni di pH fortemente acide per aggiunta di HCl o acido acetico glaciale. In tali condizioni di pH acido, mantenute per di più per periodi di tempo relativamente lunghi durante la miscelazione dei due componenti, la molecola di acido ialuronico viene fortemente degradata, così che la quantità di acido ialuronico nel prodotto finale disponibile per l’effetto di rigenerazione in situ dei tessuti, è molto minore di quella aggiunta nella miscela di reazione. Other examples of preparation of materials based on collagen and hyaluronic acid have been described for example in Yan Guo et al., J. Mater Sci: Mater Med. 2012 23: 2267-2279, and in Chang-qing Li et al., J. Mater Sci: Mater Med. 2010 21: 741-751. Said known preparation processes are always carried out between mixtures of aqueous solutions or suspensions of the two components, typically under highly acidic pH conditions by adding HCl or glacial acetic acid. Under such conditions of acidic pH, maintained for more than relatively long periods of time during the mixing of the two components, the hyaluronic acid molecule is strongly degraded, so that the amount of hyaluronic acid in the final product available for the regeneration effect in situ of the tissues, is much less than that added in the reaction mixture.
Anche per la condroitina solfato sono noti processi di preparazione di materiali biocompatibili ad esempio per complessazione in acidi organici o inorganici con il chitosano (si veda ad esempio Fajardo A.R. et al., Colloid Polym Sci 2011289:1739-1748); tuttavia, anche per la condroitina solfato è noto che un processo di degradazione per desolfatazione degrada il polisaccaride in ambiente acido già a temperatura ambiente (Volpi N. et al., Carbohydrate Research 1999315:345-349). Also for chondroitin sulphate, processes for the preparation of biocompatible materials are known, for example by complexing in organic or inorganic acids with chitosan (see for example Fajardo A.R. et al., Colloid Polym Sci 2011289: 1739-1748); however, also for chondroitin sulphate it is known that a degradation process by desulfation degrades the polysaccharide in an acid environment already at room temperature (Volpi N. et al., Carbohydrate Research 1999315: 345-349).
Anche altri polisaccaridi, come acido alginico e gellano, sono noti subire degradazione idrolitica in condizioni acide, specialmente a temperature elevate, tanto che se ne selezionano particolari derivati quando è richiesta la stabilità a lungo termine di un prodotto. Other polysaccharides, such as alginic acid and gellan, are also known to undergo hydrolytic degradation in acidic conditions, especially at high temperatures, so much so that particular derivatives are selected when the long-term stability of a product is required.
Per le ragioni sopra esposte, è pertanto tuttora sentita nel settore l’esigenza di poter disporre di processi di preparazione semplici che consentano di ottenere nuovi materiali biocompatibili a base di collagene e polisaccaridi davvero efficaci e privi di complicanze nella cura delle affezioni articolari, e in particolare per l’uso nel trattamento chirurgico dei danni articolari dovuti all’osteoartrite. For the reasons set out above, the need is therefore still felt in the sector to be able to have simple preparation processes that allow to obtain new biocompatible materials based on collagen and polysaccharides that are truly effective and without complications in the treatment of joint diseases, and in particularly for use in the surgical treatment of joint damage due to osteoarthritis.
Sommario dell’Invenzione Summary of the Invention
Ora la Richiedente ha messo a punto un nuovo processo semplice e poco costoso che consente di preparare un materiale composito a base di collagene e di un polisaccaride solubile in acqua, utile in particolare per il trattamento chirurgico delle lesioni articolari superficiali, ad esempio dei danni articolari dovuti a osteoartrite. Now the Applicant has developed a new simple and inexpensive process that allows the preparation of a composite material based on collagen and a water-soluble polysaccharide, useful in particular for the surgical treatment of superficial joint injuries, for example joint damage. due to osteoarthritis.
Il processo dell’invenzione consente in particolare di preparare un materiale a base di un polisaccaride solubile in acqua e di collagene, che sfrutta quindi le proprietà rigenerative e riparative di entrambi questi componenti, fornendo una matrice tridimensionale in cui una quantità di polisaccaride, una volta veicolata nel sito delle lesioni condrali e osteocondrali, può fungere da supporto per un’efficace rigenerazione cellulare delle lesioni stesse prima che il materiale venga riassorbito. The process of the invention allows in particular to prepare a material based on a water-soluble polysaccharide and collagen, which then exploits the regenerative and reparative properties of both these components, providing a three-dimensional matrix in which a quantity of polysaccharide, once delivered to the site of chondral and osteochondral lesions, it can act as a support for effective cell regeneration of the lesions themselves before the material is reabsorbed.
Rappresenta pertanto oggetto della presente invenzione un processo per la preparazione di un materiale biocompatibile comprendente una placca di collagene in cui è adsorbito un polisaccaride reticolato scelto tra acido ialuronico, condroitin solfato, gellano e acido alginico, le cui caratteristiche essenziali sono definite nella prima delle rivendicazioni annesse. Therefore, the object of the present invention is a process for the preparation of a biocompatible material comprising a collagen plate in which a cross-linked polysaccharide selected from hyaluronic acid, chondroitin sulfate, gellan and alginic acid is adsorbed, the essential characteristics of which are defined in the first of the claims annexed.
Il materiale biocompatibile comprendente una placca di collagene in cui è adsorbito un polisaccaride scelto tra acido ialuronico, condroitin solfato, gellano e acido alginico, reticolato dopo adsorbimento su collagene, le cui caratteristiche essenziali sono definite nella rivendicazione indipendente 8 qui annessa, costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione, insieme allo stesso materiale per l’uso come sostituto osteocondrale in chirurgia, in particolare nel trattamento chirurgico ortopedico, odontoiatrico e maxillo-facciale, come definito nella rivendicazione indipendente 13. The biocompatible material comprising a collagen plaque in which a polysaccharide selected from hyaluronic acid, chondroitin sulfate, gellan and alginic acid is adsorbed, cross-linked after adsorption on collagen, whose essential characteristics are defined in independent claim 8 annexed hereto, constitutes a further object of the invention, together with the same material for use as an osteochondral substitute in surgery, in particular in orthopedic, dental and maxillofacial surgical treatment, as defined in independent claim 13.
Ulteriori importanti caratteristiche del processo di preparazione del nuovo materiale e dello stesso materiale per l’uso di questa invenzione sono definite nelle rivendicazioni dipendenti qui annesse. Further important characteristics of the process of preparation of the new material and of the same material for the use of this invention are defined in the dependent claims annexed hereto.
Breve Descrizione delle Figure Brief Description of the Figures
Le caratteristiche e i vantaggi del processo di preparazione, del materiale e del materiale per l’uso secondo l’invenzione, risulteranno più chiaramente dalla descrizione che segue di sue forme realizzative fatta a titolo esemplificativo e non limitativo con riferimento ai disegni annessi in cui: The characteristics and advantages of the preparation process, of the material and of the material for use according to the invention, will become clearer from the following description of its embodiments made by way of non-limiting example with reference to the attached drawings in which:
- la Figura 1 mostra una microfotografia SEM di un dettaglio di una sezione laterale del materiale dell’invenzione in forma di spugna preparato come descritto più avanti nell’Esempio 4; - Figure 1 shows an SEM micrograph of a detail of a side section of the material of the invention in the form of a sponge prepared as described later in Example 4;
- la Figura 2 mostra una microfotografia SEM di un dettaglio di una superficie del materiale di Figura 1; Figure 2 shows an SEM photomicrograph of a detail of a surface of the material of Figure 1;
- la Figura 3 mostra una microfotografia SEM di un dettaglio della superficie opposta del materiale rispetto a quella di Figura 2; Figure 3 shows an SEM photomicrograph of a detail of the opposite surface of the material with respect to that of Figure 2;
- la Figura 4 mostra una micrografia SEM di una sezione trasversale del materiale dell’invenzione che illustra tutto lo spessore della membrana; - Figure 4 shows an SEM micrograph of a cross section of the material of the invention which illustrates the entire thickness of the membrane;
- la Figura 5 rappresenta un grafico che mostra l’andamento nel tempo del valore pesato di residuo percentuale nel test di degradazione enzimatica con collagenasi più avanti descritto, dove è indicato con HYCo “A” la membrana dell’Esempio 4 e con HYCo “B” la membrana dell’Esempio 5; - Figure 5 represents a graph showing the trend over time of the weighted percentage residual value in the enzymatic degradation test with collagenase described below, where the membrane of Example 4 is indicated with HYCo "A" and with HYCo "B ”The membrane of Example 5;
- la Figura 6 rappresenta un grafico che mostra l’andamento nel tempo del valore pesato di residuo percentuale nel test di degradazione enzimatica con ialuronidasi più avanti descritto, dove è indicato con HYCo “B” la membrana dell’Esempio 5. - Figure 6 represents a graph showing the trend over time of the weighted residual percentage value in the enzymatic degradation test with hyaluronidase described below, where the membrane of Example 5 is indicated with HYCo "B".
Descrizione Dettagliata dell’Invenzione Detailed Description of the Invention
Gli inventori hanno dunque messo a punto un processo per la preparazione di un materiale biocompatibile comprendente una placca di collagene in cui un polisaccaride scelto tra acido ialuronico, condroitin solfato, gellano e acido alginico è adsorbito e reticolato, che comprende i seguenti passaggi: The inventors have therefore developed a process for the preparation of a biocompatible material comprising a collagen plaque in which a polysaccharide chosen from hyaluronic acid, chondroitin sulfate, gellan and alginic acid is adsorbed and cross-linked, which includes the following steps:
i) adsorbimento di una soluzione acquosa del polisaccaride o di un suo sale di ammonio quaternario solubile in acqua su una placca di collagene liofilizzato; ii) raffreddamento e liofilizzazione della placca di collagene con il polisaccaride adsorbito al suo interno; i) adsorption of an aqueous solution of the polysaccharide or of a water-soluble quaternary ammonium salt thereof on a lyophilized collagen plate; ii) cooling and freeze-drying of the collagen plaque with the polysaccharide adsorbed inside it;
iii) reazione di reticolazione in soluzione del polisaccaride adsorbito sulla placca di collagene ottenuta al passaggio ii); iii) crosslinking reaction in solution of the polysaccharide adsorbed on the collagen plaque obtained in step ii);
iv) eliminazione del solvente/i della reazione di reticolazione. iv) elimination of the solvent (s) of the crosslinking reaction.
Questo processo consente di ottenere un materiale biocompatibile in forma di membrana porosa o di film a seconda di come viene eliminato il solvente nel passaggio iv: una liofilizzazione permette infatti di ottenere il materiale in forma di membrana porosa, mentre un essiccamento a secco della placca dopo reticolazione, condotto di preferenza sotto vuoto su piastre in acciaio, permette di ottenere un film. This process allows to obtain a biocompatible material in the form of a porous membrane or film depending on how the solvent is eliminated in step iv: a lyophilization in fact allows to obtain the material in the form of a porous membrane, while a dry drying of the plaque after crosslinking, preferably carried out under vacuum on steel plates, makes it possible to obtain a film.
Nell’ambito della presente invenzione si intendono sinonimi i termini “membrana porosa”, “membrana spugnosa” o “spugna”, con essi volendo definire un materiale tridimensionale poroso avente tipicamente uno spessore compreso tra 0,5 e 8,0 mm, preferibilmente tra 1,0 e 4,0 mm, ed avente porosità variabile. In the context of the present invention, the terms "porous membrane", "spongy membrane" or "sponge" are meant to be synonymous, with them wanting to define a porous three-dimensional material typically having a thickness between 0.5 and 8.0 mm, preferably between 1.0 and 4.0 mm, and having variable porosity.
Per “porosità variabile” delle membrane dell’invenzione si intende che esse presentano dimensioni dei pori che variano all’interno della membrana stessa in modo graduale passando da una superficie all’altra della membrana; in particolare si osserva una microporosità in determinate zone in cui le dimensioni dei pori sono ad esempio comprese tra 5 e 10 micrometri e una macroporosità in altre zone in cui le dimensioni dei pori sono ad esempio comprese tra 100 e 200 micrometri. By "variable porosity" of the membranes of the invention it is meant that they have pore sizes that vary gradually within the membrane itself, passing from one surface to the other of the membrane; in particular, a microporosity is observed in certain areas in which the dimensions of the pores are for example between 5 and 10 micrometers and a macroporosity in other areas in which the dimensions of the pores are for example between 100 and 200 micrometers.
Tale diversa tipologia della porosità nelle presenti membrane è mostrata nelle immagini SEM delle figure qui annesse nelle Figure 1-4, in cui la membrana spugnosa ottenuta con il presente processo mostra porosità di diversa tipologia da una superficie all’altra della struttura tridimensionale: uno spessore di una prima superficie della membrana si mostra più porosa e qui, una volta impiantato in vivo il materiale, le cellule, indifferentemente dalla loro tipologia, potranno entrare agevolmente per costruire la loro matrice naturale; andando verso la superficie opposta della membrana, un ulteriore spessore, strettamente connesso e in continuità con il primo, mostra invece pori di dimensioni molto inferiori, fino ad arrivare sulla superficie opposta, che si mostra praticamente chiusa. Questa graduale variazione di porosità è tale che le cellule, una volta che il materiale sarà impiantato in vivo, non potranno transitare attraverso la superficie chiusa e uscire verso l’ambiente fisiologico circostante, ma rimarranno intrappolate nella prima struttura tridimensionale a porosità più ampia, in un ambiente a umidità ideale per la loro crescita e riproduzione. La morfologia di questa membrana di collagene con polisaccaride reticolato all’interno, preparata con il processo dell’invenzione, è del tutto analoga alla morfologia di una membrana di collagene liofilizzato, a indicare che il processo e l’internalizzazione del polisaccaride e sua successiva reticolazione, non influenzano la caratteristica porosità variabile del collagene, vantaggiosa per la crescita cellulare e dunque per la rigenerazione in vivo dei tessuti. This different type of porosity in the present membranes is shown in the SEM images of the figures annexed here in Figures 1-4, in which the spongy membrane obtained with the present process shows porosity of different types from one surface to another of the three-dimensional structure: a thickness of a first surface of the membrane is more porous and here, once the material is implanted in vivo, the cells, regardless of their type, will be able to enter easily to build their natural matrix; going towards the opposite surface of the membrane, a further thickness, closely connected and in continuity with the first, shows pores of much smaller dimensions, up to the opposite surface, which is practically closed. This gradual change in porosity is such that the cells, once the material is implanted in vivo, will not be able to transit through the closed surface and exit towards the surrounding physiological environment, but will remain trapped in the first three-dimensional structure with larger porosity, in an ideal humidity environment for their growth and reproduction. The morphology of this collagen membrane with cross-linked polysaccharide inside, prepared with the process of the invention, is completely analogous to the morphology of a lyophilized collagen membrane, indicating that the process and internalization of the polysaccharide and its subsequent cross-linking , do not affect the characteristic variable porosity of collagen, which is advantageous for cell growth and therefore for the regeneration of tissues in vivo.
Con il termine “film” si intende un materiale in forma di film o foglio sottile, avente tipicamente uno spessore di dimensioni trascurabili rispetto alle dimensioni dell’area superficiale, compreso ad esempio tra 0,5 e 1,0 mm. The term "film" refers to a material in the form of a film or thin sheet, typically having a thickness of negligible dimensions compared to the dimensions of the surface area, for example between 0.5 and 1.0 mm.
In un particolare aspetto del processo di questa invenzione, il materiale biocompatibile preparato, consiste essenzialmente di collagene e di un polisaccaride reticolato scelto tra acido ialuronico, gellano, condroitin solfato e acido alginico. Il presente materiale biocompatibile, sia in forma di membrana porosa sia in forma di film, può essere caricato con una o più sostanze farmacologicamente attive scelte tra agenti anti-infiammatori, immunosoppressori, antimicrobici, antifungini, antibiotici, antiblastici e antivirali, e/o con sostanze biologicamente attive quali ad esempio fattori di crescita, e/o con cellule, quali ad esempio cellule staminali mesenchimali (Mesenchimal Stem Cells, MSC) o cellule condrocitarie, così da incrementare la propria efficacia come sostituto osteocondrale e/o aggiungere a questa funzione primaria anche un’ulteriore attività farmaceutica dovuta allo specifico agente farmaceutico caricato sul materiale. In a particular aspect of the process of this invention, the biocompatible material prepared essentially consists of collagen and a cross-linked polysaccharide selected from hyaluronic acid, gellan, chondroitin sulfate and alginic acid. The present biocompatible material, both in the form of a porous membrane and in the form of a film, can be loaded with one or more pharmacologically active substances selected from anti-inflammatory, immunosuppressive, antimicrobial, antifungal, antibiotic, antiblastic and antiviral agents, and / or with biologically active substances such as growth factors, and / or with cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs) or chondrocyte cells, so as to increase its effectiveness as an osteochondral substitute and / or add to this primary function also a further pharmaceutical activity due to the specific pharmaceutical agent loaded on the material.
I materiali biocompatibili preparati con il processo dell’invenzione sono caratterizzati da una elevata biocompatibilità e particolarmente indicati per l’uso come sostituti osteocondrali per applicazione chirurgica in particolare in chirurgia ortopedica, ma anche in altri tipi di chirurgia, quali ad esempio la chirurgia maxillo-facciale e la chirurgia odontoiatrica. Resta inteso che i materiali biocompatibili dell’invenzione possono trovare applicazione anche in altri tipi di chirurgia, ogniqualvolta vi sia la necessità di trattare lesioni di tessuto cartilagineo. I materiali dell’invenzione devono la loro biocompatibilità al fatto che i suoi costituenti essenziali, collagene e polisaccaridi sopra indicati, sono costituenti naturali del corpo umano o comunque perfettamente compatibili con esso. The biocompatible materials prepared with the process of the invention are characterized by a high biocompatibility and particularly suitable for use as osteochondral substitutes for surgical application in particular in orthopedic surgery, but also in other types of surgery, such as for example maxillofacial surgery. facial and dental surgery. It is understood that the biocompatible materials of the invention can also find application in other types of surgery, whenever there is a need to treat cartilage tissue injuries. The materials of the invention owe their biocompatibility to the fact that its essential constituents, collagen and polysaccharides indicated above, are natural constituents of the human body or in any case perfectly compatible with it.
La quantità di polisaccaride adsorbito nella placca collagenica, e in essa reticolato, può variare a seconda della quantità e della concentrazione di soluzione acquosa che è distribuita fino ad adsorbimento sulla placca di collagene. In generale, con una concentrazione della soluzione acquosa di partenza tipicamente compresa tra 0.1 e 3.0% in peso rispetto al peso totale della soluzione, tale quantità di polisaccaride adsorbita può essere compresa tra 5 e 40% in peso e vantaggiosamente è superiore al 30%, arrivando anche fino al 40% in peso rispetto al peso totale del materiale. Una forma realizzativa preferita del materiale consiste di collagene in quantità compresa tra il 70 e il 60% in peso, e polisaccaride, in particolare acido ialuronico, in quantità compresa tra 30 e 40% in peso. The quantity of polysaccharide adsorbed in the collagen plaque, and cross-linked in it, can vary depending on the quantity and concentration of aqueous solution that is distributed until adsorption on the collagen plaque. In general, with a concentration of the starting aqueous solution typically comprised between 0.1 and 3.0% by weight with respect to the total weight of the solution, this quantity of adsorbed polysaccharide can be comprised between 5 and 40% by weight and advantageously is greater than 30%, reaching even up to 40% by weight with respect to the total weight of the material. A preferred embodiment of the material consists of collagen in an amount comprised between 70 and 60% by weight, and polysaccharide, in particular hyaluronic acid, in an amount comprised between 30 and 40% by weight.
Se non altrimenti specificato, le percentuali in peso indicate nella presente sono da intendere come percentuali in peso rispetto al peso totale del materiale. Unless otherwise specified, the percentages by weight indicated herein are to be understood as percentages by weight with respect to the total weight of the material.
Il passaggio i) di adsorbimento della soluzione polisaccaridica sulla placca di collagene può essere eseguito semplicemente distribuendo la soluzione in modo uniforme sulla placca. In un aspetto particolarmente preferito di questa invenzione il sale di ammonio quaternario del polisaccaride utilizzabile al passaggio i) è un sale di tetrabutil ammonio. In un aspetto preferito del processo di questa invenzione il collagene utilizzato è collagene naturale non modificato, in forma liofila. Tale operazione di adsorbimento della soluzione polisaccaridica può essere condotta a temperatura ambiente, mentre il passaggio successivo ii) prevede, prima della liofilizzazione, il raffreddamento della placca con il polisaccaride adsorbito, preferibilmente a temperatura compresa tra -20 e -40°C. Le operazioni di liofilizzazione incluse nel processo di questa invenzione possono essere condotte secondo procedure e condizioni operative note a qualsiasi tecnico medio del settore. Step i) of adsorption of the polysaccharide solution on the collagen plaque can be performed simply by distributing the solution evenly on the plaque. In a particularly preferred aspect of this invention the quaternary ammonium salt of the polysaccharide usable in step i) is a tetrabutyl ammonium salt. In a preferred aspect of the process of this invention the collagen used is natural unmodified collagen, in lyophilic form. This adsorption operation of the polysaccharide solution can be carried out at room temperature, while the subsequent step ii) provides, before lyophilization, the cooling of the plate with the adsorbed polysaccharide, preferably at a temperature between -20 and -40 ° C. The lyophilization operations included in the process of this invention can be carried out according to procedures and operating conditions known to any average person skilled in the art.
Anche la reazione di reticolazione allo stadio iii) del presente processo può essere effettuata secondo qualsiasi procedura nota e con reagenti e condizioni sperimentali note e facilmente identificabili da qualsiasi esperto con conoscenze ordinarie del settore. Esempi di adatte reazioni di auto-reticolazione del polisaccaride sono ad esempio quelle descritte nella domanda di brevetto internazionale pubblicata con il N. WO 89/10941 (Fidia SpA) oppure nelle pubblicazioni Pluda S. et al. Carbohydr Res.2016 433:47-53 e Young J.J. et al. J Biomater Sci Polym Ed.200415(6):767-80. Also the crosslinking reaction at stage iii) of the present process can be carried out according to any known procedure and with reagents and experimental conditions which are known and easily identifiable by any expert with ordinary knowledge of the sector. Examples of suitable polysaccharide self-crosslinking reactions are for example those described in the international patent application published under WO 89/10941 (Fidia SpA) or in the publications Pluda S. et al. Carbohydr Res. 2016 433: 47-53 and Young J.J. et al. J Biomater Sci Polym Ed. 200415 (6): 767-80.
Il prodotto proveniente dalla reazione di reticolazione può essere purificato semplicemente operando uno o più lavaggi con acqua o con soluzioni acquose saline. The product coming from the crosslinking reaction can be purified simply by carrying out one or more washes with water or with aqueous saline solutions.
In nessuno dei passaggi del presente processo viene modificato il pH delle soluzioni, in particolare mediante aggiunta di acidi. Ciascun passaggio del processo di questa invenzione è condotto a pH sostanzialmente neutro, o comunque non acido. In none of the steps of the present process is the pH of the solutions changed, in particular by adding acids. Each step of the process of this invention is carried out at a substantially neutral, or in any case non-acidic, pH.
In generale la reazione di reticolazione allo stadio iii) può essere condotta in presenza di un agente “attivante” la reticolazione del polisaccaride, in grado cioè di attivare un gruppo reattivo in una molecola del polisaccaride capace di reagire con un secondo gruppo reattivo in un’altra molecola dello stesso polisaccaride, creando così la cosiddetta “auto-reticolazione”; e di un solvente in grado di “bagnare” il costrutto finale e allo stesso tempo dissolvere l’agente attivante. In una forma realizzativa preferita dell’invenzione, la reazione di reticolazione è condotta con 2-cloro-1-metilpiridinio ioduro come agente attivante in un solvente polare aprotico, quali ad esempio acetone o tetraidrofurano (THF). In general, the cross-linking reaction in step iii) can be carried out in the presence of an "activating" agent for the cross-linking of the polysaccharide, that is, capable of activating a reactive group in a molecule of the polysaccharide capable of reacting with a second reactive group in a another molecule of the same polysaccharide, thus creating the so-called "self-crosslinking"; and a solvent capable of "wetting" the final construct and at the same time dissolving the activating agent. In a preferred embodiment of the invention, the crosslinking reaction is carried out with 2-chloro-1-methylpyridinium iodide as an activating agent in an aprotic polar solvent, such as for example acetone or tetrahydrofuran (THF).
In una forma realizzativa preferita del presente processo, la reticolazione è effettuata sciogliendo l’agente attivamente nel solvente suddetto e immergendovi la placca di collagene con il polisaccaride adsorbito, dopo raffreddamento e liofilizzazione. Il tempo di reazione può ad esempio variare tra 2 e 15 ore, mentre la temperatura di reazione è preferibilmente quella di ebollizione del solvente utilizzato. Variando il tempo della reazione di reticolazione si otterrà un grado di reticolazione più o meno elevato: per tempi più lunghi, in particolare, si ottengono gradi di reticolazione più alti. Anche variando la quantità di agente attivante utilizzato, si può ottenere un grado di reticolazione più o meno elevato. Preferibilmente, il materiale biocompatibile dell’invenzione ha un grado di reticolazione pari ad almeno il 5%. In questa invenzione, per “grado di reticolazione” del polisaccaride, espresso in percentuale, si intende il rapporto tra il numero di molecole di polisaccaride effettivamente reticolato e il numero di molecole di polisaccaride non reticolate x 100. In a preferred embodiment of the present process, crosslinking is carried out by dissolving the agent actively in the aforementioned solvent and immersing the collagen plaque with the adsorbed polysaccharide, after cooling and lyophilization. The reaction time can for example vary between 2 and 15 hours, while the reaction temperature is preferably that of boiling of the solvent used. By varying the time of the crosslinking reaction, a more or less high degree of crosslinking will be obtained: for longer times, in particular, higher degrees of crosslinking are obtained. Even by varying the amount of activating agent used, a more or less high degree of crosslinking can be obtained. Preferably, the biocompatible material of the invention has a degree of crosslinking of at least 5%. In this invention, by "crosslinking degree" of the polysaccharide, expressed as a percentage, is meant the ratio between the number of effectively crosslinked polysaccharide molecules and the number of non crosslinked polysaccharide molecules x 100.
Qualsiasi tecnico con conoscenze ordinarie del settore potrà senza alcuno sforzo determinare tempo e quantità di agente attivante ottimali per ottenere un determinato grado di reticolazione desiderato. Any technician with ordinary knowledge of the art will be able without any effort to determine the optimal time and quantity of activating agent to obtain a certain desired degree of crosslinking.
I passaggi del presente processo come sopra definiti sono tali per cui la reticolazione avviene tra molecole di polisaccaride, essendo così sostanzialmente una auto-reticolazione, che non coinvolge il collagene. Senza con questo volersi legare a una teoria, il rilascio ottimale del polisaccaride dal materiale dell’invenzione, vantaggiosamente più lento rispetto a quello dello stesso materiale con il polisaccaride non reticolato, sembra essere reso possibile per le dimensioni assunte dal polisaccaride reticolato dopo l’adsorbimento nella matrice collagenica piuttosto che per il legame formatosi a seguito della sua reticolazione al collagene. The steps of the present process as defined above are such that crosslinking takes place between polysaccharide molecules, thus essentially being a self crosslinking, which does not involve collagen. Without wishing to bind to a theory, the optimal release of the polysaccharide from the material of the invention, advantageously slower than that of the same material with the non-cross-linked polysaccharide, seems to be made possible due to the dimensions assumed by the cross-linked polysaccharide after adsorption. in the collagen matrix rather than for the bond formed as a result of its cross-linking to collagen.
Il processo dell’invenzione consente di modulare le caratteristiche del prodotto finale, che può essere ottenuto con diversi gradi di reticolazione del polisaccaride. Ciò si ripercuote sul tempo di riassorbimento del materiale composito ottenuto una volta impiantato chirurgicamente, che sarà diverso a seconda del grado di reticolazione. Si è in ogni caso osservato che il composito di collagene con polisaccaride reticolato adsorbito ha un tempo di riassorbimento in ogni caso più lungo dei singoli costituenti il composito, e idoneo ad esplicare quelle funzioni necessarie alla rigenerazione nei campi di applicazione chirurgici sopra menzionati. In altre parole, con il presente processo, si può ottenere un materiale tridimensionale con caratteristiche simili a quelle del collagene nativo, ma con tempi di residenza in situ sufficienti ad esplicare quelle funzioni di sostituti osteocondrali necessarie nelle chirurgie sopra menzionate. The process of the invention allows to modulate the characteristics of the final product, which can be obtained with different degrees of crosslinking of the polysaccharide. This affects the resorption time of the composite material obtained once surgically implanted, which will differ according to the degree of crosslinking. In any case, it has been observed that the adsorbed collagen composite with cross-linked polysaccharide has a reabsorption time that is in any case longer than the individual constituents of the composite, and is suitable for carrying out those functions necessary for regeneration in the aforementioned surgical fields of application. In other words, with the present process, it is possible to obtain a three-dimensional material with characteristics similar to those of native collagen, but with residence times in situ sufficient to perform those functions of osteochondral substitutes necessary in the aforementioned surgeries.
Anche la possibilità di variare la percentuale del polisaccaride adsorbito in collagene, offre la possibilità di modulare la degradabilità del composito, consentendo di preparare formulazioni diverse per le diverse applicazioni desiderate. In base al contenuto di polisaccaride nella matrice collagenica, si possono ottenere materiali con caratteristiche diverse, per proprietà di assorbimento e di degradazione, sia in vitro sia in vivo. In particolare, come mostrato nella parte sperimentale che segue, l’uso di enzimi come la collagenasi e la ialuronidasi, in grado di degradare il collagene e l’acido ialuronico, si sono dimostrati tanto più impotenti nella loro azione quanto più alta è la quantità di polisaccaride reticolato adsorbito nel biomateriale finale. Infatti più alto è il rapporto in peso tra collagene e polisaccaride, più evidente è l’effetto della collagenasi verso la ialuronidasi e viceversa. The possibility of varying the percentage of the polysaccharide adsorbed in collagen also offers the possibility of modulating the degradability of the composite, allowing the preparation of different formulations for the different desired applications. Based on the polysaccharide content in the collagen matrix, it is possible to obtain materials with different characteristics, for absorption and degradation properties, both in vitro and in vivo. In particular, as shown in the experimental part that follows, the use of enzymes such as collagenase and hyaluronidase, capable of degrading collagen and hyaluronic acid, proved to be all the more powerless in their action the higher the quantity of cross-linked polysaccharide adsorbed in the final biomaterial. In fact, the higher the weight ratio between collagen and polysaccharide, the more evident is the effect of collagenase towards hyaluronidase and vice versa.
Una composizione risultata ottimale, rispetto alla quale entrambi gli enzimi suddetti risultano minimamente attivi nella degradazione del materiale, è un materiale -in forma di spugna o in forma film indifferentemente – consistente per il 70% in peso di collagene e per il 30% in peso di un polisaccaride summenzionato adsorbito nel collagene e reticolato con il processo dell’invenzione. An optimal composition, with respect to which both the aforementioned enzymes are minimally active in the degradation of the material, is a material - in the form of sponge or in film form indifferently - consisting of 70% by weight of collagen and 30% by weight of an aforementioned polysaccharide adsorbed in collagen and cross-linked with the process of the invention.
I seguenti esempi sono riportati a scopo illustrativo e non limitativo della presente invenzione. The following examples are given for illustrative and not limitative purposes of the present invention.
ESEMPI EXAMPLES
Esempio 1: Preparazione di una placca di collagene Example 1: Preparation of a collagen plaque
In un bicchiere in vetro da 2000 ml sono stati pesati circa 1000 g di gel di collagene all’1% in soluzione acidificata con acido acetico. Il gel è stato sottoposto ad agitazione magnetica e fluidificato alla temperatura di 37°C. Raggiunta la temperatura, si è mantenuto in agitazione per altri 5 minuti. Si è quindi trasferito il collagene fluidificato, su un vassoio in acciaio delle dimensioni di 30x35x3 cm, distribuendolo su tutta la superficie del vassoio. Si è lasciato raffreddare per 4 ore a -20°C e poi per 4 ore a -40°C. Il vassoio contenente il collagene ghiacciato è stato trasferito in un liofilizzatore dove si è proceduto alla liofilizzazione per 48-72 ore, ottenendo infine una placca di collagene delle dimensioni di circa 28x30x1cm, con un peso variabile dai 9 agli 11 g. In a 2000 ml glass beaker, about 1000 g of 1% collagen gel in a solution acidified with acetic acid were weighed. The gel was subjected to magnetic stirring and fluidized at a temperature of 37 ° C. Once the temperature was reached, it was kept under stirring for a further 5 minutes. The fluidized collagen was then transferred onto a steel tray measuring 30x35x3 cm, distributing it over the entire surface of the tray. It was allowed to cool for 4 hours at -20 ° C and then for 4 hours at -40 ° C. The tray containing the frozen collagen was transferred to a lyophilizer where freeze-drying was carried out for 48-72 hours, finally obtaining a collagen plaque measuring approximately 28x30x1cm, with a weight ranging from 9 to 11 g.
Esempio 2: Preparazione di una membrana di collagene con acido ialuronico (HA) adsorbito Example 2: Preparation of a collagen membrane with adsorbed hyaluronic acid (HA)
In un bicchiere in vetro da 1000 ml sono stati pesati 4 g di acido ialuronico sale di tetrabutilammonio. Sotto agitazione magnetica sono stati quindi aggiunti 400 ml di acqua, ottenendo una soluzione acquosa di acido ialuronico in concentrazione pari a 10 mg/ml. Si è poi trasferita la soluzione acquosa di acido ialuronico in un imbuto separatore in vetro da 500 ml, e da questo la soluzione di acido ialuronico è stata distribuita lentamente ed uniformemente su tutta la superficie della placca di collagene, preparata come descritto sopra nell’Esempio 1. Terminata l’operazione, si è coperto il vassoio contenente placca di collagene e acido ialuronico, e si è lasciato riposare a 4°C per una notte in modo da favorire il completo adsorbimento dell’acido ialuronico nella matrice collagenica. Si è poi raffreddato per 4 ore a -20°C, e poi ancora per ulteriori 4 ore a -40°C. Il vassoio contenente la placca di collagene adsorbita con acido ialuronico è stato poi trasferito in un liofilizzatore, dove si è proceduto alla liofilizzazione per 48-72 ore, ottenendo infine una membrana di collagene con un contenuto di acido ialuronico adsorbito pari a circa il 30.6% in peso rispetto al peso del collagene. In a 1000 ml glass beaker, 4 g of hyaluronic acid tetrabutylammonium salt was weighed. 400 ml of water were then added under magnetic stirring, obtaining an aqueous solution of hyaluronic acid in a concentration equal to 10 mg / ml. The aqueous solution of hyaluronic acid was then transferred into a 500 ml glass separating funnel, and from this the hyaluronic acid solution was slowly and uniformly distributed over the entire surface of the collagen plate, prepared as described above in the Example 1. At the end of the operation, the tray containing collagen plaque and hyaluronic acid was covered, and it was left to rest at 4 ° C for one night in order to favor the complete adsorption of the hyaluronic acid in the collagen matrix. It was then cooled for 4 hours at -20 ° C, and then again for a further 4 hours at -40 ° C. The tray containing the collagen plaque adsorbed with hyaluronic acid was then transferred to a lyophilizer, where freeze drying was carried out for 48-72 hours, finally obtaining a collagen membrane with an adsorbed hyaluronic acid content of approximately 30.6%. by weight relative to the weight of collagen.
Il contenuto in peso dell’acido ialuronico presente è stato determinato mediante tecnica cromatografica, che ha permesso di rilevare la presenza dell’acido glucuronico nel campione seguendo le procedure descritte ad esempio in Bitter T. et al. Anal Biochem. 1962; 4:330–334; e in Plaetzer M. et al. J Pharm Biomed Anal. 1999; 21:491–496. In particolare, la placca di collagene preparata come descritto sopra è risultata avere un contenuto di acido glucuronico pari al 15.3% che, rapportato all’acido ialuronico adsorbito dalla placca di collagene, corrisponde a un contenuto di acido ialuronico pari a circa il 31%. The weight content of the hyaluronic acid present was determined by chromatographic technique, which made it possible to detect the presence of glucuronic acid in the sample by following the procedures described for example in Bitter T. et al. Anal Biochem. 1962; 4: 330–334; and in Plaetzer M. et al. J Pharm Biomed Anal. 1999; 21: 491–496. In particular, the collagen plaque prepared as described above was found to have a glucuronic acid content of 15.3% which, compared to the hyaluronic acid adsorbed by the collagen plaque, corresponds to a hyaluronic acid content of approximately 31%.
Esempio 3: Preparazione di una membrana di collagene con condroitin-4-solfato (CS) adsorbito Example 3: Preparation of a collagen membrane with adsorbed chondroitin-4-sulfate (CS)
In un bicchiere in vetro da 500 ml sono stati pesati 4 g di condroitin-4-solfato sale di tetrabutil ammonio, quindi sono stati aggiunti, sotto agitazione magnetica, 200 ml di acqua, ottenendo così una soluzione acquosa di condroitin solfato con concentrazione pari a 20 mg/ml. Si è poi trasferita questa soluzione in un imbuto separatore in vetro da 500 ml, dal quale la soluzione di condroitin-solfato è stata distribuita lentamente ed uniformemente su tutta la superficie della placca di collagene, preparata come descritto sopra nell’Esempio 1. Dopo alcune ore (2-4 ore) a riposo a 4°C si è raggiunto il completo adsorbimento. Quindi si è raffreddata la placca per 4 ore a -20°C e poi per 4 ore a -40°C. Il vassoio contenente la placca di collagene adsorbita con condroitina solfato è stato poi trasferito in un liofilizzatore, dove si è proceduto alla liofilizzazione per 48-72 ore ottenendo infine una membrana di collagene con un contenuto di condroitina solfato adsorbito pari a circa 32.1% in peso rispetto al peso del collagene. In a 500 ml glass beaker, 4 g of chondroitin-4-sulfate salt of tetrabutyl ammonium were weighed, then 200 ml of water were added under magnetic stirring, thus obtaining an aqueous solution of chondroitin sulphate with a concentration equal to 20 mg / ml. This solution was then transferred into a 500 ml glass separating funnel, from which the chondroitin-sulphate solution was slowly and uniformly distributed over the entire surface of the collagen plate, prepared as described above in Example 1. After a few hours (2-4 hours) at rest at 4 ° C complete adsorption was achieved. The plate was then cooled for 4 hours at -20 ° C and then for 4 hours at -40 ° C. The tray containing the collagen plaque adsorbed with chondroitin sulphate was then transferred to a lyophilizer, where it was freeze-dried for 48-72 hours, finally obtaining a collagen membrane with an adsorbed chondroitin sulphate content equal to about 32.1% by weight. compared to the weight of the collagen.
Il contenuto in peso della condroitina solfato presente è stato determinato sempre mediante tecnica cromatografica, andando a rilevare la quantità di acido glucuronico, come descritto sopra nell’Esempio 2; in questo caso, il contenuto di acido glucuronico rilevato era pari al 13.1% in peso rispetto al peso del collagene che, rapportato all’acido ialuronico adsorbito dalla placca di collagene, corrisponde ad un contenuto di acido ialuronico pari al 32.1%. The weight content of the chondroitin sulfate present was always determined by chromatographic technique, detecting the amount of glucuronic acid, as described above in Example 2; in this case, the glucuronic acid content detected was 13.1% by weight with respect to the weight of the collagen which, compared to the hyaluronic acid adsorbed by the collagen plaque, corresponds to a hyaluronic acid content equal to 32.1%.
Esempio 4: Reazione di reticolazione sulla membrana contenente HA dell’Esempio 2 Example 4: Crosslinking reaction on the membrane containing HA of Example 2
4.5 g del prodotto in forma di membrana preparato come descritto sopra nell’Esempio 2 sono stati introdotti in un reattore in vetro da 1 l collegato a un refrigerante a bolle e a un agitatore magnetico. Sono stati addizionati di seguito 4 g di 2-cloro-1-metilpiridinio ioduro (97%, Sigma/Aldrich), 400 ml di acetone, e 2 ml di TEA (trietilammina, >99%, Sigma/Aldrich). Il solvente nel reattore è stato portato a ebollizione sotto blanda agitazione e mantenuto per 2 ore in tali condizioni. Si è quindi fermata l’agitazione e spento il riscaldamento fino a raffreddamento alla temperatura ambiente. Dopo eliminazione dal reattore di tutto il solvente, sono stati aggiunti 200 ml di acetone fresco e la membrana è stata lavata per 4 ore dopo aver di nuovo portato ad ebollizione il solvente. Si è lasciato poi raffreddare fino a temperatura ambiente per circa 1 ora, e si è estratta la membrana dal reattore per sottoporla a una serie di lavaggi in soluzioni acquose saline come segue: 4.5 g of the product in the form of a membrane prepared as described above in Example 2 were introduced into a 1 l glass reactor connected to a bubble cooler and a magnetic stirrer. 4 g of 2-chloro-1-methylpyridinium iodide (97%, Sigma / Aldrich), 400 ml of acetone, and 2 ml of TEA (triethylamine,> 99%, Sigma / Aldrich) were then added. The solvent in the reactor was brought to a boil under gentle stirring and maintained for 2 hours under these conditions. The agitation was then stopped and the heating turned off until it cooled to room temperature. After removing all the solvent from the reactor, 200 ml of fresh acetone were added and the membrane was washed for 4 hours after boiling the solvent again. It was then left to cool down to room temperature for about 1 hour, and the membrane was extracted from the reactor to subject it to a series of washes in aqueous saline solutions as follows:
2 ore di lavaggio in 500 ml di ammonio acetato al 2% in acqua; 2 hours of washing in 500 ml of 2% ammonium acetate in water;
2 ore di lavaggio in 500 ml di una miscela NaCl e acido citrico, rispettivamente al 2% e 1% in acqua; 2 hours of washing in 500 ml of a mixture of NaCl and citric acid, respectively at 2% and 1% in water;
1 ora di lavaggio in 500 ml di NaCl all’1% in acqua; 1 hour of washing in 500 ml of 1% NaCl in water;
1 notte di lavaggio in 1000 ml di acqua distillata. 1 night of washing in 1000 ml of distilled water.
Dopo questa sequenza di lavaggi, il prodotto è stato sottoposto a liofilizzazione per 48-72 ore per ottenere una membrana. After this washing sequence, the product was subjected to lyophilization for 48-72 hours to obtain a membrane.
In alternativa alla liofilizzazione, dopo i lavaggi, il prodotto lavato ottenuto da un’ulteriore preparazione, analoga a quella descritta sopra, è stato sottoposto ad essiccamento su piastra sotto vuoto, a temperatura ambiente per 24 ore, per ottenere un film. As an alternative to freeze-drying, after washing, the washed product obtained from a further preparation, similar to that described above, was subjected to drying on a vacuum plate, at room temperature for 24 hours, to obtain a film.
Esempio 5: Reazione di reticolazione sulla membrana contenente HA dell’Esempio 2 Example 5: Crosslinking reaction on the membrane containing HA of Example 2
4.5 g del prodotto in forma di membrana preparato come descritto sopra nell’Esempio 2 sono stati introdotti in un reattore in vetro da 1 l collegato a un refrigerante a bolle e a un agitatore magnetico. Sono stati addizionati di seguito 4 g di 2-cloro-1-metilpiridinio ioduro (97%, Sigma/Aldrich), 400 ml di acetone, e 2 ml di TEA (trietilammina, >99%, Sigma/Aldrich). Il solvente nel reattore è stato portato a ebollizione sotto blanda agitazione e mantenuto per 1 notte intera in tali condizioni. Si è poi fermata l’agitazione e spento il riscaldamento fino a raffreddamento alla temperatura ambiente. Dopo eliminazione dal reattore di tutto il solvente, sono stati aggiunti 200 ml di acetone fresco e la membrana è stata lavata per 4 ore dopo aver di nuovo portato ad ebollizione il solvente. Si è lasciato poi raffreddare fino a temperatura ambiente per circa 1 ora, e si è estratta la membrana dal reattore per sottoporla a una serie di lavaggi in soluzioni acquose saline come segue: 4.5 g of the product in the form of a membrane prepared as described above in Example 2 were introduced into a 1 l glass reactor connected to a bubble cooler and a magnetic stirrer. 4 g of 2-chloro-1-methylpyridinium iodide (97%, Sigma / Aldrich), 400 ml of acetone, and 2 ml of TEA (triethylamine,> 99%, Sigma / Aldrich) were then added. The solvent in the reactor was brought to a boil under gentle stirring and kept for 1 whole night under these conditions. The stirring was then stopped and the heating turned off until it cooled down to room temperature. After removing all the solvent from the reactor, 200 ml of fresh acetone were added and the membrane was washed for 4 hours after boiling the solvent again. It was then left to cool down to room temperature for about 1 hour, and the membrane was extracted from the reactor to subject it to a series of washes in aqueous saline solutions as follows:
2 ore di lavaggio in 500 ml di ammonio acetato al 2% in acqua; 2 hours of washing in 500 ml of 2% ammonium acetate in water;
2 ore di lavaggio in 500 ml di una miscela NaCl e acido citrico, rispettivamente al 2% e 1% in acqua; 2 hours of washing in 500 ml of a mixture of NaCl and citric acid, respectively at 2% and 1% in water;
1 ora di lavaggio in 500 ml di NaCl all’1% in acqua; 1 hour of washing in 500 ml of 1% NaCl in water;
1 notte di lavaggio in 1000 ml di acqua distillata. 1 night of washing in 1000 ml of distilled water.
Dopo questa sequenza di lavaggi, il prodotto è stato sottoposto a liofilizzazione per 48-72 ore per ottenere una membrana. After this washing sequence, the product was subjected to lyophilization for 48-72 hours to obtain a membrane.
In alternativa alla liofilizzazione, dopo i lavaggi, il prodotto lavato ottenuto da un’ulteriore preparazione, analoga a quella descritta sopra, è stato sottoposto ad essiccamento su piastra sotto vuoto, a temperatura ambiente per 24 ore, per ottenere un film. As an alternative to freeze-drying, after washing, the washed product obtained from a further preparation, similar to that described above, was subjected to drying on a vacuum plate, at room temperature for 24 hours, to obtain a film.
Esempio 6: Reazione di reticolazione sulla membrana contenente CS dell’Esempio 3 Example 6: Crosslinking reaction on the membrane containing CS of Example 3
4.5 g della membrana preparata come descritto sopra nell’Esempio 3 sono stati introdotti in un reattore in vetro da 1 l collegato a un refrigerante a bolle e a un agitatore magnetico. Sono stati addizionati di seguito 4 g di 2-cloro-1-metilpiridinio ioduro (97%, Sigma/Aldrich), 400 ml di THF (tetraidrofurano), e 2 ml di TEA (trietilammina, >99%, Sigma/Aldrich). Il solvente nel reattore è stato portato a ebollizione sotto blanda agitazione e mantenuto a reagire per 1 notte in tali condizioni. Si è quindi fermata l’agitazione e spento il riscaldamento fino a raffreddamento alla temperatura ambiente. Dopo eliminazione dal reattore di tutto il solvente, sono stati aggiunti 500 ml di acetone e la membrana è stata lavata per 4 ore dopo aver di nuovo portato ad ebollizione il solvente. Si è lasciato poi raffreddare fino a temperatura ambiente per circa 1 ora, e si è estratta la membrana dal reattore per sottoporla a una serie di lavaggi in soluzioni acquose saline come segue: 4.5 g of the membrane prepared as described above in Example 3 were introduced into a 1 l glass reactor connected to a bubble cooler and a magnetic stirrer. 4 g of 2-chloro-1-methylpyridinium iodide (97%, Sigma / Aldrich), 400 ml of THF (tetrahydrofuran), and 2 ml of TEA (triethylamine,> 99%, Sigma / Aldrich) were then added. The solvent in the reactor was brought to a boil under gentle stirring and kept reacting for 1 night under these conditions. The agitation was then stopped and the heating turned off until it cooled to room temperature. After eliminating all the solvent from the reactor, 500 ml of acetone were added and the membrane was washed for 4 hours after boiling the solvent again. It was then left to cool down to room temperature for about 1 hour, and the membrane was extracted from the reactor to subject it to a series of washes in aqueous saline solutions as follows:
2 ore di lavaggio in 500 ml di ammonio acetato al 2% in acqua; 2 hours of washing in 500 ml of 2% ammonium acetate in water;
2 ore di lavaggio in 500 ml di una miscela NaCl e acido citrico, rispettivamente al 2% e 1% in acqua; 2 hours of washing in 500 ml of a mixture of NaCl and citric acid, respectively at 2% and 1% in water;
1 ora di lavaggio in 500 ml di NaCl all’1% in acqua; 1 hour of washing in 500 ml of 1% NaCl in water;
1 notte di lavaggio in 1000 ml di acqua distillata. 1 night of washing in 1000 ml of distilled water.
Dopo questa sequenza di lavaggi, il prodotto è stato sottoposto a liofilizzazione per 48-72 ore per ottenere una membrana. In alternativa alla liofilizzazione, dopo i lavaggi, il prodotto lavato ottenuto da un’ulteriore preparazione è stato sottoposto ad essiccamento su piastra sotto vuoto, a temperatura ambiente per 24 ore, per ottenere un film. After this washing sequence, the product was subjected to lyophilization for 48-72 hours to obtain a membrane. As an alternative to freeze-drying, after washing, the washed product obtained from a further preparation was subjected to drying on a vacuum plate, at room temperature for 24 hours, to obtain a film.
Esempio 7: Caratterizzazione e test effettuati sulle membrane dell’invenzione Analisi della struttura e delle superfici della membrana: Example 7: Characterization and tests carried out on the membranes of the invention Analysis of the structure and surfaces of the membrane:
L’analisi delle membrane reticolate contenenti polisaccaridi al microscopio elettronico a scansione (SEM) ha permesso di osservare l’ordinato reticolo di fibre di collagene e acido ialuronico che costituisce la struttura della membrana; in Figura 1 è mostrata una microfotografia SEM di una sezione laterale della membrana preparata come descritto sopra nell’Esempio 4. The analysis of the cross-linked membranes containing polysaccharides under a scanning electron microscope (SEM) made it possible to observe the ordered network of collagen and hyaluronic acid fibers that make up the structure of the membrane; Figure 1 shows an SEM photomicrograph of a lateral section of the membrane prepared as described above in Example 4.
Questa analisi ha inoltre permesso di distinguere caratteristiche diverse delle due superfici della membrana: una delle due superfici risulta infatti porosa e reticolata (in Figura 2 una immagine SEM di un dettaglio della porzione di membrana adiacente a tale superficie), mentre quella opposta risulta completamente chiusa (in Figura 3 una immagine SEM di un dettaglio della porzione di membrana adiacente a tale superficie). Questo dato indica una particolare struttura del presente materiale, che lo rende adatto alla semina di cellule su un solo lato della membrana, quello poroso e reticolato, e permette una buona penetrazione nell’interno del materiale delle cellule seminate, impedendo la loro fuoriuscita dal lato opposto. In Figura 4 è una immagine SEM che mostra l’intero spessore della membrana suddetta, in cui è ben visibile la variazione graduale di porosità andando da una superficie all’altra. This analysis also made it possible to distinguish different characteristics of the two surfaces of the membrane: one of the two surfaces is in fact porous and cross-linked (in Figure 2 a SEM image of a detail of the portion of the membrane adjacent to this surface), while the opposite one is completely closed. (in Figure 3 a SEM image of a detail of the membrane portion adjacent to this surface). This datum indicates a particular structure of the present material, which makes it suitable for the seeding of cells on only one side of the membrane, the porous and cross-linked one, and allows a good penetration into the interior of the material of the seeded cells, preventing their escape from the side opposite to. In Figure 4 is a SEM image showing the entire thickness of the aforementioned membrane, in which the gradual variation of porosity going from one surface to another is clearly visible.
Test di assorbimento: Absorption test:
La membrana ottenuta come descritto sopra nell’Esempio 4 è stata sottoposta a un test di assorbimento allo scopo di valutarne le proprietà assorbenti. The membrane obtained as described above in Example 4 was subjected to an absorption test in order to evaluate its absorbent properties.
In un matraccio in vetro da 250 ml, sono stati pesati 2.096 g di NaCl e 104.400 mg di CaCl2, portando poi a volume con acqua distillata per ottenere una soluzione salina da utilizzare nel test. Separatamente sono stati pesati 10 pezzi di membrana dell’Esempio 4, ciascuno del peso di circa 150 mg. Ogni singolo pezzo è stato idratato con 8 ml della soluzione salina preparata come detto sopra raggiungendo in pochi secondi la condizione di idratazione completa, dopodiché ogni singolo pezzo di membrana è stato nuovamente pesato per calcolarne il grado di assorbimento. In a 250 ml glass flask, 2,096 g of NaCl and 104,400 mg of CaCl2 were weighed, then made up to volume with distilled water to obtain a saline solution for use in the test. 10 pieces of membrane from Example 4 were weighed separately, each weighing about 150 mg. Each single piece was hydrated with 8 ml of the saline solution prepared as mentioned above, reaching the condition of complete hydration in a few seconds, after which each single piece of membrane was weighed again to calculate the degree of absorption.
Nella Tabella 1 sottostante sono riportati i valori medi su 10 punti delle pesate allo stato secco, allo stato umido, il grado di assorbimento e il rapporto tra il prodotto allo stato secco e quello umido. Table 1 below shows the average values over 10 points of the weighings in the dry state, in the wet state, the degree of absorption and the ratio between the product in the dry and wet state.
Tabella 1 Table 1
Peso Peso Grado di Rapporto Weight Weight Degree of Relationship
Test di degradazione enzimatica con collagenasi: Collagenase enzymatic degradation test:
Frammenti della membrana ottenuta come descritto sopra nell’Esempio 4 del peso di circa 50 mg l’uno sono stati accuratamente pesati (peso iniziale, wO) e posti in fiale di vetro da laboratorio. Ogni frammento è stato quindi reidratato con 4 ml di una soluzione, composta da Tris-HCl (pH=7.4), CaCl25mM e NaN350mg/l, e posto in incubatore a 37°C per 30 minuti. Di seguito in ogni fiala sono stati aggiunti 4 ml di una soluzione contenente 2.4 U/ml di enzima Collagenasi di tipo II (da Clostridium histolyticum) in Tris-HCl, in modo da ottenere una concentrazione enzimatica finale per fiala pari a 1.2 U/ml. Le fiale sono state mantenute a 37°C e, a tempi di analisi determinati, la reazione è stata bloccata raffreddando la membrana a 4°C per 20 minuti e addizionandovi 1 ml di soluzione di acido citrico 0.4 M. Il materiale residuo è stato quindi filtrato su una membrana porosa con pori da 8 µm, lavato 3 volte con acqua milliQ, congelato a -20°C e liofilizzato. Fragments of the membrane obtained as described above in Example 4 weighing about 50 mg each were carefully weighed (initial weight, wO) and placed in laboratory glass vials. Each fragment was then rehydrated with 4 ml of a solution, composed of Tris-HCl (pH = 7.4), CaCl25mM and NaN350mg / l, and placed in an incubator at 37 ° C for 30 minutes. 4 ml of a solution containing 2.4 U / ml of collagenase type II enzyme (from Clostridium histolyticum) in Tris-HCl was then added to each vial, in order to obtain a final enzymatic concentration per vial equal to 1.2 U / ml. . The vials were kept at 37 ° C and, at determined analysis times, the reaction was stopped by cooling the membrane at 4 ° C for 20 minutes and adding 1 ml of 0.4 M citric acid solution. filtered on a porous membrane with 8 µm pores, washed 3 times with milliQ water, frozen at -20 ° C and freeze-dried.
Al termine della liofilizzazione, ogni pezzo di membrana è stato ripesato (peso al tempo di analisi t wT). Le percentuali residue delle membrane sono state calcolate tramite la formula: Residuo% = (wT/wO)x100. At the end of the lyophilization, each piece of membrane was reweighed (weight at analysis time t wT). The residual percentages of the membranes were calculated using the formula: Residual% = (wT / wO) x100.
Questo stesso test di degradazione enzimatica è stato effettuato anche sulla membrana ottenuta dopo una reazione di reticolazione in condizioni più spinte, come descritto sopra nell’Esempio 5. In entrambi i casi la durata complessiva dei test è stata di 14 giorni e i tempi di analisi sono stati fissati a 24 ore, 48 ore, 72 ore e 336 ore (14 giorni). In Figura 5 sono illustrati i risultati di tali test in forma di andamento nel tempo del valore pesato di residuo percentuale, dove si è indicato con HYCo “A” la membrana dell’Esempio 4 e con HYCo “B” la membrana dell’Esempio 5. Come si può vedere dalla Figura 5, per la membrana HYCo “A” con un minor grado di reticolazione, dopo 24 ore il residuo percentuale di membrana è dell’89% circa; al termine delle 48 ore è risultato degradato circa il 33% della membrana, e a 72 ore l’enzima aveva tagliato circa il 50% del peso totale. Al termine della reazione enzimatica, dopo 14 giorni, il residuo di HYCo “A” rimasto era del 35.4%: la Collagenasi aveva perciò raggiunto quasi tutto il collagene presente, che ammontava all’inizio del test al 70% della membrana totale (si veda Figura 5, curva HYCo “A”). This same enzymatic degradation test was also carried out on the membrane obtained after a cross-linking reaction under more stringent conditions, as described above in Example 5. In both cases the overall duration of the tests was 14 days and the analysis times were were set at 24 hours, 48 hours, 72 hours and 336 hours (14 days). Figure 5 illustrates the results of these tests in the form of a trend over time of the weighted residual percentage value, where the membrane of Example 4 is indicated with HYCo "A" and the membrane of Example 5 with HYCo "B" As can be seen from Figure 5, for the HYCo “A” membrane with a lower degree of crosslinking, after 24 hours the residual percentage of membrane is about 89%; at the end of 48 hours about 33% of the membrane was degraded, and at 72 hours the enzyme had cut about 50% of the total weight. At the end of the enzymatic reaction, after 14 days, the remaining HYCo "A" residue was 35.4%: the Collagenase had therefore reached almost all the collagen present, which at the start of the test amounted to 70% of the total membrane (see Figure 5, HYCo “A” curve).
Diverso invece il risultato ottenuto con le membrane HYCo “B” maggiormente reticolate ottenute come descritto sopra nell’Esempio 5: dopo 24 ore di reazione il peso della membrana era ancora pari al 100% rispetto al peso iniziale; al termine delle 48 ore l’enzima aveva degradato il 5% della membrana e dopo 72 ore il residuo percentuale era ancora pari al 69%. In corrispondenza dell’ultimo punto di analisi a 14 giorni di reazione, era stato tagliato dall’enzima solo la metà circa di tutto il collagene presente: il residuo percentuale di HYCo era infatti pari al 64% (si veda Figura 5, curva HYCo “B”). On the other hand, the result obtained with the more cross-linked HYCo "B" membranes obtained as described above in Example 5 was different: after 24 hours of reaction, the weight of the membrane was still 100% compared to the initial weight; at the end of 48 hours the enzyme had degraded 5% of the membrane and after 72 hours the residual percentage was still 69%. At the last point of analysis at 14 days of reaction, only about half of all collagen present had been cut by the enzyme: the residual percentage of HYCo was in fact equal to 64% (see Figure 5, HYCo curve " B ").
Test di degradazione enzimatica con ialuronidasi di tipo I-S (da testicoli bovini): Frammenti di membrane preparate come descritto sopra nell’Esempio 5, dal peso di circa 50 mg l’una sono state accuratamente pesate (peso iniziale, wO) e poste in fiale da laboratorio in vetro. Ogni frammento è stato poi reidratato con 8 ml di una soluzione (pH 7.2) in tampone salino fosfato di Dulbecco (DPBS) di enzima ialuronidasi di tipo I-S, ottenuto da testicoli bovini. Si sono collocate le fiale alla temperatura di 37°C, alla quale l’enzima è attivo quindi, a specifici e prestabiliti tempi di analisi, la reazione di degradazione è stata bloccata raffreddando le membrane a 4°C per 20 minuti. I residui delle membrane sono stati poi filtrati su una membrana da 8µm, lavati 3 volte con acqua milliQ, congelati a -20°C e liofilizzati. Al termine della liofilizzazione, ogni membrana è ripesata (wT). Le percentuali residue delle membrane sono calcolate tramite la formula: Residuo% = ( wT/wO)*100. Enzymatic degradation test with type I-S hyaluronidase (from bovine testes): Fragments of membranes prepared as described above in Example 5, weighing about 50 mg each, were carefully weighed (initial weight, wO) and placed in vials laboratory glass. Each fragment was then rehydrated with 8 ml of a solution (pH 7.2) in Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) of type I-S hyaluronidase enzyme, obtained from bovine testes. The vials were placed at a temperature of 37 ° C, at which the enzyme is active, therefore, at specific and predetermined analysis times, the degradation reaction was stopped by cooling the membranes at 4 ° C for 20 minutes. Membrane residues were then filtered on an 8µm membrane, washed 3 times with milliQ water, frozen at -20 ° C and freeze-dried. At the end of lyophilization, each membrane is reweighed (wT). The residual percentages of the membranes are calculated using the formula: Residual% = (wT / wO) * 100.
Il test di degradazione enzimatica con Ialuronidasi è stato effettuato su membrane HYCo “B”, preparata come da Esempio 5, per una durata di 14 giorni; i tempi di analisi sono stati 5: a 24 ore, 48 ore, 72 ore, 7 giorni e 14 giorni di reazione. L’esito del test ha dimostrato che nel corso delle due settimane di reazione, circa il 10-11% del peso totale delle membrane viene degradato dall’enzima: la Ialuronidasi raggiunge e taglia un terzo circa di tutto l’acido ialuronico presente (30% della membrana totale) (Figura 6). The enzymatic degradation test with Hyaluronidase was carried out on HYCo “B” membranes, prepared as per Example 5, for a duration of 14 days; the analysis times were 5: 24 hours, 48 hours, 72 hours, 7 days and 14 days of reaction. The result of the test showed that during the two weeks of reaction, about 10-11% of the total weight of the membranes is degraded by the enzyme: the hyaluronidase reaches and cuts about one third of all the hyaluronic acid present (30 % of the total membrane) (Figure 6).
La presente invenzione è stata fin qui descritta con riferimento a una forma preferita di realizzazione. È da intendersi che possano esistere altre forme di realizzazione che afferiscono al medesimo nucleo inventivo, come definito dall’ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate. The present invention has been described up to now with reference to a preferred embodiment. It is to be understood that there may be other embodiments that pertain to the same inventive core, as defined by the scope of the claims set out below.
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| IT102018000005455A IT201800005455A1 (en) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A BIOCOMPATIBLE MATERIAL FOR USE IN SURGERY |
Applications Claiming Priority (1)
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| IT102018000005455A IT201800005455A1 (en) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A BIOCOMPATIBLE MATERIAL FOR USE IN SURGERY |
Publications (1)
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Family
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Family Applications (1)
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| IT102018000005455A IT201800005455A1 (en) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A BIOCOMPATIBLE MATERIAL FOR USE IN SURGERY |
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| IT (1) | IT201800005455A1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006008748A2 (en) * | 2004-07-22 | 2006-01-26 | Prochon Biotech Ltd. | Porous plasma protein matrices and methods for preparation thereof |
| WO2007070617A1 (en) * | 2005-12-14 | 2007-06-21 | Anika Therapeutics, Inc. | Bioabsorbable implant of hyaluronic acid derivative for treatment of osteochondral and chondral defects |
| WO2010084481A1 (en) * | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Royal College Of Surgeons In Ireland | Layered scaffold suitable for osteochondral repair |
-
2018
- 2018-05-17 IT IT102018000005455A patent/IT201800005455A1/en unknown
Patent Citations (3)
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| WO2010084481A1 (en) * | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Royal College Of Surgeons In Ireland | Layered scaffold suitable for osteochondral repair |
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