IT201800004464A1 - Metodo e apparato per la diagnostica delle piante micropropagate - Google Patents

Description

Descrizione

di invenzione industriale avente per titolo:

METODO E APPARATO PER LA DIAGNOSTICA

DELLE PIANTE MICROPROPAGATE

[001] La presente invenzione si riferisce al campo tecnico della coltivazione di piante allevate con la tecnica della micropropagazione. Più particolarmente, l’invenzione riguarda un metodo e un apparato per diagnosticare la vitalità dei germogli micropropagati.

[002] La micropropagazione è una tecnica per replicare il germoplasma iniziale di una pianta madre ed ottenere un numero esteso di cloni della stessa pianta aventi il medesimo patrimonio genetico. Tale tecnica è condotta all’interno di laboratori dove le piante vengono micropropagate mediante la tecnica della coltura in vitro, partendo da tessuti vegetali, ad esempio una porzione della pianta madre.

[003] La tecnica della micropropagazione viene utilizzata per produrre piante arboree, arbustive e ornamentali di alto pregio economico-produttivo.

[004] La micropropagazione si suddivide in quattro fasi principali:

1. Allestimento: si svolge all’interno di un substrato phytogel sterile e con nutrienti e fitormoni specifici. Si parte da un frammento di tessuto vegetale della pianta desiderata avente dimensioni di pochi millimetri.

2. Moltiplicazione o Propagazione: sempre coltivando il germoglio/piantina su substrato phytogel sterile, ma con diverse combinazioni di nutrienti e fitormoni per favorire la replicazione dei germogli. Qui da un germoglio grande pochi millimetri si arriva ad ottenere una plantula di dimensioni pari a qualche centimetro. Questa fase viene ripetuta ciclicamente per ottenere un numero a piacere di germogli geneticamente identici alla pianta madre. Questa fase è il punto cruciale dell’intera tecnica di micropropagazione: i germogli che si sviluppano vengono fisicamente separati in porzioni sotto cappa sterile e le porzioni sono impiantate in nuovi vasetti con phytogel per aumentare esponenzialmente il numero di plantule ottenute. Nella fase ciclica, maggiore è il numero di ripetizioni, più alto è il numero di plantule prodotto.

3. Allungamento e Radicazione: le plantule sono coltivate su un substrato in modo da favorire lo sviluppo delle radici della pianta, che alla fine di questa fase passa da una condizione di eterotrofia ad una condizione di autotrofia.

4. Ambientamento: ultima fase che avviene in vivaio, dove le piante diventano definitivamente autotrofe, pronte alla fine del processo per il trapianto in pieno campo.

[005] Le prime tre fasi sopra descritte avvengono in laboratorio, in condizioni di sterilità, mentre la quarta fase avviene in serra gestita a vivaio di piccole dimensioni.

[006] Ovviamente tutte le piante derivanti dalla medesima pianta madre condividono il suo patrimonio genetico, e in campo assicurano una certa uniformità di prestazioni produttive e resistenza alle condizioni biotiche e abiotiche microclimatiche e pedologiche.

[007] La tecnica della micropropagazione è estremamente costosa perché avviene in laboratorio, ed è totalmente manuale nelle fasi di separazione e impianto dei germogli; tutte le operazioni sono effettuate sotto cappa sterile da personale specializzato.

[008] Il tempo necessario per far sviluppare le piante, le delicate condizioni del substrato e dell’ambiente in cui vengono allevate fanno sì che possano insorgere malformazioni, disomogeneità di sviluppo e contaminazioni fungino-batteriche all’interno dei vasetti delle colture, per cui la qualità e la quantità del materiale vegetale prodotta può subire gravi decurtazioni.

[009] È bene rammentare che le piante fino alla fase 3 della micropropagazione sono eterotrofe, ovvero dipendono totalmente da macro-, micro-nutrienti, zuccheri (che normalmente sono prodotti con il processo fotosintetico, ad es. mannitolo, saccarosio e glucosio) e fitormoni per lo sviluppo di foglie e radici, che sono forniti nel terreno di coltura. Di conseguenza, carenze di tali elementi disciolti nel substrato di crescita determinano carenze fisiologiche riscontrabili esteticamente.

[0010] Anche le condizioni di illuminazione artificiale possono influire sullo sviluppo e sulla salute delle piante micropropagate: carenze o eccessi di luce, oppure uno spettro luminoso errato possono alterare la fisiologia della pianta e dare origine a inestetismi o malformazioni nello sviluppo del germoglio; anche questi sono riscontrabili esteticamente.

[0011] Ad oggi la valutazione della qualità e della sanità delle piante durante l’intero processo della micropropagazione in laboratorio è totalmente a carico dell’operatore manuale e della sua esperienza; tale valutazione viene effettuata valutando l’aspetto estetico della pianta ed è soggettiva, quindi si può avere una grande differenza interindividuo nella valutazione.

[0012] Scopo dell’invenzione è fornire un metodo e un apparato per valutare in modo veloce, oggettivo, ripetibile e documentabile la qualità delle piantine allevate con la tecnica della micropropagazione direttamente all’interno dei vasetti di coltura.

[0013] Questo scopo è ottenuto con un metodo e un’apparecchiatura che hanno le caratteristiche delle rivendicazioni indipendenti. Forme realizzative vantaggiose e affinamenti sono specificati nelle rivendicazioni dipendenti da queste.

[0014] Il metodo secondo la presente invenzione prevede di utilizzare un sistema di diagnostica ottica che permette di standardizzare le condizioni di acquisizione dell’immagine, controllando lo spettro e l’intensità luminosa a cui il campione è sottoposto durante l’acquisizione.

[0015] Sostanzialmente, il metodo è un processo non distruttivo, che prevede di acquisire il campione fotografandolo con condizioni di apertura del diaframma e tempo di esposizione omogenei, mantenendo costanti e note le condizioni di luce esterna con cui vengono illuminati i vasetti.

[0016] La tripletta di valori RGB relativa all’immagine di ciascun vasetto viene poi sottoposta ad un algoritmo di valutazione che elabora i tre valori in indici di qualità del colore GI (Green Index) sulla base dello spazio cromatico RGB (Red Green, Blue) e/o HSI (Hue, Saturation, Intensity) e/o NDVI (Normalized Difference Vegetation Index).

[0017] RGB e HSI sono entrambi sistemi tridimensionali per indicare il tipo di colore. RGB è uno spazio tridimensionale cubico in cui le coordinate Red = 0, Green = 0, Blue = 0 rappresentano il bianco, mentre Red = 255, Green = 255, Blue = 255 rappresentano il nero. HSI è uno spazio tridimensionale conico in cui il colore (Hue) è calcolato in radianti da 0 a 360° sulla circonferenza della base del cono, mentre l’intensità di colore (Intensity) e la saturazione (Saturation) normalizzati da 0 a 1 sono rispettivamente l’altezza e il raggio del cono.

[0018] I valori di H (Hue) e S (Saturation) dello spazio cromatico HSI vengono ottenuti per conversione matematica a partire dai valori RGB mediante la formula indicata in Li et al. A new equation of saturation in RGB-to-HSI conversion for more rapidity of computing. Machine Learning and Cybernetics. 2000; 3: 1493-1497.

[0019] Sulla base dell’esperienza specifica ottenuta su una specifica cultura (ad esempio pesco) il micropropagatore determina quali valori per ciascun vasetto siano nel campo dell’accettabilità e quali valori siano inaccettabili (fase di taratura del metodo per adattarla ad una specifica coltura).

[0020] L’apparato per l’esecuzione del metodo secondo la presente invenzione è un contenitore impervio alla luce esterna, all’interno del quale sono presenti delle sorgenti luminose a spettro luminoso noto (preferibilmente LED) che emettono lunghezze d’onda e intensità di luce predefinite. Tali sorgenti luminose devono essere almeno due, provenienti da posizioni opposte, in modo tale che i coni di luce si sovrappongano per ridurre la presenza di ombre, che inficerebbero la predittività dell’indice. Nella parte superiore del contenitore è disposto un sistema di acquisizione di immagini. In una forma realizzativa preferita, tale sistema è una macchina fotografica reflex, ma è possibile utilizzare anche dei sensori CCD o CMOS opportunamente filtrati.

[0021] Un primo vantaggio della presente invenzione consiste nel valutare rapidamente e oggettivamente la quantità e la qualità delle piante micropropagate all’interno dei vasetti di coltura nella fase di Moltiplicazione o Propagazione; opzionalmente il metodo può essere usato anche nelle fasi tre (Radicazione) e quattro (Ambientamento) della micropropagazione, con accorgimenti diversi.

[0022] Un secondo vantaggio è la valutazione tempestiva della presenza di vasetti contaminati, che possono essere rapidamente scartati dal processo di micropropagazione, prevenendo la propagazione della contaminazione e facendo risparmiare all’operatore umano il tempo necessario per valutazioni e correzioni da apportare al vasetto.

[0023] Un terzo vantaggio della presente invenzione consiste nella possibilità di intervenire nelle condizioni di coltura dei vasetti, ad esempio aggiungendo nutrienti e/o cambiando le condizioni di illuminazione artificiale.

[0024] Un quarto vantaggio della presente invenzione è la sua adattabilità a qualsiasi tipo di coltura si desideri propagare tramite il processo di micropropagazione.

[0025] Ulteriori vantaggi e caratteristiche della presente invenzione sono descritte nella seguente descrizione, in cui forme realizzative esemplificative sono spiegate in dettaglio sulla base dei disegni:

Figura 1 Rappresentazione schematica della micropropagazione, con le sue quattro fasi;

Figura 2 Diagramma di flusso delle fasi del metodo;

Figure 3, 4, 5, 6 Grafici di correlazione qualità delle piante nel vasetto verso indice cromatico; sono mostrati quattro diversi indici cromatici.

Figura 7A, 7B Viste assonometriche di una light box per l’esecuzione del metodo secondo la presente invenzione in versione reale e con alcune pareti rese trasparenti;

Figura 8 Vista laterale di un tunnel per acquisizione automatica delle immagini per l’esecuzione del metodo secondo la presente invenzione.

[0026] La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica delle quattro fasi della micropropagazione come sopra descritte.

[0027] Fase 1 (STEP 1), Allestimento: da una pianta adulta viene prelevata una porzione di tessuto vegetale che viene posta in coltura all’interno di un vasetto sterile (spesso piastra di Petri) fornito di adatti nutrienti e fitormoni.

[0028] Fase 2 (STEP 2), Moltiplicazione o Propagazione: il tessuto vegetale prelevato, posto in condizioni adatte in termini di nutrienti ed illuminazione, dà origine ad un germoglio, cioè ad una pianta non ancora matura ma che presenta diversi tipi di tessuti (radici, fusto, foglie). Questa fase è il punto cruciale dell’intera tecnica di micropropagazione: i germogli che si sviluppano vengono fisicamente separati in porzioni sotto cappa sterile e impiantati in nuovi vasetti con phytogel per aumentare esponenzialmente il numero di plantule ottenute. Tale fase è ciclica, e maggiore è il numero di ripetizioni, più alto è il numero di plantule prodotto.

[0029] Fase 3 (STEP 3), Allungamento e Radicazione: il substrato permette di sviluppare le radici della pianta, che passa gradualmente da una condizione di eterotrofia in cui è completamente dipendente dai nutrienti forniti dall’uomo, ad una condizione di autotrofia, in cui sintetizza le proprie molecole organiche a partire da sostanze inorganiche, utilizzando energia non derivante da sostanze organiche assimilate (cioè l’energia fornita dall’illuminazione artificiale).

[0030] Fase 4 (STEP 4), Ambientamento: qui la giovane pianta autotrofa, ormai in grado di sopravvivere autonomamente, viene spostata in un vivaio, in cui non è più necessario disporre di condizioni sterili. Da qui la pianta verrà poi trapiantata in campo aperto e portata alla condizione di pianta adulta e produttiva.

[0031] La Figura 2 mostra un diagramma di flusso delle fasi del metodo secondo la presente invenzione, le cui fasi sono:

− Inserire il germoglio/piantina 7 contenuto in un adatto vasetto/capsula di Petri 6 all’interno di una light box 1, 11 che permette di illuminarli in condizioni prefissate di illuminazione (lunghezze d’onda e intensità luminosa delle sorgenti di luce), Step 201;

− Acquisire in modo standardizzato (condizioni di apertura del diaframma e tempo di esposizione) l’immagine digitale a colori di un germoglio/piantina che si trova nel processo di micropropagazione, Step 202;

− Sottoporre la tripletta di valori RGB dell’immagine digitale a colori ad un algoritmo che li elabora per ottenere almeno un indice di qualità del colore Green Index, sulla base dello spazio cromatico RGB (Red Green, Blue) e/o HSI (Hue, Saturation, Intensity) e/o NDVI (Normalized Difference Vegetation Index), Step 203;

− Sulla base di una fase di taratura precedentemente effettuata, valutare se il valore di Green Index ottenuto per il singolo vasetto cada nel range dei valori considerati accettabili o nel range dei valori considerati inaccettabili, Step 204; − Qualora il vasetto ottemperi allo standard di qualità stabilito dal produttore, riimmetterlo nel ciclo produttivo, Step 205;

− Qualora il vasetto non ottemperi allo standard di qualità stabilito dal produttore, Step 206, sono possibili due esiti: salvare il vasetto togliendo gli scarti e recuperando i germogli, Step 208, inquadrare nuovamente il vasetto, Step 201, e ri-immetterlo nel ciclo produttivo; oppure scartare definitivamente il vasetto, ritirandolo dal ciclo produttivo, Step 207.

[0032] L’immagine digitale di un singolo vasetto così ottenuta va elaborata considerando la media dei valori R (Red), G (Green), B (Blue) dell’intera immagine, in modo da poter avere una tripletta di valori RGB che rispecchi lo status dell’intero vasetto. Ad esempio, facendo riferimento alla Tabella 1, e al vasetto n. 1 (colonna A) il valore R (colonna C) è 70,2, il valore di G (colonna D) è 95,9, e il valore di B (colonna E) è 36.

[0033] La Tabella 1 è stata ottenuta con una sperimentazione su piante di pesco.

[0034] I valori di R (colonna C), G (colonna D), B (colonna E) sono facilmente ottenibili dal file Raw dell’immagine acquisita dal sistema digitale di acquisizione.

Tabella 1

[0035] I tre valori RGB così ottenuti per ciascun vasetto vengono sottoposti ad un algoritmo di valutazione che ne elabora i parametri in indici di qualità del colore GI (Green Index) elaborati sulla base dello spazio cromatico RGB (Red Green, Blue) e/o HSI (Hue, Saturation, Intensity) e/o NDVI (Normalized Difference Vegetation Index). Nella Tabella 2 sono mostrati alcuni esempi di elaborazione dei tre valori RGB.

Tabella 2

GREEN INDEX GI1 (R-B)/(R+B)

GI2 G/(R+G+B)

GI3 R/(R+G+B)

GI4 G/R

GI5 R+G

GI6 (G-R)/(G+R-B)

GI7 G/(R+G-B)

[0036] Esiste una vasta bibliografia scientifica che ha soppesato l’efficacia di diversi Green Index in contesti legati soprattutto alla correlazione tra il GI e il livello di nutrizione (azoto e ferro) delle piante. Al proposito si possono citare i seguenti articoli:

− Adamsen et al. Crop ecology, production & management; Crop Science 1999;

39: 719-724;

− Daughtry et al. Estimating Corn Leaf Chlorophyll Concentration from Leaf and Canopy Reflectance; Remote Sensing of Environment 2000; 74(2): 229-239; − Mercado-Luna et al. Nitrogen determination on tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seedlings by color image analysis (RGB); African Journal of Biotechnology 2010; 9(33): 5326-5332;

− Yuzhu et al. Nitrogen determination in pepper (Capsicum frutescens L.) plants by color image analysis (RGB); African Journal of Biotechnology 2011; 10(77): 17737-17741.

[0037] Nella Tabella 1, per ciascun vasetto 1-30 sono mostrati i valori ottenuti per ciascun Green Index elaborato (colonne da F a P). In particolare, le colonne da F a N mostrano i valori ottenuti per i Green Index mostrati nella Tabella 2, mentre la colonna O mostra i valori di Hue (H) e la colonna P i valori di Saturation (S).

[0038] Dal momento che non vi è consenso sulla sull’identificazione di una plantula ben sviluppata rispetto al callo prodotti nella fase di Propagazione, per ottenere una stima oggettiva di quanto tessuto vegetale è stato prodotto, si preferisce utilizzare il parametro piante sane (g)/totale (g) espresso in percentuale, come mostrato nella colonna B.

[0039] Ad esempio, il 62% del vasetto n. 1 (colonna B) è così ottenuto:

[0040] Sono state effettuate diverse prove sperimentali per correlare i GI ottenuti nello spazio cromatico RGB e HSI (Figure 3, 4, 5, 6). I grafici mostrati nelle Figure 3, 4, 5, 6 riportano ciascuno i valori di un differente Green Index nell’asse Y, e nell’asse X la percentuale di piante sane ottenuta con la formula mostrata sopra.

[0041] In particolare, nella Tabella 1 sono riportati i valori acquisiti in tutti i parametri cromatici RGB, HSI su un numero significativo di trenta vasetti di pesco. Il valore che ha prodotto la correlazione migliore in questo caso, e quindi l’interpretabilità più efficace dello stato di salute delle piante, è stato il valore di saturazione S (HSI) mostrato nella colonna P, e plottato nella Figura 6.

[0042] Altre correlazioni che sono risultate efficaci nel caso del pesco nel discriminare la salute delle piante allevate nei vasetti sono gli indici GI2 (G/(R+G+B)) mostrato nella Figura 3, GI5 (R+G) mostrato nella Figura 4, e H mostrato nella Figura 5.

[0043] Tuttavia, va specificato che questo metodo diagnostico può essere applicato su altre tipologie di colture che potrebbero mostrare una correlazione migliore adottando altri GI, ad esempio uno di quelli mostrati nella Tabella 2. La scelta del Green Index per un particolare tipo di coltura (ad es. Cucurbitacee, Solanacee) è lasciata alle capacità dell’uomo dell’arte nell’ambito delle sperimentazioni specifiche per ciascun tipo di coltura.

[0044] In particolare, la fase di taratura per la determinazione della correlazione migliore per una specifica coltura viene effettuata utilizzando i grafici mostrati nelle Figure 3, 4, 5, 6, che permettono di correlare il parametro piante sane (g)/totale (g) % con un determinato Green Index. Ogni tipo di coltura presenta una sua migliore correlazione, così come è possibile elaborare altri tipi di Green Index, non specificamente indicati nella presente domanda, per altri tipi di colture.

[0045] Le Figure 7 mostrano una possibile forma realizzativa dell’apparato per eseguire il metodo secondo la presente invenzione. La Figura 7A e la Figura 7B mostrano la medesima light box 1, che nella Figura 7A è mostrata come appare nella realtà, mentre nella Figura 7B due pareti esterne sono state rese trasparenti per meglio illustrarne il funzionamento. Detta light box 1 è sostanzialmente un contenitore a forma di parallelepipedo dotato di cinque pareti (un lato superiore 5 e quattro pareti laterali 4), mentre il fondo è assente. Le pareti e il lato superiore sono impermeabili alla luce: all’interno della light box non illuminata è buio.

[0046] Il lato superiore 5 presenta sulla sua pagina inferiore almeno due sorgenti 2 di luce, disposte in modo da emettere coni luminosi che si sovrappongano almeno parzialmente all’interno della light box stessa, al fine di evitare di generare ombre. Il lato superiore 5 presenta inoltre un dispositivo 3 in grado di acquisire immagini digitali con condizioni di apertura del diaframma e tempo di esposizione omogenei, mantenendo costanti e note le condizioni di luce esterna con cui un vasetto 6 viene illuminato. Nella forma realizzativa preferita mostrata nelle Figure 7, il dispositivo 3 di acquisizione immagini è una macchina fotografica digitale reflex. In altre forme realizzative il dispositivo potrebbe essere ad esempio un sensore CCD oppure CMOS opportunamente filtrato o altri dispositivi analoghi, purché in grado di acquisire immagini colorate del visibile.

[0047] Operativamente, si appoggia il vasetto 6 da esaminare su un piano, e sopra il vasetto da valutare viene appoggiata a campana la light box 1, in modo che la piantina si trovi all’interno della light box 1; dopo di che il vasetto 6 contenente la piantina 7 viene illuminato in modo opportuno dalle sorgenti di luce 2 e la piantina 7 stessa viene fotografata digitalmente tramite il dispositivo di acquisizione 3.

[0048] Utilizzando la light box 1, è evidente che il metodo di acquisizione è totalmente manuale e viene effettuato da un operatore del laboratorio di micropropagazione.

[0049] In una forma realizzativa alternativa, mostrata nella Figura 8, il sistema di acquisizione delle immagini è adattato per renderlo più idoneo ad una situazione industriale. In questo caso la light box 11 è prevista nella forma di un tunnel provvisto di un dispositivo 3 di acquisizione delle immagini avente le caratteristiche sopra definite, al cui interno scorrono i vasetti 6 trasportati da un sistema di trasporto automatizzato, ad esempio su un trasportatore 8 a nastro chiuso. Ovviamente la light box 11 è congegnata in modo da permettere di non risentire delle condizioni esterne di illuminazione.

[0050] Utilizzando la light box 11, il metodo può essere utilizzato per valutare anche decine di migliaia di vasetti della medesima coltura, ed evidentemente tutto il processo di acquisizione viene automatizzato. In questo caso, deve essere previsto un dispositivo (ad esempio un Personal Computer) che registri il numero del vasetto acquisito insieme alla tripletta di valori RGB acquisiti e che applichi automaticamente l’elaborazione di detti parametri per ottenere il Green Index precedentemente stabilito nella fase di taratura come il più efficace per quello specifico tipo di coltura. Ad esempio, è stato sperimentalmente verificato che per basilico, lattuga, menta, cetriolo e fragole i Green Index maggiormente predittivi sono G/(R+G+B), H e S con R<2 >(coefficiente di determinazione) rispettivamente superiori a 0,65 - 0,75 - 0,68.

[0051] Questo metodo è in fase di validazione anche per piante di pomodoro utilizzate in colture fuori suolo in serre di ultima tecnologia, al fine di garantire il trapianto di piante sane e potenzialmente altamente produttive (fase di Ambientamento in vivaio).

[0052] La luce emessa dalle sorgenti luminose 2 è preferibilmente una luce bianca e fredda. Il termine temperatura di colore è utilizzato in illuminotecnica, in fotografia e in altre discipline correlate per quantificare la tonalità della luce. Si misura in kelvin (K). Una temperatura intorno ai 2.000 K corrisponde al colore arancione. A valori di temperatura inferiori corrispondono il rosso e, ancora più in basso, l'infrarosso, non più visibile, mentre in ordine crescente la luce è dapprima bianca, quindi azzurra, violetta e ultravioletta. Controintuitivamente, la luce definita “calda” nell'uso comune (ovvero con tonalità tendenti al rosso-giallo) ha in realtà una temperatura di colore pari a circa 2.000 – 3.000 kelvin, mentre a quella definita “fredda” (tendente all'azzurro chiaro-bianco) ha una temperatura di colore tra i 4.000 e i 6.500 kelvin.

1 light box

2 sorgente luminosa

3 dispositivo di acquisizione immagini

4 pareti laterali

5 parete superiore

6 vasetto/piastra Petri

7 piantina micropropagata

8 convogliatore

11 light box automatizzato

Claims (11)

1. Rivendicazioni 1) Metodo diagnostico per valutare la qualità di piante micropropagate (7) facente uso di almeno un Green Index ottenuto tramite l’elaborazione dei valori di rosso (R), verde (G) e blu (B) dell’immagine di una singola pianta caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: a) Opzionalmente, stabilire tramite una fase di taratura quale sia il valore di Green Index più predittivo per la specifica coltura che si desidera indagare, e quali siano i limiti di accettabilità del valore di Green Index del singolo vasetto; b) Proiettare fasci luminosi predeterminati in termini di lunghezza d’onda e intensità luminosa delle sorgenti di luce (2) configurando detti fasci luminosi in modo da impedire la formazione di ombre, preferibilmente inserendo un germoglio/piantina (7) sottoposto al procedimento di micropropagazione contenuto in un adatto vasetto/capsula di Petri (6) all’interno di una light box (1, 11) che permette di illuminarli in condizioni prefissate di illuminazione in termini di lunghezze d’onda e intensità luminosa delle sorgenti (2) di luce (Step 201); c) Acquisire in modo standardizzato in termini di condizioni di apertura del diaframma e tempo di esposizione una immagine digitale a colori di un germoglio/piantina (7) che si trova nel processo di micropropagazione; detta immagine dispone di una tripletta di valori di RGB (Step 202); d) Sottoporre la tripletta di valori RGB dell’immagine digitale così acquisita ad un algoritmo che la elabora in indici di qualità del colore Green Index, sulla base dello spazio cromatico RGB (Red Green, Blue) e/o HSI (Hue, Saturation, Intensity) e/o NDVI (Normalized Difference Vegetation Index) (Step 203); e) Valutare se il Green Index del singolo vasetto cada nel range di accettabilità per quella specifica coltura stabilito nella fase di taratura (Step 204).
2. 2) Metodo diagnostico per valutare la qualità di piante micropropagate (7) secondo la rivendicazione 1, ulteriormente comprendente le seguenti fasi: − Qualora il vasetto (6) ottemperi allo standard di qualità stabilito dal produttore, ri-immetterlo nel ciclo produttivo (Step 205); − Qualora il vasetto (6) non ottemperi allo standard di qualità stabilito dal produttore (Step 206), sono possibili due esiti: salvare il detto vasetto togliendo gli scarti e recuperando i germogli (Step 208) sottoponendo il detto vasetto (6) nuovamente ai passi da b) a e), e ri-immetterndolo nel ciclo produttivo qualora alla seconda osservazione vengano rispettati i suddetti standard di qualità; oppure scartare definitivamente il vasetto, ritirandolo dal ciclo produttivo (Step 207).
3. 3) Metodo diagnostico per valutare la qualità di piante micropropagate (7) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l’immagine digitale di un singolo vasetto così ottenuta è elaborata considerando la media dei valori R (Red), G (Green), B (Blue) dell’intera immagine, in modo da ottenere una tripletta di valori di RGB che rispecchino lo status dell’intero vasetto.
4. 4) Metodo diagnostico per valutare la qualità di piante micropropagate (7) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, in cui l’algoritmo di elaborazione dei valori RGB ottenuti per ciascun vasetto (6) è scelto nel gruppo consistente dei seguenti metodi di calcolo: − GI1 (R-B)/(R+B) − GI2 G/(R+G+B) − GI3 R/(R+G+B) − GI4 G/R − GI5 R+G − GI6 (G-R)/(G+R-B) − GI7 G/(R+G-B) − H Hue − S Saturation in cui le variabili RGB corrispondono ai valori rilevati per le componenti di colore R=Red, G=Green, B= Blue, mentre le variabili H e S fanno parte dello spazio colorimetrico denominato HSI.
5. 5) Metodo diagnostico per valutare la qualità di piante micropropagate (7) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase opzionale di taratura per una nuova coltura da valutare è effettuata plottando nell’asse Y di un grafico cartesiano bidimensionale il Green Index e nell’asse X la percentuale di piante sane per un numero significativo di vasetti da valutare, tale percentuale di piante sane essendo valutata secondo la formula:
6. 6) Metodo diagnostico per valutare la qualità di piante micropropagate (7) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, per uso in tutte le fasi: STEP 1 Allestimento, STEP 2 Moltiplicazione o Propagazione, STEP 3 Allungamento e Radicazione, STEP 4 Ambientamento della micropropagazione, preferibilmente nello STEP 2 Moltiplicazione o Propagazione.
7. 7) Apparato (1, 11) per l’esecuzione del metodo secondo le rivendicazioni da 1 a 6, caratterizzato dal fatto di comprendere una light box (1) costituita da una cassa impermeabile alla luce esterna, comprendente almeno due sorgenti luminose (2) che emettono coni sovrapposti di luce con caratteristiche prestabilite e fisse in termini di lunghezze d’onda e intensità luminosa, i quali sono orientati in modo da illuminare il vasetto (6) da sottoporre a diagnosi collocato all’interno della light box (1); ulteriormente comprendente un sistema (3) di acquisizione digitale di immagini a colori, in cui i parametri di acquisizione in termini di condizioni di apertura del diaframma e tempo di esposizione sono settati in modo prestabilito e fisso; ed una unità di processamento delle immagini a colori acquisite per la determinazione dei valori RGB e/o HSI dalle dette immagini e per il calcolo di un parametro diagnostico sulla base dei detti valori RGB e/o HSI.
8. 8) Apparato (1, 11) secondo la rivendicazione 7, comprendente ulteriormente una interfaccia di immissione di almeno una soglia per un parametro diagnostico prestabilito per almeno un tipo di coltura; una unità di processamento configurata per eseguire il calcolo del valore effettivo del detto parametro diagnostico effettivo in funzione dei valori dei parametri RGB o HSI determinati in base alle immagini acquisite con valori prestabiliti; un comparatore per comparare il valore effettivo calcolato del detto parametro diagnostico con detta soglia; un segnalatore del risultato della detta comparazione; e/o opzionalmente un organo di prelievo del vasetto dalla linea di produzione e di alimentazione ad una linea di scarto o di pulitura quando il valore del detto parametro diagnostico è maggiore o minore del detto valore di soglia.
9. 9) Apparato (11) per l’esecuzione del metodo secondo la rivendicazione 7 o 8, in combinazione con un sistema di trasporto automatico (8) dei vasetti (6) da diagnosticare e con un sistema di salvataggio automatico del numero di identificazione del vasetto (6) acquisito e dei valori RGB ad esso relativi, in modo da acquisire in modo automatico grandi quantità di vasetti.
10. 10) Apparato per l’esecuzione del metodo secondo una o più delle rivendicazioni da 7 a 9, in cui il detto sistema (3) di acquisizione digitale di immagini a colori è una macchina fotografica digitale reflex, oppure un sensore CCD oppure CMOS opportunamente filtrati.
11. 11) Apparato per l’esecuzione del metodo secondo una o più delle rivendicazioni 7-10, in cui le sorgenti luminose (2) per l’illuminazione del vasetto (6) da diagnosticare sono dei LED che emettono luce bianca, preferibilmente fredda.