IT201800004359A1 - IDENTIFICATION OF MUSCLE miRNAs AS BIOMARCATORS AND CO-ADJUVANT TREATMENT FOR SPINAL MUSCULAR ATROPHY - Google Patents
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Description
- 1 - SIB BI5210R - 1 - SIB BI5210R
"IDENTIFICAZIONE DI miRNA MUSCOLARI COME BIOMARCATORI E "IDENTIFICATION OF MUSCLE miRNAs AS BIOMARCATORS E
TRATTAMENTO CO-ADIUVANTE PER L’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE" CO-ADJUVANT TREATMENT FOR SPINAL MUSCULAR ATROPHY "
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione riguarda inibitori specifici di microRNA umani, per uso nel 5 trattamento dell’atrofia muscolare spinale (SMA) e composizioni farmaceutiche che li comprendano. La presente invenzione riguarda anche l’identificazione di marcatori con elevata sensibilità e specificità per la prognosi della SMA, metodi prognostici che comprendono l’uso di tali marcatori e kit prognostici per rivelare tali marcatori. The present invention relates to specific human microRNA inhibitors, for use in the treatment of spinal muscular atrophy (SMA) and pharmaceutical compositions including them. The present invention also relates to the identification of markers with high sensitivity and specificity for the prognosis of SMA, prognostic methods that include the use of such markers and prognostic kits to detect such markers.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE STATE OF THE PRIOR ART
10 L’atrofia muscolare spinale (SMA) è una condizione rara, geneticamente determinata, a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata da paralisi muscolare progressiva da perdita dei motoneuroni spinali. In base alla gravità clinica (all’età di esordio e alla massima acquisizione motoria) la SMA viene classificata in 3 forme infantili (SMA I-III). Il gene responsabile di tutte le forme di SMA è localizzato in 5q13 ed è 15 denominato SMN1 (Survival of Motor Neuron 1). Il gene SMN1 è assente in omozigosi nel 95-97% dei pazienti SMA. Nella stessa regione è presente un gene ipormorfo di SMN1, SMN2. I due geni sono altamente omologhi e codificano per la stessa proteina (SMN) ma a causa dello splicing alternativo dell’esone 7, i geni SMN2 producono prevalentemente un’isoforma proteica priva di questo esone che viene rapidamente 20 degradata. 10 Spinal muscular atrophy (SMA) is a rare, genetically determined condition with an autosomal recessive inheritance, characterized by progressive muscle paralysis from loss of spinal motor neurons. Based on clinical severity (at the age of onset and at maximum motor acquisition), SMA is classified into 3 infantile forms (SMA I-III). The gene responsible for all forms of SMA is located in 5q13 and is 15 called SMN1 (Survival of Motor Neuron 1). The SMN1 gene is absent in homozygosity in 95-97% of SMA patients. In the same region there is a hypormorphic gene of SMN1, SMN2. The two genes are highly homologous and code for the same protein (SMN) but due to the alternative splicing of exon 7, the SMN2 genes mainly produce a protein isoform devoid of this exon which is rapidly degraded 20.
La SMA è caratterizzata da paralisi muscolare progressiva dovuta alla degenerazione degli alfa-motoneuroni del midollo spinale. Il ruolo del muscolo scheletrico nella fisiopatologia della condizione è tuttora controverso, sebbene vi siano diverse evidenze sperimentali a supporto di un ruolo patogenetico attivo (Braun et al., 25 1995; Guettier-Sigrist et al., 2002; Chan et al., 2003; Arnold et al., 2004; Kariya et al., 2008; Walker et al., 2008; Bricceno et al., 2014). In base all’età di esordio e alla massima acquisizione motoria, sono generalmente identificate 3 forme di SMA con esordio in età infantile: la SMA I, o malattia di Werdning-Hoffmann, ha esordio entro i 6 mesi, i bambini affetti non acquisiscono la posizione seduta; la SMA II o malattia di Dubowitz ha età 30 d’esordio <18 mesi, i pazienti non acquisiscono la deambulazione autonoma; l’esordio - 2 - SIB BI5210R SMA is characterized by progressive muscle paralysis due to the degeneration of alpha-motor neurons in the spinal cord. The role of skeletal muscle in the pathophysiology of the condition is still controversial, although there is several experimental evidence supporting an active pathogenetic role (Braun et al., 25 1995; Guettier-Sigrist et al., 2002; Chan et al., 2003 ; Arnold et al., 2004; Kariya et al., 2008; Walker et al., 2008; Bricceno et al., 2014). Based on age of onset and maximal motor acquisition, 3 forms of SMA with onset in childhood are generally identified: SMA I, or Werdning-Hoffmann disease, onset within 6 months, affected children do not acquire sitting position; SMA II or Dubowitz disease has an onset age of <18 months, patients do not acquire autonomous walking; the debut - 2 - SIB BI5210R
della SMA III è >18 mesi, le acquisizioni motorie avvengono nella norma, tuttavia i pazienti possono perdere la deambulazione ad età variabile (D’Amico et al., 2011). of SMA III is> 18 months, motor acquisitions occur within the norm, however patients may lose walking at varying ages (D'Amico et al., 2011).
La maggior parte degli approcci terapeutici in corso di sperimentazione hanno come obiettivo l’incremento dei livelli di proteina SMN prodotta dai geni SMN2. Tra 5 questi, Nusinersen (Spinraza®, Biogen) è stato recentemente registrato da EMA e FDA, e si basa su oligonucleotidi antisenso (ASO) che riducono lo splicing alternativo dell’esone 7. Most of the therapeutic approaches being tested are aimed at increasing the levels of SMN protein produced by SMN2 genes. Among these, Nusinersen (Spinraza®, Biogen) was recently registered by the EMA and the FDA, and is based on antisense oligonucleotides (ASOs) that reduce the alternative splicing of exon 7.
Non sono ancora noti gli effetti a lungo termine del trattamento, visto il follow-up ancora limitato nel tempo. Tuttavia, ciò che al momento emerge in maniera chiara è che 10 il trattamento con Nusinersen consente un netto miglioramento clinico dei pazienti, ma non la totale reversione del fenotipo (Finkel et al., 2017; Mercuri et al., 2018). Le possibili ragioni del non completo successo terapeutico possono essere molteplici: 1) il trattamento potrebbe non consentire di raggiungere livelli terapeutici di SMN nel sistema nervoso centrale; 2) il solo rescue di SMN a livello centrale potrebbe non essere 15 sufficiente al recupero totale del fenotipo, dal momento che il muscolo scheletrico e gli altri tessuti periferici non sono raggiunti dal farmaco; 3) potrebbe esistere una cosiddetta finestra terapeutica, al di fuori della quale il trattamento consente di ottenere effetti limitati. A sostegno di quest’ultima ipotesi vi sono i dati dello studio Nurture condotto da Biogen (EudraCT Number: 2014-002098-12), non ancora pubblicati; i risultati dell’analisi 20 ad interim sono stati presentati nel corso dell’ultimo congresso della World Muscle Society, nel 2017 (Hwu et al., 2017). In questo studio, bambini con presunta SMA I, identificati mediante screening prenatale o in quanto gravidanze successive di famiglie con un precedente figlio affetto da SMA I, sono stati trattati in fase pre-sintomatica. Ciò che emerge in maniera piuttosto evidente è che quanto più precocemente venga iniziato 25 il trattamento, tanto migliore è l’outcome terapeutico atteso. Da notare che anche in modelli pre-clinici di SMA, la somministrazione degli ASO migliora, ma non reverte il fenotipo (Passini et al., 2011). The long-term effects of the treatment are not yet known, given the time-limited follow-up. However, what emerges clearly at the moment is that 10 treatment with Nusinersen allows a marked clinical improvement of patients, but not the total reversion of the phenotype (Finkel et al., 2017; Mercuri et al., 2018). The possible reasons for the incomplete therapeutic success can be many: 1) the treatment may not allow to reach therapeutic levels of NMS in the central nervous system; 2) central SMN rescue alone may not be sufficient for total recovery of the phenotype, since skeletal muscle and other peripheral tissues are not reached by the drug; 3) there could be a so-called therapeutic window, outside of which the treatment allows to obtain limited effects. In support of the latter hypothesis, there are data from the Nurture study conducted by Biogen (EudraCT Number: 2014-002098-12), not yet published; the results of the interim analysis 20 were presented during the last congress of the World Muscle Society, in 2017 (Hwu et al., 2017). In this study, children with presumptive SMA I, identified by prenatal screening or as successive pregnancies of families with a previous child with SMA I, were treated in the pre-symptomatic phase. What emerges quite clearly is that the earlier the treatment is started 25, the better the expected therapeutic outcome. It should be noted that even in pre-clinical models of SMA, the administration of ASOs improves, but does not reverse the phenotype (Passini et al., 2011).
In parallelo all’identificazione di approcci terapeutici efficaci, parte della comunità scientifica si è dedicata all’identificazione di biomarcatori per la SMA, sia prognostici che 30 predittivi. Essendo SMN2 il principale modificatore della gravità fenotipica a tutt’oggi - 3 - SIB BI5210R In parallel with the identification of effective therapeutic approaches, part of the scientific community has dedicated itself to the identification of biomarkers for SMA, both prognostic and 30 predictive. SMN2 being the main modifier of phenotypic severity to date - 3 - SIB BI5210R
noto, il primo biomarcatore identificato è stato la determinazione del numero di copie di SMN2 (Feldkotter et al., 2002; Tiziano et al., 2007; Crawford et al., 2012): l’identificazione di due copie di SMN2 è fortemente predittiva di un fenotipo grave, essendovi circa l’80% di probabilità di una SMA I. Il potere predittivo dell’identificazione 5 di 3 copie di SMN2 è notevolmente più limitato, poiché si osservano nel 60% circa delle SMA II e nel 50% delle SMA III. Il riscontro di 4 copie di SMN2 è predittivo di un fenotipo più lieve (Crawford et al., 2012). known, the first biomarker identified was the determination of the number of copies of SMN2 (Feldkotter et al., 2002; Tiziano et al., 2007; Crawford et al., 2012): the identification of two copies of SMN2 is strongly predictive of a severe phenotype, there being about 80% probability of SMA I. The predictive power of identifying 5 of 3 copies of SMN2 is considerably more limited, as they are observed in about 60% of SMA II and 50% of SMA III. The finding of 4 copies of SMN2 is predictive of a milder phenotype (Crawford et al., 2012).
La determinazione dei livelli di prodotti di SMN2 (trascritti e/o proteina) in campioni di sangue periferico di pazienti e controlli è stato uno dei potenziali biomarcatori 10 per la SMA maggiormente esplorati: mentre i livelli di proteina non correlano con la gravità fenotipica (Kobayashi et al., 2011; Kobayashi et al., 2012; Tiziano et al., 2013), i livelli di trascritti SMN2-fl sono il biomarcatore che meglio predice la gravità della SMA (Tiziano et al., 2010a; Tiziano et al., 2010b; Tiziano et al., 2013; brevetto no: RM2008A000270). Determining the levels of SMN2 products (transcripts and / or protein) in peripheral blood samples from patients and controls has been one of the 10 most explored potential biomarkers for SMA: while protein levels do not correlate with phenotypic severity (Kobayashi et al., 2011; Kobayashi et al., 2012; Tiziano et al., 2013), SMN2-fl transcript levels are the biomarker that best predicts SMA severity (Tiziano et al., 2010a; Tiziano et al. , 2010b; Tiziano et al., 2013; patent no: RM2008A000270).
15 Per quel che riguarda l’identificazione di biomarcatori indipendenti dai prodotti dei geni SMN2, in un unico studio pubblicato (Kobayashi et al., 2013) sono stati analizzati sieri di controlli e pazienti affetti da forme di gravità diversa: sono stati identificati mediante immunoassay 12 analiti significativamente correlati con la funzione motoria dei pazienti. Tuttavia tali analiti non sono stati successivamente validati in studi clinici 20 interventistici. 15 As regards the identification of biomarkers independent of SMN2 gene products, in a single published study (Kobayashi et al., 2013) sera from controls and patients affected by forms of different severity were analyzed: they were identified by immunoassay 12 analytes significantly correlated with patient motor function. However, these analytes were not subsequently validated in interventional clinical trials 20.
Scopo della presente invenzione è quello di fornire biomarcatori prognostici dell’atrofia muscolare spinale (SMA) e nuovi composti utili nella prevenzione e/o trattamento di questa patologia. The purpose of the present invention is to provide prognostic biomarkers of spinal muscular atrophy (SMA) and new compounds useful in the prevention and / or treatment of this pathology.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION
25 La presente invenzione si basa sulla sperimentazione scientifica riportata negli esempi. Gli autori hanno identificato miRNA deregolati nei pazienti affetti da SMA, in particolare hanno identificato tre miRNA (HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e HSA-miR451a) sovra-espressi nei pazienti affetti da SMA che mostrano una correlazione con la gravità della condizione. Inoltre hanno scoperto che inibitori del microRNA miR181, in - 4 - SIB BI5210R 25 The present invention is based on the scientific experimentation reported in the examples. The authors identified deregulated miRNAs in SMA patients, specifically they identified three miRNAs (HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p, and HSA-miR451a) over-expressed in SMA patients that show a correlation with severity of the condition. They also found that miR181 microRNA inhibitors, in - 4 - SIB BI5210R
particolare inibitori del HSA-miR181a-5p determinano un incremento della sopravvivenza di topi affetti da SMA. particular inhibitors of HSA-miR181a-5p determine an increase in the survival of mice affected by SMA.
Un primo oggetto della presente invenzione è un inibitore del microRNA miR181, in particolare del microRNA HSA-miR181a-5p, per uso nella prevenzione e/o trattamento 5 dell’atrofia muscolare spinale (SMA), in cui detto microRNA HSA-miR181a-5p ha SEQ ID NO 1 e numero d’accesso miRbase MIMAT0000256. A first object of the present invention is an inhibitor of the microRNA miR181, in particular of the microRNA HSA-miR181a-5p, for use in the prevention and / or treatment 5 of spinal muscular atrophy (SMA), in which said microRNA HSA-miR181a-5p has SEQ ID NO 1 and miRbase access number MIMAT0000256.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è una composizione farmaceutica comprendente come agente farmacologicamente attivo un inibitore del microRNA HSA-miR181a-5p e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile. A further object of the present invention is a pharmaceutical composition comprising as a pharmacologically active agent an inhibitor of the microRNA HSA-miR181a-5p and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
10 Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un Kit per la somministrazione simultanea, separata o sequenziale di un inibitore del microRNA miR181 HSA-miR181a-5p e uno o più dei seguenti composti Nusinersen, inibitore del microRNA HSA-miR324-5p, inibitore del microRNA HSA-miR451a. 10 A further object of the present invention is a Kit for the simultaneous, separate or sequential administration of an inhibitor of the microRNA miR181 HSA-miR181a-5p and one or more of the following compounds Nusinersen, inhibitor of the microRNA HSA-miR324-5p, inhibitor of the microRNA HSA-miR451a.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un metodo in vitro per valutare 15 la prognosi dell’atrofia muscolare spinale (SMA) in un soggetto, comprendente: A further object of the present invention is an in vitro method to evaluate 15 the prognosis of spinal muscular atrophy (SMA) in a subject, comprising:
a. determinare il livello dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e/o HSA-miR451a in un campione biologico di detto soggetto; to. determining the level of the microRNAs HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and / or HSA-miR451a in a biological sample of said subject;
b. confrontare il livello di detti micro RNA nel campione di detto soggetto con i livelli di controllo e opzionalmente b. comparing the level of said micro RNAs in the sample of said subject with the control levels and optionally
20 c. (i) identificare il soggetto come affetto dall’atrofia muscolare spinale quando i livelli dei microRNA nel campione del soggetto sono aumentati rispetto a quelli di controllo o (ii) identificare il soggetto come non affetto dall’atrofia muscolare spinale quando i livelli dei microRNA nel campione del soggetto non sono aumentati. 20 c. (i) identify the subject as having spinal muscular atrophy when the microRNA levels in the subject sample are increased relative to those of the control or (ii) identify the subject as not suffering from spinal muscular atrophy when the microRNA levels in the subject sample did not increase.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un metodo per monitorare lo 25 sviluppo dell’atrofia muscolare spinale in un soggetto, comprendente: A further object of the present invention is a method for monitoring the development of spinal muscular atrophy in a subject, comprising:
a. determinare il livello dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e/o HSA-miR451a in due o più campioni biologici di detto soggetto, in cui i campioni sono stati ottenuti a punti di tempo distanziati, e to. determine the level of HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and / or HSA-miR451a microRNAs in two or more biological samples from that subject, in which the samples were obtained at spaced time points, and
b. confrontare i livelli di microRNA tra i campioni biologici ottenuti in precedenza e quelli 30 ottenuti successivamente. b. compare the levels of microRNA between the biological samples obtained previously and those 30 obtained subsequently.
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Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un metodo per monitorare l'efficacia di un trattamento dell’atrofia muscolare spinale in un soggetto, comprendente: a. determinare il livello dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e/o HSA-miR451a in un campione biologico di detto soggetto ottenuto prima dell'inizio del 5 trattamento, in particolare singoli e/o sommati; A further object of the present invention is a method for monitoring the effectiveness of a spinal muscular atrophy treatment in a subject, comprising: a. determining the level of the microRNAs HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and / or HSA-miR451a in a biological sample of said subject obtained before starting the 5 treatment, in particular single and / or summed;
b. determinare il livello dei microRNA in uno o più campioni biologici di detto soggetto ottenuti nel corso o dopo il trattamento, in particolare singoli e/o sommati, e b. determine the level of microRNAs in one or more biological samples of said subject obtained during or after treatment, in particular single and / or summed, and
c. confrontare il livello dei singoli microRNA e/o della loro somma determinati nei passaggi (a) e (b), e facoltativamente tra diversi campioni nel passaggio (b). c. compare the level of individual microRNAs and / or their sum determined in steps (a) and (b), and optionally between different samples in step (b).
10 DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE 10 DETAILED DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1: Heatmap relativa all’analisi del miRnoma di biopsie muscolari di pazienti e controlli. Il grafico mostra l’espressione differenziale dei miRNA deregolati nelle biopsie muscolari. Le bande in blu indicano i miRNA down-regolati, mentre quelle in giallo si riferiscono ai miRNA up-regolati. L’heatmap mostra che i gruppi analizzati generano due 15 cluster distinti (CTRL vs SMA). Figure 1: Heatmap relating to the analysis of the miRnoma of muscle biopsies of patients and controls. The graph shows the differential expression of deregulated miRNAs in muscle biopsies. Bands in blue indicate down-regulated miRNAs, while bands in yellow refer to up-regulated miRNAs. The heatmap shows that the analyzed groups generate two 15 distinct clusters (CTRL vs SMA).
Figura 2: miRNA deregolati nel siero di pazienti SMA, emersi da una prima validazione eseguita tramite qRT-PCR relativa su 10 campioni SMA e 10 controlli (*α≤0.05). Figure 2: miRNAs deregulated in the serum of SMA patients, emerged from a first validation performed by relative qRT-PCR on 10 SMA samples and 10 controls (* α≤0.05).
Figura 3: Grafici di correlazione tra i livelli di espressione dei miR-181a-5p, 324-20 5p e 451a e tipo di SMA. Il boxplot mostra il numero di molecole/µl siero rilevato per i miR-181a-5p (a), miR-324-5p (b) e miR-451a (c) in correlazione al tipo di SMA (I, II, III) (*P≤0.05). Figure 3: Correlation graphs between miR-181a-5p, 324-20 5p and 451a expression levels and SMA type. The boxplot shows the number of molecules / µl serum detected for miR-181a-5p (a), miR-324-5p (b) and miR-451a (c) in correlation to the type of SMA (I, II, III) (* P≤0.05).
Figura 4: Potere predittivo dei miR-181a-5p, miR-324-5p e miR-451a nel discriminare pazienti SMA da controlli. I grafici mostrano (a) le ROC curves di ciascun 25 miRNA analizzato singolarmente; (b) la ROC curve relativa alla somma dei 3 miRNA. Figure 4: Predictive power of miR-181a-5p, miR-324-5p and miR-451a in discriminating SMA patients from controls. The graphs show (a) the curved ROCs of each 25 miRNA analyzed individually; (b) the ROC curve relating to the sum of the 3 miRNAs.
Figura 5: Curve di sopravvivenza dei topi SMA-Δ7 trattati con singola iniezione intratecale di anti-miR-181a-5p o anti-miR-324-5p. I topi affetti sono stati trattati il giorno dopo la nascita con 0.5 nM di antagomir, di controllo negativo o non hanno subito trattamento. Dai dati ottenuti emerge che l’anti-miR-181a-5p induce un aumento 30 statisticamente significativo della sopravvivenza dei topi affetti. Figure 5: Survival curves of SMA-Δ7 mice treated with single intrathecal injection of anti-miR-181a-5p or anti-miR-324-5p. Affected mice were treated the day after birth with 0.5 nM antagomir, negative control or did not undergo treatment. From the data obtained, it emerges that anti-miR-181a-5p induces a statistically significant 30 increase in the survival of affected mice.
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Figura 6: Effetto del trattamento con i Mimic dei mir-181a-5p e miR-324-5p in cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y. Entrambi i miR sono quasi indosabili in condizioni basali (scramble). La transfezione transiente dei Mimic determina un incremento marcato dei livelli dei singoli miR. Tuttavia, i livelli di trascritti dei geni SMN1 5 e SMN2 rimangono invariati. Solo nel caso del miR-324-5p si osserva una riduzione dei livelli dell’isoforma SMN-del7, il cui significato biologico rimane sconosciuto. Figure 6: Effect of Mimic treatment of mir-181a-5p and miR-324-5p in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Both miRs are nearly wearable under basal conditions (scramble). Transient transfection of Mimics results in a marked increase in the levels of individual miRs. However, the transcript levels of SMN1 5 and SMN2 genes remain unchanged. Only in the case of miR-324-5p is there a reduction in the levels of the SMN-del7 isoform, whose biological significance remains unknown.
GLOSSARIO GLOSSARY
MicroRNA (miRNA o miR): sono una sottoclasse endogena di piccoli RNA non codificanti costituita da acidi ribonucleici a singolo filamento, lunghi solitamente 21-22 nucleotidi, 10 che hanno la capacità di legare specifiche sequenze di RNA messaggero inibendone la successiva traduzione in proteina. La loro presenza garantisce un fine meccanismo di regolazione dell’espressione proteica sia in condizioni normali o patologiche. MicroRNAs (miRNA or miR): they are an endogenous subclass of small non-coding RNAs made up of single-stranded ribonucleic acids, usually 21-22 nucleotides long, 10 which have the ability to bind specific sequences of messenger RNA, inhibiting their subsequent translation into protein. Their presence guarantees a fine regulation mechanism of protein expression both in normal or pathological conditions.
Inibitore di microRNA: (indicato nel presente testo anche come anti miRNA) oligonucleotide modificato, complementare a uno specifico miRNA; quando miRNA e 15 anti-miRNA si legano, la funzione endogena del micro-RNA viene abolita. MicroRNA inhibitor: (also referred to in this text as anti miRNA) modified oligonucleotide, complementary to a specific miRNA; when miRNA and 15 anti-miRNA bind, the endogenous function of the micro-RNA is abolished.
SMA: atrofia muscolare spinale, malattia autosomica recessiva neurodegenerativa SMN: survival of motor neuron, proteina essenziale per la sopravvivenza e funzione dei motoneuroni spinali SMA: spinal muscular atrophy, autosomal recessive neurodegenerative disease SMN: survival of motor neuron, protein essential for the survival and function of spinal motor neurons
NGS: next generation sequencing, sequenziamento parallelo massivo di molecole di 20 DNA. NGS: next generation sequencing, massive parallel sequencing of 20 DNA molecules.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invenzione riguarda quindi inibitori del microRNA miR181, in particolare del microRNA miR181HSA-miR181a-5p per uso nella prevenzione e/o trattamento dell’atrofia muscolare spinale (SMA), in cui detto microRNA HSA-miR181a-25 5p ha SEQ ID NO 1 e numero d’accesso miRbase MIMAT0000256. The present invention therefore relates to inhibitors of the miR181 microRNA, in particular of the miR181HSA-miR181a-5p microRNA for use in the prevention and / or treatment of spinal muscular atrophy (SMA), in which said microRNA HSA-miR181a-25 5p has SEQ ID NO 1 and miRbase access number MIMAT0000256.
L’inibitore potrà ad esempio essere un antagomir, un oligonucleotide antisenso o un inibitore dell’RNA. Le molecole più comunemente utilizzate come inibitori di microRNA, comprese nello scopo della presente invenzione, sono rappresentate da oligonucleotidi antisenso, detti anche antimiR, la cui sequenza è complementare, del - 7 - SIB BI5210R The inhibitor may, for example, be an antagomir, an antisense oligonucleotide or an RNA inhibitor. The molecules most commonly used as microRNA inhibitors, included in the scope of the present invention, are represented by antisense oligonucleotides, also called antimiR, whose sequence is complementary, of - 7 - SIB BI5210R
tutto o parzialmente, alla sequenza, (che normalmente include la cosiddetta seed sequence) del microRNA bersaglio, e cioè del microRNA da inibire. La sequenza sarà complementare almeno per il 90, 91, 92, 93, 95 o 100%; è verosimile che l’effetto inibitorio si abbia con almeno il 90% di complementarietà. wholly or partially, to the sequence (which normally includes the so-called seed sequence) of the target microRNA, that is, of the microRNA to be inhibited. The sequence will be complementary at least for 90, 91, 92, 93, 95 or 100%; it is likely that the inhibitory effect occurs with at least 90% complementarity.
5 Preferibilmente, ai fini della presente invenzione, qualsiasi inibitore del mircoRNA HSA-miR181a-5p selezionato, è un inibitore specifico per il micro RNA HSA-miR181a-5p avente SEQ ID NO 1 e numero d’accesso miRbase MIMAT0000256, e cioè un inibitore che inibisce, e cioè silenzia, unicamente detto microRNA e che non è in grado di inibire, e cioè di silenziare, altri microRNA espressi nello stesso organismo. 5 Preferably, for the purposes of the present invention, any selected HSA-miR181a-5p mircoRNA inhibitor is a specific inhibitor for HSA-miR181a-5p microRNA having SEQ ID NO 1 and miRbase access number MIMAT0000256, i.e. an inhibitor which inhibits, ie silences, only said microRNA and which is not capable of inhibiting, ie silencing, other microRNAs expressed in the same organism.
10 In una forma di realizzazione, quindi, l’inibitore dell’invenzione, sarà un oligonucleotide, opzionalmente chimicamente modificato, avente una sequenza complementare a SEQ ID NO 1. 10 In one embodiment, therefore, the inhibitor of the invention will be an oligonucleotide, optionally chemically modified, having a complementary sequence to SEQ ID NO 1.
È noto, nello stato della tecnica che gli antimiR (e cioè gli oligonucleotidi inibitori di microRNA) possono essere modificati chimicamente al fine di aumentarne l’affinità per il 15 microRNA bersaglio (aumentando quindi la temperatura di annealing dell’ibrido inibitoremicroRNA), di aumentarne l’emivita e/o, ad esempio, la biodistribuzione in vivo. It is known, in the state of the art, that antimiRs (i.e. the inhibitory oligonucleotides of microRNA) can be chemically modified in order to increase their affinity for the target 15 microRNA (thus increasing the annealing temperature of the inhibitory microRNA hybrid), to increase its affinity half-life and / or, for example, in vivo biodistribution.
Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione, quindi, gli inibitori dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e HSA-miR451a sono oligonucleotidi chimicamente modificati. L’esperto del settore potrà disegnare, partendo da quanto comunemente noto 20 nello stato della tecnica, diversi antimiR idonei alla realizzazione dell’invenzione. Le modifiche comunemente utilizzate nello stato della tecnica comprendono, ad esempio, modifiche allo zucchero del nucleotide, modifiche alla base azotata, modifiche al legame nucleotidico. According to an embodiment of the invention, therefore, the inhibitors of the microRNAs HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and HSA-miR451a are chemically modified oligonucleotides. The expert in the field will be able to design, starting from what is commonly known 20 in the state of the art, various antimiRs suitable for the realization of the invention. Modifications commonly used in the state of the art include, for example, modifications to the nucleotide sugar, modifications to the nitrogenous base, modifications to the nucleotide bond.
I saggi descritti nella parte sperimentale sono sufficienti per valutare l’efficacia degli 25 inibitori disegnati sulla base degli insegnamenti sopra e sono disponibili metodi e programmi che permettono di valutare la specificità degli stessi; tra questi, sono ad esempio disponibili programmi comunemente utilizzati dal tecnico del settore per valutare il possibile crosslinking e quindi la specificità del antimiR, come BLAST, Vmatch, and RNAhybrid. Il programma CrossLink, ad esempio, può essere utilizzato per valutare 30 le potenziali interazioni tra microRNA o anti-microRNA e le loro sequenze bersaglio. The assays described in the experimental part are sufficient to evaluate the effectiveness of the 25 inhibitors designed on the basis of the teachings above and methods and programs are available that allow to evaluate their specificity; among these, for example, programs commonly used by those skilled in the art are available to evaluate the possible crosslinking and therefore the specificity of the antimiR, such as BLAST, Vmatch, and RNAhybrid. The CrossLink program, for example, can be used to evaluate 30 potential interactions between microRNA or anti-microRNA and their target sequences.
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Inoltre, opportuni inibitori dei microRNA oggetto dell’invenzione possono essere acquistati presso produttori specializzati per tali servizi e sono anche disponibili in commercio inibitori specifici per detti microRNA. Esempi d’inibitori disponibili commercialmente da Exiqon sono i seguenti: mmu-miR-181a-5p batch#620620; mmu-5 miR-451a batch#183631; mmu-miR-324-5p batch#190693). In addition, suitable inhibitors of the microRNAs object of the invention can be purchased from specialized manufacturers for such services and specific inhibitors for said microRNAs are also commercially available. Examples of inhibitors available commercially from Exiqon are the following: mmu-miR-181a-5p batch # 620620; mmu-5 miR-451a batch # 183631; mmu-miR-324-5p batch # 190693).
Esempi d’inibitori sono gli oligonucleotidi aventi sequenza SEQ ID NO 4 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-181a-5p- product sequence 5’-C*G*A*C*A*G*C*G*T*T*G*A*A*T*G*T-3’), SEQ ID NO 5 (LNA miRNA inhibitor mmumiR-451a- product sequence 5’- G*T*A*A*T*G*G*T*A*A*C*G*G*T*T-3’), SEQ ID NO 6 10 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-324-5p product sequence 5’-A*T*G*C*C*C*T*A*G*G*G*G*A*T*G*C-3’). Examples of inhibitors are oligonucleotides having sequence SEQ ID NO 4 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-181a-5p- product sequence 5'-C * G * A * C * A * G * C * G * T * T * G * A * A * T * G * T-3 '), SEQ ID NO 5 (LNA miRNA inhibitor mmumiR-451a- product sequence 5'- G * T * A * A * T * G * G * T * A * A * C * G * G * T * T-3 '), SEQ ID NO 6 10 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-324-5p product sequence 5'-A * T * G * C * C * C * T * A * G * G * G * G * A * T * G * C-3 ').
Come detto sopra, l’inibitore della presente invenzione può essere utilizzato nella prevenzione e/o trattamento della SMA (di tipo I-III). Secondo la presente invenzione l’inibitore del microRNA HSA-miR181a-5p avente SEQ ID NO 1 e numero d’accesso 15 miRbase MIMAT0000256, è inteso per uso nel prevenire, trattare, revertire, curare o diminuire il processo di patogenesi correlato alla SMA. Il trattamento terapeutico secondo la presente invenzione può essere realizzato con una formulazione adatta ad una qualsiasi via di somministrazione, preferibilmente sistemica, ancora più preferibilmente intratecale. Tale somministrazione potrà essere effettuata mediante più 20 dosi oppure mediante trattamento con una dose unica. As mentioned above, the inhibitor of the present invention can be used in the prevention and / or treatment of SMA (type I-III). According to the present invention, the HSA-miR181a-5p microRNA inhibitor having SEQ ID NO 1 and access number 15 miRbase MIMAT0000256, is intended for use in preventing, treating, reversing, curing or decreasing the pathogenesis process related to SMA. The therapeutic treatment according to the present invention can be carried out with a formulation suitable for any route of administration, preferably systemic, even more preferably intrathecal. This administration can be carried out by more than 20 doses or by treatment with a single dose.
Secondo una forma di realizzazione l’inibitore del microRNA HSA-miR181a-5p sarà somministrato in una terapia combinata con il medicamento Nusinersen e/o con un inibitore del microRNA HSA-miR324-5p e/o con un inibitore del micro RNA HSA-miR451a, in cui detto microRNA HSA-miR324-5p ha SEQ ID NO 2 e numero d’accesso 25 miRbase MIMAT0000761 e detto micro RNA HSA-miR-451a ha SEQ ID NO 3 e numero d’accesso miRbase MIMAT0001631. È qui descritto anche un kit per la somministrazione simultanea, separata o sequenziale di un inibitore del microRNA HSA-miR181a-5p e uno o più dei seguenti composti Nusinersen, inibitore del micro RNA HSA-miR324-5p, inibitore del microRNA HSA-miR451a. Tale kit sarà vantaggiosamente usato 30 per uso nella prevenzione e/o trattamento dell’atrofia muscolare spinale (SMA). According to one embodiment, the microRNA inhibitor HSA-miR181a-5p will be administered in a combination therapy with the drug Nusinersen and / or with an inhibitor of the microRNA HSA-miR324-5p and / or with an inhibitor of the microRNA HSA-miR451a , wherein said microRNA HSA-miR324-5p has SEQ ID NO 2 and access number 25 miRbase MIMAT0000761 and said microRNA HSA-miR-451a has SEQ ID NO 3 and access number miRbase MIMAT0001631. Also described here is a kit for the simultaneous, separate or sequential administration of a HSA-miR181a-5p microRNA inhibitor and one or more of the following compounds Nusinersen, HSA-miR324-5p microRNA inhibitor, HSA-miR451a microRNA inhibitor. This kit will be advantageously used 30 for use in the prevention and / or treatment of spinal muscular atrophy (SMA).
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Il termine "quantitativo terapeuticamente efficace" come qui utilizzato, significa quel quantitativo di composto attivo o agente farmaceutico che induce la risposta biologica o medica in un sistema di tessuti, in un animale o in un essere umano che comprende alleviamento, prevenzione, trattamento o ritardo dell’inizio o della progressione dei 5 sintomi della malattia o del disturbo trattato. The term "therapeutically effective quantity" as used herein means that amount of active compound or pharmaceutical agent that induces the biological or medical response in a tissue system, animal or human which includes alleviation, prevention, treatment or delay. the onset or progression of the 5 symptoms of the disease or disorder being treated.
Come qui utilizzato, il termine "composizione" è inteso riguardare anche un prodotto comprendente gli ingredienti specifici nelle quantità specifiche, così come qualsiasi prodotto che risulti, direttamente o indirettamente, da combinazioni degli ingredienti specificati nei quantitativi specificati. As used herein, the term "composition" is also intended to refer to a product comprising the specific ingredients in the specified quantities, as well as any product that results, directly or indirectly, from combinations of the specified ingredients in the specified quantities.
10 L’invenzione riguarda quindi anche una composizione farmaceutica comprendente un inibitore come sopra definito e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile. Per preparare le composizioni farmaceutiche di questa invenzione, un inibitore secondo la presente invenzione come ingrediente attivo è mescolato o con un veicolante farmaceutico secondo tecniche di preparazione farmaceutica convenzionali, il quale 15 veicolante può avere un’ampia varietà di forme secondo la forma di preparazione desiderata per la somministrazione. 10 The invention therefore also relates to a pharmaceutical composition comprising an inhibitor as defined above and at least one pharmaceutically acceptable carrier. To prepare the pharmaceutical compositions of this invention, an inhibitor according to the present invention as an active ingredient is mixed with either a pharmaceutical carrier according to conventional pharmaceutical preparation techniques, which carrier 15 can have a wide variety of forms according to the desired preparation form. for administration.
Secondo una forma di realizzazione la composizione comprenderà anche uno o più dei seguenti agenti farmacologicamente attivi: Nusinersen, inibitore del microRNA HSA-miR324-5p, inibitore del microRNA HSA-miR451a. According to an embodiment, the composition will also comprise one or more of the following pharmacologically active agents: Nusinersen, inhibitor of the microRNA HSA-miR324-5p, inhibitor of the microRNA HSA-miR451a.
20 Più in generale, i composti e preparati dell’invenzione potranno essere formulati per somministrazione con ogni modalità risulti conveniente per scopi medici o veterinari. Compresse e capsule per somministrazione orale potranno corrispondere ad una singola dose, e potranno contenere eccipienti convenzionali come, ad es., agenti leganti, ad esempio sciroppo di mais o di glucosio, gomma d’ acacia o arabica, gomma 25 tragacanth, gelatina, sorbitolo, polivinilpirrolidone; riempitivi, ad es. lattosio, zucchero, amido di mais, calcio fosfato, sorbitolo o glicina; lubrificanti per compresse, ad es. stearato di magnesio, talco, polietilenglicole o silice; disintegranti, ad es. amido di patata; e agenti umidificanti utilizzabili farmaceuticamente, ad es. sodio laurilsolfato. Le compresse potranno essere rivestite seguendo metodi ben noti nella normale pratica 30 farmaceutica. 20 More generally, the compounds and preparations of the invention can be formulated for administration in any way that is convenient for medical or veterinary purposes. Tablets and capsules for oral administration may correspond to a single dose, and may contain conventional excipients such as, for example, binding agents, for example corn or glucose syrup, acacia or arabic gum, 25 tragacanth gum, gelatin, sorbitol , polyvinylpyrrolidone; fillers, e.g. lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine; tablet lubricants, e.g. magnesium stearate, talc, polyethylene glycol or silica; disintegrants, eg. potato starch; and pharmaceutically usable wetting agents, e.g. sodium lauryl sulfate. The tablets may be coated following methods well known in normal pharmaceutical practice 30.
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Preparazioni liquide per somministrazione orale potranno assumere la forma di, per esempio, sospensioni acquose od oleose, soluzioni, emulsioni, sciroppi od elisir, oppure di un prodotto secco da ricostituire con acqua o un altro veicolo opportuno prima dell’uso. Tali preparati liquidi potranno contenere additivi convenzionali, inclusi, ad esempio, 5 agenti stabilizzanti della sospensione, ad es. sorbitolo, metil cellulosa, sciroppo di glucosio, gelatina, idrossietil cellulosa, carbossimetil cellulosa, stearato di alluminio o grassi commestibili idrogenati; agenti emulsificanti, ad es. lecitina, sorbitan monooleato o gomma d’acacia; veicoli non acquosi (che possono includere olii commestibili), ad es. olio di mandorla, esteri oleosi (ad es. glicerina), glicole propilenico, o alcool etilico; 10 conservanti, ad es. metil- o propil-idrossibenzoato o acido sorbico; e, opzionalmente, agenti coloranti e aromatizzanti convenzionali. Liquid preparations for oral administration may take the form of, for example, aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or elixirs, or a dry product to be reconstituted with water or another suitable vehicle before use. Such liquid preparations may contain conventional additives, including, for example, 5 suspension stabilizing agents, e.g. sorbitol, methyl cellulose, glucose syrup, gelatin, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, aluminum stearate or hydrogenated edible fats; emulsifying agents, e.g. lecithin, sorbitan monooleate or acacia gum; non-aqueous vehicles (which may include edible oils), e.g. almond oil, oil esters (eg glycerin), propylene glycol, or ethyl alcohol; 10 preservatives, eg. methyl- or propyl-hydroxybenzoate or sorbic acid; and, optionally, conventional coloring and flavoring agents.
Le composizioni secondo la presente invenzione potranno opportunamente contenere un inibitore come qui descritto o un suo sale o derivato o solvatato dallo 0.03% al 95% in peso rispetto alla composizione. Quando presentata in forma di dose unitaria, ogni 15 dose potrà ad esempio contenere ad es. da 0,1 a 1000 mg di composto. The compositions according to the present invention may suitably contain an inhibitor as described herein or a salt or derivative or solvate thereof from 0.03% to 95% by weight with respect to the composition. When presented in unit dose form, every 15 dose may for example contain eg. from 0.1 to 1000 mg of compound.
L’invenzione fornisce anche un metodo per uso nella prevenzione e/o trattamento dell’atrofia muscolare spinale (SMA) comprendente un passaggio di somministrazione ad un soggetto umano che lo necessiti, un quantitativo terapeuticamente efficace di inibitore del microRNA HSA-miR181a-5p avente SEQ ID NO 1 e numero d’accesso 20 miRbase MIMAT0000256 come definito nella presente descrizione e nelle rivendicazioni opzionalmente in associazione agli altri agenti attivi qui descritti. The invention also provides a method for use in the prevention and / or treatment of spinal muscular atrophy (SMA) comprising an administration step to a human subject who needs it, a therapeutically effective amount of HSA-miR181a-5p microRNA inhibitor having SEQ ID NO 1 and access number 20 miRbase MIMAT0000256 as defined in the present description and in the claims optionally in association with the other active agents described herein.
L’invenzione fornisce anche i seguenti metodi: The invention also provides the following methods:
Un metodo per valutare la prognosi dell’atrofia muscolare spinale (SMA) in un soggetto, comprendente: A method for assessing the prognosis of spinal muscular atrophy (SMA) in a subject, including:
25 a. determinare i livelli dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e/o HSA-miR451a i in un campione biologico di detto soggetto; 25 a. determining the levels of the microRNAs HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and / or HSA-miR451a i in a biological sample of said subject;
b. confrontare i livelli di detti microRNA nel campione di detto soggetto con i livelli di un controllo e opzionalmente b. comparing the levels of said microRNAs in the sample of said subject with the levels of a control and optionally
c. (i) identificare il soggetto come affetto dall’atrofia muscolare spinale quando i livelli dei 30 microRNA nel campione del soggetto sono aumentati rispetto a quelli di controllo o (ii) - 11 - SIB BI5210R c. (i) identify the subject as suffering from spinal muscular atrophy when the levels of the 30 microRNAs in the subject's sample have increased compared to the control ones or (ii) - 11 - SIB BI5210R
identificare il soggetto come non affetto dall’atrofia muscolare spinale quando i livelli dei microRNA nel campione del soggetto non sono aumentati. identify the subject as not affected by spinal muscular atrophy when the levels of microRNAs in the subject's sample have not increased.
Un metodo per monitorare lo sviluppo dell’atrofia muscolare spinale in un soggetto, comprendente: A method for monitoring the development of spinal muscular atrophy in a subject, including:
5 a. determinare i livelli dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e/o HSA-miR451a in due o più campioni biologici di detto soggetto, in cui i campioni sono stati ottenuti a punti di tempo distanziati, e 5 a. determine the levels of the HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and / or HSA-miR451a microRNAs in two or more biological samples from that subject, in which the samples were obtained at spaced time points, and
b. confrontare i livelli di microRNA tra i campioni biologici ottenuti in precedenza e quelli ottenuti successivamente. b. compare the levels of microRNA between the biological samples obtained previously and those obtained subsequently.
10 Un metodo per monitorare l'efficacia di un trattamento dell’atrofia muscolare spinale in un soggetto, comprendente: 10 A method for monitoring the effectiveness of a spinal muscular atrophy treatment in a subject, including:
a. determinare i livelli dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e/o HSA-miR451a in un campione biologico di detto soggetto ottenuto prima dell'inizio del trattamento; to. determining the levels of the microRNAs HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and / or HSA-miR451a in a biological sample of said subject obtained before starting the treatment;
15 b. determinare i livelli dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e/o HSA-miR451a in uno o più campioni biologici di detto soggetto ottenuti nel corso o dopo il trattamento, e 15 b. determine the levels of the microRNAs HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and / or HSA-miR451a in one or more biological samples of that subject obtained during or after treatment, and
c. confrontare i livelli dei microRNA HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e HSA-miR451a determinato nei passaggi (a) e (b), e facoltativamente tra diversi campioni nel passaggio 20 (b), ad esempio 1, 3, 6, 12, 24, 36 o 48 mesi prima. c. compare the levels of the microRNAs HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and HSA-miR451a determined in steps (a) and (b), and optionally between different samples in step 20 (b), e.g. 1, 3, 6 , 12, 24, 36 or 48 months earlier.
Esempi non limitativi di campioni biologici utili in uno qualsiasi dei metodi dell'invenzione comprendono plasma, siero, urina, biopsie muscolari, biopsie cutanee, liquido cefalorachidiano. Non-limiting examples of biological samples useful in any of the methods of the invention include plasma, serum, urine, muscle biopsies, skin biopsies, cerebrospinal fluid.
Esempi non limitativi di procedure per determinare il livello di microRNA utili in uno 25 qualsiasi dei metodi dell'invenzione includono l'ibridazione, RT-PCR e sequenziamento. Non-limiting examples of procedures for determining the level of microRNA useful in any 25 of the methods of the invention include hybridization, RT-PCR and sequencing.
Esempi di procedure utili per misurare il livello di microRNA nei campioni biologici includono l'ibridazione con sonde selettive (ad esempio, l'utilizzo di Northern blotting, citometria a flusso basata su microsfere, microchip oligonucleotidico [microarray] o saggi di ibridazione in soluzione come kit commerciali. In una forma di realizzazione, prima del 30 passaggio (a) in uno qualsiasi dei metodi precedenti, i microRNA vengono estratti e - 12 - SIB BI5210R Examples of procedures useful for measuring microRNA level in biological samples include hybridization with selective probes (e.g., using Northern blotting, bead-based flow cytometry, oligonucleotide microchips [microarray] or solution hybridization assays such as commercial kits. In one embodiment, prior to step 30 (a) in any of the above methods, the microRNAs are extracted and - 12 - SIB BI5210R
purificati da un qualsiasi campione biologico. Uno qualsiasi dei metodi sopra descritti può inoltre comprendere la fase di ridurre o eliminare la degradazione dei microRNA. Il termine "individuo" o "soggetto" come qui usato, si riferisce ad animali in generale, preferibilmente ad esseri umani. purified from any biological sample. Any of the methods described above may further comprise the step of reducing or eliminating the degradation of the microRNAs. The term "individual" or "subject" as used herein refers to animals in general, preferably to humans.
5 Il termine “livello di controllo” come qui usato comprende standard predeterminati (ad esempio, un valore pubblicato in una referenza) e livelli determinati sperimentalmente in campioni analizzati ed elaborati da soggetti di controllo (ad es. soggetti sani di pari età, pazienti trattati con placebo, ecc.). 5 The term "control level" as used herein includes predetermined standards (e.g., a value published in a reference) and experimentally determined levels in samples analyzed and processed by control subjects (e.g., age-matched healthy subjects, treated patients with placebo, etc.).
È anche qui descritto un Kit per uso nella prognosi dell’atrofia muscolare spinale in un 10 soggetto comprendente reagenti per la determinazione dei livelli del micro RNA HSA-miR324-5p e/o del micro RNA HSA-miR451a in un campione biologico e opzionalmente uno o più campioni di controllo, cioè campioni in cui i livelli di microRNA sono noti. I reagenti per la misura dei livelli per la determinazione dei livelli del microRNA sono noti al tecnico del settore ed esemplificati negli esempi. Also described here is a kit for use in the prognosis of spinal muscular atrophy in a subject 10 comprising reagents for determining the levels of the micro RNA HSA-miR324-5p and / or the micro RNA HSA-miR451a in a biological sample and optionally one or more control samples, i.e. samples in which the microRNA levels are known. The reagents for measuring the levels for determining the levels of the microRNA are known to the person skilled in the art and exemplified in the examples.
15 I seguenti esempi sono forniti per facilitare la comprensione dell’invenzione, e non sono intesi e non devono essere interpretati in alcun modo come limitanti l’invenzione descritta nelle rivendicazioni che seguono dopo. 15 The following examples are provided to facilitate understanding of the invention, and are not intended and should not be interpreted in any way as limiting the invention described in the following claims.
20 ESEMPI 20 EXAMPLES
MATERIALI E METODI MATERIALS AND METHODS
1. Campioni analizzati 1. Samples analyzed
L’analisi high-throughput del miRnoma dei pazienti affetti da SMA è stata effettuata su 7 biopsie muscolari (3 SMA I, 2 SMA II e 2 SMA III), e 7 controlli ottenuti dalla Divisione di 25 Neuropsichiatria Infantile dell’Istituto Neurologico “Carlo Besta” di Milano. Per ridurre la variabilità sperimentale, i campioni sono stati selezionati in base al sito della biopsia (quadricipite femorale) ed all’esecuzione del campionamento ai primi stadi della malattia per evitare l’eccessiva presenza di tessuto fibrotico. I controlli sono stati selezionati tra campioni morfologicamente normali, ottenuti da soggetti sani dello stesso range di età. The high-throughput analysis of the miRnoma of SMA patients was performed on 7 muscle biopsies (3 SMA I, 2 SMA II and 2 SMA III), and 7 controls obtained from the Division of 25 Child Neuropsychiatry of the Neurological Institute "Carlo Besta ”in Milan. To reduce the experimental variability, the samples were selected based on the site of the biopsy (quadriceps femoris) and the execution of sampling in the early stages of the disease to avoid the excessive presence of fibrotic tissue. Controls were selected from morphologically normal samples obtained from healthy subjects of the same age range.
30 La successiva validazione dei miRNA risultati differenzialmente espressi dall’analisi del - 13 - SIB BI5210R 30 The subsequent validation of miRNA results differentially expressed by the analysis of - 13 - SIB BI5210R
miRNoma è stata effettuata su campioni di siero ottenuti dai seguenti istituti: Divisione di Neuropsichiatria Infantile – Istituto Neurologico “Carlo Besta” (Milano); U.O. Malattie Neuromuscolari-Neuroimmunologia – Istituto Neurologico “Carlo Besta” (Milano); Sezione di Neuropsichiatria Infantile – Università Cattolica del Sacro Cuore/Policlinico 5 Agostino Gemelli (Roma); Dipartimento di Medicina Molecolare – Ospedale Pediatrico Bambino Gesù (Roma). In totale sono stati reclutati 51 pazienti SMA (4 SMA I, 20 SMA II e 27 SMA III) e 40 controlli. I controlli sono stati ottenuti come campioni anonimizzati dal Laboratorio Analisi della Fondazione Policlinico Gemelli e dell’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, di Roma. miRNoma was performed on serum samples obtained from the following institutes: Division of Child Neuropsychiatry - “Carlo Besta” Neurological Institute (Milan); U.O. Neuromuscular Diseases-Neuroimmunology - “Carlo Besta” Neurological Institute (Milan); Section of Child Neuropsychiatry - Catholic University of the Sacred Heart / Policlinico 5 Agostino Gemelli (Rome); Department of Molecular Medicine - Bambino Gesù Pediatric Hospital (Rome). In total, 51 SMA patients (4 SMA I, 20 SMA II and 27 SMA III) and 40 controls were recruited. The controls were obtained as anonymized samples by the Analysis Laboratory of the Gemelli Polyclinic Foundation and the Bambino Gesù Pediatric Hospital, Rome.
10 10
2. Estrazione di RNA da tessuto e di miRNA da siero 2. Extraction of RNA from tissue and miRNA from serum
L’RNA totale è stato estratto da biopsie muscolari mediante l’uso di TRIzol® Reagent (Life Techologies) in un rapporto di 1 ml/100 mg di campione, secondo il protocollo del produttore. L’RNA estratto è stato risospeso in acqua RNase-free e quantificato 15 mediante lettura allo spettrofotometro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). Per l’estrazione dei piccoli RNA, l’RNA totale è stato dapprima quantificato e qualificato mediante Byoanalyzer (Agilent) al fine di valutarne qualità ed integrità, definita tramite il numero di integrità del RNA (RIN). La frazione dei piccoli RNA, contenente i miRNA, è stata selezionata mediante taglio da gel di poliacrilammide al 6% non-denaturante. 20 L’estrazione di miRNA da siero è stata effettuata utilizzando il miRCURY<TM >RNA Isolation Kit – Biofluids (EXIQON). Al fine di evitare la presenza di cellule del sangue nel siero, il campione è stato centrifugato a 3.000rpm per 5 minuti prima di procedere con l’estrazione. I miRNA sono stati estratti da un volume iniziale di siero di 200µl per ciascun campione. Nella fase finale di estrazione, è stata eseguita una digestione con DNase 25 RNase-free per 15 minuti a temperatura ambiente al fine di rimuovere i residui di cellfree DNA. Total RNA was extracted from muscle biopsies using TRIzol® Reagent (Life Techologies) in a ratio of 1 ml / 100 mg of sample, according to the manufacturer's protocol. The extracted RNA was resuspended in RNase-free water and quantified 15 by reading on the NanoDrop 1000 spectrophotometer (Thermo Scientific). For the extraction of the small RNAs, the total RNA was first quantified and qualified by Byoanalyzer (Agilent) in order to evaluate its quality and integrity, defined by the RNA integrity number (RIN). The fraction of the small RNAs, containing the miRNAs, was selected by cleavage from non-denaturing 6% polyacrylamide gel. 20 The extraction of miRNA from serum was carried out using the miRCURY <TM> RNA Isolation Kit - Biofluids (EXIQON). In order to avoid the presence of blood cells in the serum, the sample was centrifuged at 3,000rpm for 5 minutes before proceeding with the extraction. The miRNAs were extracted from an initial volume of serum of 200µl for each sample. In the final extraction step, a digestion with DNase 25 RNase-free was performed for 15 minutes at room temperature in order to remove cellfree DNA residues.
3. Retrotrascrizione 3. Reverse transcription
La retrotrascrizione di miRNA estratti da siero è stata effettuata con Universal cDNA synthesis kit II (EXIQON), secondo le istruzioni del produttore. The reverse transcription of miRNA extracted from serum was performed with Universal cDNA synthesis kit II (EXIQON), according to the manufacturer's instructions.
30 A seconda dell’utilizzo del cDNA ottenuto, la reazione di retrotrascrizione è stata - 14 - SIB BI5210R 30 Depending on the use of the obtained cDNA, the reverse transcription reaction was - 14 - SIB BI5210R
eseguita in condizioni differenti. Per la quantificazione di miRNA nel siero tramite qRT-PCR relativa sono stati retrotrascritti 4µl di RNA a cui sono stati aggiunti 4µl 5x Reaction Buffer, 2µl Enzyme mix, 1µl Synthetic RNA spike in (UniSp6) e 9µl H2O nuclease-free, in un volume finale di 20µl. Per la quantificazione di miRNA nel siero tramite qRT-PCR 5 assoluta sono stati retrotrascritti 2µl di RNA a cui sono stati aggiunti 2µl 5x Reaction Buffer, 1µl Enzyme mix e 5µl H2O nuclease-free, in un volume finale di 10µl.Il cDNA ottenuto è stato portato ad una concentrazione 100x della diluizione finale con H2O nuclease-free per le successive reazioni di qRT-PCR relativa, o ad una concentrazione 25x della diluizione finale in TE pH8 (10mM Tris-HCL, 1mM EDTA) per le successive 10 reazioni di qRT-PCR assoluta. performed under different conditions. For the quantification of miRNA in serum by relative qRT-PCR, 4µl of RNA were back-transcribed to which 4µl 5x Reaction Buffer, 2µl Enzyme mix, 1µl Synthetic RNA spike in (UniSp6) and 9µl H2O nuclease-free were added, in one volume final of 20µl. For the quantification of miRNA in serum by absolute qRT-PCR 5, 2µl of RNA were back-transcribed to which 2µl 5x Reaction Buffer, 1µl Enzyme mix and 5µl H2O nuclease-free were added, in a final volume of 10µl. The cDNA obtained is was brought to a 100x concentration of the final dilution with nuclease-free H2O for the subsequent relative qRT-PCR reactions, or to a 25x concentration of the final dilution in TE pH8 (10mM Tris-HCL, 1mM EDTA) for the next 10 reactions of Absolute qRT-PCR.
4. miRNA sequencing 4. miRNA sequencing
4.1 Preparazione delle librerie di miRNA 4.1 Preparation of miRNA libraries
Per la preparazione delle librerie di miRNA è stato utilizzato il kit TruSeq Small RNA Sample Preparation (Illumina), secondo le istruzioni del produttore. La qualità delle 15 library è stata valutata tramite corsa su High Sensitivity DNA Chip sullo strumento 2100 Byoanalyzer (Agilent). La quantificazione delle librerie è stata effettuata tramite metodo fluorimetrico sullo strumento Q bit (Thermo Scientific) e tramite qRT-PCR (Kapa-Biosystems). The TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit (Illumina) was used for the preparation of the miRNA libraries, according to the manufacturer's instructions. The quality of the 15 libraries was assessed by running on the High Sensitivity DNA Chip on the 2100 Byoanalyzer instrument (Agilent). The quantification of the libraries was performed by fluorimetric method on the Q bit instrument (Thermo Scientific) and by qRT-PCR (Kapa-Biosystems).
Le library sono state sequenziate su Genome Analyze IIx (Illumina), secondo le 20 indicazioni del produttore. The libraries were sequenced on Genome Analyze IIx (Illumina), according to the manufacturer's 20 recommendations.
4.2 Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento 4.2 Bioinformatic analysis of sequencing data
Dopo conversione in FastQ dei file .bcl ottenuti dal sequenziamento, le reads ottenute (di lunghezza 31 basi, in single-end) sono state inizialmente filtrate per qualità, utilizzando FASTX-toolkit, e poi sottoposte a trimming (mediante Trim_galore) per la 25 rimozione dell'adattatore. Soltanto le reads più lunghe di 15 basi sono state conservate per l'analisi successiva. Le reads filtrate sono state allineate alle sequenze dei miRNA precursori annotati nel database miRBase (www.mirbase.org). Per l'allineamento è stato utilizzato l'algoritmo Bowtie, consentendo un massimo di due mismatch. L'identificazione e quantificazione dei miRNA maturi noti sono state effettuate utilizzando esclusivamente 30 le reads perfettamente allineate alla sequenza di ciascun miRNA maturo. Le reads non - 15 - SIB BI5210R After converting the .bcl files obtained from sequencing into FastQ, the reads obtained (31 bases in single-end length) were initially filtered for quality, using FASTX-toolkit, and then subjected to trimming (using Trim_galore) for the 25 removing the adapter. Only reads longer than 15 bases were kept for later analysis. The filtered reads were aligned to the precursor miRNA sequences annotated in the miRBase database (www.mirbase.org). The Bowtie algorithm was used for the alignment, allowing a maximum of two mismatches. The identification and quantification of known mature miRNAs were performed using only 30 reads perfectly aligned to the sequence of each mature miRNA. The reads do not - 15 - SIB BI5210R
allineate in miRBase sono state successivamente filtrate, rimuovendo molecole potenziali di tRNA, rRNA o altri prodotti annotati nei database Rfam, ncRNA e NONCODE. Le reads rimanenti sono state raggruppate insieme per l'identificazione di eventuali miRNA ancora non annotati, effettuata tramite miRDeep (v2). Infine, la 5 valutazione dell'espressione differenziale dei miRNA identificati fra campioni SMA e controlli è stata effettuata tramite il software edgeR (v2.4.1). I miRNA così identificati sono stati considerati espressi in maniera differenziale tra pazienti e controlli esclusivamente per valori di FDR (False Discovery Rate) < 0.05. aligned in miRBase were subsequently filtered, removing potential molecules of tRNA, rRNA or other products annotated in the Rfam, ncRNA and NONCODE databases. The remaining reads were grouped together for the identification of any un-annotated miRNAs, carried out via miRDeep (v2). Finally, the 5 evaluation of the differential expression of the miRNAs identified between SMA samples and controls was performed using the edgeR software (v2.4.1). The miRNAs thus identified were considered to be expressed in a differential manner between patients and controls exclusively for values of FDR (False Discovery Rate) <0.05.
10 5. Costruzione di standard esterni 10 5. Building External Standards
Per determinare in numero assoluto le molecole di ciascun miRNA presenti nei campioni di siero, è stato sviluppato un sistema di quantificazione in-house, basato sull’uso di curve standard specifiche in qRT-PCR (Tiziano et al., 2010). To determine the absolute number of molecules of each miRNA present in serum samples, an in-house quantification system was developed, based on the use of specific standard curves in qRT-PCR (Tiziano et al., 2010).
Per ciascun miRNA sono stati disegnati 2 primer parzialmente complementari, F ed R. Il 15 primer reverse (exst_R), lungo 36 nucleotidi, comprendeva la sequenza del primer universale utilizzato nel kit commerciale Universal cDNA synthesis kit II (EXIQON), seguita da una coda di T15 e da 4 nucleotidi complementari agli ultimi 4 dell’estremità 3’ della sequenza del miRNA maturo. Il primer forward (exst_F) aveva lunghezza variabile e conteneva la sequenza del miRNA maturo (www.mirbase.org), seguita da una coda di 20 A15e dai 3 nucleotidi complementari agli ultimi 3 dell’estremità 3’ del primer universale R. For each miRNA, 2 partially complementary primers were designed, F and R. The 15 reverse primer (exst_R), 36 nucleotides long, included the sequence of the universal primer used in the commercial Universal cDNA synthesis kit II (EXIQON), followed by a tail of T15 and 4 nucleotides complementary to the last 4 of the 3 'end of the mature miRNA sequence. The forward primer (exst_F) had variable length and contained the mature miRNA sequence (www.mirbase.org), followed by a tail of 20 A15 and by the 3 complementary nucleotides to the last 3 of the 3 'end of the universal primer R.
Per trasformare in DNA a doppio filamento il frammento contenente la sequenza del miRNA maturo, è stato effettuato un singolo ciclo di PCR. La reazione di PCR è stata eseguita in un volume finale di 12.5µl contenente: 0.1µl GC-Platinum Taq DNA Polymerase (5u/µl), 1.25µl 10x Reaction Buffer, 1µl 25mM MgCl2, 0.25µl 10mM dNTPs, 25 1µl primer exst_F 10µM, 1µl primer exst_R 10µM e 7.9µl H2O nuclease-free. A single round of PCR was performed to transform the fragment containing the mature miRNA sequence into double-stranded DNA. The PCR reaction was performed in a final volume of 12.5µl containing: 0.1µl GC-Platinum Taq DNA Polymerase (5u / µl), 1.25µl 10x Reaction Buffer, 1µl 25mM MgCl2, 0.25µl 10mM dNTPs, 25 1µl primer exst_F 10µM , 1µl primer exst_R 10µM and 7.9µl H2O nuclease-free.
Il ciclo di PCR era: 30’’ - 94°C, 30’’ - 54°C, 30’’ - 72°C. The PCR cycle was: 30 '' - 94 ° C, 30 '' - 54 ° C, 30 '' - 72 ° C.
5.1 Clonaggio 5.1 Cloning
Il prodotto ottenuto dalla reazione precedente è stato clonato nel vettore pDrive (Qiagen). Il pDrive è stato inizialmente linearizzato con EcoRV (Roche) incubando a 37°C per 1 30 ora 10µg del vettore con 10 U di enzima , 2.5µl 10x SuRE/Cut Buffer B e 2dH2O in un - 16 - SIB BI5210R The product obtained from the previous reaction was cloned into the pDrive vector (Qiagen). The pDrive was initially linearized with EcoRV (Roche) by incubating at 37 ° C for 1 30 hour 10µg of the vector with 10 U of enzyme, 2.5µl 10x SuRE / Cut Buffer B and 2dH2O in a - 16 - SIB BI5210R
volume finale di 25µl. final volume of 25µl.
Il vettore digerito è stato successivamente purificato mediante precipitazione con sodio acetato 3M (C2H3NaO2) pH 5.2. Il vettore digerito è stato reso T-overhang mediante amplificazione in presenza di soli dTTPs, al fine di favorirne l’appaiamento con la A-5 overhang presente negli inserti. Tale reazione è stata effettuata in un volume finale di 12.5µl con 0.2µl GC-Platinum Taq DNA Polymerase (5u/µl), 1.25µl 10x Reaction Buffer, 0.75µl 25mM MgCl2, 0.25µl 10mM dTTPs, 300ng del vettore pDrive linearizzato e 2dH2O a volume. La reazione è stata incubata per 20 minuti a 72°C. The digested vector was subsequently purified by precipitation with 3M sodium acetate (C2H3NaO2) pH 5.2. The digested vector was made T-overhang by amplification in the presence of only dTTPs, in order to favor the pairing with the A-5 overhang present in the inserts. This reaction was carried out in a final volume of 12.5µl with 0.2µl GC-Platinum Taq DNA Polymerase (5u / µl), 1.25µl 10x Reaction Buffer, 0.75µl 25mM MgCl2, 0.25µl 10mM dTTPs, 300ng of the linearized pDrive vector and 2dH2O by volume. The reaction was incubated for 20 minutes at 72 ° C.
Successivamente, è stata effettuata la ligazione in un volume finale di 20µl con 5µl 4x 10 AnzaTM T4 DNA Ligase Master Mix (Invitrogen), 1µl vettore pDrive EcoRV T-overhang [50ng/µl], 10ng dell’inserto. La reazione è stata incubata a temperatura ambiente per 30 minuti. Subsequently, ligation was carried out in a final volume of 20µl with 5µl 4x 10 AnzaTM T4 DNA Ligase Master Mix (Invitrogen), 1µl pDrive EcoRV T-overhang vector [50ng / µl], 10ng of the insert. The reaction was incubated at room temperature for 30 minutes.
5.2 Trasformazione batterica e selezione delle colonie 5.2 Bacterial transformation and colony selection
Batteri competenti EZ sono stati trasformati con il vettore pDrive contenente il frammento 15 di interesse secondo il metodo dell’heat shock: 30 minuti in ghiaccio, 50 secondi a 42°C e 2 minuti in ghiaccio. Sono stati poi aggiunti 250µl di SOC medium (2% tryptone, 0.5% 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM Glu); i batteri sono stati incubati per 1.5 ore a 37°C in agitazione a 300 rpm. Successivamente, sono stati piastrati su petri contenenti LB-AGAR con ampicillina 100µg/ml, X-Gal 80µg/ml, IPTG 50µM e 20 incubati O/N a 37°C. Competent EZ bacteria were transformed with the pDrive vector containing the fragment 15 of interest according to the heat shock method: 30 minutes on ice, 50 seconds at 42 ° C and 2 minutes on ice. 250µl of SOC medium (2% tryptone, 0.5% 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM Glu) were then added; the bacteria were incubated for 1.5 hours at 37 ° C under stirring at 300 rpm. Subsequently, they were plated on petri dishes containing LB-AGAR with ampicillin 100µg / ml, X-Gal 80µg / ml, IPTG 50µM and 20 incubated O / N at 37 ° C.
Per la selezione delle colonie positive (contenenti l’inserto) è stato usato il blue screening. Le colonie bianche sono state prelevate, risospese in 10µl TE pH8 e incubate per 5 minuti a 95°C; le colonie positive sono state identificate mediante PCR -colony usando i primer del vettore T7 (5’-GTAATACGACTCACTATAG-3’) e SP6 (5’-25 CATTTAGGTGACACTATAG-3’). La reazione è stata effettuata in un volume finale di 12.5µl con 6.25µl 2x GoTaq® Hot Start Colorless Master Mix (Promega), 5 nM di primer T7 ed SP6, 2µl di DNA. Blue screening was used for the selection of positive colonies (containing the insert). White colonies were collected, resuspended in 10µl TE pH8 and incubated for 5 minutes at 95 ° C; the positive colonies were identified by PCR -colony using the primers of the vector T7 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3 ') and SP6 (5'-25 CATTTAGGTGACACTATAG-3'). The reaction was carried out in a final volume of 12.5µl with 6.25µl 2x GoTaq® Hot Start Colorless Master Mix (Promega), 5 nM of T7 and SP6 primers, 2µl of DNA.
Il ciclo di PCR era : 5’ - 95°C; 1’ - 95°C, 1’ - 56°C, 1’ - 72°C (per 30 cicli); 5’ - 72°C. La dimensione degli amplificati ottenuti è stata valutata mediante elettroforesi su gel di 30 agarosio: sono state sequenziate solo le colonie che producessero prodotti di PCR> di - 17 - SIB BI5210R The PCR cycle was: 5 '- 95 ° C; 1 '- 95 ° C, 1' - 56 ° C, 1 '- 72 ° C (for 30 cycles); 5 '- 72 ° C. The size of the amplificates obtained was evaluated by electrophoresis on a 30 agarose gel: only the colonies that produced PCR products> of - 17 - SIB BI5210R were sequenced
~200 bp ~ 200 bp
. .
5.3 Sequenziamento 5.3 Sequencing
La sequenza di ciascun miRNA clonato è stata verificata mediante sequenziamento di 5 Sanger. Il prodotto di PCR (5µl) è stato purificato con 1µl ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Affymetrix) per 15 minuti a 37°C, dopo i quali l’ExoSAP è stato inattivato a 80°C per 15 minuti. Il frammento di DNA d’interesse è stato sequenziato utilizzando il BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), secondo le indicazioni del produttore, in un volume finale di 10µl. Le reazioni di sequenza sono state 10 purificate con il BigDye® XTerminatorTM Purification Kit (Applied Biosystems), secondo il protocollo del produttore. Il sequenziamento è stato eseguito tramite elettroforesi capillare su sequenziatore automatico ABI-Prism 3130 (Applied Biosystem). The sequence of each cloned miRNA was verified by sequencing of 5 Sangers. The PCR product (5µl) was purified with 1µl ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Affymetrix) for 15 minutes at 37 ° C, after which the ExoSAP was inactivated at 80 ° C for 15 minutes. The DNA fragment of interest was sequenced using the BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), according to the manufacturer's instructions, in a final volume of 10µl. Sequence reactions were 10 purified with the BigDye® XTerminatorTM Purification Kit (Applied Biosystems), according to the manufacturer's protocol. Sequencing was performed by capillary electrophoresis on an ABI-Prism 3130 (Applied Biosystem) automatic sequencer.
Confermata la presenza dell’inserto e la sua corretta sequenza, la corrispondente colonia batterica è stata prelevata nuovamente e incubata in LB medium O/N a 37°C in 15 agitazione. Confirmed the presence of the insert and its correct sequence, the corresponding bacterial colony was taken again and incubated in LB medium O / N at 37 ° C with 15 stirring.
5.4 Estrazione di DNA plasmidico 5.4 Plasmid DNA Extraction
Il DNA plasmidico è stato estratto con E.Z.N.A Plasmid DNA Mini Kit I Spin Protocol (OMEGA Biotek) secondo il protocollo del produttore. La concentrazione del DNA estratto è stata quantificata tramite spettrofotometro MultiskanTM Go (Thermo Scientific) 20 e la sua integrità è stata verificata tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio. La correttezza della sequenza dell’inserto è stata nuovamente verificata. Il DNA plasmidico estratto è stato diluito ad una concentrazione finale di 3ng/µl mediante diluzioni seriali per la costruzione delle curve standard. Il numero di molecole/ng di DNA è stato determinato a partire dal peso molecolare e dal numero di Avogadro (si veda Tiziano et 25 al., 2010 per la descrizione dettagliata del metodo); le curve standard spaziavano in un range di concentrazione 10<2>-10<7 >molecole di miRNA. Le curve standard ottimali sono state scelte sulla base della pendenza (~-3.33) e del coefficiente di correlazione (R<2>=0.99-1), usato come una misura della riproducibilità sperimentale, ottenute dall’amplificazione in qPCR. Plasmid DNA was extracted with E.Z.N.A Plasmid DNA Mini Kit I Spin Protocol (OMEGA Biotek) according to the manufacturer's protocol. The concentration of the extracted DNA was quantified by MultiskanTM Go spectrophotometer (Thermo Scientific) 20 and its integrity was verified by electrophoretic run on agarose gel. The correctness of the insert sequence has been checked again. The extracted plasmid DNA was diluted to a final concentration of 3ng / µl by serial dilutions for the construction of the standard curves. The number of molecules / ng of DNA was determined starting from the molecular weight and the Avogadro number (see Tiziano et 25 al., 2010 for a detailed description of the method); the standard curves ranged over a concentration range of 10 <2> -10 <7> miRNA molecules. The optimal standard curves were chosen on the basis of the slope (~ -3.33) and the correlation coefficient (R <2> = 0.99-1), used as a measure of experimental reproducibility, obtained from the amplification in qPCR.
30 30
- 18 - SIB BI5210R - 18 - SIB BI5210R
6. qRT-PCR 6. qRT-PCR
Per identificare i miR deregolati nei campioni di siero di pazienti SMA, è stato utilizzato dapprima un approccio di qRT-PCR relativa, utilizzando il Pick-&-Mix miRNA PCR Panel da 96-well (EXIQON). Il pannello comprendeva primer liolifizzati ad LNA<TM>, specifici per 5 i miRNA di interesse, ed uno Spike-In (UniSp6) usato come calibratore interno. Le reazioni di PCR sono state preparate ed amplificate secondo le indicazioni del produttore. To identify the deregulated miRs in serum samples from SMA patients, a relative qRT-PCR approach was first used, using the 96-well Pick - & - Mix miRNA PCR Panel (EXIQON). The panel included freeze-dried LNA <TM> primers, specific for 5 miRNAs of interest, and a Spike-In (UniSp6) used as an internal calibrator. The PCR reactions were prepared and amplified according to the manufacturer's instructions.
Per l’analisi dei miR per i quali non fossero disponibili assay commerciali EXIQON e per la fase di validazione dei miR identificati mediante approccio relativo, è stata utilizzata la 10 qRT-PCR assoluta. La reazione è stata effettuata in un volume finale di 12.5µl con: For the analysis of the miRs for which commercial EXIQON assays were not available and for the validation phase of the miRs identified by a relative approach, the absolute 10 qRT-PCR was used. The reaction was carried out in a final volume of 12.5µl with:
6.25µl SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 2.5 nM di ciascun primer, 4µl cDNA diluito 1:25. 6.25µl SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 2.5 nM of each primer, 4µl cDNA diluted 1:25.
In ciascuna reazione è stato usato il primer R universale (v. sopra) ed un primer forward specifico per ciascun miRNA, come da sequenza pubblicata in miRBase 15 (www.mirbase.org) (Tabella 7). Per incrementare la temperatura di melting dei primer fino a ~60°C, calcolata con l’algoritmo OligoAnalyzer 3.1 (Integrated DNA Technologies), sono stati aggiunti all’estremità 5’ stretch di tetranucleotidi (GACT) che non formassero strutture secondarie o hairpin che potessero ridurre l’efficienza di amplificazione. La qRT-PCR è stata effettuata nello strumento ViiA 7<TM >Real-Time PCR System (Applied 20 Biosystems). Ciascun campione è stato amplificato in triplicato ed ogni esperimento è stato ripetuto almeno tre volte. The universal R primer (see above) and a specific forward primer for each miRNA were used in each reaction, as per the sequence published in miRBase 15 (www.mirbase.org) (Table 7). To increase the melting temperature of the primers up to ~ 60 ° C, calculated with the OligoAnalyzer 3.1 algorithm (Integrated DNA Technologies), tetranucleotides (GACT) that did not form secondary structures or hairpins were added to the 5 'stretch end. could reduce the amplification efficiency. QRT-PCR was performed in the ViiA 7 <TM> Real-Time PCR System (Applied 20 Biosystems) instrument. Each sample was amplified in triplicate and each experiment was repeated at least three times.
7. Iniezioni intratecali 7. Intrathecal injections
Gli antagomir commerciali sono stati acquisiti da EXIQON e risospesi in acqua. Prima dell’iniezione intra-cerebro-ventricolare, ciascun antagomir è stato diluito 1:1 in Cerebro 25 Spinal Fluid (CSF) artificiale 2x (238 mM NaCl, 52.4 mM NaHCO3, 5 mM KCl, 2 mM NaH2PO4, 2.6 mM MgCl2, 20 mM glucose). Dopo determinazione del genotipo a P1 (il giorno della nascita), è stata effettuata l’iniezione a P2 intra-cerebro-ventricolare dei topi affetti con 0.5 nM di ciascun antagomiR (in un volume finale di 1µl). L’effetto fenotipico del trattamento è stato valutato esclusivamente attraverso la sopravvivenza. Commercial antagomirs were acquired by EXIQON and resuspended in water. Prior to intra-cerebroventricular injection, each antagomir was diluted 1: 1 in 2x artificial Cerebro 25 Spinal Fluid (CSF) (238 mM NaCl, 52.4 mM NaHCO3, 5 mM KCl, 2 mM NaH2PO4, 2.6 mM MgCl2, 20 mM glucose). After determining the genotype at P1 (on the day of birth), intra-cerebro-ventricular P2 injection was performed in the affected mice with 0.5 nM of each antagonist (in a final volume of 1µl). The phenotypic effect of the treatment was evaluated exclusively through survival.
30 8. Analisi statistica 30 8. Statistical Analysis
- 19 - SIB BI5210R - 19 - SIB BI5210R
I file AQ (Absolute Quantification) ottenuti dalle qRT-PCR relative sono stati convertiti in file RQ (Relative Quantification) mediante RQ Manager 1.2 e successivamente analizzati con Real Time StatMiner® v4.1. Per l’identificazione e successiva eliminazione dall’analisi degli outliers è stato applicato il test di Grubbs. Lo Spike-In UniSp6 è stato 5 utilizzato come normalizzatore nelle qRT-PCR relative. Il confronto dei livelli dei diversi miRNA tra pazienti e controlli è stato effettuato utilizzando il test non-parametrico Wilcoxon e solo i miRNA con FDR (False Discovery Rate) < 0.05 sono stati considerati significativi. L’analisi statistica dei dati ottenuti dalle qRT-PCR assoluta è stata condotta mediante il software Statgraphics Centurion XV (StatPoint Inc.). Il confronto dei livelli dei 10 diversi miRNA tra pazienti e controlli, o tra le diverse forme di SMA, è stato effettuato utilizzando il test non-parametrico Mann-Withney U-test. Le variabili continue sono state confrontate mediante correlazioni lineari. La gravità del fenotipo è stata correlata con i diversi parametri molecolari (livelli di miRNA, livelli di trascritti SMN2, numero di geni SMN2) e clinici (Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded/Extended, Six minutes 15 walking test, North Star Ambulatory Assessment) mediante analisi multivariata. Per tutti i test, sono stati considerati significativi livelli di P≤0.05. The AQ (Absolute Quantification) files obtained from the relative qRT-PCRs were converted into RQ (Relative Quantification) files using RQ Manager 1.2 and subsequently analyzed with Real Time StatMiner® v4.1. For the identification and subsequent elimination of the outliers from the analysis, the Grubbs test was applied. The Spike-In UniSp6 was 5 used as a normalizer in relative qRT-PCR. Comparison of the levels of the different miRNAs between patients and controls was performed using the Wilcoxon non-parametric test and only miRNAs with FDR (False Discovery Rate) <0.05 were considered significant. Statistical analysis of the data obtained from absolute qRT-PCR was conducted using Statgraphics Centurion XV software (StatPoint Inc.). Comparison of the levels of the 10 different miRNAs between patients and controls, or between different forms of SMA, was performed using the non-parametric Mann-Withney U-test. Continuous variables were compared using linear correlations. The severity of the phenotype was correlated with different molecular parameters (miRNA levels, SMN2 transcript levels, number of SMN2 genes) and clinical (Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded / Extended, Six minutes 15 walking test, North Star Ambulatory Assessment) by multivariate analysis. For all tests, P≤0.05 levels were considered significant.
Infine, sensibilità e specificità della determinazione dei livelli di miRNA nei pazienti rispetto ai controlli sono state determinate mediante le ROC (Receiver Operator Charactestic) curves. Il valore di cut-off dei singoli miRNA o della somma dei tre è stato 20 identificato sulla base dei valori maggiori di sensibilità e specificità. Finally, the sensitivity and specificity of the determination of miRNA levels in patients compared to controls were determined using the ROC (Receiver Operator Charactestic) curves. The cut-off value of the single miRNAs or the sum of the three was identified on the basis of the higher values of sensitivity and specificity.
RISULTATI RESULTS
L’oggetto della presente invenzione può essere sintetizzato in due punti fondamentali: 1) l’identificazione di 3 miRNA prodotti dal muscolo scheletrico, deregolati nei pazienti SMA, come biomarcatori per la condizione. A tale scopo è stata sviluppata una metodica 25 di qPCR assoluta che consente la determinazione dei livelli dei miRNA nel siero (espressi come numero di molecole/µl di siero); 2) l’applicazione terapeutica della modulazione di tali miRNA in condizioni neurodegenerative quali, oltre la SMA, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). The object of the present invention can be summarized in two fundamental points: 1) the identification of 3 miRNAs produced by skeletal muscle, deregulated in SMA patients, as biomarkers for the condition. For this purpose, an absolute qPCR method 25 has been developed which allows the determination of miRNA levels in serum (expressed as number of molecules / µl of serum); 2) the therapeutic application of the modulation of these miRNAs in neurodegenerative conditions such as, in addition to SMA, amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
Al fine di identificare miRNA espressi in maniera differenziale tra pazienti e controlli, con 30 possibile applicazione come biomarcatori nella SMA, nella prima fase del nostro studio - 20 - SIB BI5210R In order to identify miRNAs expressed in a differential manner between patients and controls, with 30 possible application as biomarkers in SMA, in the first phase of our study - 20 - SIB BI5210R
abbiamo effettuato l’analisi differenziale dei livelli di espressione dei miRNA in campioni di muscolo scheletrico di pazienti SMA rispetto a controlli adeguatamente scelti. A questo scopo abbiamo condotto un’analisi del miRnoma mediante tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sia su colture di mioblasti e miotubi di 5 pazienti SMA e 5 5 controlli, che su biopsie muscolari di 7 pazienti SMA e 7 controlli. La scelta del doppio approccio, in vivo ed in vitro, ha diverse ragioni: 1) il modello in vitro ha consentito di analizzare una popolazione omogenea di cellule, indipendentemente dai processi di denervazione, re-innervazione ed atrofia che si verificano normalmente nel muscolo SMA e, di conseguenza, di identificare miRNA la cui deregolazione potrebbe avere 10 rilevanza patogenetica; 2) l’uso del modello in vivo ha avuto un maggior impatto nell’identificazione di nuovi miRNA biomarcatori, poiché meglio riflette il processo fisiopatologico che si verifica nei pazienti durante il decorso della condizione. L’analisi comparativa dei campioni SMA verso i controlli ha dimostrato che i due gruppi clusterizzano separatamente. Nelle colture di mioblasti e miotubi SMA, abbiamo 15 identificato 22 e 19 miRNA, rispettivamente, espressi in maniera differenziale (alfa <0.05), suggerendo l’esistenza di un difetto muscolare primitivo, indipendente dal processo denervativo. Novantanove miRNA sono risultati deregolati nelle biopsie muscolari dei pazienti (alfa <0.05) (Fig. 1): tra questi, 5 miRNA erano condivisi con mioblasti e miotubi. Tre miRNA (miR-1, miR-133a and miR208b) mostravano una 20 regolazione opposta nelle colture muscolari rispetto alle biopsie: tale discrepanza è verosimilmente dovuta al diverso grado di maturazione delle fibrocellule muscolari nel modello in vitro e/o alla mancanza di innervazione. Tra i miRNA deregolati, alcuni svolgono un ruolo chiave nella fisiologia muscolare; alcuni di essi erano stati precedentemente identificati come biomarcatori per altre condizioni neuromuscolari 25 (miR-1, miR-133a/b e miR-206). Inoltre, i nostri dati indicano che i miRNA coinvolti in processi di atrofia/denervazione sono deregolati anche nella SMA e la loro modulazione potrebbe essere un valido bersaglio terapeutico per rallentare la progressione della malattia. we performed the differential analysis of miRNA expression levels in skeletal muscle samples from SMA patients compared to adequately selected controls. To this end, we conducted an analysis of the miRnoma using next generation sequencing techniques (NGS) both on cultures of myoblasts and myotubes from 5 SMA patients and 5 5 controls, and on muscle biopsies from 7 SMA patients and 7 controls. The choice of the double approach, in vivo and in vitro, has several reasons: 1) the in vitro model allowed to analyze a homogeneous population of cells, regardless of the denervation, re-innervation and atrophy processes that normally occur in the SMA muscle and, consequently, to identify miRNAs whose deregulation could have pathogenetic significance; 2) the use of the in vivo model had a greater impact in the identification of new biomarker miRNAs, as it better reflects the pathophysiological process that occurs in patients during the course of the condition. Comparative analysis of SMA samples versus controls showed that the two groups cluster separately. In cultures of SMA myoblasts and myotubes, we identified 15 22 and 19 miRNAs, respectively, expressed differentially (alpha <0.05), suggesting the existence of a primitive muscle defect, independent of the denervative process. Ninety-nine miRNAs were found to be deregulated in the patients' muscle biopsies (alpha <0.05) (Fig. 1): among these, 5 miRNAs were shared with myoblasts and myotubes. Three miRNAs (miR-1, miR-133a and miR208b) showed opposite regulation in muscle cultures compared to biopsies: this discrepancy is likely due to the different degree of maturation of the muscle cells in the in vitro model and / or the lack of innervation. Among the deregulated miRNAs, some play a key role in muscle physiology; some of them had previously been identified as biomarkers for other neuromuscular conditions 25 (miR-1, miR-133a / b and miR-206). Furthermore, our data indicate that miRNAs involved in atrophy / denervation processes are also deregulated in SMA and their modulation could be a valid therapeutic target for slowing the progression of the disease.
I 99 miRNA deregolati nelle biopsie muscolari sono stati validati come potenziali 30 biomarcatori per la SMA. Abbiamo usato un approccio sviluppato in due fasi: Fase 1: - 21 - SIB BI5210R The 99 miRNAs deregulated in muscle biopsies were validated as a potential 30 biomarkers for SMA. We used a two-step developed approach: Phase 1: - 21 - SIB BI5210R
abbiamo testato i livelli di espressione dei 99 miRNA deregolati emersi dall’analisi delle biopsie muscolari su campioni di siero di 10 pazienti SMA e 10 controlli mediante qRT-PCR relativa con saggi commerciali (Exiqon, miRCURY LNA). Test commerciali erano disponibili per 76/99 miR deregolati nelle biopsie muscolari. La quantificazione relativa 5 è stata eseguita utilizzando uno spike-in, Unisp6, come calibratore. Per un valore di alfa <0.05, 21 miRNA erano significativamente sovra-espressi e 3 sotto-espressi nel siero dei pazienti SMA rispetto ai controlli, risultando dunque potenziali biomarcatori (Fig.2) Fase 2: Per i 24 miRs individuati nella Fase 1 e per i 23 miRs per i quali non erano disponibili assay commerciali, abbiamo sviluppato un sistema in-house di qRT-PCR 10 assoluta. Utilizzando tali assay, abbiamo analizzato i livelli di espressione di 47/99 miR identificati dall’analisi del miRnoma su 91 campioni di siero (51 di pazienti affetti da diverse forme di SMA e 40 di soggetti sani di controllo, Fig. 2). La maggior parte dei miRNA analizzati non erano dosabili o non espressi in maniera differenziale tra pazienti e controlli; 3 miRNA (miR324-5p, miR181a-5p e miR-451a) sono risultati promettenti 15 biomarcatori per la SMA, poiché significativamente sovra-espressi in campioni di siero di pazienti. Di particolare interesse, alcuni studi hanno dimostrato il coinvolgimento del miR-181a-5p e del miR-451a nel controllo dei processi di differenziamento miogenico (Naguibneva et al., 2006 e Dmitriev et al., 2013). In seguito, abbiamo valutato l’applicabilità dei miRNA sopraindicati come biomarcatori per la SMA, analizzando 20 possibili correlazioni tra i livelli sierici e alcuni parametri clinici. La prima e più semplice correlazione analizzata è quella tra i livelli dei singoli miRNA e la gravità del fenotipo (forma di SMA): i livelli del miR-181a-5p non correlano con la gravità della condizione, mentre il miR-324-5p è sotto-espresso nelle SMA I rispetto alle SMA II (P=0.03) e III (P=0.04). Analogamente, il miR-451a è sotto-espresso nelle SMA I rispetto alle SMA III 25 (P=0.03), ma non alle SMA II (Fig.3). In seguito, è stato valutato il potere predittivo della quantificazione dei miRNA (singoli o combinati) nel distinguere i pazienti dai controlli. A tale scopo, abbiamo costruito le ROC curves. Il miRNA maggiormente predittivo è il miR-181a-5p: fissando il cut-off a 70.5 molecole/µl, la determinazione del miRNA ha una sensibilità diagnostica del 75% ed una specificità del 61% (Fig. 4a); la somma dei 3 30 miRNA incrementa sensibilità e specificità: in particolare, fissando il cut-off a 380 - 22 - SIB BI5210R we tested the expression levels of the 99 deregulated miRNAs that emerged from the analysis of muscle biopsies on serum samples from 10 SMA patients and 10 controls by relative qRT-PCR with commercial assays (Exiqon, miRCURY LNA). Commercial tests were available for 76/99 miR deregulated in muscle biopsies. Relative quantification 5 was performed using a spike-in, Unisp6, as a calibrator. For an alpha value <0.05, 21 miRNAs were significantly over-expressed and 3 under-expressed in the serum of SMA patients compared to controls, thus resulting in potential biomarkers (Fig. 2) Phase 2: For the 24 miRs identified in Phase 1 and for the 23 miRs for which no commercial assays were available, we developed an in-house absolute qRT-PCR 10 system. Using these assays, we analyzed the expression levels of 47/99 miR identified by the analysis of the miRnoma on 91 serum samples (51 from patients with different forms of SMA and 40 from healthy control subjects, Fig. 2). Most of the miRNAs analyzed were undetectable or not differentially expressed between patients and controls; 3 miRNAs (miR324-5p, miR181a-5p and miR-451a) were promising 15 biomarkers for SMA, as they were significantly over-expressed in patient serum samples. Of particular interest, some studies have shown the involvement of miR-181a-5p and miR-451a in the control of myogenic differentiation processes (Naguibneva et al., 2006 and Dmitriev et al., 2013). We then evaluated the applicability of the above miRNAs as biomarkers for SMA, analyzing 20 possible correlations between serum levels and some clinical parameters. The first and simplest correlation analyzed is that between the levels of individual miRNAs and the severity of the phenotype (form of SMA): the levels of miR-181a-5p do not correlate with the severity of the condition, while the miR-324-5p is under-expressed in SMA I compared to SMA II (P = 0.03) and III (P = 0.04). Similarly, miR-451a is under-expressed in SMA I compared to SMA III 25 (P = 0.03), but not in SMA II (Fig. 3). Next, the predictive power of miRNA quantification (single or combined) in distinguishing patients from controls was assessed. For this purpose, we have built the ROC curves. The most predictive miRNA is miR-181a-5p: setting the cut-off at 70.5 molecules / µl, the determination of miRNA has a diagnostic sensitivity of 75% and a specificity of 61% (Fig. 4a); the sum of the 3 30 miRNAs increases sensitivity and specificity: in particular, setting the cut-off at 380 - 22 - SIB BI5210R
molecole/µl, sensibilità e specificità raggiungono l’80 e il 74%, rispettivamente (Fig.4b). Infine, abbiamo valutato il potenziale ruolo terapeutico dei miRNA in esame mediante iniezioni intratecali in modelli murini SMA (topi SMNΔ7). Dal momento che i nostri dati indicano che i miRNA selezionati sono secreti attivamente dal muscolo scheletrico nel 5 circolo sanguigno, abbiamo ipotizzato che potessero agire come segnale pro-apoptotico o di sopravvivenza su altri distretti tissutali, in particolare sui motoneuroni spinali. Al fine di testare questa ipotesi, abbiamo iniettato 5 topi SMNΔ7 con ciascun antagomiR e altri 5 con un antagomiR-scramble di controllo. Abbiamo eseguito una singola iniezione di 5 nM di ogni antagomiR a due giorni di vita post-natale (P2) e valutato la sopravvivenza di 10 topi iniettati con ciascun antagomiR rispetto a quelli iniettati con il controllo negativo o non trattati. A differenza degli altri due antagomir, il trattamento con antimiR-181a-5p ha indotto un significativo aumento della sopravvivenza dei topi (p=0,004, fig.5 e dati non mostrati). L’anti-miR-324-5p ha indotto un significativo incremento ponderale dei topi trattati (dati non mostrati. Il meccanismo di azione degli antagomiR è sconosciuto e sarà 15 oggetto di uno studio dedicato. La prima ipotesi che abbiamo testato è se l’incremento della sopravvivenza dei topi SMA potesse essere dovuta all’eventuale modulazione dell’espressione dei geni SMN da parte del miR-181a. A tale scopo abbiamo transfettato cellule di neuroblastoma SH-SY5Y con il mimic-181a. Come appare chiaro dai dati in fig.6, sebbene vi sia un incremento molto consistente dei livelli del miR-181a, i livelli di 20 SMN rimangono sostanzialmente inviariati. Pertanto il meccanismo d’azione del miR è indipendente da SMN. molecules / µl, sensitivity and specificity reach 80 and 74%, respectively (Fig.4b). Finally, we evaluated the potential therapeutic role of the miRNAs under investigation by intrathecal injections in SMA mouse models (SMNΔ7 mice). Since our data indicate that the selected miRNAs are actively secreted by skeletal muscle in the 5th bloodstream, we hypothesized that they could act as a pro-apoptotic or survival signal on other tissue districts, in particular on spinal motor neurons. In order to test this hypothesis, we injected 5 SMNΔ7 mice with each antagomiR and another 5 with a control antagomiR-scramble. We performed a single 5 nM injection of each antagomiR at two days of postnatal life (P2) and evaluated the survival of 10 mice injected with each antagonist versus those injected with the negative control or untreated. Unlike the other two antagomirs, treatment with antimiR-181a-5p induced a significant increase in the survival of the mice (p = 0.004, fig. 5 and data not shown). Anti-miR-324-5p induced significant weight gain in treated mice (data not shown. The mechanism of action of antagomiRs is unknown and will be the subject of a dedicated study. 15 The first hypothesis we tested is whether increased survival of SMA mice could be due to the possible modulation of SMN gene expression by miR-181a. To this purpose we transfected neuroblastoma cells SH-SY5Y with mimic-181a. As it appears clear from the data in fig .6, although there is a very substantial increase in the levels of miR-181a, the levels of 20 SMN remain substantially sent in. Therefore the mechanism of action of miR is independent of SMN.
DISCUSSIONE DISCUSSION
Gli inventori hanno identificato miRNA deregolati nei pazienti SMA rispetto ai controlli. L’obiettivo primario dello studio è stato identificare dei biomarcatori per la condizione: 1) 25 la cui modulazione fosse indipendente dai prodotti dei geni SMN2 e 2) che derivassero da un tessuto (il muscolo scheletrico) che ha un ruolo centrale nel meccanismo patogenetico della condizione. Visto il coinvolgimento del muscolo scheletrico (sia esso attivo, come effetto retrogrado sul motoneurone spinale, o passivo, in seguito alla denervazione e all’innesco dei processi di atrofia) nella SMA, il razionale dietro la scelta 30 di questo approccio era di identificare miRNA deregolati su tessuti derivanti da pazienti. The inventors identified deregulated miRNAs in SMA patients compared to controls. The primary objective of the study was to identify biomarkers for the condition: 1) 25 whose modulation was independent of the products of the SMN2 genes and 2) which derived from a tissue (skeletal muscle) that plays a central role in the pathogenetic mechanism of condition. Given the involvement of skeletal muscle (be it active, as a retrograde effect on the spinal motor neuron, or passive, following denervation and triggering of atrophy processes) in SMA, the rationale behind choosing this approach was to identify miRNA deregulated on tissues deriving from patients.
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I miRNA deregolati nel muscolo scheletrico sono stati identificati mediante analisi del miRNoma di biopsie muscolari e sono stati successivamente quantificati in oltre 90 campioni di siero di pazienti e controlli. Dei 99 miRNA deregolati nel muscolo scheletrico dei pazienti, solo 3 erano dosabili e/o deregolati nel siero dei pazienti. Da notare che 5 tipici myomiRs, quali miR-1, miR-133 e miR-2016, sovra-espressi nel siero di pazienti affetti da DMD (Cacchiarelli et al., 2011) o miR normalmente rilasciati in circolo durante processi di morte cellulare, non sono deregolati nei sieri SMA. Questi dati indicano che 1) i 3 miRNA sono secreti attivamente nel plasma, verosimilmente in vescicole esosomiali; 2) il muscolo scheletrico dei pazienti SMA non rilascia miRNA in maniera 10 passiva, a differenza di altre condizioni neuromuscolari, in cui può esservi leakage del sarcolemma. MiRNAs deregulated in skeletal muscle were identified by miRNoma analysis of muscle biopsies and were subsequently quantified in over 90 patient and control serum samples. Of the 99 miRNAs deregulated in patient skeletal muscle, only 3 were detectable and / or deregulated in patient serum. Note that 5 typical myomiRs, such as miR-1, miR-133 and miR-2016, over-expressed in the serum of patients affected by DMD (Cacchiarelli et al., 2011) or miR normally released into the circulation during cell death processes, they are not deregulated in SMA sera. These data indicate that 1) the 3 miRNAs are actively secreted into plasma, probably in exosomal vesicles; 2) the skeletal muscle of SMA patients does not passively release miRNA 10, unlike other neuromuscular conditions, in which sarcolemma leakage may occur.
I tre miRNA identificati (HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e HSA-miR451a) sono sovra-espressi nei pazienti e consentono di differenziare pazienti e controlli con una sensibilità dell’80% e una specificità del 74% (p<0.0001). HSA-miR324-5p e HSA-15 miR451a sono inoltre correlati con la gravità fenotipica, dal momento che presentano livelli significativamente più elevati nelle forme meno gravi di SMA. The three miRNAs identified (HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and HSA-miR451a) are over-expressed in patients and allow differentiating patients and controls with an 80% sensitivity and 74% specificity (p < 0.0001). HSA-miR324-5p and HSA-15 miR451a also correlate with phenotypic severity, as they have significantly higher levels in less severe forms of SMA.
Nell’ipotesi di un sistema di comunicazione a distanza tra il muscolo scheletrico e i motoneuroni spinali, mediato dagli HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p e HSA-miR451a, è stato valutato l’effetto della iniezione intratecale di ciascun antagomiR in un modello 20 murino grave di SMA. L’anti-miR-181a-5p induce un incremento significativo della sopravvivenza dei topi affetti. Questi dati dimostrano, per la prima volta, che la modulazione in vivo dei livelli di un miRNA in una condizione neurodegenerativa può costituire un approccio terapeutico, indipendentemente dalla correzione del difetto genetico di base. Pertanto, la modulazione di HSA-miR181a-5p può essere considerato 25 un approccio terapeutico per la SMA, in combinazione con altri trattamenti, ma può essere efficace anche in altre malattie neurodegenerative quali la SLA, che presenta numerose caratteristiche comuni con la SMA. Sarebbe inoltre interessante valutarne l’applicazione in altre condizioni neurodegenerative del SNC, quali la malattia di Alzheimer e di Parkinson. In the hypothesis of a remote communication system between skeletal muscle and spinal motor neurons, mediated by HSA-miR181a-5p, HSA-miR324-5p and HSA-miR451a, the effect of the intrathecal injection of each antagomiR in a severe murine model 20 of SMA. Anti-miR-181a-5p induces a significant increase in the survival of affected mice. These data demonstrate, for the first time, that in vivo modulation of miRNA levels in a neurodegenerative condition can constitute a therapeutic approach, regardless of the correction of the underlying genetic defect. Therefore, modulation of HSA-miR181a-5p can be considered 25 as a therapeutic approach for SMA, in combination with other treatments, but can also be effective in other neurodegenerative diseases such as ALS, which has several features common with SMA. It would also be interesting to evaluate its application in other neurodegenerative conditions of the CNS, such as Alzheimer's and Parkinson's disease.
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L’uso di metodiche basate sulla qRT-PCR assoluta per la quantificazione dei livelli di miRNA nel siero ha consentito di ridurre il bias della variabilità sperimentale. Poiché i livelli di espressione dei miRNA sono in generale molto bassi, le metodiche relative inseriscono numerosi possibili bias. Questa osservazione potrebbe spiegare la scarsa 5 riproducibilità dei dati di miRNA profiling pubblicati. Sebbene siano stati descritti ad oggi alcuni miRNA deregolati nella SMA, la presente invenzione offre alcuni vantaggi rispetto a quanto noto: 1) a differenza di quanto riportato in letteratura, i dati sono stati ottenuti a partire da materiale biologico di origine umana (campioni di muscolo scheletrico) e non da colture cellulari o da tessuti di modelli pre-clinici. Inoltre, l’uso del muscolo scheletrico 10 ha consentito di analizzare un tessuto sicuramente coinvolto nei meccanismi patogenetici della SMA. I campioni analizzati sono particolarmente preziosi e rari poiché derivanti da biopsie muscolari effettuate a scopo diagnostico diversi anni fa: bisogna tenere conto che, data la disponibilità di un test genetico altamente sensibile e specifico, la biopsia muscolare è procedura ormai obsoleta nel processo diagnostico della SMA, 15 oltre ad essere eticamente non accettabile. The use of methods based on absolute qRT-PCR for the quantification of miRNA levels in serum allowed to reduce the bias of the experimental variability. Since miRNA expression levels are generally very low, related methods insert numerous possible biases. This observation could explain the poor reproducibility of published miRNA profiling data. Although some miRNAs deregulated in SMA have been described to date, the present invention offers some advantages with respect to what is known: 1) unlike what is reported in the literature, the data have been obtained starting from biological material of human origin (muscle samples skeletal) and not from cell cultures or from pre-clinical model tissues. Furthermore, the use of skeletal muscle 10 made it possible to analyze a tissue that is certainly involved in the pathogenetic mechanisms of SMA. The samples analyzed are particularly precious and rare since they derive from muscle biopsies carried out for diagnostic purposes several years ago: it must be taken into account that, given the availability of a highly sensitive and specific genetic test, muscle biopsy is an obsolete procedure in the diagnostic process of SMA. , 15 as well as being ethically unacceptable.
Nel disegno del protocollo sperimentale, si sarebbero potuti identificare direttamente i miRNA deregolati nel siero dei pazienti rispetto ai controlli. Tuttavia si è preferito identificare miRNA correlati alla fisiopatologia della SMA e procedere poi all’analisi biased su campioni di siero dei miRNA deregolati nel muscolo scheletrico. Questo 20 approccio, a differenza degli studi pubblicati non solo in ambito SMA ma anche di altre condizioni, ha consentito di individuare 3 miRNA deregolati, ma soprattutto di dare un significato terapeutico oltre che prognostico/patogenetico all’invenzione. La scoperta di maggior impatto traslazionale dello studio è la definizione del ruolo terapeutico della modulazione del HSA-miR-181a-5p. Visti i pochi dati della letteratura scientifica 25 disponibili sulla funzione di questo miRNA, è verosimile che agisca in maniera proapoptotica e che la sua inibizione possa aumentare la sopravvivenza neuronale (Moon et al., 2013). A differenza di quanto riportato in letteratura, i dati indicano che HSA-miR-181a-5p possa derivare dal muscolo scheletrico e non soltanto essere prodotto in loco nel SNC. Inoltre, la co-somministrazione dell’anti-HSA-miR-181a-5p potrebbe 30 potenziare l’effetto terapeutico del Nusinersen o di altri farmaci che modulino i livelli di - 25 - SIB BI5210R In the design of the experimental protocol, the deregulated miRNAs could have been directly identified in the serum of the patients compared to the controls. However, it was preferred to identify miRNAs related to the pathophysiology of SMA and then proceed to biased analysis on serum samples of miRNAs deregulated in skeletal muscle. This approach, unlike the studies published not only in the SMA field but also in other conditions, made it possible to identify 3 deregulated miRNAs, but above all to give a therapeutic as well as prognostic / pathogenetic significance to the invention. The finding of greatest translational impact of the study is the definition of the therapeutic role of the modulation of HSA-miR-181a-5p. Given the limited data available in the scientific literature 25 on the function of this miRNA, it is likely that it acts in a proapoptotic manner and that its inhibition may increase neuronal survival (Moon et al., 2013). Unlike what has been reported in the literature, the data indicate that HSA-miR-181a-5p may derive from skeletal muscle and not only be produced locally in the CNS. Furthermore, the co-administration of anti-HSA-miR-181a-5p could 30 enhance the therapeutic effect of Nusinersen or other drugs that modulate the levels of - 25 - SIB BI5210R
SMN. Infine, l’anti-HSA-miR-181a-5p potrebbe essere utile in altre condizioni neurodegenerative, soprattutto nella SLA che condivide diversi aspetti patogenetici con la SMA. SMN. Finally, anti-HSA-miR-181a-5p could be useful in other neurodegenerative conditions, especially in ALS which shares various pathogenetic aspects with SMA.
5 DESCRIZIONE DELLE SEQUENZE 5 DESCRIPTION OF THE SEQUENCES
SEQ ID NO 1 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU micro RNA HSA-miR181a-5p ha SEQ ID NO 1 e numero d’accesso miRbase MIMAT0000256; SEQ ID NO 1 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU micro RNA HSA-miR181a-5p has SEQ ID NO 1 and miRbase access number MIMAT0000256;
SEQ ID NO 2 CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU micro RNA HSA-miR324-5p numero d’accesso miRbase MIMAT0000761; SEQ ID NO 2 CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU micro RNA HSA-miR324-5p miRbase access number MIMAT0000761;
10 SEQ ID NO 3 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU micro RNA HSA-miR-451a ha SEQ ID NO 3 e numero d’accesso miRbase MIMAT0001631; 10 SEQ ID NO 3 AAACCGUACCAUUACUGAGUU micro RNA HSA-miR-451a has SEQ ID NO 3 and miRbase access number MIMAT0001631;
SEQ ID NO 4 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-181a-5p product sequence 5’-C*G*A*C*A*G*C*G*T*T*G*A*A*T*G*T-3’)3’; SEQ ID NO 4 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-181a-5p product sequence 5'-C * G * A * C * A * G * C * G * T * T * G * A * A * T * G * T-3 ') 3';
SEQ ID NO 5 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-451a- product sequence 5’-15 G*T*A*A*T*G*G*T*A*A*C*G*G*T*T-3’); SEQ ID NO 5 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-451a- product sequence 5'-15 G * T * A * A * T * G * G * T * A * A * C * G * G * T * T- 3 ');
SEQ ID NO 6 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-324-5p product sequence 5’-A*T*G*C*C*C*T*A*G*G*G*G*A*T*G*C-3’) SEQ ID NO 6 (LNA miRNA inhibitor mmu-miR-324-5p product sequence 5'-A * T * G * C * C * C * T * A * G * G * G * G * A * T * G * C-3 ')
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