IT201800004270A1

IT201800004270A1 - FORMULATION BASED ON SERENOA REPENS

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Publication number: IT201800004270A1
Application number: IT102018000004270A
Authority: IT
Priority date: 2018-04-06
Filing date: 2018-04-06
Publication date: 2019-10-06

Description

Titolo: FORMULAZIONE A BASE DI SERENOA REPENS Title: FORMULATION BASED ON SERENOA REPENS

Descrizione Description

Campo della tecnica dell’invenzione Field of the technique of the invention

Forma oggetto della presente invenzione una formulazione a base di Serenoa repens e Vaccinium macrocarpon. The subject of the present invention is a formulation based on Serenoa repens and Vaccinium macrocarpon.

Stato dell’arte State of the art

L'iperplasia prostatica benigna (IPB o BPH - benign prostatic hyperplasia), conosciuta anche come adenoma prostatico o, in maniera inesatta, come "ipertrofia prostatica benigna", è una condizione caratterizzata dall'aumento di volume della ghiandola prostatica. Benign prostatic hyperplasia (BPH or BPH - benign prostatic hyperplasia), also known as prostate adenoma or, incorrectly, as "benign prostatic hypertrophy", is a condition characterized by the enlargement of the prostate gland.

Nel 2010, a livello globale, l'iperplasia prostatica benigna interessava circa 210 milioni di maschi (il 6% della popolazione). In 2010, globally, benign prostatic hyperplasia affected approximately 210 million males (6% of the population).

A livello microscopico, l'IPB può essere notata nelle cellule prostatiche della maggior parte degli uomini anziani, particolarmente dopo i 70 anni, in tutto il mondo. Per un uomo senza sintomi di 46 anni, il rischio di sviluppare la condizione nei prossimi 30 anni è del 45%. I tassi di incidenza aumentano da 3 casi per 1000 anni/uomo in età 45-49 anni, a 38 casi per 1000 anni/uomo dall'età di 75-79 anni. Mentre il tasso di prevalenza è del 2,7% per gli uomini di età compresa tra 45 e 49 anni ed aumenta al 24% all'età di 80 anni. On a microscopic level, BPH can be seen in the prostate cells of most older men, particularly after age 70, around the world. For a 46-year-old man without symptoms, the risk of developing the condition in the next 30 years is 45%. Incidence rates increase from 3 cases per 1000 man-years at the age of 45-49, to 38 cases per 1000 man-years from the age of 75-79 years. While the prevalence rate is 2.7% for men between the ages of 45 and 49 and increases to 24% by the age of 80.

Il grado dei sintomi significativi della patologia varia notevolmente in funzione dello stile di vita del paziente. Gli uomini che conducono uno stile di vita di tipo occidentale hanno una maggiore incidenza nella sintomatologia dell'IPB rispetto a chi conduce una vita tradizionale e più rurale. Questo è confermato da ricerche condotte in Cina, che dimostrano come uomini che vivono in aree rurali hanno minori frequenze della patologia, mentre chi vive in grandi città, nella stessa nazione, mostra una incidenza molto maggiore, anche se ancora molto inferiore agli uomini che vivono in occidente. The degree of significant symptoms of the disease varies greatly depending on the patient's lifestyle. Men who lead a Western-style lifestyle have a higher incidence of BPH symptoms than those who lead a traditional and more rural life. This is confirmed by research conducted in China, which shows that men living in rural areas have lower frequencies of the disease, while those who live in large cities, in the same country, show a much greater incidence, although still much lower than men who live in the west.

Gli alfa bloccanti (α1-recettori adrenergici antagonisti) procurano un sostanziale miglioramento dei sintomi dell'IPB, rilassando la muscolatura della prostata e del collo vescicale e aumentando la portata del flusso urinario. Molecole come doxazosina, terazosina, alfuzosina, silodosina e ta msulosina vengono impiegate con successo. Gli alfa bloccanti possono tuttavia causare eiaculazione retrograda. Alpha blockers (α1-adrenergic receptor antagonists) provide a substantial improvement in BPH symptoms by relaxing the prostate and bladder neck muscles and increasing the urinary flow rate. Molecules such as doxazosin, terazosin, alfuzosin, silodosin and ta msulosin are used successfully. However, alpha blockers can cause retrograde ejaculation.

Gli inibitori della 5α-reduttasi, (finasteride e dutasteride) sono un altro trattamento praticato. Quando vengono usati in abbinamento agli alfa bloccanti, si è notata una drastica riduzione del volume della prostata in persone con ghiandole molto ipertrofiche. 5α-reductase inhibitors, (finasteride and dutasteride) are another treatment practiced. When used in combination with alpha blockers, a drastic reduction in prostate volume has been noted in people with very hypertrophic glands.

L'estratto del frutto della Serenoa repens ha dimostrato efficacia nel ridurre i sintomi della patologia. Altre erbe medicinali che hanno alla base sistematiche ricerche sono il beta-sitosterolo estratto dalla Hypoxis rooperi (pianta grassa africana) e la pigelina (estratta da Prunus africana), mentre vi è una minore conoscenza sull'efficacia della Cucurbita pepo (semi di zucca) e dell’Urtica dioica. In ultimo, una sperimentazione condotta in doppio cieco ha avvalorato l'efficacia del polline del fiore delle segali. The extract of the fruit of the Serenoa repens has been shown to be effective in reducing the symptoms of the disease. Other medicinal herbs that are based on systematic research are beta-sitosterol extracted from Hypoxis rooperi (African succulent plant) and pigelin (extracted from Prunus africana), while there is less knowledge on the effectiveness of Cucurbita pepo (pumpkin seeds) and the dioecious Urtica. Finally, a double-blind experimentation has confirmed the effectiveness of the pollen of the rye flower.

Sommario dell’invenzione Summary of the invention

Un problema tecnico indirizzato dalla presente invenzione è quello di mettere a disposizione una formulazione utilizzabile efficacemente nel trattamento dell’iperplasia prostatica benigna. A technical problem addressed by the present invention is that of providing a formulation that can be used effectively in the treatment of benign prostatic hyperplasia.

Inoltre, un problema tecnico dell’invenzione è quello di mettere a disposizione una formulazione per il trattamento dell’iperplasia prostatica benigna avente una biodisponibilità sufficientemente elevata. Furthermore, a technical problem of the invention is that of providing a formulation for the treatment of benign prostatic hyperplasia having a sufficiently high bioavailability.

Oggetto dell’invenzione è quindi una formulazione a base di Serenoa repens e Vaccinium macrocarpon come definita nelle annesse rivendicazioni, le cui definizioni formano parte integrante della presente descrizione. The object of the invention is therefore a formulation based on Serenoa repens and Vaccinium macrocarpon as defined in the attached claims, the definitions of which form an integral part of this description.

La formulazione dell’invenzione ha dimostrato: The formulation of the invention has shown:

- Una migliore biodisponibilità ed assorbimento enterico degli attivi specifici con assenza di tossicità cellulare, - Better bioavailability and enteric absorption of specific active ingredients with no cellular toxicity,

- Una buona attività di riduzione del volume della prostata grazie all’effetto apoptotico con assenza di tossicità cellulare, - A good reduction in the volume of the prostate thanks to the apoptotic effect with the absence of cellular toxicity,

- Una buona attività antiinfiammatoria con riduzione di marcatori specifici con assenza di tossicità cellulare, - A good anti-inflammatory activity with reduction of specific markers with absence of cellular toxicity,

- Una buona azione di riduzione dell’antigene prostatico specifico (PSA) dovuto all’attività di inibizione dell’enzima 5α-reduttasi con riduzione della conversione di Testosterone a Diidrotestosterone. - A good action to reduce prostate specific antigen (PSA) due to the inhibition activity of the 5α-reductase enzyme with a reduction in the conversion of Testosterone to Dihydrotestosterone.

- Una buona attività miorilassante che permette un miglior svuotamento della vescica in condizioni di iperplasia prostatica, - A good muscle relaxant activity that allows a better emptying of the bladder in conditions of prostatic hyperplasia,

- Una buona azione antiadesiva batterica in grado di prevenire l’insorgenza di prostatiti e pielonefriti. In tal senso, la formulazione dell’invenzione agisce in modo sinergico migliorando il benessere prostatico ed apportando un reale beneficio ad un paziente affetto da iperplasia prostatica benigna. - A good bacterial anti-adhesive action able to prevent the onset of prostatitis and pyelonephritis. In this sense, the formulation of the invention acts synergistically by improving prostatic well-being and providing a real benefit to a patient suffering from benign prostatic hyperplasia.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è quindi la formulazione a base di Serenoa repens e Vaccinium macrocarpon dell’invenzione, per l’uso nel trattamento della iperplasia prostatica benigna. A further object of the invention is therefore the Serenoa repens and Vaccinium macrocarpon-based formulation of the invention, for use in the treatment of benign prostatic hyperplasia.

Ancora un altro oggetto dell’invenzione è una formulazione a base di Serenoa repens e Vaccinium macrocarpon comprendente ulteriormente estratto di Solanum lycopersicum o Licopene in forma purificata. Yet another object of the invention is a formulation based on Serenoa repens and Vaccinium macrocarpon further comprising extract of Solanum lycopersicum or Lycopene in purified form.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è quello di mettere a disposizione una formulazione per il trattamento dell’iperplasia prostatica benigna contenente principi attivi lipofili ed idrofili, in cui detta formulazione è una formulazione in forma solida. A further object of the invention is to provide a formulation for the treatment of benign prostatic hyperplasia containing lipophilic and hydrophilic active ingredients, in which said formulation is a solid formulation.

Un diverso oggetto dell’invenzione è quindi un procedimento per la preparazione della formulazione dell’invenzione come definito nelle rivendicazioni da 7 a 10. A different object of the invention is therefore a process for the preparation of the formulation of the invention as defined in claims 7 to 10.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del processo secondo l’invenzione risulteranno dalla descrizione di seguito riportata di esempi preferiti di realizzazione, dati a titolo indicativo e non limitativo. Further features and advantages of the process according to the invention will result from the following description of preferred embodiment examples, given for indicative and non-limiting purposes.

Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention

La presente invenzione riguarda una formulazione a base di Serenoa repens e Vaccinium macrocarpon. The present invention relates to a formulation based on Serenoa repens and Vaccinium macrocarpon.

La Serenoa repens è una palma con fusto che può raggiungere un'altezza tra i 2 ed i 4 metri. Serenoa repens is a palm with a stem that can reach a height between 2 and 4 meters.

È una palma a ventaglio appartenente alle Livistoneae, endemiche nel sud-est degli Stati Uniti (dove è anche nota come Saw Palmetto), soprattutto lungo le coste e lungo il litorale dell'oceano Atlantico dal South Carolina alla Florida e, verso Ovest, fino al Texas. It is a fan palm belonging to the Livistoneae, endemic to the southeastern United States (where it is also known as Saw Palmetto), especially along the coasts and along the coast of the Atlantic Ocean from South Carolina to Florida and, towards the west, up to to Texas.

Cresce in fitte boscaglie adiacenti alle coste o nei sottoboschi di pini e latifoglie, su terreno sabbioso, soprattutto lungo le pianure costiere. It grows in dense thickets adjacent to the coasts or in the undergrowth of pine and deciduous trees, on sandy soil, especially along the coastal plains.

Il frutto è una drupa di colore nero-rossastro. The fruit is a reddish-black drupe.

Sono state eseguite diverse ricerche sugli estratti dei frutti e si è potuto dimostrare che la Serenoa repens è ricchissima di acidi grassi e fitosteroli. Several researches have been carried out on fruit extracts and it has been shown that Serenoa repens is very rich in fatty acids and phytosterols.

I principi attivi della pianta sono in grado di stimolare a livello prostatico i recettori estrogenici e di inibire quelli progestinici, e sono in grado di produrre effetti antiestrogenici e antiandrogenici, che si manifestano con blocco causato dall'inibizione della 5-alfa-reduttasi di tipo I e II del legame da parte del diidrotestosterone a livello dei recettori androgenici. The active ingredients of the plant are able to stimulate estrogen receptors in the prostate and inhibit progestogenic ones, and are able to produce antiestrogenic and antiandrogenic effects, which manifest themselves with blockage caused by the inhibition of type 5-alpha-reductase I and II of the binding by dihydrotestosterone at the level of androgen receptors.

Ha una capacità di alleviare i problemi della vescica e dell’apparato urinario nei soggetti con iperplasia benigna della prostata. Si prescrive anche per infiammazioni dell’uretra, cistite, prostatite, problemi della cistifellea, disturbi bronchiali e debilitazione generale. It has an ability to relieve bladder and urinary tract problems in subjects with benign prostate hyperplasia. It is also prescribed for inflammation of the urethra, cystitis, prostatitis, gallbladder problems, bronchial disorders and general debility.

Dal punto di vista chimico, l’estratto di Serenoa repens è composto da varie sostanze tra cui un olio volatile ricco di acidi grassi che pare sia responsabile dell’attività terapeutica. Serenoa repens allevia i sintomi della malattia prima inibendo la conversione dell’ormone maschile Diidrotestosterone (DHT), poi interferendo con la produzione di estrogeno e progesterone, altri due ormoni coinvolti nella produzione di DHT. From a chemical point of view, the extract of Serenoa repens is composed of various substances including a volatile oil rich in fatty acids which appears to be responsible for the therapeutic activity. Serenoa repens relieves the symptoms of the disease by first inhibiting the conversion of the male hormone Dihydrotestosterone (DHT), then by interfering with the production of estrogen and progesterone, two other hormones involved in the production of DHT.

L’oleoresina al 90% in acidi grassi di Serenoa repens è il principale attivo utilizzato per l’Iperplasia Prostatica Benigna e la formulazione è solitamente in capsula di gelatina molle. Gli attivi di questo estratto botanico hanno bassa biodisponibilità e bassa stabilità in matrice liquida. The 90% oleoresin in fatty acids of Serenoa repens is the main active used for Benign Prostatic Hyperplasia and the formulation is usually in a soft gelatin capsule. The active ingredients of this botanical extract have low bioavailability and low stability in the liquid matrix.

Il dosaggio giornaliero generalmente raccomandato è di 320 mg di Serenoa repens oleoresina al 90% in acidi grassi. The generally recommended daily dosage is 320 mg of 90% Serenoa repens oleoresin in fatty acids.

Inoltre, l’oleoresina di Serenoa repens al 90% in acidi grassi è difficile da miscelare con altri attivi, soprattutto se composti da fitocomplesso idrosolubile in polvere o in granulato. Essendo molto importante, ai fini della efficacia del prodotto, sia la concentrazione in acidi grassi dell’estratto, sia la qualità dell’estratto stesso, un estratto con titolo inferiore al 90% in acidi grassi, anche se potenzialmente formulabile a secco, non sarebbe però sufficientemente efficace nel trattamento della IPB. In addition, the 90% Serenoa repens oleoresin in fatty acids is difficult to mix with other active ingredients, especially if they are composed of a water-soluble phytocomplex in powder or granulate form. Since both the concentration in fatty acids of the extract and the quality of the extract itself are very important for the efficacy of the product, an extract with a title of less than 90% in fatty acids, even if potentially formable dry, would not be however sufficiently effective in the treatment of BPH.

Il Vaccinium macrocarpon o cranberry, appartenente alla famiglia delle Ericacee e al genere Vaccinium, è una piccola pianta da frutto di origine americana che produce bacche rosse. Il cranberry viene detto anche "mirtillo rosso americano", da non confondersi con quello detto semplicemente "mirtillo rosso" (Vaccinium vitis-idaea), arbusto producente un frutto analogo, anch'esso delle Ericacee, di origine europea ed asiatica. Vaccinium macrocarpon or cranberry, belonging to the Ericaceae family and to the Vaccinium genus, is a small fruit plant of American origin that produces red berries. The cranberry is also called "American cranberry", not to be confused with the one called simply "cranberry" (Vaccinium vitis-idaea), a shrub that produces a similar fruit, also of the Ericaceae, of European and Asian origin.

I frutti e le composte, succhi e gelatine derivate, oltre che a scopo alimentare, sono anche consumati secondo tradizione d’uso per la loro attività farmacologica, disinfettante e antiinfiammatoria, particolarmente nota per le infezioni alle basse vie urinarie (cistite). Proprio in quest'ultimo tipo d'infezioni, pubblicazioni mediche internazionali evidenziano tuttavia un apporto benefico insignificante, non giustificandone il consumo a lungo termine. The fruits and compotes, juices and derived jellies, as well as for food purposes, are also consumed according to tradition for their pharmacological, disinfectant and anti-inflammatory activity, particularly known for lower urinary tract infections (cystitis). Precisely in this last type of infections, international medical publications however show an insignificant beneficial contribution, not justifying its long-term consumption.

E’ stato tuttavia verificato che fitocomplessi creati dal frutto intero di cranberry essiccati e miscelati a formare una polvere hanno un’azione farmacologica evidente non solo a livello antiinfiammatorio e antiossidante (grazie alla presenza di acidi organici e polifenoli), ma anche nell’inibire l’adesione batterica a livello urologico, utile per prevenire prostatiti e pielonefriti. Ci sono anche evidenze sperimentali di blocco del ciclo cellulare in cellule tumorali della prostata. Tenuto conto che l’iperplasia prostatica benigna può essere causa di complicanze quali rischio di infezioni urinarie, febbri urosettiche e danneggiamento dei reni, il suddetto effetto antiadesivo batterico del fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon ha un’azione sinergica con l’estratto di Serenoa repens, agendo in modo concomitante, ma con diverso meccanismo, nel trattamento sia dell’IPB che delle sue complicanze. However, it has been verified that phytocomplexes created from the whole dried cranberry fruit mixed to form a powder have an evident pharmacological action not only at an anti-inflammatory and antioxidant level (thanks to the presence of organic acids and polyphenols), but also in inhibiting the bacterial adhesion at the urological level, useful for preventing prostatitis and pyelonephritis. There is also experimental evidence of cell cycle blockage in prostate cancer cells. Taking into account that benign prostatic hyperplasia can cause complications such as the risk of urinary infections, uroseptic fevers and kidney damage, the aforementioned bacterial anti-adhesive effect of the phytocomplex of Vaccinium macrocarpon has a synergistic action with the extract of Serenoa repens, acting concomitantly, but with different mechanisms, in the treatment of both BPH and its complications.

Il fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon sopra descritto è in forma solida ed è solo parzialmente solubile in acqua, in quanto contiene una certa percentuale di fibre vegetali. The phytocomplex of Vaccinium macrocarpon described above is in solid form and is only partially soluble in water, as it contains a certain percentage of vegetable fibers.

In forme di realizzazione preferite, la formulazione dell’invenzione comprende ulteriormente estratto di Solanum lycopersicum o Licopene in forma purificata. In preferred embodiments, the formulation of the invention further comprises Solanum lycopersicum or Lycopene extract in purified form.

Alcuni studi epidemiologici confermano che il consumo di Solanum lycopersicum determina una riduzione del rischio di cancro alla prostata e suggeriscono che gli effetti possano essere legati alla presenza di diverse sostanze antiossidanti come i carotenoidi, in particolare il licopene, l’acido ascorbico, la vitamina E e diversi flavonoidi. Il meccanismo d’azione può essere considerato multifattoriale: Some epidemiological studies confirm that the consumption of Solanum lycopersicum determines a reduction in the risk of prostate cancer and suggest that the effects may be linked to the presence of various antioxidant substances such as carotenoids, in particular lycopene, ascorbic acid, vitamin E and several flavonoids. The mechanism of action can be considered multifactorial:

- inibizione della proliferazione cellulare delle cellule epiteliali in IPB; - inhibition of cell proliferation of epithelial cells in BPH;

- inibizione della 5α-riduttasi e della segnalazione dell’IL-6 (marker dell’infiammazione); - inhibition of 5α-reductase and IL-6 signaling (inflammation marker);

- modulazione della proliferazione cellulare mediata da stress ossidativo. - modulation of cell proliferation mediated by oxidative stress.

La formulazione dell’invenzione comprende una oleoresina di Serenoa repens con titolo in principi attivi maggiore di 80% in peso, un fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon comprendente il frutto intero di Vaccinium macrocarpon e, opzionalmente, estratto di Solanum lycopersicum o Licopene in forma purificata. The formulation of the invention includes a Serenoa repens oleoresin with a title in active ingredients greater than 80% by weight, a phytocomplex of Vaccinium macrocarpon including the whole fruit of Vaccinium macrocarpon and, optionally, extract of Solanum lycopersicum or Lycopene in purified form.

In forme di realizzazione preferite, la formulazione comprende la seguente composizione percentuale in peso: In preferred embodiments, the formulation comprises the following weight percent composition:

- oleoresina di Serenoa repens 20-40% - oleoresin of Serenoa repens 20-40%

- fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon 10-40% - phytocomplex of Vaccinium macrocarpon 10-40%

- opzionalmente, estratto di Solanum lycopersicum o Licopene in forma purificata 5-25%. - optionally, extract of Solanum lycopersicum or Lycopene in purified form 5-25%.

L’oleoresina di Serenoa repens ha preferibilmente un titolo maggiore di 80% in peso in olio, più preferibilmente maggiore di 85%. Serenoa repens oleoresin preferably has a titer greater than 80% by weight in oil, more preferably greater than 85%.

L’estratto di Solanum lycopersicum è preferibilmente usato come estratto con un titolo di circa 6% in Licopene o, in alternativa, può essere utilizzato lo stesso Licopene in forma purificata. Solanum lycopersicum extract is preferably used as an extract with a title of about 6% in Lycopene or, alternatively, the same Lycopene in purified form can be used.

Il fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon è realizzato da frutto intero essiccato e preferibilmente usato con titolo in proantocianidine maggiore di 1,5% in peso. The phytocomplex of Vaccinium macrocarpon is made from whole dried fruit and preferably used with a title in proanthocyanidins greater than 1.5% by weight.

La formulazione dell’invenzione può inoltre comprendere ulteriori antiossidanti, quali per esempio Astaxantina (e altri eventuali carotenoidi), estratto di pino Marittimo, Vitamina E, Resveratrolo e idrossistilbeni. The formulation of the invention may also include additional antioxidants, such as for example astaxanthin (and any other carotenoids), Maritime pine extract, Vitamin E, Resveratrol and hydroxystylbenes.

La formulazione dell’invenzione comprende inoltre, in aggiunta alle componenti essenziali ed opzionali sopra descritte, eccipienti adatti ad una forma di dosaggio solida a completare il 100% della formulazione. The formulation of the invention also includes, in addition to the essential and optional components described above, excipients suitable for a solid dosage form to complete 100% of the formulation.

Un problema tecnico insito nell’associazione dei suddetti principi attivi è tuttavia quello di miscelare l’oleoresina di Serenoa repens, prodotto lipofilo, con il fitocomplesso secco e sostanzialmente idrofilo di Vaccinium macrocarpon a dare una polvere che possa essere formulata anche in capsule. Fino ad ora una tale formulazione non era realizzabile. A technical problem inherent in the association of the aforementioned active ingredients is however that of mixing the oleoresin of Serenoa repens, a lipophilic product, with the dry and substantially hydrophilic phytocomplex of Vaccinium macrocarpon to give a powder that can also be formulated in capsules. Until now, such a formulation was not feasible.

Inoltre, un altro problema affrontato nella realizzazione della presente invenzione è quello di ottenere una formulazione con sufficientemente elevata biodisponibilità, in particolare per quanto riguarda l’oleoresina di Serenoa repens, la cui biodisponibilità, con le formulazioni note, è ridotta. Furthermore, another problem faced in the realization of the present invention is that of obtaining a formulation with sufficiently high bioavailability, in particular as regards the oleoresin of Serenoa repens, whose bioavailability, with the known formulations, is reduced.

Questi problemi sono almeno in parte risolti da un procedimento per la realizzazione di una formulazione in forma solida contenente oleoresina di Serenoa repens e fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon comprendente i seguenti passaggi: These problems are at least partially solved by a process for the production of a solid formulation containing oleoresin of Serenoa repens and phytocomplex of Vaccinium macrocarpon comprising the following steps:

a) miscelazione a secco di fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon e, quando presente, estratto di Solanum lycopersicum o Licopene in forma purificata con un diluente e con un glidante farmaceutici; a) dry mixing of Vaccinium macrocarpon phytocomplex and, when present, extract of Solanum lycopersicum or Lycopene in purified form with a pharmaceutical diluent and glidant;

b) raffreddamento della miscela del passaggio a) ad una temperatura minore di 15°C; b) cooling the mixture of step a) to a temperature lower than 15 ° C;

c) miscelazione di un emulsionante e di un antiossidante e riscaldamento di tale miscela ad una temperatura non maggiore di circa 60°C a formare una miscela fusa; c) mixing an emulsifier and an antioxidant and heating this mixture to a temperature not higher than about 60 ° C to form a melted mixture;

d) aggiunta dell’oleoresina di Serenoa repens alla miscela fusa del passaggio c) a formare una miscela lipofila di Serenoa repens; d) addition of the oleoresin of Serenoa repens to the melted mixture of step c) to form a lipophilic mixture of Serenoa repens;

e) adsorbimento della miscela lipofila del passaggio d) sulla miscela del passaggio b) ad ottenere una miscela solida in forma di polvere; e) adsorption of the lipophilic mixture of step d) on the mixture of step b) to obtain a solid mixture in the form of a powder;

f) aggiunta di un lubrificante e di un glidante alla miscela della fase e). f) adding a lubricant and a glidant to the mixture of step e).

Nella fase a), il diluente è preferibilmente uno zucchero o un poliolo, più preferibilmente mannitolo, ed il glidante è preferibilmente silice amorfa precipitata. In step a), the diluent is preferably a sugar or a polyol, more preferably mannitol, and the glidant is preferably precipitated amorphous silica.

Nella fase b), la temperatura è preferibilmente compresa tra 10°C e 12°C. In step b), the temperature is preferably between 10 ° C and 12 ° C.

Nella fase c), l’emulsionante è preferibilmente una miscela di mono- e digliceridi di acidi grassi, più preferibilmente mono- e digliceridi di acidi grassi C12-C20, e l’antiossidante è preferibilmente palmitato di ascorbile. In step c), the emulsifier is preferably a mixture of mono- and diglycerides of fatty acids, more preferably mono- and diglycerides of C12-C20 fatty acids, and the antioxidant is preferably palmitate of ascorbyl.

Nella fase d), la temperatura è preferibilmente mantenuta a circa 60°C. In step d), the temperature is preferably maintained at about 60 ° C.

Nella fase e), la temperatura viene preferibilmente raffreddata, prima della fase f) a 25°C o minore. In step e), the temperature is preferably cooled, before step f), to 25 ° C or lower.

Nella fase f), il lubrificante è preferibilmente magnesio stearato ed il glidante è preferibilmente silice amorfa precipitata. In step f), the lubricant is preferably magnesium stearate and the glidant is preferably precipitated amorphous silica.

In forme di realizzazione preferite, per la realizzazione della formulazione dell’invenzione si utilizzano i seguenti rapporti ponderali della varie componenti: In preferred embodiments, the following weight ratios of the various components are used for the realization of the formulation of the invention:

- nel passaggio a), fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon 20-40%, mannitolo 5-25%, silice amorfa precipitata 3-20%, opzionalmente estratto di Solanum lycopersicum o Licopene in forma purificata 5-25%; - in step a), phytocomplex of Vaccinium macrocarpon 20-40%, mannitol 5-25%, precipitated amorphous silica 3-20%, optionally extract of Solanum lycopersicum or Lycopene in purified form 5-25%;

- nel passaggio c), mono- e digliceridi di acidi grassi 2-3,5%, ascorbile palmitato 1-2,5%; - in step c), mono- and diglycerides of fatty acids 2-3.5%, ascorbyl palmitate 1-2.5%;

- nel passaggio d), oleoresina di Serenoa repens 20-40%; - in step d), Serenoa repens oleoresin 20-40%;

- nel passaggio f), magnesio stearato 1-2,5%, silice amorfa precipitata 8-12%. - in step f), 1-2.5% magnesium stearate, 8-12% precipitated amorphous silica.

La miscela di mono- e digliceridi di acidi grassi è commerciale con la sigla E 471. The mixture of mono- and diglycerides of fatty acids is commercial under the code E 471.

La miscela solida in polvere ottenuta come descritto può essere poi formulata come compressa o inserita in capsule di gelatina dura. Altre forme orali convenzionali possono anche essere previste. The solid powder mixture obtained as described can then be formulated as a tablet or inserted into hard gelatin capsules. Other conventional oral forms may also be provided.

Le formulazioni secondo l’invenzione possono essere preparate secondo metodiche convenzionali, quali quelle descritte in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USA, 17th edition, 1985. The formulations according to the invention can be prepared according to conventional methods, such as those described in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USA, 17th edition, 1985.

La formulazione dell’invenzione ha evidenziato un effetto sinergico nel trattamento dell’iperplasia prostatica benigna, grazie anche al fatto di essere dotata di una biodisponibilità migliorata rispetto alle note formulazioni a base di Serenoa repens. The formulation of the invention has shown a synergistic effect in the treatment of benign prostatic hyperplasia, thanks also to the fact that it has an improved bioavailability compared to the known formulations based on Serenoa repens.

PARTE SPERIMENTALE MATERIALI E METODI EXPERIMENTAL PART MATERIALS AND METHODS

E’ stato preparato come sopra descritto un prodotto in capsule di gelatina dura (formulazione A) contenente la formulazione dell’invenzione con la seguente composizione: A product in hard gelatin capsules (formulation A) containing the formulation of the invention with the following composition was prepared as described above:

Valutazione della biodisponibilità Evaluation of bioavailability

La suddetta formulazione A è stata confrontata con note formulazioni commerciali: The above formulation A was compared with known commercial formulations:

- Formulazione B contenente Serenoa repens (Bartram) estratto oleoso da frutto 320 mg; gelatina; glicerolo 85%. - Formulation B containing Serenoa repens (Bartram) oily fruit extract 320 mg; jelly; glycerol 85%.

- Formulazione C contenente Serenoa repens (Bartram) estratto oleoso da frutto (88% acidi grassi) 320 mg; Gelatina Alimentare; Pinus Massoniana Lamb. E.S. Corteccia tit. min. al 95% in Proantocianidine 120 mg.; Crocus Sativus E.S. Stigma tit. min. allo 0,3% in Safranale 100 mg.; Addensanti: Olio di Soja Parzialmente Idrogenato, Olio di Soja Idrogenato, Olio di Soja; Agenti di Resistenza: Sorbitolo, Glicerolo; Emulsionante: Lecitina di Soja; Colorante: E172. - Formulation C containing Serenoa repens (Bartram) oily fruit extract (88% fatty acids) 320 mg; Gelatin; Pinus Massoniana Lamb. E.S. Bark tit. min. 95% in Proanthocyanidins 120 mg .; Crocus Sativus E.S. Stigma tit. min. 0.3% in 100 mg Safranal; Thickeners: Partially Hydrogenated Soya Oil, Hydrogenated Soya Oil, Soya Oil; Resistance agents: Sorbitol, Glycerol; Emulsifier: Soy Lecithin; Dye: E172.

1. Processo digestivo 1. Digestive process

Una dose singola di ogni formulazione A, B e C è stata esposta ad un processo di digestione in vitro che simula la digestione umana fisiologica nei compartimenti orale, gastrico ed intestinale. Una volta completato il processo di digestione, la biodisponibilità di Serenoa repens è stata determinata misurando gli acidi grassi con GC/MS, mentre proantocianidina e Licopene sono stati determinati mediante HPLC. A single dose of each formulation A, B and C was exposed to an in vitro digestion process that simulates physiological human digestion in the oral, gastric and intestinal compartments. Once the digestion process was completed, the bioavailability of Serenoa repens was determined by measuring the fatty acids with GC / MS, while proanthocyanidin and Lycopene were determined by HPLC.

2. Modello in vitro di epitelio umano intestinale L’assorbimento e la biodisponibilità degli acidi grassi di S. repens, proantocianidina e Licopene sono stati valutati usando un modello in vitro di epitelio intestinale umano basato su cellule intestinali Caco-2 (ATCC, HTB-37TM) derivate da adenocarcinoma umano, coltivate come monostrati funzionali in inserti Transwell<®>. Brevemente, gli inserti Transwell<® >sono caratterizzati da due compartimenti, apicale (o lume) e basolaterale (o serosale), separati da una membrana microporosa. Sulla membrana microporosa i monostrati Caco-2 sono caratterizzati da cellule polarizzate con aspetti morfologici e funzionali tipici di enterociti, come la presenza di microvilli, giunzioni occludenti e P-glicoproteine. 2. In vitro model of human intestinal epithelium The absorption and bioavailability of the fatty acids of S. repens, proanthocyanidin and lycopene were evaluated using an in vitro model of human intestinal epithelium based on intestinal Caco-2 cells (ATCC, HTB- 37TM) derived from human adenocarcinoma, grown as functional monolayers in Transwell <®> inserts. Briefly, Transwell <®> inserts are characterized by two compartments, apical (or lumen) and basolateral (or serosal), separated by a microporous membrane. On the microporous membrane the Caco-2 monolayers are characterized by polarized cells with morphological and functional aspects typical of enterocytes, such as the presence of microvilli, occluding junctions and P-glycoproteins.

3. Valutazione dell’impatto delle formulazioni digerite sulla vitalità dell’epitelio intestinale. 3. Evaluation of the impact of the digested formulations on the vitality of the intestinal epithelium.

Per valutare l’impatto delle formulazioni digerite sulla vitalità dell’epitelio intestinale, le formulazioni digerite sono state diluite serialmente in fluidi digestivi (diluizione da 1:2 fino a 1:32) e sono state addizionate al lato apicale degli epiteli intestinali in vitro, mentre un tampone HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) è stato posto nel compartimento basolaterale. I fluidi digestivi (senza formulazioni) sono stati aggiunti al lato apicale di epiteli intestinali in vitro come controllo negativo. Dopo 3 ore di incubazione, la vitalità degli epiteli intestinali è stata valutata usando il saggio MTS, che è basato sulla riduzione del composto tetrazolico MTS da parte delle cellule vitali per generare un composto formazanico colorato che può essere quantificato misurando l’assorbanza a 490 nm. Pertanto, la vitalità cellulare è direttamente proporzionale all’assorbanza. Gli esperimenti di biodisponibilità sono stati condotti usando concentrazioni non tossiche determinate da curve dose-risposta. To evaluate the impact of the digested formulations on the vitality of the intestinal epithelium, the digested formulations were serially diluted in digestive fluids (dilution from 1: 2 to 1:32) and added to the apical side of the intestinal epithelia in vitro. while a Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) buffer was placed in the basolateral compartment. Digestive fluids (without formulations) were added to the apical side of intestinal epithelia in vitro as a negative control. After 3 hours of incubation, the viability of intestinal epithelia was assessed using the MTS assay, which is based on the reduction of the tetrazole compound MTS by viable cells to generate a colored formazan compound which can be quantified by measuring absorbance at 490 nm. . Therefore, cell viability is directly proportional to absorbance. Bioavailability experiments were conducted using non-toxic concentrations determined from dose-response curves.

4. Valutazione della biodisponibilità di S. repens (acidi grassi), proantocianidina e Licopene. 4. Evaluation of the bioavailability of S. repens (fatty acids), proanthocyanidin and Lycopene.

Sulla base di informazioni da curve dose-risposta e dalla posologia, le formulazioni digerite sono state aggiunte al lato apicale degli epiteli intestinali in vitro, mentre il tampone HBSS addizionato con 1% BSA (bovine serum albumin) è stato posto nel compartimento basolaterale. A causa della lipofilia dei componenti attivi della formulazione, 1% BSA è stato aggiunto al compartimento basolaterale per aumentare la loro biodisponibilità. Dopo 3 ore di incubazione, le soluzioni apicale e basolaterale sono state raccolte e il contenuto di acidi grassi, proantocianidina e Licopene è stato determinato mediante GC/MS e HPLC rispettivamente. La biodisponibilità di acidi grassi, proantocianidina e Licopene è espressa come percentuale di assorbimento, derivata da due esperimenti indipendenti. Based on information from dose-response curves and posology, the digested formulations were added to the apical side of the intestinal epithelia in vitro, while the HBSS buffer supplemented with 1% BSA (bovine serum albumin) was placed in the basolateral compartment. Due to the lipophilicity of the active components of the formulation, 1% BSA was added to the basolateral compartment to increase their bioavailability. After 3 hours of incubation, the apical and basolateral solutions were collected and the content of fatty acids, proanthocyanidin and lycopene was determined by GC / MS and HPLC respectively. The bioavailability of fatty acids, proanthocyanidin and lycopene is expressed as a percentage of absorption, derived from two independent experiments.

5. Integrità di barriera e vitalità cellulare Dopo esposizione alle formulazioni digerite, la vitalità cellulare e l’integrità di barriera del modello di epitelio intestinale sono state valutate. La vitalità cellulare è stata valutata usando il saggio MTS sopra descritto. L’integrità di barriera è stata valutata misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) del monostrato di cellule e valutando la sua permeabilità a Lucifer Yellow, un tracciante polare incapace di passare attraverso giunzioni occludenti intatte. Il coefficiente di permeabilità apparente (Papp, cm/s) è stato calcolato con la seguente formula: 5. Barrier integrity and cell viability After exposure to the digested formulations, the cell viability and barrier integrity of the intestinal epithelium model were evaluated. Cell viability was assessed using the MTS assay described above. The barrier integrity was assessed by measuring the transepithelial electrical resistance (TEER) of the cell monolayer and evaluating its permeability to Lucifer Yellow, a polar tracer unable to pass through intact occluding junctions. The apparent permeability coefficient (Papp, cm / s) was calculated with the following formula:

In cui ΔC/Δt è il flusso di molecole trasportate attraverso il monostrato durante il tempo di incubazione (mM/s), V è il volume del compartimento basolaterale (cm<3>), A è l’area della membrana (cm<2>), C0 è la concentrazione iniziale della molecola nel compartimento apicale. Where ΔC / Δt is the flow of molecules transported through the monolayer during the incubation time (mM / s), V is the volume of the basolateral compartment (cm <3>), A is the membrane area (cm <2 >), C0 is the initial concentration of the molecule in the apical compartment.

Attività antiinfiammatoria specifica della prostata L’attività antiinfiammatoria specifica della prostata della frazione biodisponibile delle formulazioni A, B e C è stata valutata in un modello in vitro di epitelio prostatico, basato su cellule tumorali prostatiche (LNCaP). L’attività antiinfiammatoria specifica della prostata è stata valutata pre-trattando il modello in vitro per 2 ore con le frazioni biodisponibili corrispondenti a concentrazioni di S. repens riportate nella tabella 1 e quindi esponendo il modello a condizioni infiammatorie per 4 ore. In particolare, il modello in vitro di epitelio prostatico è stato esposto o ad un mezzo di coltura di cellule monocitiche/macrofage normali (condizioni di non infiammazione) o ad un mezzo di coltura condizionato di cellule THP-1 (CM, condizione di infiammazione). Specific anti-inflammatory activity of the prostate The specific anti-inflammatory activity of the prostate of the bioavailable fraction of formulations A, B and C was evaluated in an in vitro model of prostate epithelium, based on prostate cancer cells (LNCaP). The specific anti-inflammatory activity of the prostate was assessed by pre-treating the in vitro model for 2 hours with the bioavailable fractions corresponding to S. repens concentrations shown in table 1 and then exposing the model to inflammatory conditions for 4 hours. Specifically, the in vitro model of prostate epithelium was exposed to either a normal monocyte / macrophage cell culture medium (noninflammatory conditions) or a conditioned THP-1 cell culture medium (CM, inflammatory condition). .

Tabella 1 Table 1

CM è stato ottenuto stimolando cellule THP-1 con il composto pro-infiammatorio LPS. Cellule LNCaP nel mezzo di coltura di cellule monocitiche/macrofage normali e CM sono stati usati come controllo infiammatorio negativo e positivo rispettivamente. Diclofenac, un composto antiinfiammatorio ben noto, è stato usato come controllo positivo di attività antiinfiammatoria. Una curva doserisposta è stata ottenuta con il saggio MTS per determinare la più alta concentrazione non letale di Diclofenac sul modello in vitro di epitelio prostatico dopo 6 ore di esposizione. Similarmente, l’impatto delle frazioni biodisponibili sulla vitalità delle LNCaP è stata controllata usando il saggio MTS e a morfologia cellulare. CM was obtained by stimulating THP-1 cells with the pro-inflammatory compound LPS. LNCaP cells in normal monocyte / macrophage cell culture medium and CM were used as negative and positive inflammatory control respectively. Diclofenac, a well known anti-inflammatory compound, has been used as a positive control for anti-inflammatory activity. A dose response curve was obtained with the MTS assay to determine the highest non-lethal concentration of Diclofenac on the in vitro model of prostate epithelium after 6 hours of exposure. Similarly, the impact of the bioavailable fractions on the viability of LNCaPs was checked using the MTS and cell morphology assay.

L’attività antiinfiammatoria è stata determinata misurando la quantità di citochine pro-infiammatorie interleuchina-1beta (IL-1β) e Tumor Necrosis Factor-alfa (TNFα) prodotti dalle cellule LNCaP in condizioni sperimentali differenti. IL-1β e TNF-α sono state quantificate mediante kit commerciali ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (R&D Systems; Peprotech), seguendo le istruzioni del fornitore. L’effetto antiinfiammatorio delle frazioni biodisponibili è stato anche determinato misurando l’attività dell’enzima cicloossigenasi (COX) 1 e 2. Le attività totali di COX-1 e COX-2 sono state determinate usando un kit commerciale per il saggio dell’attività di COX (Cayman Chemical), seguendo le istruzioni del fornitore. The anti-inflammatory activity was determined by measuring the amount of pro-inflammatory cytokines interleukin-1beta (IL-1β) and Tumor Necrosis Factor-alpha (TNFα) produced by LNCaP cells under different experimental conditions. IL-1β and TNF-α were quantified by commercial ELISA kits (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (R&D Systems; Peprotech), following the supplier's instructions. The anti-inflammatory effect of the bioavailable fractions was also determined by measuring the activity of the enzyme cyclooxygenase (COX) 1 and 2. Total COX-1 and COX-2 activities were determined using a commercial activity assay kit. of COX (Cayman Chemical), following the supplier's instructions.

Attività pro-apoptotica di S. repens Pro-apoptotic activity of S. repens

Per valutare l’attività pro-apoptotica delle frazioni biodisponibili di S. repens, è stato condotto un saggio fluorimetrico, basato sull’attivazione delle caspasi 3/7 (Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay, Promega). Questo saggio è basato sull’abilità delle caspasi 3 e 7 attivate di rompere selettivamente un substrato specifico, rendendolo fluorescente (lunghezza d’onda di eccitazione 499 nm, lunghezza d’onda di emissione 521 nm). Conseguentemente, l’intensità della fluorescenza prodotta è legata all’attivazione del processo apoptotico da parte delle cellule. Per correlare l’attività antiinfiammatoria con quella proapoptotica, è stata applicata la stessa disposizione sperimentale. To evaluate the pro-apoptotic activity of the bioavailable fractions of S. repens, a fluorimetric assay was performed, based on the activation of caspases 3/7 (Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay, Promega). This assay is based on the ability of activated caspases 3 and 7 to selectively break a specific substrate, making it fluorescent (excitation wavelength 499 nm, emission wavelength 521 nm). Consequently, the intensity of the fluorescence produced is linked to the activation of the apoptotic process by the cells. To correlate the anti-inflammatory activity with the pro-apoptotic one, the same experimental arrangement was applied.

Attività miorilassante della muscolatura liscia L’attività miorilassante delle frazioni biodisponibili delle formulazioni A, B e C è stata valutata in un modello in vitro di muscolatura liscia, basato sui fibroblasti. L’effetto miorilassante è stato analizzato per mezzo di un saggio di gel-contrazione in due fasi, seguendo le istruzioni del fornitore (Cell Biolabs). Il saggio di gel-contrazione è caratterizzato da due fasi: fase di generazione di stress meccanico e fase di galleggiamento. Durante la prima fase, una miscela di fibroblasti e collagene viene seminata e lasciata sviluppare stress meccanico per 2 giorni, mentre, durante la fase di galleggiamento, i gel vengono rilasciati e lasciati contrarre liberamente, dissipando lo stress meccanico generato durante la prima fase. I gel contenenti fibroblasti sono stati esposti alla frazione biodisponibile delle formulazioni per la durata dell’esperimento (24 h). L’attività di miorilassamento è stata calcolata con la seguente formula: Muscle relaxant activity of smooth muscle The muscle relaxant activity of the bioavailable fractions of formulations A, B and C was evaluated in an in vitro model of smooth muscle, based on fibroblasts. The muscle relaxant effect was analyzed by means of a two-phase gel-contraction assay, following the instructions of the supplier (Cell Biolabs). The gel-contraction assay is characterized by two phases: the mechanical stress generation phase and the buoyancy phase. During the first phase, a mixture of fibroblasts and collagen is seeded and left to develop mechanical stress for 2 days, while, during the buoyancy phase, the gels are released and allowed to contract freely, dissipating the mechanical stress generated during the first phase. The gels containing fibroblasts were exposed to the bioavailable fraction of the formulations for the duration of the experiment (24 h). The muscle relaxation activity was calculated with the following formula:

Attività miorilassante (%) = 100((Cfibroblasti/Ccontrollo) X 100) Muscle relaxant activity (%) = 100 ((Cfibroblasts / Ccontrol) X 100)

dove Cfibroblasti è la concentrazione del gel contenente fibroblasti esposti alla frazione biodisponibile delle varie formulazioni e Ccontrollo la concentrazione del gel contenente fibroblasti non trattati (controllo positivo di concentrazione). La contrazione del gel è calcolata come segue: where Cfibroblasts is the concentration of the gel containing fibroblasts exposed to the bioavailable fraction of the various formulations and C is the concentration of the gel containing untreated fibroblasts (positive concentration control). The contraction of the gel is calculated as follows:

Contrazione (%) = 100-((Dfibroblasti/Dcollagene) X 100) dove Dfibroblasti rappresenta il diametro del gel contenente fibroblasti e Dcollagene il diametro del gel di collagene in cui i fibroblasti non sono stati seminati (controllo negativo di concentrazione). La misura dei diametri è stata ottenuta mediante analisi delle immagini con ImageJ. Contraction (%) = 100 - ((Dfibroblasts / Dcollagen) X 100) where Dfibroblasts represents the diameter of the gel containing fibroblasts and Dcollagen the diameter of the collagen gel in which the fibroblasts were not seeded (negative concentration control). The measurement of the diameters was obtained by analyzing the images with ImageJ.

Misura della secrezione dell’Antigene Specifico della Prostata (PSA) da parte delle cellule prostatiche LNCaP Measurement of the secretion of Prostate Specific Antigen (PSA) by prostate LNCaP cells

L’effetto della frazione biodisponibile delle formulazioni A, B e C sulla secrezione dell’Antigene Specifico della Prostata (PSA) indotta da androgeni, usata normalmente come marker di tumori prostatici, è stata valutata in cellule prostatiche LNCaP. Dopo semina e adesione, il mezzo di coltura di cellule normali è stato rimpiazzato con un mezzo contenente un basso livello di ormone per 24 ore. Il mezzo di pretrattamento è stato quindi rimosso e le cellule sono state incubate con la frazione biodisponibile di ogni formulazione. E’ stato incluso un controllo nel saggio trattando le cellule con un mezzo di coltura a basso contenuto di ormoni. In aggiunta, le cellule di controllo e quelle trattate con la frazione biodisponibile della formulazione A sono state stimolate con diidrotestosterone (DHT), noto per stimolare il rilascio di PSA2. Dopo un’esposizione per 24 ore, i mezzi sono stati raccolti per la misurazione del PSA secreto usando un kit commerciale ELISA (Abcam), seguendo le istruzioni del fornitore. I risultati sono stati espressi come percentuale di PSA secreto dalle cellule trattate con le differenti formulazioni in confronto con il controllo. The effect of the bioavailable fraction of formulations A, B and C on the secretion of androgen-induced Prostate Specific Antigen (PSA), normally used as a marker of prostate tumors, was evaluated in LNCaP prostate cells. After seeding and adhesion, the normal cell culture medium was replaced with a medium containing a low level of hormone for 24 hours. The pretreatment medium was then removed and the cells were incubated with the bioavailable fraction of each formulation. A control was included in the assay by treating the cells with a low hormone content medium. In addition, the control cells and those treated with the bioavailable fraction of formulation A were stimulated with dihydrotestosterone (DHT), known to stimulate the release of PSA2. After exposure for 24 hours, the media were collected for the measurement of secreted PSA using a commercial ELISA kit (Abcam), following the supplier's instructions. The results were expressed as a percentage of PSA secreted by the cells treated with the different formulations in comparison with the control.

RISULTATI RESULTS

Bioaccessibilità di S. repens, proantocianidina e Licopene Bioaccessibility of S. repens, proanthocyanidin and Lycopene

La formulazione A (formulazione dell’invenzione) ha una biodisponibilità apparente (cioè parte solubile e parte rilasciata dalla sua matrice) simile alla formulazione B ed alla formulazione C, con un buon effetto emulsionante (Tabella 2). S. repens è una molecola lipofila che richiede stabilizzatori per essere bioaccessibile in mezzi acquosi quali i fluidi digestivi. L’efficienza della tecnologia utilizzata nell’invenzione per la preparazione dell’emulsione è simile a quella della formulazione C che contiene lecitina di soia come emulsionante. L’emulsione della formulazione B (che non contiene emulsionanti) è probabilmente dovuta alla presenza di bile nel compartimento intestinale. Formulation A (formulation of the invention) has an apparent bioavailability (i.e. part soluble and part released from its matrix) similar to formulation B and formulation C, with a good emulsifying effect (Table 2). S. repens is a lipophilic molecule that requires stabilizers to be bioaccessible in aqueous media such as digestive fluids. The efficiency of the technology used in the invention for the preparation of the emulsion is similar to that of formulation C which contains soy lecithin as an emulsifier. The emulsion of formulation B (which does not contain emulsifiers) is probably due to the presence of bile in the intestinal compartment.

Tabella 2 Table 2

La formulazione A secondo l’invenzione contiene inoltre proantocianidina (da Vaccinium macrocarpon) e Licopene come principi attivi. La tecnologia descritta per la sua preparazione preserva le proantocianidine ed il Licopene dalla degradazione (Tabella 3). Formulation A according to the invention also contains proanthocyanidin (from Vaccinium macrocarpon) and Lycopene as active ingredients. The technology described for its preparation preserves proanthocyanidins and lycopene from degradation (Table 3).

Tabella 3 Table 3

Impatto delle formulazioni digerite sulla vitalità dell’epitelio intestinale Impact of digested formulations on the vitality of the intestinal epithelium

Prima di misurare la biodisponibilità delle tre formulazioni, è stato determinato l’impatto delle formulazioni digerite sulla vitalità e sull’integrità dell’epitelio intestinale. A questo scopo, i monostrati epiteliali sono stati esposti a concentrazioni crescenti delle tre formulazioni e sono state ottenute curve doserisposta. Da tali curve è stata ricavata l’EC50 (Tabella 4). Before measuring the bioavailability of the three formulations, the impact of the digested formulations on the vitality and integrity of the intestinal epithelium was determined. For this purpose, the epithelial monolayers were exposed to increasing concentrations of the three formulations and dose-response curves were obtained. The EC50 was obtained from these curves (Table 4).

Tabella 4 Table 4

Come emerge dai valori di EC50, la formulazione A secondo l’invenzione è la meno tossica per la vitalità delle cellule epiteliali intestinali (valore più alto di EC50). As emerges from the EC50 values, formulation A according to the invention is the least toxic for the vitality of intestinal epithelial cells (higher EC50 value).

Per correlare la tossicità delle formulazione alla loro composizione, le curve dose-risposta sono state normalizzate sul contenuto di S. repens e le relative EC50 sono state ricavate (Tabella 5). To correlate the toxicity of the formulations to their composition, the dose-response curves were normalized on the S. repens content and the relative EC50s were obtained (Table 5).

Tabella 5 Table 5

I dati di EC50 normalizzati mostrano che la tossicità è legata alla presenza di Serenoa repens. The normalized EC50 data show that toxicity is linked to the presence of Serenoa repens.

Biodisponibilità di S. repens, proantocianidina e Licopene Bioavailability of S. repens, proanthocyanidin and Lycopene

Sulla base della posologia (2 capsule/giorno formulazione A, 1 capsula/giorno formulazioni B e C) e dell’impatto delle formulazioni digerite sulla vitalità dell’epitelio intestinale, sono stati condotti esperimenti per determinare la biodisponibilità di S. repens, proantocianidina e Licopene. Epiteli intestinali in vitro sono stati esposti alle formulazioni digerite per 3 ore, e S. repens (come acidi grassi), proantocianidina e Licopene sia nella camera apicale (lume) che in quella basolaterale (serosale). La biodisponibilità è stata poi calcolata ed espressa come percentuale di assorbimento. I valori di proantocianidina e Licopene nel compartimento basolaterale sono al di sotto dei limiti di rilevamento (come atteso considerando la piccola quantità ed il titolo di 1.33% di Licopene nella formulazione A ed il basso titolo in proantocianidina nel fitocomplesso di Vaccinium macrocarpon, PAC=2.45%). Per quanto riguarda S. repens, la sua biodisponibilità è maggiore nella formulazione A dell’invenzione che nelle formulazioni B e C dello stato dell’arte (Tabella 6). Based on the posology (2 capsules / day formulation A, 1 capsule / day formulations B and C) and the impact of the digested formulations on the vitality of the intestinal epithelium, experiments were conducted to determine the bioavailability of S. repens, proanthocyanidin and Lycopene. Intestinal epithelia in vitro were exposed to the digested formulations for 3 hours, and S. repens (as fatty acids), proanthocyanidin and lycopene in both the apical (lumen) and basolateral (serosal) chambers. Bioavailability was then calculated and expressed as a percentage of absorption. The values of proanthocyanidin and lycopene in the basolateral compartment are below the detection limits (as expected considering the small quantity and the title of 1.33% of lycopene in formulation A and the low titer in proanthocyanidin in the phytocomplex of Vaccinium macrocarpon, PAC = 2.45 %). As for S. repens, its bioavailability is greater in formulation A of the invention than in formulations B and C of the state of the art (Table 6).

Tabella 6 Table 6

Impatto delle formulazioni digerite sulla vitalità e sulla integrità della mucosa intestinale Impact of digested formulations on the vitality and integrity of the intestinal mucosa

Dopo esposizione degli epiteli intestinali alle formulazioni A, B e C digerite, la vitalità e l’integrità di barriera del monostrato Caco-2 sono state analizzate. Usando il saggio MTS non è stata osservata alcuna riduzione di vitalità durante gli esperimenti di biodisponibilità, mentre un basso ma significante aumento di “Papp” è stato osservato per tutte le formulazioni. After exposure of the intestinal epithelia to digested formulations A, B and C, the viability and barrier integrity of the Caco-2 monolayer were analyzed. Using the MTS assay, no decrease in viability was observed during the bioavailability experiments, while a low but significant increase in "Papp" was observed for all formulations.

Effetto citotossico di Diclofenac ed estratto di S. repens sul modello LNCaP Cytotoxic effect of Diclofenac and S. repens extract on the LNCaP model

L’attività citotossica dell’antiinfiammatorio Diclofenac e di S. repens è stato valutato sull’epitelio prostatico nel modello in vitro. The cytotoxic activity of the anti-inflammatory Diclofenac and S. repens was evaluated on the prostate epithelium in the in vitro model.

Diclofenac diminuisce significativamente la vitalità delle cellule prostatiche ad una concentrazione di 80 µg/mL dopo 6 ore di esposizione, con una concentrazione non tossica massimale di 32 µg/mL. Diversamente, non è stato osservato un effetto sulla vitalità cellulare dopo trattamento con S. repens a tutte le concentrazioni testate (fino a 310 µg/mL). Non sono state osservate rilevanti modifiche morfologiche dopo il trattamento. Diclofenac significantly decreases the viability of prostate cells at a concentration of 80 µg / mL after 6 hours of exposure, with a maximal non-toxic concentration of 32 µg / mL. Otherwise, no effect on cell viability was observed after treatment with S. repens at all concentrations tested (up to 310 µg / mL). No relevant morphological changes were observed after treatment.

Si può concludere che le concentrazioni testate, che includono la più alta concentrazione di S. repens nella formulazione A dell’invenzione, non inducono alcun effetto negativo sulla vitalità dell’epitelio prostatico. It can be concluded that the concentrations tested, which include the highest concentration of S. repens in formulation A of the invention, do not induce any negative effect on the vitality of the prostate epithelium.

Attività antiinfiammatoria specifica sulla prostata delle frazioni biodisponibili Specific anti-inflammatory activity on the prostate of the bioavailable fractions

L’attività antiinfiammatoria specifica sulla prostata delle frazioni biodisponibili è stata valutata nel modello di epitelio prostatico in vitro, misurando la produzione di citochine pro-infiammatorie IL-1β e TNF-α. The specific anti-inflammatory activity on the prostate of the bioavailable fractions was evaluated in the model of prostate epithelium in vitro, by measuring the production of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α.

Le frazioni biodisponibili riducono significativamente la produzione di IL-1β nei confronti del controllo. In particolare, la maggiore quantità di S. repens della formulazione A, confrontata con le due formulazioni commerciali B e C, presenta il maggiore effetto, con una riduzione del 85% della produzione di IL-1β (a fronte di una riduzione del 50% circa con Diclofenac, del 64% circa con la formulazione B e del 9% con la formulazione C). The bioavailable fractions significantly reduce IL-1β production compared to the control. In particular, the greater quantity of S. repens of formulation A, compared with the two commercial formulations B and C, has the greatest effect, with an 85% reduction in IL-1β production (compared to a 50% reduction approximately with Diclofenac, approximately 64% with formulation B and 9% with formulation C).

Non è stato osservato però lo stesso andamento di riduzione per TNF-α. However, the same reduction trend was not observed for TNF-α.

Al contrario di IL-1β, la produzione di TNF-α aumenta significativamente dopo esposizione alle frazioni biodisponibili delle formulazioni A e B. Non è stato osservato effetto per la formulazione C. Questo andamento peculiare può essere spiegato considerando l’attività pro-apoptotica di S. repens. Per verificare tale ipotesi, è stato valutato l’effetto pro-apoptotico delle frazioni biodisponibili sul modello di epitelio prostatico sia in condizioni di infiammazione che di non infiammazione. In contrast to IL-1β, TNF-α production significantly increases after exposure to the bioavailable fractions of formulations A and B. No effect was observed for formulation C. This peculiar pattern can be explained by considering the pro-apoptotic activity of S. repens. To test this hypothesis, the pro-apoptotic effect of the bioavailable fractions on the prostate epithelium model was evaluated in both inflammatory and non-inflammatory conditions.

Come atteso, l’attività pro-apoptotica correla bene con l’espressione di TNF-α, provando un ruolo di S. repens nell’indurre apoptosi nei confronti di cellule infiammate e tumorali. L’apparente contrasto tra la vitalità di cellule prostatiche LNCaP e apoptosi può essere spiegata da un fenomeno di apoptosi precoce, in cui le cellule mantengono ancora la loro vitalità. A concentrazioni di S. repens con quelle presenti nelle frazioni biodisponibili delle formulazioni A e B, la vitalità cellulare diminuisce significativamente dopo esposizione per 24 h, mentre non si osserva alcun effetto a 6 h. As expected, the pro-apoptotic activity correlates well with the expression of TNF-α, proving a role of S. repens in inducing apoptosis against inflamed and tumor cells. The apparent contrast between the viability of LNCaP prostate cells and apoptosis can be explained by a phenomenon of early apoptosis, in which the cells still maintain their viability. At concentrations of S. repens with those present in the bioavailable fractions of formulations A and B, cell viability decreases significantly after exposure for 24 h, while no effect is observed at 6 h.

Effetto prostata-specifico delle frazioni biodisponibili sull’attività delle cicloossigenasi (COX-1 and COX-2) Prostate-specific effect of the bioavailable fractions on the activity of cyclooxygenases (COX-1 and COX-2)

Dopo trattamento, non è stato osservato alcun effetto indotto dalle frazioni biodisponibili sull’attività della forma inducibile della cicloossigenasi (COX-2). After treatment, no effect induced by the bioavailable fractions on the activity of the inducible form of cyclooxygenase (COX-2) was observed.

Attività miorilassante sulla muscolatura liscia L’attività miorilassante sulla muscolatura liscia della frazione biodisponibile delle formulazioni A, B e C è stata valutata in un modello in vitro di muscolatura liscia basato su fibroblasti. Muscle relaxant activity on smooth muscle The muscle relaxant activity on smooth muscle of the bioavailable fraction of formulations A, B and C was evaluated in an in vitro model of smooth muscle based on fibroblasts.

Non è stato osservato alcun effetto miorilassante dopo esposizione alla frazione biodisponibile della formulazione C. Al contrario, le frazioni biodisponibili delle formulazioni A e B hanno mostrato una significativa attività miorilassante sulla muscolatura liscia, soprattutto per quanto riguarda la formulazione A (52% attività miorilassante, contro 31% attività miorilassante per formulazione B). Questo può essere dovuto alla presenza di estratto di Solanum lycopersicum e fitocomplesso di cranberry. No muscle relaxant effect was observed after exposure to the bioavailable fraction of formulation C. On the contrary, the bioavailable fractions of formulations A and B showed significant muscle relaxant activity on smooth muscle, especially as regards formulation A (52% muscle relaxant activity, against 31% muscle relaxant activity for formulation B). This may be due to the presence of Solanum lycopersicum extract and cranberry phytocomplex.

I risultati indicano che la formulazione A secondo l’invenzione, grazie alla sua composizione unica, è dotata della più alta attività miorilassante sulla muscolatura liscia in confronto con le formulazioni dello stato dell’arte. The results indicate that formulation A according to the invention, thanks to its unique composition, is endowed with the highest muscle relaxant activity on smooth muscle in comparison with state-of-the-art formulations.

Attività delle frazioni biodisponibili sulla secrezione di PSA Activity of bioavailable fractions on PSA secretion

Per verificare l’effetto della frazione biodisponibile delle diverse formulazioni sulla secrezione di PSA, è stata usata una linea cellulare LNCaP ormone-sensibile. In confronto alla condizione di controllo, la secrezione di PSA è diminuita di circa il 50% nelle cellule trattate con la frazione biodisponibile della formulazione A dell’invenzione e della formulazione B, mentre non è stata osservata alcuna differenza nelle cellule trattate con la formulazione C. To verify the effect of the bioavailable fraction of the different formulations on PSA secretion, a hormone-sensitive LNCaP cell line was used. Compared to the control condition, PSA secretion decreased by about 50% in cells treated with the bioavailable fraction of formulation A of the invention and formulation B, while no difference was observed in cells treated with formulation C .

L’efficacia della frazione biodisponibile della formulazione A è stata anche testata in cellule LNCaP stimolate con diidrotestosterone (DHT). L’aggiunta di DHT induce un significativo aumento di rilascio di PSA nei confronti della condizione non stimolata. Quando il rilascio di PSA è stimolato da DHT, il trattamento con la frazione biodisponibile della formulazione A non riduce la secrezione di PSA. Questo può essere dovuto al meccanismo d’azione di S.repens come inibitore della 5αreduttasi. The efficacy of the bioavailable fraction of formulation A was also tested in LNCaP cells stimulated with dihydrotestosterone (DHT). The addition of DHT induces a significant increase in PSA release against the non-stimulated condition. When PSA release is stimulated by DHT, treatment with the bioavailable fraction of formulation A does not reduce PSA secretion. This may be due to the mechanism of action of S.repens as a 5α reductase inhibitor.

In sintesi, la formulazione secondo l’invenzione è dotata di elevata biodisponibilità e di migliorata efficacia nel trattamento dell’iperplasia prostatica benigna se confrontata con le formulazioni dell’arte nota. In summary, the formulation according to the invention has a high bioavailability and improved efficacy in the treatment of benign prostatic hyperplasia when compared with the formulations of the known art.

Il procedimento dell’invenzione ha inoltre permesso l’ottenimento di una formulazione solida in polvere da una fase lipofila e da una idrofila, risolvendo quindi un problema tecnico presente nello stato dell’arte per questo tipo di formulazioni. The process of the invention has also made it possible to obtain a solid powder formulation from a lipophilic and a hydrophilic phase, thus solving a technical problem present in the state of the art for this type of formulations.

E’ evidente che sono state descritte solo alcune forme particolari di realizzazione della presente invenzione, cui l’esperto dell’arte sarà in grado di apportare tutte quelle modifiche necessarie per il suo adattamento a particolari applicazioni, senza peraltro discostarsi dall’ambito di protezione della presente invenzione. It is evident that only some particular embodiments of the present invention have been described, to which the skilled in the art will be able to make all those modifications necessary for its adaptation to particular applications, without however departing from the scope of protection of the present invention.

Claims

CLAIMS L. Formulation based on Serenoa repens and Vaccinium macrocarpon, in which said formulation is in solid form.

2. Formulation according to claim 1, comprising a Serenoa repens oleoresin with a title in active principles greater than 80% by weight and a phytocomplex of Vaccinium macrocarpon comprising or consisting of pulp, peel, seeds and dried Vaccinium macrocarpon juice.

3. Formulation according to claim 1 or 2, comprising Solanum lycopersicum or Lycopene extract.

4. Formulation according to any one of claims 1 to 3, comprising the following components: - Serenoa repens oleoresin 20-40% by weight - Vaccinium macrocarpon phytocomplex 10-40% by weight - optionally, Solanum lycopersicum or Lycopene extract in purified form 5-25% by weight.

5. Formulation according to any one of claims 1 to 4, comprising further antioxidants selected from Astaxanthin and other possible carotenoids, Maritime pine extract, Vitamin E, Resveratrol and hydroxystylbenes.

Formulation according to any one of claims 1 to 5, in a dosage form in hard gelatin capsules or in tablets.

7. Process for making a formulation in solid form according to any one of claims 1 to 6, comprising the following steps: a) dry mixing of the phytocomplex of Vaccinium macrocarpon and, when present, of the extract of Solanum lycopersicum or Lycopene in purified form with a pharmaceutical diluent and glidant; b) cooling the mixture of step a) to a temperature lower than 15 ° C; c) mixing an emulsifier and an antioxidant and heating this mixture to a temperature not higher than about 60 ° C to form a melted mixture; d) addition of the oleoresin of Serenoa repens to the melted mixture of step c) to form a lipophilic mixture of Serenoa repens; e) adsorption of the lipophilic mixture of step d) on the mixture of step b) to obtain a solid mixture in the form of a powder; f) adding a lubricant and a glidant to the mixture of step e).

8. Process according to claim 7, wherein: - in step a), the diluent is a sugar or a polyol, preferably mannitol, and / or the glidant is precipitated amorphous silica, and / or - in step c), the emulsifier is a mixture of mono- and diglycerides of fatty acids, preferably mono- and diglycerides of C12-C20 fatty acids, and / or the antioxidant is ascorbyl palmitate, and / or - in step f), the lubricant is magnesium stearate and / or the glidant is precipitated amorphous silica.

9. Process according to claim 7 or 8, wherein: - in step b), the temperature is between 10 ° C and 12 ° C, and / or - in step d), the temperature is maintained at about 60 ° C, and / or - in step e), the temperature is cooled, before step f), to 25 ° C or lower.

10. Process according to any one of claims 7 to 9, in which the following weight ratios of the various components are used: - in step a), phytocomplex of Vaccinium macrocarpon 10-40%, mannitol 5-25%, precipitated amorphous silica 3-20%, optionally extract of Solanum lycopersicum or Lycopene in purified form 5-25%; - in step c), mono- and diglycerides of fatty acids 2-3.5%, ascorbyl palmitate 1-2.5%; - in step d), Serenoa repens oleoresin 20-40%; - in step f), 1-2.5% magnesium stearate, 8-12% precipitated amorphous silica.

11. Formulation according to any of claims 1 to 5 for use in the treatment of benign prostatic hyperplasia.