IT201800004126A1 - Combinazione di inibitori di un complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina e di farmaci anti-ipertensivi e/o ipoglicemizzanti nella malattia renale diabetica - Google Patents

Description

COMBINAZIONE DI INIBITORI DI UN COMPLESSO ENZIMATICO CONIUGANTE L’UBIQUITINA E DI FARMACI ANTI-IPERTENSIVI E/O IPOGLICEMIZZANTI NELLA MALATTIA RENALE DIABETICA

Settore dell’invenzione

La presente invenzione si riferisce al settore farmaceutico.

Più in particolare, si riferisce al trattamento della nefropatia diabetica, ancora più in particolare alla prevenzione del danno fibrotico che si verifica in tale patologia.

Sfondo dell’invenzione

I pazienti con nefropatia diabetica, e con qualsiasi malattia renale cronica, nel corso del tempo sviluppano fibrosi renale.

Nonostante gli investimenti finanziari e di ricerca spesi per determinare il meccanismo di base della fibrosi, non sono stati fatti molti progressi in termini di opzioni terapeutiche attualmente disponibili (Anil Karihaloo. Curr Diab Rep (2012) 12:414–422).

I modelli animali hanno aumentato la comprensione dei meccanismi patogenetici alla base della progressione del danno renale come complicanza del diabete.

Tuttavia, non ci sono ancora terapie mirate disponibili, soprattutto mirate a bloccare la fibrosi o a rallentarne la progressione.

Le terapie attualmente in uso per il trattamento del diabete e delle sue complicanze tra cui la nefropatia diabetica, prevedono l’utilizzo di varie classi di farmaci inclusi farmaci nella categoria degli anti-ipertensivi, tra cui farmaci inibitori del sistema renina angiotensina aldosterone (RAAS), e farmaci ipoglicemizzanti, tra cui metformina, inibitori della dipeptidil peptidasi 4 (DPP-4), inibitori del cotrasportatore 2 sodio-glucosio (SGLT-2) e antagonisti del recettore GLP-1.

Il blocco dell’enzima di conversione dell’angiotensina o del recettore dell’angiotensina II indotto da questi farmaci anti-ipertensivi è in grado di rallentare la progressione della nefropatia diabetica, tuttavia l’utilizzo di queste molecole non è sufficiente a bloccare l’evoluzione della patologia (Mauer M, et al. N Engl J Med 361: 40 –51, 2009).

Nonostante il largo utilizzo di questi farmaci per la gestione del diabete e l'ipertensione, un elevato numero di pazienti affetti da diabete sviluppa danno renale ed evolve verso il trattamento sostitutivo (dialisi o trapianto di rene).

Nonostante siano stati riportati benefici importanti e a lungo termine dei farmaci ipo-glicemizzanti orali sul rene (Writing Team for the Diabetes C, Complications Trial/Epidemiology of Diabetes I, Complications Research G. Sustained effect of intensive treatment of type 1 diabetes mellitus on development and progression of diabetic nephropathy: the Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications (EDIC) study. JAMA.

2003;290(16):2159-67), tuttavia tali farmaci possono favorire l'aumento del rischio di ipoglicemia grave e mortalità correlata alla malattia cardiovascolare nei pazienti diabetici.

Ad esempio, la capacità degli inibitori del recettore SGLT2 di ridurre l’iperfiltrazione e la sclerosi glomerulare è stata dimostrata in numerosi modelli sperimentali di Nefropatia Diabetica; tali inibitori tuttavia sono in grado di modulare solo alcuni dei marcatori molecolari e istologici tipici della fibrosi. I processi molecolari regolati in maniera specifica dagli inibitori del recettore SGLT2 necessitano di maggiori approfondimenti al fine di migliorare il regime terapeutico dei pazienti con Nefropatia Diabetica. La metformina, un farmaco ipoglicemizzante orale utilizzato nel trattamento del diabete, è un noto attivatore della protein-kinasi AMP attivata (AMPK), che agisce attraverso l’alterazione del metabolismo energetico cellulare; sebbene sia stato dimostrato che la metformina inibisce la fibrosi d’organo (Feng Y, Wang S, Zhang Y, Xiao H. Metformin attenuates renal fibrosis in both AMPKα2-dependent and independent manners. Clin Exp Pharmacol Physiol.2017;44(6):648-655; Shen Y, Miao N, Xu J, Gan X, Xu D, Zhou L, Xue H, Zhang W, Lu L. Metformin Prevents Renal Fibrosis in Mice with Unilateral Ureteral Obstruction and Inhibits Ang II-Induced ECM Production in Renal Fibroblasts. Int J Mol Sci. 2016;17(2).), il meccanismo d’azione antifibrotico è ancora poco chiaro. Infine, gli analoghi del glucagon-like peptide-1 (GLP-1), appartenenti alla classe dei farmaci incretino-mimetici che esercitano la loro azione ipoglicemizzante stimolando la produzione di insulina da parte delle cellule beta-pancreatiche, pur mostrando risultati promettenti in vari modelli animali e cellulari (Li YK, Ma DX, Wang ZM, Hu XF, Li SL, Tian HZ, Wang MJ, Shu YW, Yang J. The glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog liraglutide attenuates renal fibrosis. Pharmacol Res. 2018. pii: S1043-6618(17)31160-X; Bisgaard LS, Bosteen MH, Fink LN, Sørensen CM, Rosendahl A, Mogensen CK, Rasmussen SE, Rolin B, Nielsen LB, Pedersen TX. Liraglutide Reduces Both Atherosclerosis and Kidney Inflammation in Moderately Uremic LDLr-/- Mice. PLoS One.

2016;11(12):e0168396.), non sembrano apportare benefici in termini di miglioramento della funzionalità renale (Marso SP, Daniels GH, Brown-Frandsen K, Kristensen P, Mann JF, Nauck MA, et al. Liraglutide and Cardiovascular Outcomes in Type 2 Diabetes. N Engl J Med.

2016;375(4):311-22.).

Nuove molecole che agiscono su meccanismi target, come l'iperfiltrazione glomerulare, l'infiammazione e la fibrosi, sono dunque un obiettivo principale per lo sviluppo di nuovi trattamenti efficaci (Alicic RZ, Rooney MT, Tuttle KR. Clin J Am Soc Nephrol.; 12(12): 2032-2045, 2017.) Sono quindi altamente ricercate nuove terapie farmacologiche in grado di rallentare o bloccare la progressione della nefropatia diabetica e in particolare lo sviluppo del danno fibrotico renale.

Negli ultimi anni sta emergendo significativamente l’importanza dell’ubiquitinazione nella nefropatia diabetica (Huang W et al. Biomed Res Int. 2014; 2014:684765; Gao C, et al. Biomed Res Int. 2014; 2014:160692; Gao C, et al. J Diabetes Res.2014;2014:918396; Goru SK, Kadakol A, Gaikwad AB. Pharmacol Res. 2017;120:170-179; Pontrelli P. et al. Minerva Med. 2018).

Il meccanismo di accumulo di proteine ubiquitinate in lisina 63 è stato descritto dagli inventori della presente invenzione come meccanismo potenzialmente coinvolto nella progressione del danno fibrotico nel paziente diabetico, legato ad una aumentata espressione del gene UBE2v1 (Pontrelli P, et al. FASEB J.;31: 308-319, 2017). I risultati hanno dimostrato che questo meccanismo riguarda esclusivamente le cellule tubulari renali e induce una “trasformazione cellulare” nota come transizione epitelio-mesenchimale, che indurrebbe tali cellule a produrre matrice fibrotica. E’ stato anche mostrato che la molecola NSC697923, inibitore del complesso E2 Ubc13-Uev1A, attraverso l’inibizione selettiva dell’accumulo di proteine ubiquitinate in lisina 63, blocca questa transizione epitelio-mesenchimale nel modello cellulare di cellule tubulari renali immortalizzate HK2.

Tuttavia, non esistono evidenze del ruolo dell’inibizione della ubiquitinazione in lisina 63 nell’impedire l’insorgenza o bloccare la progressione del danno fibrotico renale legato alla malattia renale diabetica in vivo. Infatti, non vi è alcun dato sperimentale su modelli animali che mostri che l’inibizione di questo meccanismo abbia un reale effetto sul danno fibrotico renale.

E’ noto l’uso di inibitori del complesso enzimatico UBC13/Uev1A per il trattamento di alcune patologie, in particolare per la terapia del cancro. Si vedano ad esempio i seguenti documenti brevettuali: WO2013123320 descrive l’utilizzo dell’inibitore NSC697923 nel trattamento delle neoplasie delle cellule B; US2002173524 descrive l’utilizzo di una molecola con formula simile all’inibitore NSC697923 per le patologie CCR4 mediate tra cui il diabete tipo I.

Tuttavia, non è descritto nello stato dell’arte l’utilizzo dell’NSC697923 o di simili inibitori nel trattamento delle complicanze legate alla fibrosi nella nefropatia diabetica, né da solo né in associazione.

Rimane quindi nello stato dell’arte la necessità di una terapia farmacologica per la nefropatia diabetica che sia in grado in particolare di rallentare o bloccare in maniera efficace la progressione del danno fibrotico o impedirne l’insorgenza.

E’ stato ora trovato che una combinazione dell’inibitore NSC697923 con un composto avente azione anti-ipertensiva o ipoglicemizzante è in grado di ridurre sia lo sviluppo della fibrosi renale sia l’albuminuria in situazioni di danno renale.

In particolare, è stato trovato che una combinazione dell’inibitore NSC697923 con un ACE-inibitore riduce la transizione epiteliomesenchimale indotta dall’iperglicemia e il grado di fibrosi tubulointerstiziale in vivo in un modello murino di danno renale indotto dal diabete.

Inoltre, è stato trovato che una tale combinazione riduce significativamente l’albuminuria nei topi diabetici (STZ), in misura maggiore rispetto al loro utilizzo singolo. L’albuminuria è una perdita di albumina nelle urine che caratterizza i primi stadi di sviluppo della nefropatia diabetica e che senza un trattamento efficace può portare alla completa perdita di funzionalità renale. L’albuminuria prima e la proteinuria poi possono avere un ruolo diretto nella progressione dell'insufficienza renale cronica in quanto possono esse stesse indurre un danno tubulo-interstiziale.

Una tale composizione ha dunque il vantaggio di essere efficace al tempo stesso sulla riduzione della albuminuria e sulla riduzione del danno fibrotico, grazie all’azione combinata dei due componenti comportando per il paziente affetto da malattia renale un complessivo miglioramento della funzionalità renale e una conseguente riduzione del rischio di sviluppare insufficienza renale terminale, curabile solo con trattamento sostitutivo (dialisi o trapianto di rene).

Sommario dell’invenzione

E’ un oggetto della presente invenzione una composizione comprendente almeno un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a e almeno un agente ad azione anti-ipertensiva e/o un agente ad azione ipoglicemizzante.

Preferibilmente, detto inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a è il composto 2-(4-methylphenyl)sulfonyl-5-nitrofuran, noto come NSC697923.

Preferibilmente, detto agente anti-ipertensivo è un inibitore del sistema renina-angiotensina-aldosterone, preferibilmente un ACE-inibitore, in particolare il composto Ramipril.

Preferibilmente, detto agente ipoglicemizzante è scelto nel gruppo che consiste di: inibitori delle alpha-glucosidasi, analoghi dell’amilina, inibitori della dipeptidil peptidasi 4, mimetici dell’incretina, insulina, meglitinidi, non-sulfonilueri, inibitori di co-trasportatore 2 sodio glucosio (SGLT2), sulfonilurei, tiazolidindioni, e loro combinazioni.

Rientra nell’ambito della presente invenzione anche detta composizione per l’uso come medicamento.

In particolare, è un oggetto della presente invenzione, detta composizione per l’uso nel trattamento, in particolare nel trattamento precoce, e/o nella prevenzione della fibrosi renale.

Il trattamento precoce può avere in particolare lo scopo di impedire l’insorgenza della fibrosi.

Più in particolare, detta composizione è per l’uso nella prevenzione della fibrosi e della progressione della fibrosi renale.

Detta fibrosi renale può essere conseguente ad una qualsiasi malattia renale cronica. Può essere anche conseguente alla nefropatia diabetica. Più in particolare, è un oggetto della presente invenzione, detta composizione per l’uso nel trattamento, in particolare precoce, e/o nella prevenzione della fibrosi renale che si verifica nella nefropatia diabetica. In una realizzazione, tale composizione è per l’uso nel trattamento, in particolare precoce, e/o nella prevenzione della nefropatia diabetica.

Ancora più in particolare, detta composizione è per la somministrazione ad un paziente diabetico. Detto paziente diabetico può essere normoalbuminurico, micro-albuminurico o macro-albuminurico. Può non avere alterazioni della funzionalità renale o può essere un paziente diabetico con nefropatia diabetica.

E’ anche un oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente come principi attivi almeno un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a e almeno un agente anti-ipertensivo, ad esempio un inibitore del sistema renina angiotensina aldosterone, e/o un agente ipoglicemizzante, ad esempio un inibitore delle alpha-glucosidasi, un analogo dell’amilina, un inibitore della dipeptidil peptidasi 4, un mimetico dell’incretina, un’insulina, un meglitinide, non-sulfonilurei, un inibitore di SGLT2, sulfonilurei, tiazolidindioni, o loro combinazioni, insieme ad almeno un veicolo e/o eccipiente farmaceuticamente accettabile.

E’ stato infatti trovato che l’inibitore del complesso enzimatico Ubc13/Uev1a, NSC697923, riduce significativamente la fibrosi tubulointerstiziale negli animali diabetici e in combinazione con un ACE-inibitore (ramipril), riduce in vitro in cellule tubulari renali la transizione epiteliomesenchimale indotta dall’iperglicemia e dunque il danno fibrotico, mentre gli ACE-inibitori da soli non hanno effetto sulla progressione del processo fibrotico.

Inoltre l’associazione dei due composti agisce significativamente sulla riduzione dell’albuminuria, caratteristica clinica importante nella nefropatia diabetica o in altre patologie croniche renali.

I due composti possono quindi essere vantaggiosamente usati insieme per ridurre e/o bloccare la progressione del danno fibrotico che si verifica nella nefropatia diabetica o in altre patologie croniche renali.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Definizioni

Nel contesto della presente invenzione, per “inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a” si intende un composto in grado di inibire in maniera apprezzabile l’attività del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a, anche noto come complesso Ubc13/UBE2v1.

Nel contesto della presente invenzione, per “agente ad azione antiipertensiva” o “agente antipertensivo” si intende un agente in grado di ridurre la pressione arteriosa, in particolare si intende un farmaco utilizzato nella terapia della pressione arteriosa.

Nel contesto della presente invenzione, per “inibitore del sistema reninaangiotensina-aldosterone” si intende un composto in grado di inibire il funzionamento del sistema renina-angiotensina-aldosterone. Tale inibizione può essere parziale o totale. Tale inibizione può avvenire a qualunque livello e su qualunque elemento o meccanismo del sistema. In particolare, l’inibitore può agire su qualunque passaggio del suddetto sistema. In particolare, può agire sulla produzione dell’angiotensina II o sui suoi recettori. “Sistema renina-angiotensina” è qui usato come sinonimo di “sistema renina-angiotensina-aldosterone”.

Nel contesto della presente invenzione, per “ACE-inibitore” si intende un composto in grado di inibire l’enzima di conversione dell’angiotensina. Nel contesto della presente invenzione, per “agente ad azione ipoglicemizzante” o “agente ipoglicemizzante” si intende un agente in grado di ridurre la concentrazione di glucosio nel sangue. In particolare, si intende un farmaco comunemente utilizzato per provocare una diminuzione della glicemia.

Nel contesto della presente invenzione, per “nefropatia diabetica” si intende una malattia che insorge in pazienti diabetici caratterizzata da alterazione della funzionalità renale, con comparsa di albuminuria e danno istologico tipico (Tervaert TW, et al.. (2010) J Am Soc Nephrol.; 21(4): 556-563.).

Nel contesto della presente invenzione, per “fibrosi renale” si intende una condizione in cui nel rene aumentano in maniera anormale le componenti connettivali rispetto a quelle parenchimali. “Danno fibrotico renale” è qui usato come sinonimo.

Nel contesto della presente invenzione, per “prevenzione” si intende la riduzione del rischio dell'insorgenza e dello sviluppo di una patologia. Nel contesto della presente invenzione, per “prevenzione della progressione” si intende una somministrazione ad un paziente con l’obiettivo di bloccare o rallentare l’avanzamento di una patologia.

Nel contesto della presente invenzione, per “trattamento precoce" si intende la somministrazione ad un paziente in uno stadio iniziale della patologia, ad esempio in uno stadio in cui iniziano a manifestarsi i primi segni e sintomi della patologia.

Nel contesto della presente invenzione, per “paziente normoalbuminurico” si intende un paziente la cui escrezione urinaria di albumina nelle 24h sia al di sotto di 30mg.

Nel contesto della presente invenzione, per “paziente micro-albuminurico” si intende un paziente la cui escrezione urinaria di albumina nelle 24h sia compresa tra 30 e 300mg.

Nel contesto della presente invenzione, per “paziente macroalbuminurico” si intende un paziente la cui escrezione urinaria di albumina nelle 24h sia superiore ai 300mg.

Figure

Figura 1. Effetto dell’ NSC697923 (NSC) sull’accumulo delle proteine ubiquitinate in Lys63 (Lys63-Ub) e sulla fibrosi tubulo-interstiziale (valutata mediante colorazione syrius red) nei reni dei topi diabetici (STZ). Le lettere e numeri nella figura indicano gli animali rappresentati in figura.

Figura 2. Quantizzazione della fibrosi renale valutata mediante colorazione syrius red in reni di topi normali (CTRL) e di topi diabetici (STZ) trattati e non con l’NSC697923 (NSC). La quantizzazione è riportata come numero di cellule fortemente positive (NSP: number of strong positive cells) per unità di area.

Figura 3. Western Blotting su cellule tubulari renali HK2 per valutare l’espressione di α-sma (normalizzato all’espressione della actina) in presenza di alto glucosio (HG), NSC697923 (NSC), Ramipril (Ram), L-glucosio (LG), da soli o in combinazione. *p<0.05 vs HG ;Figura 4. Effetto dell’NSC697923 e del ramipril sull’accumulo delle proteine ubiquitinate in lisina63 e sull’espressione di α-sma indotte dall’iperglicemia (HG) valutato mediante microscopia confocale su cellule tubulari renali immortalizzate (HK2). ;Figura 5. Quantizzazione dell’espressione di α-sma (a) e di proteine ubiquitinate in lisina63 (b) in cellule tubulari renali immortalizzate (HK2) (vedi figura 4). La quantizzazione è riportata come intensità del segnale in % di Area. ;Figura 6. Effetto della combinazione di NSC697923 (NSC) e ramipril (RAM) sull’espressione di α-sma in cellule tubulari renali (HK2) in condizioni normali (basale) e di iperglicemia (HG) valutata mediante microscopia confocale. ;Figura 7. Quantizzazione dell’espressione di α-sma in cellule tubulari renali immortalizzate (HK2) (vedi figura 6). La quantizzazione è riportata come intensità del segnale in % di Area. *p<0.05 vs HG

Figura 8. Effetto dell’ NSC697923 (NSC) da solo e in combinazione con il ramipril sull’accumulo di proteine ubiquitinate in Lisina63 (Lys63-Ub) e sulla fibrosi tubulo-interstiziale (valutata mediante colorazione syrius red) nei reni dei topi diabetici (STZ). Le lettere e numeri nella figura indicano gli animali rappresentati in figura. La quantizzazione è riportata come numero di cellule fortemente positive (NSP: number of strong positive cells) rispetto al numero totale di cellule (NT).

Figura 9. Albuminuria urinaria valutata mediante ELISA in topi diabetici (STZ) e non trattati con diluenti dei farmaci (PBS+DMSO), NSC697923 (NSC), Ramipril da solo o in associazione all’NSC697923 (NSC+RAMIPRIL).

Secondo la presente invenzione, la composizione dell’invenzione comprende almeno un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina (E2) Ubc13/Uev1a.

Inibitori del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina (E2) Ubc13/Uev1a sono noti nel settore e commercialmente reperibili.

Qualunque composto in grado di inibire il complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina (E2) Ubc13/Uev1a può essere utilizzato nella composizione dell’invenzione.

Lo stato dell’arte fornisce i mezzi e le conoscenze necessarie ad un esperto nel settore per stabilire se un composto è in grado di inibire il complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina (E2) Ubc13/Uev1a. Ad esempio, la capacità di una molecola di inibire tale complesso può essere valutata mediante la comune tecnica del western blotting, ad esempio valutando l’effetto di una molecola ritenuta inibitore sull’espressione delle proteine UBC13 e Uev1a rispetto ad un controllo senza inibitore. A questo scopo, si può fare riferimento al lavoro di Pulvino et al., Blood, 2012. Si può fare anche riferimento al lavoro di Scheper J,et al. PLoS One del 2010, dove viene descritto un test per l’identificazione degli inibitori del complesso Ubc13/Uev1a. Pertanto, l’esperto nel settore è del tutto in grado di sapere quali composti possono essere utilizzati nella presente invenzione.

In una realizzazione preferita, tale inibitore è il composto 2-(4-methylphenyl)sulfonyl-5-nitrofuran, conosciuto come NSC697923. Tale composto è reperibile commercialmente, ad esempio è acquistabile da Selleckem.com, Tocris Bioscience, Calbiochem, Sigma-Aldrich. Altri inibitori simili al NSC697923 che possono essere utilizzati nella presente invenzione sono i composti descritti nel documento WO2013123320.

In un’altra realizzazione, tale inibitore è un inibitore dell’enzima coniugante l’ubiquitina E2 R1 (Ubiquitin-conjugating enzyme E2 R1). Inibitori di questa proteina sono noti nel settore. Ad esempio, la molecola nota come CC0651 (Cell. 2011 Jun 24;145(7):1075-87.An allosteric inhibitor of the human Cdc34 ubiquitin-conjugating enzyme. Ceccarelli DF1, Tang X, Pelletier B, Orlicky S, Xie W, Plantevin V, Neculai D, Chou YC, Ogunjimi A, Al-Hakim A, Varelas X, Koszela J, Wasney GA, Vedadi M, Dhe-Paganon S, Cox S, Xu S, Lopez-Girona A, Mercurio F, Wrana J, Durocher D, Meloche S, Webb DR, Tyers M, Sicheri F.).

In un’altra realizzazione, tale inibitore è il composto noto come BAY 11-7082 ((E)-3-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-propenenitrile), noto per prevenire la formazione di catene di poliubiquitina legate mediante lisina63 e catene lineari poliubiquitinate (Strickson S, et al. Biochem J. 451(3):427-37, 2013). Il composto BAY-11-7082 è acquistabile da Anbcam, Santa Cruz Biotechnology, Selleckem.com.

In un’altra realizzazione, tale inibitore è il composto noto leucettamol A e i suoi derivati noti, per i quali si può fare riferimento al lavoro di Tsukamoto S, et al. Bioorg Med Chem Lett.2008;18(24):6319-20.

In un’altra realizzazione, tale inibitore è un peptide in grado di inibire l'interazione Ubc13-Uev1 occupando l'interfaccia di dimerizzazione tra i due. Peptidi di questo tipo sono noti nel settore, in particolare si può fare riferimento ai peptidi descritti nel lavoro Scheper J,et al. PLoS One.

2010;5(6):e11403.

La composizione dell’invenzione comprende inoltre almeno un agente anti-ipertensivo e/o un agente ipoglicemizzante.

In una realizzazione dell’invenzione, essa comprende almeno un agente ad azione anti-ipertensiva. Qualunque agente noto per la sua attività antiipertensiva può essere utilizzato nella composizione dell’invenzione. In particolare, esso può essere un qualunque farmaco comunemente usato nella terapia dell'ipertensione arteriosa. Detto farmaco può anche essere una composizione, cioè può contenere più principi attivi ad azione antiipertensiva. Agenti e farmaci anti-ipertensivi sono noti nel settore.

In una realizzazione preferita, esso è un inibitore del sistema reninaangiotensina-aldosterone.

Qualunque composto in grado di inibire il sistema renina angiotensina aldosterone (RAAS) può essere utilizzato nella composizione dell’invenzione.

In particolare, qualunque composto che interferisca a qualunque livello con il sistema renina angiotensina aldosterone provocando una inibizione del funzionamento del sistema può essere utilizzato.

In una realizzazione ancora più preferita, esso è un ACE-inibitore.

Qualunque composto in grado di inibire l’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE) può essere utilizzato nella composizione dell’invenzione.

Inibitori del sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS) e ACE inibitori sono noti nel settore e commercialmente reperibili.

Detto ACE inibitore può essere ad esempio scelto nel gruppo che consiste di: fosinopril, captopril, moexipril, lisinopril, enalapril, quinapril, trandolapril, benazepril, lisinopril, perindopril e ramipril.

Preferibilmente è il ramipril.

In una realizzazione dell’invenzione, la composizione dell’invenzione comprende almeno un agente ad azione ipoglicemizzante. Qualunque agente noto per la sua attività ipoglicemizzante può essere utilizzato nella composizione dell’invenzione. In particolare, esso può essere un qualunque farmaco comunemente usato per la diminuzione della glicemia. Detto farmaco può anche essere una composizione, cioè può contenere più principi attivi ad azione ipoglicemizzante.

Agenti e farmaci ipoglicemizzanti sono noti nel settore e commercialmente reperibili.

In una realizzazione preferita, detto agente ipoglicemizzante è scelto nel gruppo che consiste di: inibitori delle alpha-glucosidasi, analoghi dell’amilina, inibitori della dipeptidil peptidasi 4, mimetici dell’incretina, insulina, meglitinidi, non-sulfonilurei, inibitori di SGLT2, sulfonilurei, tiazolidindioni e loro combinazioni. Tutti questi composti e classi di composti sono noti nel settore e comunemente usati nella terapia del diabete.

Detto farmaco può essere ad esempio scelto nel gruppo che consiste di: inibitori delle alpha-glucosidasi (ad esempio miglitol, agarbose), analoghi dell’amilina (ad esempio pramlintide), inibitori della dipeptidil peptidasi 4 (ad esempio saxagliptin, sitagliptin, alogliptin, linagliptin), mimetici dell’incretina (ad esempio liraglutide, exenatide, dulaglutide, albiglutide, lixisenatide, semaglutide), insulina (ad esempio insulina, insulina aspart/insulina aspart protamine, insulin lispro/insulin lispro protamine, insulin aspart/insulin aspart protamine, insulin isophane/insulin regular, insulin glulisine, insulina inalata ad azione rapida, insulin isophane, insulin aspart, insulin lispro, insulin glargine, insulin detemir, insulin degludec, insulin zinc), meglitinidi (ad esempio repaglinide, nateglinide), nonsulfonilurei (ad esempio metformina), inibitori di SGLT2 (ad esempio ertugliflozin, empagliflozin, canagliflozin, dapagliflozin), sulfonilurei (ad esempio clorpropamide, glimepiride, glyburide, glipizide, tolazamide, tolbutamide), tiazolidindioni (ad esempio rosiglitazone, pioglitazone), combinazioni di farmaci antidiabetici, ovvero farmaci che comprendono uno o più principi attivi comunemente utilizzati nella terapia del diabete (ad esempio metformina/pioglitazone, glimepiride/pioglitazone, empagliflozin/metformina, dapagliflozin/metformina, glimepiride/rosiglitazone, glyburide/metformina, linagliptin/metformina, empagliflozin/linagliptin, metformina/sitagliptin, metformina/pioglitazone, metformina/rosiglitazone, metformina/saxagliptin, insulin glargine/lixisenatide, canaglifozin/metformina, alogliptin/metformina, canaglifozin/metformina, metformina/sitagliptin, simvastatina/sitagliptin, glipizide/metformina, alogliptin/pioglitazone, metformina/repaglinide, dapaglifozin/saxagliptin, ertugliflozin/sitagliptin, emagliflozin/metformina, insulin degludec/liraglutide). Tutti questi composti sono noti nel settore e commercialmente reperibili.

La composizione sopra descritta può essere usata come medicamento. Preferibilmente, essa è per l’uso nella prevenzione della fibrosi renale, in particolare per la prevenzione della progressione della fibrosi renale.

Infatti, la composizione dell’invenzione consente di evitare o diminuire la comparsa di fibrosi tubulo-interstiziale che si può verificare nel rene in condizioni di iperglicemia, prevenendo così lo sviluppo e/o la progressione della fibrosi.

In una realizzazione, essa può essere usata per il trattamento precoce della fibrosi renale.

Infatti, tale composizione può essere somministrata ad un paziente nei primi stadi di comparsa della fibrosi renale al fine di trattare, bloccare e/o rallentare la progressione della patologia.

La fibrosi renale è una condizione patologica che si può verificare come conseguenza di una malattia renale cronica, ad esempio nella nefropatia diabetica.

Pertanto, la composizione dell’invenzione può essere usata in un paziente affetto da qualunque malattia renale cronica allo scopo di prevenire l’insorgenza della fibrosi. In particolare, la composizione può essere per l’uso in un paziente affetto da nefropatia diabetica.

In una realizzazione, la composizione è quindi per l’uso nella prevenzione della fibrosi renale conseguente alla nefropatia diabetica.

La composizione può anche essere utilizzata per il trattamento, in particolare precoce, della nefropatia diabetica o di altre disfunzioni renali, ad esempio allo scopo di rallentare o impedire l’insorgenza del danno fibrotico.

In tal caso, la composizione è tipicamente somministrata nei primi stadi della patologia.

Una disfunzione renale ai primi stadi può essere identificata da un esperto nel settore mediante le sue comuni conoscenze. Ad esempio, può essere identificata dalla comparsa nel paziente di micro o macroalbuminuria nelle urine.

In una realizzazione, i soggetti trattati sono soggetti affetti da diabete, in particolare affetti da diabete di tipo 2.

Più in particolare, i soggetti trattati possono essere pazienti diabetici con albuminuria.

La composizione può essere somministrata ad un soggetto che ne necessita mediante metodi convenzionali.

Convenientemente, detto medicamento è nella forma di una preparazione per somministrazione orale, ma altre forme sono altrettanto idonee per mettere in atto la presente invenzione, ad esempio la via parenterale. La persona esperta nel settore può decidere di somministrare la composizione per mezzo di qualsiasi forma farmaceutica convenzionale. Si può fare riferimento al Remington’s Pharmaceutical Sciences, ultima edizione.

L’esperto del settore deciderà la tempistica efficace di somministrazione, a seconda delle condizioni del paziente, del livello di gravità della patologia, della risposta del paziente e di ogni altro parametro clinico compreso nella conoscenza generale di questo argomento.

E’ anche un oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente come principi attivi almeno un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a e almeno un agente antipertensivo e/o almeno un agente ipoglicemizzante insieme ad almeno un veicolo e/o eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Detta composizione contiene, insieme agli ingredienti attivi, almeno un vettore o un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Tale vettore può essere una macromolecola, come proteine, polisaccaridi, acidi polilattici, acidi poliglicolici, amminoacidi polimerici, copolimeri di amminoacidi, un anticorpo, una molecola lipidica, una particella virale inattiva o qualunque altro vettore noto nel settore farmaceutico.

Un’ampia discussione dei veicoli commercialmente disponibili è reperibile nel manuale Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J.

1991).

I veicoli possono contenere in aggiunta liquidi come acqua, soluzione salina, glicerolo ed etanolo.

In aggiunta, possono essere presenti coadiuvanti della formulazione particolarmente utili, ad esempio agenti solubilizzanti, agenti disperdenti, agenti sospendenti e agenti emulsionanti. Tali componenti consentono di formulare le composizioni farmaceutiche come compresse, pillole, capsule, confetti, liquidi, gel, sciroppi, impasti, sospensioni e simili, ad esempio per la somministrazione orale.

Tutti questi componenti sono noti nel settore e possono essere facilmente scelti dall’esperto in base alle sue conoscenze generali nel settore farmaceutico.

Una volta formulata, la composizione può essere somministrata direttamente al soggetto. I soggetti da trattare possono essere animali; in particolare, possono essere soggetti umani.

Il medicamento dell’invenzione può essere somministrato tramite qualsiasi via, inclusa la via orale, endovenosa, intramuscolare, intraarteriosa, intramedullare, intratecale, intraventricolare, transdermica o tramite mezzi di applicazione transcutanei, subcutanei, intraperitoneali, intranasali, enterali, topici, sublinguali, intravaginali o rettali. Una via preferita è quella orale.

Le composizioni per la somministrazione orale possono avere la forma di soluzioni o sospensioni liquide o polveri. Più comunemente, sono in una forma di dosaggio unitaria per facilitarne il dosaggio. Per forma di dosaggio unitaria si intende una unità discreta idonea come dose unitaria per soggetti umani e altri mammiferi, ogni unità contenente una quantità predeterminata di materiale attivo calcolata per produrre l’effetto terapeutico desiderato, in associazione con un eccipiente farmaceuticamente accettabile. Forme di dosaggio unitario tipiche comprendono ampolle o siringhe pre-misurate per composizioni liquide o pillole, compresse, capsule o simili nel caso di composizioni solide. In tali composizioni, i composti dell’invenzione sono generalmente una componente minore (ad esempio da circa 0,1 a circa 50% in peso o preferibilmente da circa 1 a circa 40% in peso), il rimanente comprende vari veicoli o vettori e sostanze ausiliarie utili a comporre la forma di dosaggio desiderata. Il trattamento può prevedere una somministrazione a singola dose o a dose multipla.

Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione possono anche contenere uno o più ulteriori principi attivi.

Tale ulteriore principio attivo può essere, ad esempio, un composto noto per l’uso nella nefropatia diabetica.

Le quantità medie di composto attivo possono variare e in particolare dovrebbero essere basate sulle raccomandazioni e la prescrizione di un medico qualificato. Il regime di somministrazione, il dosaggio e la posologia saranno decisi dal medico in base alla propria esperienza, alla malattia da trattare e alle condizioni del paziente e in base alle conoscenze generali nel settore.

Per ogni composto, la dose terapeuticamente efficace può essere stimata inizialmente in saggi di colture cellulari o in modelli animali, in genere topi, ratti, guinea pigs, cani o maiali. Il modello animale può anche essere usato per determinare l’intervallo di concentrazione appropriato e la via di somministrazione. Tale informazione può essere utilizzata per determinare dosi e vie di somministrazione utili per l’uomo. Nel calcolare la Human Equivalent Dose (HED) si consiglia di utilizzare la tabella di conversione fornita nel documento Guidance for Industry and Reviewers (2002, U.S. Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, USA). Una dose media per la somministrazione nell’uomo potrà essere stabilita durante gli studi clinici, come da prassi nel settore.

La dose efficace specifica per un soggetto umano dipenderà poi dalla gravità della patologia, la salute generale del soggetto, l’età, il peso e il sesso del soggetto, la dieta, il tempo e la frequenza di somministrazione, eventuali combinazioni di farmaci e la tolleranza/risposta alla terapia. Questa quantità può essere determinata tramite sperimentazioni di routine e rientra nella valutazione del medico.

A seconda della via di somministrazione prescelta, le composizioni saranno in forma solida o liquida, adatta alla somministrazione orale o parenterale o a qualunque altro tipo di somministrazione prescelta.

In una realizzazione dell’invenzione, la composizione farmaceutica dell’invenzione è per l’uso come medicamento. Preferibilmente, essa è per l’uso nella prevenzione della fibrosi renale o per gli altri usi sopra descritti.

La composizione dell’invenzione può anche essere sotto forma di un kit comprendente come componente a) un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a e come componente b) un agente anti-ipertensivo, come gli inibitori del sistema reninaangiotensina-aldosterone, e/o un agente ipoglicemizzante o loro combinazioni. In tal caso, le due componenti a) e b) possono essere somministrate contemporaneamente o in qualunque successione.

E’ anche un oggetto della presente invenzione un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a per uso nella prevenzione della fibrosi renale in terapia combinata con almeno un agente antipertensivo e/o almeno un agente ipoglicemizzante o in un regime terapeutico contenente almeno un agente antipertensivo e/o almeno un agente ipoglicemizzante e/o una combinazione di farmaci comunemente usati nella terapia del diabete. Per regime terapeutico contenente una combinazione di farmaci comunemente usati nella terapia del diabete si intende una terapia che prevede l’utilizzo contemporaneo di due o più farmaci comunemente utilizzati nel trattamento del diabete, ad esempio un’associazione di farmaci antipertensivi con farmaci ipoglicemizzanti o altri farmaci antidiabetici. Le sostanze possono essere quindi somministrate ad un soggetto tramite una unica composizione comprendente tutti i principi attivi oppure tramite composizioni separate, una per ogni principio attivo, somministrate contemporaneamente o in maniera sequenziale, in qualunque ordine. L’esperto del settore potrà scegliere la terapia, i tempi e i dosaggi più adeguati facendo riferimento alle sue conoscenze generali nel settore.

L’invenzione sarà ora ulteriormente illustrata dai seguenti esempi.

ESEMPI MATERIALI E METODI

Colture cellulari

Le HK2, una linea cellulare immortalizzata di cellule epiteliali del tubulo prossimale (PTEC) ottenute da rene umano normale adulto, sono state acquistate dall’American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Le cellule sono state coltivate in terreno DMEM low glucose (5,5 mM) e gli antibiotici Penicillina e Streptomicina (Sigma- Aldrich, Munich, Germany) all’1% (terreno completo). Prima di ogni passaggio, le cellule a confluenza sono state lavate con tampone fosfato salino (PBS), staccate con tripsina allo 0,05% e acido etilen-diammino-tetra-acetico (EDTA) allo 0,02% in PBS e piastrate con terreno completo con o senza l’aggiunta di D-glucosio o L-glucosio (Sigma- Aldrich, Munich, Germany) 24,5 mM (Conc. Finale in iperglicemia HG=30 mM) come controllo di osmolarità, per ciascun tempo prestabilito. Le cellule sono state incubate in incubatore a 37° C.

Western Blotting

Le cellule sono state piastrate in piastre da 6 pozzetti fino al raggiungimento della confluenza. Le cellule sono state esposte a D- o L-Glucosio a una concentrazione di 30mM per il periodo di tempo indicato. Prima dell’aggiunta del glucosio, è stata effettuata una preincubazione di un’ora con l’inibitore specifico del processo di ubiquitinazione in lisina63, NSC697923, alla concentrazione finale di 1µM, e con l’ACE inibitore Ramipril alla concentrazione finale di 10 µM. Alla fine del trattamento, le cellule sono state lisate in 100 µl di buffer di lisi RIPA (5mM EDTA, 1mM ortovanadato di sodio, 150 mM sodium chloride, 1.5% Nonidet P-40, 20 mM tris-HCl, pH 7.4, 2-Cloroacetamide 10 µl/ml, inibitori delle fosfatasi 10 µl/ml). Il lisato è stato poi incubato 30 min in ghiaccio e successivamente centrifugato a 10000g per 5 minuti a 4°C. Le proteine di ogni lisato (40 µg) sono state separate su un gel precast di poliacrilammide 4-15% (Biorad, Milano, Italia) e trasferite su una membrana di PVDF di 0.2 µm (Biorad). Sulla membrana è stato effettuato un blocking di 30 minuti con Skim Milk Powder al 5% in TPBS (PBS 1X+0.1% Tween 20) e poi incubata con l’anticorpo primario anti-αsma (Santa Cruz). Dopo il lavaggio in TPBS la membrana è stata incubata per un’ora a temperatura ambiente con lo specifico anticorpo secondario coniugato alla perossidasi HRP. Il sistema di chemiluminescenza ECL (Amersham, Milano, Italia) è stato utilizzato per rilevare il segnale.

Immunofluorescenza su cellule HK2

La distribuzione cellulare delle proteine ubiquitinate in lisina63 e del marker mesenchimale α-sma è stata valutata nelle HK2 mediante la metodica di immunofluorescenza indiretta e analisi di microscopia confocale con l’utilizzo di anticorpi specifici. Per ogni esperimento sono state piastrate circa 150000 cellule su vetrini sterili attendendo l’adesione delle cellule agli stessi. Le cellule sono state successivamente incubate con D- o L-Glucosio 30mM per il periodo di tempo indicato. Nelle condizioni specifiche è stato pre-incubato l’inibitore specifico del processo di ubiquitinazione in lisina63, NSC697923, ad una concentrazione finale di 1µM, per un’ora prima dell’aggiunta del glucosio. Dopo la stimolazione, le HK2 sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 15 minuti, trattate con Triton-X 1000,1% in PBS per 5 minuti, incubate per un’ora nel buffer specifico per il blocking (goat serum 4% BSA 2%) e successivamente incubate con l’anticorpo primario specifico anti-Lys63 e anti-αsma diluiti nella soluzione di blocking per un’ora. Il complesso antigene-anticorpo che si viene quindi a creare è stato poi identificato grazie alla successiva incubazione con l’anticorpo secondario (Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit e Alexa Fluor 488 goat anti-mouse). Tra uno step e l’altro sono stati effettuati sempre 3 lavaggi in PBS. Le cellule infine sono state incubate con il colorante nucleare TO-PRO-3 diluito in PBS ed è stato effettuato il montaggio del vetrino. Il controllo negativo è stato ottenuto incubando le cellule solo con la soluzione di blocking omettendo lo step di incubazione con l’anticorpo primario. Il segnale di fluorescenza è stato poi acquisito mediante il microscopio confocale Leica TCS SP2 e le immagini salvate ad un ingrandimento di 63X mediante il software di immagine Leica. Il segnale è stato quantizzato riportando la percentuale di area con segnale fluorescente rispetto al background.

Immunoistochimica su tessuti

I campioni tissutali sono stati ottenuti dal rene del modello DBA/2J dopo il sacrificio, fissati con formaldeide al 4%. Per la valutazione mediante immunoistochimica dell’accumulo di proteine ubiquitinate in lisina63, le sezioni, dopo la fase di sparaffinatura e smascheramento antigenico, sono state incubate con H2O2 (3%) per 10 minuti e con Triton (0,25%) per 5 minuti a temperature ambiente. Segue la fase di blocking con Protein Block (Dako, Glostrup, Denmark) per 10 minuti dopo la quale le sezioni vengono incubate con l’anticorpo specifico dell’ubiquitinazione in lisina63 per 1 ora a temperatura ambiente in una cameretta umida e il segnale è rilevato mediante la soluzione Dako EnVision G2 System (Dako). Le sezioni sono colorate con il colorante Ematossilina e i vetrini montati con glicerolo. Al controllo negativo si omette la fase di incubazione con l’anticorpo primario. La quantizzazione avviene usando l’algoritmo Positive Pixel Count v9_v10.0.0.1805 (Aperio Technologies) che permette di quantificare il numero di cellule positive rispetto al numero totale.

Colorazione sirius red

I campioni tissutali sono stati ottenuti dal rene del modello DBA/2J dopo il sacrificio, fissati con formaldeide al 4%. Dopo la fase di sparaffinatura e idratazione, le sezioni vengono incubate con il fissativo Bouin over night a temperatura ambiente. Alla fine dell’incubazione si effettua un lavaggio sotto acqua corrente per rimuovere tutti i residui del fissativo e si procede all’incubazione con il colorante Fast Green Sirius 1:1 per 1 ora a temperatura ambiente.

Modello animale

Il modello animale utilizzato è il modello murino DBA/2J. A 8 settimane di vita, gli animali hanno ricevuto mediante iniezione intraperitoneale per 5 giorni consecutivi sodio citrato per il gruppo controllo (femmine) e streptozotocina (STZ, 45mg/kg, pH4.5, dissolta in sodio citrato) per il gruppo di studio (maschi). Gli animali che ad una settimana dalla fine del trattamento STZ hanno mostrato glicemia superiore a 250mg/dl sono stati inclusi nello studio. Dopo 5 settimane dall’ultima iniezione di STZ gli animali sono stati trattati con NSC697923 disciolta in PBS (3mg/kg 3 volte a settimana per 6 settimane) e/o RAMIPRIL (2mg/kg 3 volte a settimana per 6 settimane) disciolto in DMSO (2%) da soli o in combinazione [NSC697923 (3mg/kg) RAMIPRIL (2mg/kg ) 3 volte a settimana per 6 settimane].

Alla fine del trattamento sono stati raccolti biofluidi (siero e urine 24h prima del sacrificio). Al momento del sacrificio sono stati raccolti campioni tissutali renali, immediatamente fissati in formalina e successivamente inclusi in paraffina.

Analisi dei livelli di albuminuria

Nelle urine degli animali è stata valutata la concentrazione di albumina mediante saggio ELISA, utilizzando un kit specifico disponibile in commercio (Abcam). I valori di albuminuria sono stati normalizzati rispetto al contenuto di proteine totali presenti nelle urine e rispetto al volume totale di urine prodotte nelle 24 ore precedenti al sacrificio.

Esempio 1

NSC697923 riduce nei topi diabetici (STZ) l’accumulo di proteine ubiquitinate in Lys63 (Lys63-Ub) e la fibrosi tubulo-interstiziale (valutata mediante colorazione syrius red)

L’accumulo delle proteine ubiquitinate in lys63 è stato valutato mediante immunoistochimica su tessuto renale del modello murino di nefropatia diabetica (topi DBA/2J streptozotocina-STZ); il grado di fibrosi in questi campioni è stato valutato mediante colorazione Syrius Red Fast Green. I risultati sono riportati nelle Figure 1 e 2.

I topi diabetici (STZ) presentano un elevato accumulo di proteine ubiquitinate in lys63 e un alto grado di fibrosi; il trattamento con NSC697923 riduce significativamente entrambi i processi. Questi dati supportano l’utilizzo dell’inibitore NSC697923 per prevenire il danno renale e la fibrosi tubulo-interstiziale nei pazienti diabetici.

Esempio 2

NSC796923 non riduce l’albuminuria nei topi diabetici in vivo Analizzando i dati clinici dei topi oggetto di studio è emerso che l’NSC697923 non ha alcun effetto sulla albuminuria dei topi diabetici trattati (STZ+NSC697923) rispetto ai topi diabetici non trattati (STZ). I risultati sono riportati nella seguente Tabella 1.

Tabella 1

L’albuminuria prima e la proteinuria poi possono avere un ruolo diretto nella progressione dell'insufficienza renale cronica in quanto possono esse stesse indurre un danno tubulo-interstiziale.

Esempio 3

NSC697923, da solo e in combinazione con gli ACEi, riduce la transizione epitelio-mesenchimale indotta dall’iperglicemia

Abbiamo valutato mediante western blotting su cellule tubulari renali immortalizzate in coltura (HK2) i livelli di espressione proteica dell’α-sma, marcatore della transizione epitelio-mesenchimale.

I risultati sono riportati in Figura 3.

L’iperglicemia induce l’espressione dell’α-sma, che viene ridotta invece con l’utilizzo dell’NSC697923. Gli ACEi, invece, da soli non hanno alcun effetto sulla transizione epitelio-mesenchimale (e quindi sull’espressione di α-sma) indotta dall’iperglicemia, mentre in associazione con l’NSC697923 l’espressione di α-sma è a livelli al di sotto del basale (si veda il grafico di figura 3).

Esempio 4

L’accumulo delle proteine ubiquitinate in lisina63 e l’espressione di α-sma indotte dall’iperglicemia sono ridotti dall’NSC697923 ma non dagli ACEi

Abbiamo valutato mediante immunofluorescenza l’espressione di α-sma e l’accumulo di proteine ubiquitinate in lisina63 su cellule HK2 in condizioni di iperglicemia (HG) e in presenza di ACEi o NSC697923.

Come dimostrato nelle figure 4 e 5 gli ACEi non riducono l’accumulo delle proteine ubiquitinate in Lysina63 e non bloccano l’espressione di α-sma indotta dall’iperglicemia; diversamente l’NSC796923 riduce entrambi i processi.

Esempio 5

La combinazione di NSC697923 e ACEi riduce ulteriormente la transizione epitelio-mesenchimale

Abbiamo valutato mediante immunofluorescenza l’espressione di α-sma su HK2 in condizioni di iperglicemia e in presenza di ACEi, NSC697923 e della loro combinazione.

I risultati sono riportate nelle Figure 6 e 7.

Come già precedentemente dimostrato gli ACEi da soli non riducono l’espressione di α-sma indotta dall’iperglicemia. Abbiamo confermato ancora una volta che l’inibitore NSC697923 da solo è in grado di inibire l’espressione di α-sma indotta dall’alto glucosio e la combinazione di entrambe le molecole riduce ulteriormente la transizione epiteliomesenchimale. Al contrario gli ACEi da soli non bloccano questo processo.

Esempio 6

La combinazione di NSC697923 e degli ACEi riduce l’accumulo di proteine ubiquitinate in Lisina63 e la fibrosi tubulo-interstiziale in vivo nei topi diabetici

Abbiamo valutato l’accumulo delle proteine ubiquitinate in lisina63 mediante immunoistochimica e il grado di fibrosi mediante colorazione Sirius Red Fast Green su tessuto renale di topi diabetici (STZ) sottoposti a trattamento singolo o combinato con NSC697923 e/o ACEi.

Come mostrato in Figura 8, i topi diabetici STZ trattati con NSC697923 da solo o combinato con ACEi presentano una riduzione significativa dell’accumulo di proteine ubiquitinate in Lys63 e del grado di fibrosi se paragonati ai topi diabetici non trattati o ai topi trattati col solo ACEi.

Esempio 7

Effetti della combinazione NSC796923+ACEi sulla albuminuria nei topi diabetici in vivo

Il primo stadio di sviluppo della nefropatia diabetica è caratterizzato dalla comparsa di microalbuminuria che, senza un trattamento efficace, porta nel 20-40% dei pazienti diabetici, alla completa perdita di funzionalità renale. Nel primo gruppo di animali avevamo osservato che il composto NSC697923 da solo non era in grado di ridurre l’albuminuria pur essendo capace di ridurre la fibrosi tubulo-interstiziale. Pertanto in un nuovo gruppo di animali abbiamo valutato l’effetto della combinazione NSC796923+ACEi sulla albuminuria nei topi diabetici in vivo.

Analizzando i dati clinici dei topi oggetto di studio è emerso che l’NSC697923 in combinazione con l’ACEi, riduce significativamente l’albuminuria nei topi diabetici (STZ), sia rispetto ai topi non trattati che rispetto ai topi diabetici trattati solo con NSC697923, con un trend di ulteriore riduzione dell'albuminuria anche rispetto ai topi diabetici trattati solo con il ramipril.

I risultati sono riportati nella seguente Tabella 2 e nella figura 9.

Tabella 2

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Una composizione comprendente almeno un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a e almeno un agente anti-ipertensivo e/o un agente ipoglicemizzante.
2. 2. La composizione secondo la rivendicazione 1, in cui detto inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a è scelto nel gruppo che consiste di: il composto 2-(4-methylphenyl)sulfonyl-5-nitrofuran, noto anche come NSC697923; un inibitore dell’enzima coniugante l’ubiquitina E2 R1; il composto (E)-3-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-propenenitrile, noto anche come BAY 11-7082; leucettamol A; e un peptide in grado di inibire l'interazione Ubc13-Uev1.
3. 3. La composizione secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detto agente anti-ipertensivo è un inibitore del sistema renina-angiotensinaaldosterone.
4. 4. La composizione secondo la rivendicazione 3 in cui detto inibitore del sistema renina-angiotensina-aldosterone è un ACE-inibitore, preferibilmente il composto Ramipril.
5. 5. La composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui detto agente ipoglicemizzante è scelto nel gruppo che consiste di: inibitori delle alpha-glucosidasi, analoghi dell’amilina, inibitori della dipeptidil peptidasi 4, mimetici dell’incretina, insulina, meglitinidi, non-sulfonilurei, inibitori del cotrasportatore 2 sodioglucosio (SGLT2), sulfonilurei, tiazolidindioni e loro combinazioni.
6. 6. La composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-5 per l’uso come medicamento.
7. 7. La composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-5 per l’uso nel trattamento, in particolare precoce, e/o nella prevenzione della fibrosi renale, in particolare nella prevenzione della progressione della fibrosi renale.
8. 8. La composizione per l’uso secondo la rivendicazione 7, in cui detta fibrosi renale è conseguente alla nefropatia diabetica.
9. 9. La composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-5 per l’uso nel trattamento, in particolare precoce, e/o nella prevenzione della nefropatia diabetica.
10. 10. La composizione per l’uso secondo una qualunque della rivendicazioni 7-9, in cui detta composizione è per la somministrazione ad un paziente diabetico.
11. 11. La composizione per l’uso secondo la rivendicazione 10, in cui detto paziente è affetto da nefropatia diabetica.
12. 12. Una composizione farmaceutica comprendente come principi attivi almeno un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a e almeno un agente anti-ipertensivo e/o un agente ipoglicemizzante insieme ad almeno un veicolo e/o eccipiente farmaceuticamente accettabile.
13. 13. Un kit comprendente: a) un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a; e b) almeno un agente anti-ipertensivo e/o un agente ipoglicemizzante.
14. 14. Un inibitore del complesso enzimatico coniugante l’ubiquitina Ubc13/Uev1a per uso nella prevenzione della fibrosi renale in terapia combinata con almeno un agente anti-ipertensivo e/o almeno un agente ipoglicemizzante o in un regime terapeutico contenente almeno un agente anti-ipertensivo e/o almeno un agente ipoglicemizzante e/o una combinazione di farmaci comunemente usati nella terapia del diabete.