IT201800002694A1 - MOLECULES THAT INHIBIT PKB / AKT BY COMPROMISING THE SER941 PHOSPHORILATION OF RBL2 / p130 - Google Patents
MOLECULES THAT INHIBIT PKB / AKT BY COMPROMISING THE SER941 PHOSPHORILATION OF RBL2 / p130 Download PDFInfo
- Publication number
- IT201800002694A1 IT201800002694A1 IT201800002694A IT201800002694A IT201800002694A1 IT 201800002694 A1 IT201800002694 A1 IT 201800002694A1 IT 201800002694 A IT201800002694 A IT 201800002694A IT 201800002694 A IT201800002694 A IT 201800002694A IT 201800002694 A1 IT201800002694 A1 IT 201800002694A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- rbl2
- akt
- cells
- aktiviii
- cancer
- Prior art date
Links
- 102100022828 Retinoblastoma-like protein 2 Human genes 0.000 title claims description 258
- 108010003494 Retinoblastoma-Like Protein p130 Proteins 0.000 title claims description 133
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 claims description 103
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 claims description 100
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 37
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 18
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 14
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 14
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 11
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- -1 LIKGKRKRRNXGSS Chemical compound 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000005765 Proto-Oncogene Proteins c-akt Human genes 0.000 claims 5
- 102000004642 Retinoblastoma-Like Protein p130 Human genes 0.000 claims 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims 2
- 108050002651 Retinoblastoma-like protein 2 Proteins 0.000 description 124
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 86
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 30
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 102400001093 PAK-2p27 Human genes 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 13
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 10
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 10
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 9
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 101000779418 Homo sapiens RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 8
- 102100039120 Retinoblastoma-like protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 108010091356 Tumor Protein p73 Proteins 0.000 description 8
- 102000018252 Tumor Protein p73 Human genes 0.000 description 8
- BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N seliciclib Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)CC)=NC=1NCC1=CC=CC=C1 BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 8
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 239000003197 protein kinase B inhibitor Substances 0.000 description 7
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 6
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 6
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 6
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 6
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 5
- 229940126638 Akt inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 102000015792 Cyclin-Dependent Kinase 2 Human genes 0.000 description 4
- 108010024986 Cyclin-Dependent Kinase 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000577 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27 Human genes 0.000 description 4
- 108010016777 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27 Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 108010002342 Retinoblastoma-Like Protein p107 Proteins 0.000 description 4
- 108050002592 Retinoblastoma-like protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 3
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 3
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 3
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 7-cyclopentyl-n,n-dimethyl-2-[(5-piperazin-1-ylpyridin-2-yl)amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide Chemical compound N1=C2N(C3CCCC3)C(C(=O)N(C)C)=CC2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 2
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 2
- 101000798015 Homo sapiens RAC-beta serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 206010035603 Pleural mesothelioma Diseases 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 102100032315 RAC-beta serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F Chemical compound COC(=O)C[C@@H](C(=O)CF)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 2
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229940127255 pan-caspase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 229950003687 ribociclib Drugs 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000002554 Cyclin A Human genes 0.000 description 1
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 101000798007 Homo sapiens RAC-gamma serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010021099 Lamin Type A Proteins 0.000 description 1
- 102000008201 Lamin Type A Human genes 0.000 description 1
- 231100000070 MTS assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000719 MTS assay Methods 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100032314 RAC-gamma serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000009643 clonogenic assay Methods 0.000 description 1
- 231100000096 clonogenic assay Toxicity 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 1
- 108010025821 lamin C Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000002985 oncosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009038 pharmacological inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000001686 pro-survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
DESCRIZIONE DESCRIPTION
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: “MOLECOLE CHE INIBISCONO PKB/AKT COMPROMETTENDO LA FOSFORILAZIONE DI Ser941 DI RBL2/p130” of the patent for industrial invention entitled: "MOLECULES THAT INHIBIT PKB / AKT COMPROMISING THE PHOSPHORILATION OF Ser941 OF RBL2 / p130"
Campo tecnico dell'invenzione Technical field of the invention
La presente invenzione si riferisce a molecole che inibiscono l’azione della proteina chinasi B (PKB) compromettendo la fosforilazione del residuo di Ser941 di RBL2/p130 e al relativo uso nel trattamento del cancro. The present invention refers to molecules that inhibit the action of protein kinase B (PKB) by compromising the phosphorylation of the RBL2 / p130 Ser941 residue and its use in the treatment of cancer.
Arte anteriore Front art
L'inattivazione della proteina retinoblastoma (RB) RB1/p105 è una caratteristica della maggior parte dei tumori umani. RB1/p105 appartiene alla famiglia RB, che include anche RBL1/p107 e RBL2/p130. Le proteine RB sono conosciute principalmente per il loro ruolo di regolazione del ciclo cellulare. Secondo il modello canonico queste frenano la progressione del ciclo cellulare, legando, nel loro stato ipofosforilato, i fattori di trascrizione E2F, che regolano i geni necessari per far avanzare le fasi del ciclo cellulare. Tale funzione di RB è principalmente regolata attraverso la fosforilazione mediata da complessi chinasi ciclina-dipendenti (CDK), che interferiscono con il legame RB-E2F. Le proteine RB regolano anche la progressione del ciclo cellulare attraverso meccanismi E2F indipendenti: inibendo direttamente e indirettamente l'attività delle CDK e interagendo con gli enzimi che modificano la cromatina e gli istoni, influenzando così profondamente l'espressione genica globale e mantenendo l’uscita dal ciclo cellulare sia transitoria che permanente. Infatti, le proteine RB sono emerse come determinanti chiave del destino delle cellule al crocevia di molti processi cellulari, come il differenziamento, la senescenza e l'apoptosi, che rappresentano tutti una barriera alla tumorigenesi. Inactivation of the RB1 / p105 retinoblastoma (RB) protein is a feature of most human cancers. RB1 / p105 belongs to the RB family, which also includes RBL1 / p107 and RBL2 / p130. RB proteins are known primarily for their cell cycle regulatory role. According to the canonical model, these slow down the progression of the cell cycle by binding, in their hypophosphorylated state, the transcription factors E2F, which regulate the genes necessary to advance the phases of the cell cycle. This RB function is mainly regulated through phosphorylation mediated by cyclin-dependent kinase complexes (CDKs), which interfere with RB-E2F binding. RB proteins also regulate cell cycle progression through independent E2F mechanisms: by directly and indirectly inhibiting the activity of CDKs and interacting with enzymes that modify chromatin and histones, thus profoundly affecting global gene expression and maintaining output from both transient and permanent cell cycle. Indeed, RB proteins have emerged as key determinants of cell fate at the crossroads of many cellular processes, such as differentiation, senescence and apoptosis, all of which represent a barrier to tumorigenesis.
Analogamente a RB1/p105, anche RBL2/p130 è un oncosoppressore chiave. La deregolazione di RBL2/p130 è infatti alla base di vari tipi di tumore per i quali funziona come marcatore diagnostico e prognostico. A causa della frequente deregolazione delle proteine RB e dei loro ‘pathways’ nel cancro, numerosi sono gli studi mirati ad una possibile traslazione alla clinica di strategie basate sull'utilizzo di RB. In particolare, sono state ideate strategie che mirano specificamente alle cellule in cui manca RB, nonché strategie volte a ripristinare la funzione canonica di RB di contenimento del ciclo cellulare, attraverso l'inibizione delle CDK. Inoltre, le proteine RB sono emerse come cruciali marcatori predittivi di molteplici trattamenti antitumorali, dato il loro ruolo nel dettare il destino delle cellule in risposta a diversi segnali, promuovendo l'arresto del ciclo cellulare o l'apoptosi. Pertanto la valutazione dello stato di RB è fondamentale per prevedere la risposta dei pazienti alle terapie citostatiche o citotossiche. Tuttavia, il ruolo delle proteine RB nell'apoptosi è ancora controverso perché queste proteine possono prevenire o innescare l'apoptosi a seconda del contesto. Similar to RB1 / p105, RBL2 / p130 is also a key tumor suppressor. The deregulation of RBL2 / p130 is in fact at the basis of various types of cancer for which it functions as a diagnostic and prognostic marker. Due to the frequent deregulation of RB proteins and their 'pathways' in cancer, there are numerous studies aimed at a possible translation to the clinic of strategies based on the use of RB. In particular, strategies have been devised that specifically target cells lacking RB, as well as strategies aimed at restoring the canonical function of RB to contain the cell cycle, through the inhibition of CDKs. Furthermore, RB proteins have emerged as crucial predictive markers of multiple anticancer treatments, given their role in dictating the fate of cells in response to different signals, promoting cell cycle arrest or apoptosis. Therefore, the assessment of RB status is essential to predict the response of patients to cytostatic or cytotoxic therapies. However, the role of RB proteins in apoptosis is still controversial because these proteins can prevent or trigger apoptosis depending on the context.
Vari studi finora hanno mostrato sia funzioni antiapoptotiche che proapoptotiche di RBL2/p130. In particolare, RBL2/p130 può promuovere l'apoptosi nell'osteosarcoma, nel retinoblastoma e nel glioblastoma di criceto. Più recentemente, i presenti inventori hanno scoperto che, un approccio mirato a riattivare la funzione oncosoppressiva di RBL2/p130, interferendo con la sua fosforilazione inibitoria mediata da CDK2, induceva apoptosi in varie linee di cellule tumorali tra cui il cancro del polmone non a piccole cellule e il mesotelioma, e l'apoptosi dipendeva da RBL2/p130 stessa. Dato che entrambi questi tipi di tumore sono caratterizzati da iperattivazione della chinasi PKB/AKT, una proteina chiave nel promuovere attività antiapoptotica e pro-sopravvivenza, i presenti inventori hanno studiato se PKB/AKT potesse modulare la funzione apoptotica di RBL2/p130. PKB/AKT, che comprende AKT1/PKBα, AKT2/PKBβ e AKT3/PKBγ, è una serina-treonina chinasi che agisce al crocevia di più cascate di segnali che regolano la sopravvivenza, la crescita, la proliferazione, l'angiogenesi, il metabolismo e la migrazione. L’attività di PKB/AKT contraddistingue numerose caratteristiche tumorali, tra cui la perdita del controllo del ciclo cellulare, e la sua inibizione pertanto è considerata un obiettivo critico per approcci terapeutici volti a contrastare non solo lo sviluppo e la progressione del tumore, ma anche i fenomeni di resistenza. Various studies so far have shown both antiapoptotic and proapoptotic functions of RBL2 / p130. In particular, RBL2 / p130 can promote apoptosis in osteosarcoma, retinoblastoma and hamster glioblastoma. More recently, the present inventors have discovered that, an approach aimed at reactivating the oncosuppressive function of RBL2 / p130 by interfering with its inhibitory CDK2-mediated phosphorylation induced apoptosis in various tumor cell lines including non-small lung cancer. cells and mesothelioma, and apoptosis depended on RBL2 / p130 itself. Given that both of these tumor types are characterized by hyperactivation of PKB / AKT kinase, a key protein in promoting antiapoptotic and pro-survival activity, the present inventors investigated whether PKB / AKT could modulate the apoptotic function of RBL2 / p130. PKB / AKT, which includes AKT1 / PKBα, AKT2 / PKBβ and AKT3 / PKBγ, is a serine-threonine kinase that acts at the crossroads of multiple signal cascades that regulate survival, growth, proliferation, angiogenesis, metabolism and migration. PKB / AKT activity distinguishes numerous tumor characteristics, including loss of cell cycle control, and its inhibition is therefore considered a critical target for therapeutic approaches aimed at counteracting not only tumor development and progression, but also the phenomena of resistance.
Sommario dell’invenzione Summary of the invention
È uno scopo della presente invenzione fornire molecole in grado di modulare l’attività di PKB/AKT compromettendo la fosforilazione di RBL2/p130 per il trattamento del cancro, in particolare del cancro del polmone e del mesotelioma. It is an aim of the present invention to provide molecules capable of modulating the activity of PKB / AKT by compromising the phosphorylation of RBL2 / p130 for the treatment of cancer, in particular lung cancer and mesothelioma.
Questo scopo è raggiunto mediante il peptide come definito nella rivendicazione 1. This object is achieved by means of the peptide as defined in claim 1.
Altri scopi della presente invenzione sono di fornire un acido nucleico come definito nella rivendicazione 4, usi come definiti nelle rivendicazioni 5, 7, 8 e 10. Other objects of the present invention are to provide a nucleic acid as defined in claim 4, uses as defined in claims 5, 7, 8 and 10.
Breve descrizione delle figure Brief description of the figures
La figura 1 mostra i risultati relativi all'esempio 1. In particolare la figura 1A mostra l'analisi in silico della sequenza che ha permesso di identificare il presunto sito di fosforilazione di AKT (ser 941) in RBL2/p130 all'interno di un motivo di consenso RXRXXS/TB. Nella figura 1B, le cellule HEK-293 (ATCC CRL-1573) sono state trasfettate con vettori esprimenti RBL2/p130 e HA-AKT1 miristilato(HA-MYR-Akt1) e raccolte dopo 48h per l'analisi di co-immunoprecipitazione (co-IP). La co-IP è stata effettuata usando un anticorpo anti-HA e la successiva analisi di western blotting è stata condotta con gli anticorpi contro RBL2/p130 e HA (per rilevare HA-MYR-AKT1). Nella Figura 1C, le cellule HEK-293 sono state trasfettate con il vettore HA-vuoto o i vettori di espressione di RBL2/p130 e HA-MYR-AKT1 e sono state raccolte dopo 48h per effettuare la co-IP con un anticorpo anti-RBL2/p130. La successiva analisi è stata effettuata usando gli anticorpi anti-RBL2/p130 e anti-HA. Nella figura 1D, RBL2/p130 endogeno è stato immunoprecipitato da estratti totali proteici di A549 (ATCC CCL-185) e di MSTO-211H (ATCC CRL-2081) e l'analisi di western blotting è stata effettuata usando gli anticorpi anti-RBL2/p130 e anti-AKT. Nella Figura 1E, il saggio di chinasi in vitro mostra che dosi crescenti di proteina AKT1 attiva ricombinante fosforilano il dominio ‘pocket’ GST–RBL2/p130-WT, prodotto in E. coli, ma non quando la ser 941 è mutata nell’aminoacido non fosforilabile ala (S941A). Nella Figura 1F, le cellule HEK-293 sono state trattate con l'inibitore AKT VIII (AKTiVIII) 25μM o DMSO, come controllo, e dopo 24h di trattamento le cellule sono state raccolte per la immunoprecipitazione con un anticorpo anti-RBL2/p130. L’analisi di western blot è stata effettuata prima con un anticorpo che riconosce i substrati fosforilati di AKT e successivamente con un anticorpo anti-RBL2/p130. Nella figura 1G, le cellule HEK-293 sono state trasfettate con i vettori esprimenti RBL2/p130 wt o mutato (S941A). 48 ore dopo la trasfezione, l’analisi di western blot è stata effettuata con un anticorpo anti-RBL2/p130 fosforilato nella Ser941 (pRBL2/p130 S941) e un anticorpo anti RBL2/p130 totale. Un anticorpo anti-GAPDH è stato usato come controllo di caricamento. È mostrato un esperimento rappresentativo di due esperimenti indipendenti. Nella figura 1H, le cellule HEK-293 sono state trasfettate con un vettore vuoto di controllo o con i vettori esprimenti RBL2/p130 wt o mutato (S941A). 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate per 24h con 25μM AKTiVIII o DMSO, come controllo. I livelli di pRBL2/p130 (S941), RBL2/p130 totale, AKT fosforilata (pAKT) e AKT totale sono stati valutati mediante western blot. Un anticorpo anti-GAPDH è stato usato come controllo di caricamento. I valori di densitometria riportati indicano i livelli di RBL2/p130 sia endogeno che ectopico normalizzati rispetto ai livelli di GAPDH e di pRBL2/p130 (S941) normalizzati rispetto ai livelli totali di RBL2/P130. È mostrato un esperimento rappresentativo di due esperimenti indipendenti. Figure 1 shows the results relating to example 1. In particular, Figure 1A shows the in silico analysis of the sequence that allowed to identify the presumed phosphorylation site of AKT (ser 941) in RBL2 / p130 within a reason for consent RXRXXS / TB. In Figure 1B, HEK-293 cells (ATCC CRL-1573) were transfected with vectors expressing RBL2 / p130 and myristylated HA-AKT1 (HA-MYR-Akt1) and harvested after 48h for co-immunoprecipitation analysis (co -IP). Co-IP was performed using an anti-HA antibody and subsequent western blotting analysis was performed with antibodies against RBL2 / p130 and HA (to detect HA-MYR-AKT1). In Figure 1C, HEK-293 cells were transfected with the HA-empty vector or RBL2 / p130 and HA-MYR-AKT1 expression vectors and were harvested after 48h to co-IP with an anti-RBL2 antibody / p130. Subsequent analysis was performed using anti-RBL2 / p130 and anti-HA antibodies. In Figure 1D, endogenous RBL2 / p130 was immunoprecipitated from total protein extracts of A549 (ATCC CCL-185) and MSTO-211H (ATCC CRL-2081) and western blotting analysis was performed using anti-RBL2 antibodies / p130 and anti-AKT. In Figure 1E, the in vitro kinase assay shows that increasing doses of recombinant active AKT1 protein phosphorylate the 'pocket' domain GST – RBL2 / p130-WT, produced in E. coli, but not when ser 941 is mutated into the amino acid non-phosphorylable wing (S941A). In Figure 1F, HEK-293 cells were treated with AKT VIII inhibitor (AKTiVIII) 25μM or DMSO, as a control, and after 24h of treatment the cells were harvested for immunoprecipitation with an anti-RBL2 / p130 antibody. Western blot analysis was performed first with an antibody that recognizes the phosphorylated substrates of AKT and then with an anti-RBL2 / p130 antibody. In Figure 1G, HEK-293 cells were transfected with vectors expressing RBL2 / p130 wt or mutated (S941A). 48 hours after transfection, western blot analysis was performed with an anti-RBL2 / p130 antibody phosphorylated in Ser941 (pRBL2 / p130 S941) and a total anti RBL2 / p130 antibody. An anti-GAPDH antibody was used as a loading control. A representative experiment of two independent experiments is shown. In Figure 1H, HEK-293 cells were transfected with a control blank vector or with the vectors expressing RBL2 / p130 wt or mutated (S941A). 48 hours after transfection, cells were treated for 24h with 25μM AKTiVIII or DMSO, as a control. Levels of pRBL2 / p130 (S941), total RBL2 / p130, phosphorylated AKT (pAKT) and total AKT were assessed by western blot. An anti-GAPDH antibody was used as a loading control. The reported densitometry values indicate both endogenous and ectopic RBL2 / p130 levels normalized to GAPDH and pRBL2 / p130 (S941) levels normalized to total RBL2 / P130 levels. A representative experiment of two independent experiments is shown.
Nella figura 2 sono riportati i risultati relativi all'esempio 2. La figura 2A mostra le curve dose-risposta che riportano i valori medi ± deviazione standard degli effetti di dosi diverse di AKTiVIII sulla vitalità cellulare. Quest’ultima è stata valutata con almeno due esperimenti mediante analisi MTS 72h dopo il trattamento di cellule di cancro polmonare non a piccole cellule (A549 e NSC-H358, ATCC CRL-5807) e mesotelioma (MMB, isolate e caratterizzato da L. Mutti, Istituto per la ricerca e la cura, Pavia, Italia); NSC-H2452 (ATCC CRL-5946), IST-MES 2 (Interlab Cell Line Collection (ICLC), IST: HTL01007), REN (isolate e caratterizzata dal Dr. Albelda SM University of Pennsylvania, Philadelphia, PA), MSTO-211H (ATCC CRL-2081) e NSC-H2052 (ATCC CRL-5915). I risultati sono espressi in percentuali di vitalità cellulare (calcolati in relazione alle cellule di controllo trattate con solo DMSO). La tabella riporta i valori IC50 per ogni linea cellulare. Nella figura 2B, gli effetti dell’AKTiVIII a lungo termine sono stati valutati mediante saggi clono genici. Le colonie sono state colorate con “crystal violet” due settimane dopo il trattamento di 24h con AKTiVIII o DMSO, quest’ultimo come controllo. AKTiVIII è stato usato ai relativi valori di IC50 ed anche a 1/4 e 1/2 di questi valori. Le cellule di controllo sono state trattate con DMSO alle stesse quantità usate per veicolare l'inibitore di AKT. Piastre rappresentative, su due (A549) o tre (MSTO-211H) esperimenti indipendenti, sono mostrate nel pannello superiore della figura. I valori medi del numero di colonie con la deviazione standard sono riportati negli istogrammi nel pannello inferiore. I dati sono stati sottoposti ad analisi della varianza (mediante ANOVA ad una via per misure ripetute con post-test Bonferroni), per confrontare ogni campione trattato con il rispettivo controllo non trattato. Differenze statisticamente significative sono indicate con: **molto significativo (p<0.01) e *** estremamente significativo (p<0,001). Figure 2 shows the results relating to example 2. Figure 2A shows the dose-response curves which report the mean values ± standard deviation of the effects of different doses of AKTiVIII on cell viability. The latter was evaluated with at least two experiments by MTS 72h analysis after the treatment of non-small cell lung cancer cells (A549 and NSC-H358, ATCC CRL-5807) and mesothelioma (MMB, isolated and characterized by L. Mutti , Institute for Research and Treatment, Pavia, Italy); NSC-H2452 (ATCC CRL-5946), IST-MES 2 (Interlab Cell Line Collection (ICLC), IST: HTL01007), REN (isolated and characterized by Dr. Albelda SM University of Pennsylvania, Philadelphia, PA), MSTO-211H (ATCC CRL-2081) and NSC-H2052 (ATCC CRL-5915). The results are expressed in percentages of cell viability (calculated in relation to the control cells treated with DMSO only). The table shows the IC50 values for each cell line. In Figure 2B, the long-term effects of AKTiVIII were evaluated using clono gene assays. Colonies were stained with "crystal violet" two weeks after 24h treatment with AKTiVIII or DMSO, the latter as a control. AKTiVIII was used at the relative IC50 values and also at 1/4 and 1/2 of these values. Control cells were treated with DMSO at the same amounts used to deliver the AKT inhibitor. Representative plates, on two (A549) or three (MSTO-211H) independent experiments, are shown in the upper panel of the figure. The mean values of the number of colonies with the standard deviation are shown in the histograms in the lower panel. The data were subjected to analysis of variance (by one-way ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test), to compare each treated sample with the respective untreated control. Statistically significant differences are indicated with: ** very significant (p <0.01) and *** extremely significant (p <0.001).
La figura 3 mostra i risultati relativi all'esempio 3. La Figura 3A mostra l’analisi per western blotting dei livelli di fosfoRBL2/p130 (S941), RBL2/p130, p27, fosfo-AKT (pAKT) e AKT totale in cellule A549 e MSTO-211H trattate per 24h con AKTiVIII ai suoi valori di IC50 o con DMSO come controllo. Anti-GAPDH e anti-β-actina sono stati usati come controllo di caricamento. E’ mostrato un esperimento rappresentativo di due esperimenti indipendenti. I valori di densitometria delle bande indicano i livelli di RBL2/p130 normalizzati rispetto ai livelli di GAPDH; di pRBL2/p130 (S941) normalizzati rispetto ai livelli di RBL2/P130 totale; e i livelli di p27 normalizzati rispetto ai livelli di βactina. B) analisi mediante real time qRT-PCR dell'espressione di RBL2 e CDKN1B (che codifica p27) nelle linee cellulari A549 e MSTO-211H 24h dopo il trattamento con AKTiVIII. L'espressione di RBL2 e CDKN1B in cellule trattate è stata calcolata con il metodo 2-∆∆ CT relativamente alle cellule di controllo, che sono state trattate con solo DMSO. I risultati sono riportati come media ± deviazione standard di quattro esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata effettuata sottoponendo i valori ΔCt dei campioni trattati e di controllo allo t-test di Student a due code. Differenze statisticamente significative sono indicate con: * significativo (p<0.05) e ** molto significativo (p<0.01). La figura 3C mostra l'effetto di AKTiVIII sulla stabilità di RBL2/p130 e p27 nelle linee cellulari A549 e MSTO-211H, valutate mediante western blotting dopo l'esposizione a cicloesimide (CHX). Le cellule sono state trattate con AKTiVIII ai relativi valori di IC50 o con DMSO, come controllo. Dopo 3h, CHX alla dose 0,25 mM è stata aggiunta alle cellule e sono stati valutati i livelli di RBL2/p130 e p27 mediante western blotting a diversi intervalli di tempo dopo l’ aggiunta di CHX come indicato. La freccia indica la banda specifica di RBL2/p130 mentre l'asterisco indica una banda aspecifica. La densità delle bande è stata quantificata mediante analisi densitometrica e i livelli di RBL2/p130 e p27 sono stati normalizzati rispetto ai livelli di GAPDH. I dati sono riportati come valori relativi rispetto alla densità delle bande al tempo zero (prima dell'esposizione a CHX), impostata a 1, e analizzate mediante regressione lineare. In figura 3D, A549 e MSTO-211H sono state trattate con IGF1 (100ng/ml) per 10 min o AKTiVIII (ai suoi valori di IC50) per attivare o inibire rispettivamente la via di AKT. RBL2/p130, fosfo-Akt (pAKT) ed i livelli totali di AKT sono stati valutati mediante western blot. L'anticorpo anti-GAPDH è stato usato come controllo di caricamento. E’ mostrato un esperimento rappresentativo di due esperimenti indipendenti. I valori di densitometria indicano i livelli di RBL2/p130 normalizzati rispetto ai livelli di GAPDH. In figura 2E, NSC-H358, IST-MES2 e NSC-H2052 sono state trattate con AKTiVIII (ai valori di IC50). RBL2/p130, fosfo-Akt (pAKT) ed i livelli totali di AKT sono stati valutati mediante western blot. L'anticorpo anti-GAPDH è stato usato come controllo di caricamento. I valori di densitometria della banda indicano livelli di RBL2/p130 normalizzati rispetto ai livelli di GAPDH. La figura 3F riporta l’analisi di western blot che mostra i livelli nucleari (N) e citoplasmici (C) di RBL2/p130 e p27 nelle cellule A549 e MSTO-211H 24h dopo il trattamento con AKTiVIII ai relativi valori di IC50 o con DMSO, come controllo quantificate mediante analisi densitometrica. I valori di densità nucleari e citoplasmatici sono stati normalizzati rispetto ai valori di lamin A/C e di GAPDH, rispettivamente. E’ mostrato un esperimento rappresentativo di due esperimenti indipendenti. La figura 3G riporta l’analisi mediante western che mostra l'effetto del silenzia mento di RBL2/p130 sui livelli della proteina p27 in cellule A549 e MSTO-211H trattate con AKTiVIII ai relativi valori di IC50 o con solo DMSO per 24h. Le cellule A549 e MSTO-211H sono state trasdotte stabilmente con vettori lentivirali esprimenti ‘short hairpin’ RNA (shRNAs) atti a silenziare RBL2 o un shRNA di controllo ‘non-targeting’. L'anticorpo anti-GAPDH è stato usato come controllo di caricamento. I valori di densitometria indicano i livelli di RBL2/p130 e p27 normalizzati rispetto ai livelli di GAPDH. Figure 3 shows the results for Example 3. Figure 3A shows the western blotting analysis of phosphoRBL2 / p130 (S941), RBL2 / p130, p27, phospho-AKT (pAKT) and total AKT levels in A549 cells and MSTO-211H treated for 24h with AKTiVIII at its IC50 values or with DMSO as control. Anti-GAPDH and anti-β-actin were used as loading control. A representative experiment of two independent experiments is shown. The densitometry values of the bands indicate the levels of RBL2 / p130 normalized with respect to the levels of GAPDH; pRBL2 / p130 (S941) normalized with respect to the total RBL2 / P130 levels; and p27 levels normalized to βactin levels. B) analysis by real time qRT-PCR of the expression of RBL2 and CDKN1B (encoding p27) in A549 and MSTO-211H cell lines 24h after treatment with AKTiVIII. The expression of RBL2 and CDKN1B in treated cells was calculated by the 2-∆∆ CT method for the control cells, which were treated with DMSO only. Results are reported as the mean ± standard deviation of four independent experiments. Statistical analysis was performed by subjecting the ΔCt values of the treated and control samples to the two-tailed Student's t-test. Statistically significant differences are indicated with: * significant (p <0.05) and ** very significant (p <0.01). Figure 3C shows the effect of AKTiVIII on the stability of RBL2 / p130 and p27 in the A549 and MSTO-211H cell lines, assessed by western blotting after exposure to cycloheximide (CHX). Cells were treated with AKTiVIII at relative IC50 values or with DMSO as a control. After 3h, CHX at a dose of 0.25 mM was added to the cells and the levels of RBL2 / p130 and p27 were evaluated by western blotting at different time intervals after the addition of CHX as indicated. The arrow indicates the specific band of RBL2 / p130 while the asterisk indicates a non-specific band. The density of the bands was quantified by densitometric analysis and the levels of RBL2 / p130 and p27 were normalized with respect to the levels of GAPDH. The data are reported as relative values with respect to the density of the bands at time zero (before exposure to CHX), set to 1, and analyzed by linear regression. In Figure 3D, A549 and MSTO-211H were treated with IGF1 (100ng / ml) for 10 min or AKTiVIII (at its IC50 values) to activate or inhibit the AKT pathway respectively. RBL2 / p130, phospho-Akt (pAKT) and total AKT levels were assessed by western blot. Anti-GAPDH antibody was used as a loading control. A representative experiment of two independent experiments is shown. Densitometry values indicate normalized RBL2 / p130 levels with respect to GAPDH levels. In Figure 2E, NSC-H358, IST-MES2 and NSC-H2052 were treated with AKTiVIII (at IC50 values). RBL2 / p130, phospho-Akt (pAKT) and total AKT levels were assessed by western blot. Anti-GAPDH antibody was used as a loading control. Band densitometry values indicate normalized RBL2 / p130 levels with respect to GAPDH levels. Figure 3F reports western blot analysis showing nuclear (N) and cytoplasmic (C) levels of RBL2 / p130 and p27 in A549 and MSTO-211H cells 24h after treatment with AKTiVIII at relative IC50 or DMSO values , as a control quantified by densitometric analysis. Nuclear and cytoplasmic density values were normalized with respect to lamin A / C and GAPDH values, respectively. A representative experiment of two independent experiments is shown. Figure 3G reports the western analysis showing the effect of the silencing of RBL2 / p130 on the levels of the p27 protein in A549 and MSTO-211H cells treated with AKTiVIII at the relative values of IC50 or with only DMSO for 24h. A549 and MSTO-211H cells were stably transduced with lentiviral vectors expressing 'short hairpin' RNA (shRNAs) capable of silencing RBL2 or a 'non-targeting' control shRNA. Anti-GAPDH antibody was used as a loading control. The densitometry values indicate the levels of RBL2 / p130 and p27 normalized with respect to the levels of GAPDH.
La figura 4 mostra i risultati relativi all'esempio 4. La figura 4A mostra un'analisi del ciclo cellulare delle cellule A549 e MSTO-211H trattate con AKTiVIII ai suoi valori di IC50 o con solo DMSO, come controllo, per 24h. La tabella riporta i valori di media e le deviazioni standard da almeno quattro esperimenti indipendenti. Nella figura 4B, le cellule A549 e MSTO-211H sono state trattate per 48h con AKTiVIII (IC50), sia da solo che in combinazione con l'inibitore pan-caspasi Z-VAD-FMK (100 μm) o con DMSO, come controllo, ed analizzate tramite il saggio dell'annessina V. I grafici mostrano le percentuali di apoptosi iniziale (popolazione delle cellule positive per annessina V) e di apoptosi/necrosi tardiva (popolazione delle cellule positive sia all’annessina V che allo ioduro di propidio). E’ mostrato un esperimento rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. Nelle figure 4C, le linee cellulari A549, MSTO-211H e HEK-293 sono state trasdotte stabilmente con i vettori lentivirali esprimenti shRNAs contro RBL2 o un shRNA di controllo e sono state trattate con AKTiVIII rispettivamente a 37,5 μm, 21,3 μm e 25μM, o con DMSO, come controllo. Dopo 48h dal trattamento, l'induzione di apoptosi è stata analizzata mediante saggi di annessina V. E’ mostrato un esperimento rappresentativo di due esperimenti indipendenti. Gli esperimenti di western blot che mostrano l'efficacia del silenziamento di RBL2/p130 in ogni linea cellulare sono riportati nel pannello di destra. L'anticorpo anti-GAPDH è stato usato come controllo di caricamento. La freccia indica la banda specifica RBL2/P130 mentre l'asterisco indica una banda aspecifica. In Figura 4D, le cellule HEK-293 stabilmente silenziate per l'espressione di RBL2 mediante shRNAs sono state trasfettate con un vettore di espressione di RBL2/p130 resistente al silenzia mento per valutare se la reintroduzione di RBL2/p130 poteva recuperare l’apoptosi indotta dalla inibizione di AKT. Le cellule di controllo sono state trasfettate con un vettore vuoto. 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con 25μM di AKTiVIII o DMSO e dopo ulteriori 48h è stato effettuato il saggio dell’annessina V. E’ mostrato un esperimento rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. Un esperimento di western blot che mostra il livello di riespressione di RBL2/p130 è indicato nel pannello di destra. L'anticorpo anti-GAPDH è stato usato come controllo di caricamento. Figura 4E, l’istogramma di sinistra mostra l'analisi di real time qRT-PCR dell’ espressione di TP73 in cellule HEK-293 stabilmente trasdotte con vettori lentivirali esprimenti shRNAs contro RBL2 o non-targeting shRNAs e trattate con 25μM di AKTiVIII o con DMSO. L'istogramma di destra mostra l'analisi di real time qRT-PCR dell'espressione di TP73 nelle cellule HEK-293 stabilmente silenziate per l'espressione di RBL2 e trasfettate con un vettore di espressione RBL2/p130 o con un vettore vuoto di controllo e, dopo 48h , trattate con 25μM AKTiVIII o con DMSO, come controllo. Figure 4 shows the results relating to Example 4. Figure 4A shows a cell cycle analysis of A549 and MSTO-211H cells treated with AKTiVIII at its IC50 values or with DMSO alone, as control, for 24h. The table reports the mean values and standard deviations from at least four independent experiments. In Figure 4B, A549 and MSTO-211H cells were treated for 48h with AKTiVIII (IC50), either alone or in combination with the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK (100 μm) or with DMSO, as a control. , and analyzed by the annexin V assay. The graphs show the percentages of initial apoptosis (population of annexin V positive cells) and of late apoptosis / necrosis (population of cells positive for both annexin V and propidium iodide) . A representative experiment of three independent experiments is shown. In Figures 4C, A549, MSTO-211H, and HEK-293 cell lines were stably transduced with lentiviral vectors expressing shRNAs against RBL2 or a control shRNA and were treated with AKTiVIII at 37.5 μm, 21.3 μm, respectively. and 25μM, or with DMSO, as a control. 48 hours after treatment, the induction of apoptosis was analyzed using annexin V assays. An experiment representative of two independent experiments is shown. Western blot experiments showing the efficacy of RBL2 / p130 silencing in each cell line are shown in the right panel. Anti-GAPDH antibody was used as a loading control. The arrow indicates the specific RBL2 / P130 band while the asterisk indicates a non-specific band. In Figure 4D, HEK-293 cells stably silenced for RBL2 expression by shRNAs were transfected with a silencing resistant RBL2 / p130 expression vector to assess whether reintroduction of RBL2 / p130 could recover induced apoptosis. from the inhibition of AKT. Control cells were transfected with a blank vector. 48 hours after transfection, the cells were treated with 25μM of AKTiVIII or DMSO and after a further 48 hours the annexin V assay was performed. An experiment representative of three independent experiments was shown. A western blot experiment showing the level of RBL2 / p130 re-expression is shown in the right panel. Anti-GAPDH antibody was used as a loading control. Figure 4E, the left histogram shows real time qRT-PCR analysis of TP73 expression in HEK-293 cells stably transduced with lentiviral vectors expressing shRNAs against RBL2 or non-targeting shRNAs and treated with 25μM of AKTiVIII or with DMSO. The right histogram shows real-time qRT-PCR analysis of TP73 expression in HEK-293 cells stably silenced for RBL2 expression and transfected with an RBL2 / p130 expression vector or with a control blank vector and, after 48h, treated with 25μM AKTiVIII or with DMSO, as a control.
L'espressione di TP73 nelle cellule trattate è stata calcolata mediante il metodo 2-ΔΔCt relativamente al controllo delle cellule trattate con solo DMSO. I risultati sono riportati come media con deviazioni standard di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita sottoponendo i valori ΔCt dei campioni trattati e di controllo ad analisi della varianza (mediante ANOVA ad una via per misure ripetute con post-test Bonferroni), per confrontare ciascun campione trattato con il rispettivo controllo non trattato. Le differenze statisticamente significative sono indicate con: * significativo (P <0,05). TP73 expression in treated cells was calculated by the 2-ΔΔCt method for the control of cells treated with DMSO alone. Results are reported as mean with standard deviations from three independent experiments. Statistical analysis was performed by subjecting the ΔCt values of the treated and control samples to analysis of variance (by one-way ANOVA for repeated measurements with Bonferroni post-test), to compare each treated sample with the respective untreated control. Statistically significant differences are indicated with: * significant (P <0.05).
La Figura 5 mostra i risultati relativi all'esempio 5. La Figura 5A mostra una tabella che riporta i valori di IC50 a 72 h di AKTiVIII (come riportato anche nella Figura 2A), roscovitina e cisplatino su linee cellulari A549 e MSTO-211H. Il valore di IC50 del cisplatino per le cellule MSTO-211H è stato riportato dai dati precedentemente pubblicati, mentre gli altri valori IC50 sono stati determinati nel presente studio dai dati sulla vitalità cellulare ottenuti attraverso esperimenti MTS. Nella Figura 5B, la vitalità cellulare di A549 e MSTO-211H è stata analizzata mediante dosaggio MTS 72 ore dopo il trattamento con AKTiVIII, sia da solo che in combinazione con roscovitina o cisplatino. Pannello superiore: curve dose-risposta per solo AKTiVIII, sola roscovitina e combinazione AKTiVIII-roscovitina. Pannello inferiore: curve dose-risposta per solo AKTiVIII, solo cisplatino e combinazione AKTiVIII-cisplatino. I risultati rappresentano la media e le deviazioni standard di almeno due esperimenti indipendenti, ciascuno condotto in triplicato, e sono espressi come percentuali di vitalità cellulare, calcolata rispetto alle cellule di controllo trattate con solo DMSO. La figura 5C riporta la rappresentazione grafica mediante isobologramma per la valutazione del sinergismo farmacologico. Gli isobologrammi sono derivati dai valori medi degli esperimenti doserisposta riportati in B attraverso il software CompuSyn 1.0 ad un livello di effetto fissato al 50%. I punti sulla linea indicano l'additività; i punti sotto la linea indicano la sinergia; i punti sopra la linea indicano l'antagonismo. La figura 5D mostra una tabella che riporta le medie deviazioni standard dell'indice di combinazione (CI) e valori r delle combinazioni di farmaci al 50% di mortalità cellulare (CI50) dopo 72 ore di trattamento, calcolate dal software CalcuSyn 1.1.1 per ciascuno degli indipendenti esperimenti. I valori CI al di sotto di 1 indicano il sinergismo del farmaco. La Figura 5E mostra gli istogrammi che rappresentano la vitalità delle cellule MET-5A analizzate mediante saggio MTS 72 h dopo il trattamento con AKTiVIII (37,5 μM) in combinazione con roscovitina (3,2 μM) o cisplatino (20 μM). La vitalità cellulare è stata calcolata rispetto alle cellule di controllo trattate con solo DMSO. I risultati rappresentano la media e le deviazioni standard di almeno tre esperimenti indipendenti, ciascuno condotto in triplice copia. I valori di assorbanza dei campioni trattati e di controllo sono stati sottoposti al test t di Student a due code per dati accoppiati e non hanno mostrato differenze significative. Figure 5 shows the results for example 5. Figure 5A shows a table showing the IC50 values at 72 h of AKTiVIII (as also reported in Figure 2A), roscovitin and cisplatin on A549 and MSTO-211H cell lines. The IC50 value of cisplatin for MSTO-211H cells was reported from previously published data, while the other IC50 values were determined in the present study from cell viability data obtained through MTS experiments. In Figure 5B, cell viability of A549 and MSTO-211H was analyzed by MTS assay 72 hours after treatment with AKTiVIII, either alone or in combination with roscovitin or cisplatin. Top panel: dose response curves for AKTiVIII alone, roscovitin alone, and AKTiVIII-roscovitin combination. Bottom panel: dose-response curves for AKTiVIII only, cisplatin only and AKTiVIII-cisplatin combination. The results represent the mean and standard deviations of at least two independent experiments, each conducted in triplicate, and are expressed as percentages of cell viability, calculated with respect to control cells treated with DMSO alone. Figure 5C shows the graphical representation using an isobologram for the evaluation of pharmacological synergism. The isobolograms are derived from the mean values of the dose-response experiments reported in B through the CompuSyn 1.0 software at an effect level set at 50%. The points on the line indicate additivity; the points below the line indicate synergy; dots above the line indicate antagonism. Figure 5D shows a table showing the mean standard deviations of the combination index (CI) and r-values of the drug combinations at 50% cell mortality (CI50) after 72 hours of treatment, calculated by the CalcuSyn 1.1.1 software for each of the independent experiments. CI values below 1 indicate drug synergism. Figure 5E shows histograms representing the viability of MET-5A cells analyzed by the MTS 72 h assay after treatment with AKTiVIII (37.5 μM) in combination with roscovitin (3.2 μM) or cisplatin (20 μM). Cell viability was calculated with respect to control cells treated with DMSO alone. The results represent the mean and standard deviations of at least three independent experiments, each conducted in triplicate. The absorbance values of the treated and control samples were subjected to the two-tailed Student's t test for paired data and did not show significant differences.
Descrizione dettagliata dell'invenzione Detailed description of the invention
Nella presente invenzione, RBL2/p130 è stata identificata come substrato diretto della chinasi AKT, uno dei principali fattori antiapoptotici iperattivi in più tipi di cancro. È stato dimostrato che RBL2/p130 e AKT1 interagiscono fisicamente e AKT fosforila il residuo Ser941 di RBL2/p130, situato nel dominio definito ‘pocket’, ma non quando questo residuo è mutato in Ala. È stato anche trovato che l'inibizione farmacologica di AKT, attraverso l' inibitore selettivo VIII (AKTiVIII), altera la fosforilazione di Ser941 RBL2/p130, aumenta la stabilità, l'espressione di mRNA e i livelli nucleari di RBL2/p130 sia in linee cellulari di cancro al polmone che di mesotelioma, rispecchiando gli effetti più ampiamente studiati sull'inibitore del ciclo cellulare p27. In the present invention, RBL2 / p130 has been identified as a direct substrate of AKT kinase, one of the major hyperactive antiapoptotic factors in multiple cancers. It has been shown that RBL2 / p130 and AKT1 physically interact and AKT phosphorylates the Ser941 residue of RBL2 / p130, located in the 'pocket' domain, but not when this residue has mutated into Ala. It has also been found that pharmacological inhibition of AKT, through selective inhibitor VIII (AKTiVIII), alters Ser941 RBL2 / p130 phosphorylation, increases stability, mRNA expression and nuclear levels of RBL2 / p130 both in lines lung cancer and mesothelioma cells, mirroring the most extensively studied effects on the p27 cell cycle inhibitor.
Coerentemente, l'inibizione di AKT riduce la vitalità cellulare, induce l'accumulo delle cellule in fase G0/G1 nonché l'apoptosi, che si è dimostrata largamente dipendente dallo stesso RBL2/p130, come mostrato in seguito al suo silenziamento. Consistently, AKT inhibition reduces cell viability, induces the accumulation of cells in the G0 / G1 phase as well as apoptosis, which has been shown to be largely dependent on RBL2 / p130 itself, as shown following its silencing.
L'inibizione di AKT induce apoptosi RBL2/p130-dipendente anche nelle cellule HEK-293, in cui la ri-espressione di RBL2/p130, resistente al silenziamento con shRNA, si è dimostrata in grado di ‘recuperare’ l'apoptosi indotta da AKTiVIII dopo il silenziamento di RBL2/p130. Inhibition of AKT induces RBL2 / p130-dependent apoptosis also in HEK-293 cells, in which the re-expression of RBL2 / p130, resistant to shRNA silencing, has been shown to 'recover' the apoptosis induced by AKTiVIII after muting RBL2 / p130.
I presenti inventori hanno anche dimostrato che la combinazione di inibitori di AKT e di chinasi ciclina dipendenti (CDK), che convergono sulla riattivazione del potenziale antitumorale RBL2/p130, rappresenta una promettente strategia antitumorale. The present inventors have also shown that the combination of AKT inhibitors and cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors, which converge on reactivating the RBL2 / p130 antitumor potential, represents a promising antitumor strategy.
In particolare, il peptide della presente invenzione comprende SEQ ID NO: 2, cioè LIKGKRKRRNXGSS, in cui X è qualsiasi amminoacido eccetto che una serina. Questo peptide rappresenta il sito di consenso minimo per la chinasi PKB/AKT su RBL2/p130 con l'amminoacido naturalmente corrispondente alla serina, mutato ad un amminoacido che non è fosforilato dalla chinasi. In particular, the peptide of the present invention comprises SEQ ID NO: 2, i.e. LIKGKRKRRNXGSS, wherein X is any amino acid except a serine. This peptide represents the minimal consensus site for PKB / AKT kinase on RBL2 / p130 with the amino acid naturally corresponding to serine, mutated to an amino acid that is not phosphorylated by the kinase.
Preferibilmente, X è qualsiasi amminoacido eccetto che serina, treonina e tirosina. Preferibilmente, X è un’alanina. Preferably, X is any amino acid except serine, threonine and tyrosine. Preferably, X is an alanine.
L'intera sequenza di RBL2/p130 è rappresentata da SEQ ID NO: 3. Come si può vedere, il peptide di SEQ ID NO: 1 corrisponde alle posizioni da 930 a 944 di SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 4 rappresenta l'intera proteina RBL2/p130 con la serina941 mutata con qualsiasi altro amminoacido. The entire sequence of RBL2 / p130 is represented by SEQ ID NO: 3. As can be seen, the peptide of SEQ ID NO: 1 corresponds to positions 930 to 944 of SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 4 represents the entire RBL2 / p130 protein with serine941 mutated with any other amino acid.
Preferibilmente, la proteina della presente invenzione comprende SEQ ID NO: 4. In altre parole, l'invenzione comprende la proteina RBL2/p130 con la serina 941 mutata. Questa proteina non può essere fosforilata da PKB/AKT. Preferably, the protein of the present invention comprises SEQ ID NO: 4. In other words, the invention comprises the RBL2 / p130 protein with the mutated serine 941. This protein cannot be phosphorylated by PKB / AKT.
La presente invenzione riguarda anche acidi nucleici che codificano i suddetti peptidi. The present invention also relates to nucleic acids which encode the aforementioned peptides.
I peptidi e gli acidi nucleici secondo la presente invenzione sono usati nel trattamento del cancro, preferibilmente nel cancro del polmone, mesotelioma o un in un altro tipo di tumore che coinvolga l’attivaione della via di PKB. Preferibilmente, il cancro è un tumore polmonare non a piccole cellule o un mesotelioma. The peptides and nucleic acids according to the present invention are used in the treatment of cancer, preferably in lung cancer, mesothelioma or in another type of tumor involving the activation of the PKB pathway. Preferably, the cancer is non-small cell lung cancer or mesothelioma.
In particolare, i peptidi e gli acidi nucleici secondo la presente invenzione sono usati nel promuovere l'apoptosi nelle cellule tumorali. In particular, the peptides and nucleic acids according to the present invention are used in promoting apoptosis in tumor cells.
La presente invenzione riguarda anche composti che inibiscono la proteina chinasi B (PKB)/AKT compromettendo la fosforilazione della Ser941 RBL2/p130 per l'uso nel trattamento del cancro. Un esempio preferenziale di questi composti è l'inibitore di AKT VIII (CAS-612847-09-3). Preferibilmente, i composti che inibiscono la proteina chinasi B (PKB)/AKT compromettendo la fosforilazione della Ser941 di RBL2/p130 sono usati in combinazione con un inibitore delle CDK. L'azione convergente di questi due tipi di composti su RBL2/p130 fornisce un effetto sinergico antitumorale. Gli inibitori delle CDK preferenziali sono quelli che riportano una buona attività contro CDK2. Esempi di inibitori delle CDK preferenziali sono la roscovitina, o inibitori di nuova generazione come Lee 011 (Ribociclib). In alternativa o in aggiunta, i composti che inibiscono la proteina chinasi B (PKB) compromettendo la fosforilazione della Ser941 RBL2/p130 sono preferibilmente usati in combinazione con il cisplatino. Un altro peptide comprendente SEQ ID NO: 1 - viene utilizzato, secondo la presente invenzione, per la diagnosi o la prognosi del cancro. I test basati su questo peptide possono evidenziare se un paziente con cancro possa o meno rispondere alle terapie citostatiche o citotossiche. The present invention also relates to compounds which inhibit protein kinase B (PKB) / AKT by compromising the phosphorylation of Ser941 RBL2 / p130 for use in the treatment of cancer. A preferential example of these compounds is the AKT VIII inhibitor (CAS-612847-09-3). Preferably, compounds that inhibit protein kinase B (PKB) / AKT by impairing Ser941 phosphorylation of RBL2 / p130 are used in combination with a CDK inhibitor. The convergent action of these two types of compounds on RBL2 / p130 provides a synergistic antitumor effect. Preferred CDK inhibitors are those that report good activity against CDK2. Examples of preferential CDK inhibitors are roscovitin, or new generation inhibitors such as Lee 011 (Ribociclib). Alternatively or in addition, compounds that inhibit protein kinase B (PKB) by compromising the phosphorylation of Ser941 RBL2 / p130 are preferably used in combination with cisplatin. Another peptide comprising SEQ ID NO: 1 - is used, according to the present invention, for the diagnosis or prognosis of cancer. Tests based on this peptide can highlight whether or not a patient with cancer can respond to cytostatic or cytotoxic therapies.
Esempi Examples
Esempio 1: AKT interagisce con RBL2/p130 e fosforila la S941. Per valutare se RBL2/p130 potesse essere un bersaglio della chinasi AKT, la sequenza proteica RBL2/p130 è stata analizzata in silico (http://scansite.mit.edu) e la Ser941 (S941) è stata identificata come un sito putativo di fosforilazione di AKT, predetto con alta stringenza, all'interno della sequenza consenso RXRXXS/TB, dove X è un qualsiasi amminoacido e B è un residuo idrofobico conservato in diverse specie (Figura 1A). È stato scoperto per la prima volta che RBL2/p130 e AKT possono interagire fisicamente attraverso esperimenti di coimmunoprecipitazione reciproca in cellule HEK-293 esprimenti RBL2/p130 ed una forma di AKT1 miristilata, costitutivamente attiva taggata mediante l’epitopo HA (HA-Myr-AKT1) (Fig. 1B-C). Inoltre, interazione tra AKT endogena e RBL2/p130 è stata dimostrata mediante immunoprecipitazione di RBL2/p130 da A549 e MSTO-211H, rispettivamente derivate da un carcinoma polmonare non a piccole cellule e una linea cellulare di mesotelioma pleurico rappresentativo dell'istotipo bifasico (Fig. 1D). Example 1: AKT interacts with RBL2 / p130 and phosphorylates S941. To assess whether RBL2 / p130 could be a target of AKT kinase, the RBL2 / p130 protein sequence was analyzed in silico (http://scansite.mit.edu) and Ser941 (S941) was identified as a putative site of AKT phosphorylation, predicted with high stringency, within the consensus sequence RXRXXS / TB, where X is any amino acid and B is a hydrophobic residue conserved in different species (Figure 1A). It was first discovered that RBL2 / p130 and AKT can physically interact through mutual coimmunoprecipitation experiments in HEK-293 cells expressing RBL2 / p130 and a myristylated, constitutively active form of AKT1 tagged by the HA epitope (HA-Myr- AKT1) (Fig.1B-C). Furthermore, interaction between endogenous AKT and RBL2 / p130 was demonstrated by immunoprecipitation of RBL2 / p130 from A549 and MSTO-211H, respectively derived from non-small cell lung cancer and a pleural mesothelioma cell line representative of the biphasic histotype (Fig. . 1D).
Successivamente è stato testato se RBL2/p130 potesse essere un substrato di AKT1 in vitro. L'analisi ha mostrato che AKT1 ricombinante attiva è stata in grado di fosforilare il dominio GST-RBL2/p130-Pocket, prodotto in E. coli, ma non quando la S941 è stata mutata nell' amminoacido non fosforilabile alanina (S941A) (Fig. 1E). Per valutare se RBL2/p130 fosse efficacemente fosforilata da AKT1 anche in vivo, RBL2/p130 endogena è stata immunoprecipitata da cellule HEK-293 ed è stato utilizzato un anticorpo commerciale contro i fosfosubstrati di AKT. L'anticorpo in effetti ha riconosciuto una banda, che era più debole dopo il trattamento con l'inibitore commerciale di AKT (AKTiVIII), e corrispondeva a RBL2/p130 stessa (Fig. 1F). Successivamente, è stato generato un anticorpo fosfospecifico, contro il residuo fosforilato (RBL2/p130pS941), che ha riconosciuto RBL2/p130wt ma non il mutante RBL2/p130S941A espresso in cellule HEK-293 mediante trasfezione (Figura 1G). Coerentemente, mentre RBL2/p130S941 è risultato fosforilato in HEK-293 esprimenti la forma attiva, fosforilata di AKT, la fosforilazione è risultata inibita dal trattamento con AKTiVIII e nel mutante RBL2/p130S941A (Figura 1H). It was subsequently tested whether RBL2 / p130 could be a substrate of AKT1 in vitro. The analysis showed that active recombinant AKT1 was able to phosphorylate the GST-RBL2 / p130-Pocket domain, produced in E. coli, but not when S941 was mutated into the non-phosphorylatable amino acid alanine (S941A) (Fig . 1E). To evaluate whether RBL2 / p130 was effectively phosphorylated by AKT1 also in vivo, endogenous RBL2 / p130 was immunoprecipitated by HEK-293 cells and a commercial antibody against AKT phosphosubstrates was used. The antibody did indeed recognize a band, which was weaker after treatment with the commercial AKT inhibitor (AKTiVIII), and corresponded to RBL2 / p130 itself (Fig. 1F). Subsequently, a phosphospecific antibody was generated, against the phosphorylated residue (RBL2 / p130pS941), which recognized RBL2 / p130wt but not the RBL2 / p130S941A mutant expressed in HEK-293 cells by transfection (Figure 1G). Consistently, while RBL2 / p130S941 was found to be phosphorylated in HEK-293 expressing the active, phosphorylated form of AKT, phosphorylation was inhibited by treatment with AKTiVIII and in the RBL2 / p130S941A mutant (Figure 1H).
Esempio 2: l'inibizione di AKT attraverso AKTiVIII influenza la sopravvivenza di cellule di cancro del polmone e mesotelioma Example 2: Inhibition of AKT by AKTiVIII Influences Lung Cancer Cell Survival and Mesothelioma
Prima di indagare gli effetti dell'inibizione di AKT su RBL2/p130, l'effetto di AKTiVIII sulla vitalità cellulare è stato valutato analizzando un pannello di linee cellulari di carcinoma polmonare non a piccole cellule e di mesotelioma pleurico, caratterizzati da iperattivazione della via di AKT. Il trattamento con AKTiVIII ha avuto un effetto citotossico, inibendo la vitalità cellulare in tutte le linee cellulari testate (Figura 2A) e risultante, dopo 72 ore di trattamento, nei valori indicati di concentrazione massima inibente (IC50) (Figura 2A). Per verificare se AKTiVIII esercitava un'inibizione della crescita cellulare a lungo termine, sono stati eseguiti saggi clonogenici su linee cellulari A549 e MSTO-211H. AKTiVIII, infatti, ha ridotto drasticamente il numero di colonie in entrambe le linee cellulari (Figura 2B). Before investigating the effects of AKT inhibition on RBL2 / p130, the effect of AKTiVIII on cell viability was evaluated by analyzing a panel of non-small cell lung cancer and pleural mesothelioma cell lines characterized by hyperactivation of the AKT. Treatment with AKTiVIII had a cytotoxic effect, inhibiting cell viability in all cell lines tested (Figure 2A) and resulting, after 72 hours of treatment, in the indicated values of maximum inhibitory concentration (IC50) (Figure 2A). To test whether AKTiVIII exerted long-term cell growth inhibition, clonogenic assays were performed on A549 and MSTO-211H cell lines. AKTiVIII, in fact, dramatically reduced the number of colonies in both cell lines (Figure 2B).
Esempio 3: l'inibizione di AKT aumenta i livelli di RBL2/p130 nelle linee cellulari di cancro del polmone e mesotelioma. L'effetto del trattamento con AKTiVIII ai suoi valori di IC50 è stato quindi analizzato sui livelli RBL2/p130 in A549 e MSTO-211H. Ventiquattro ore dopo il trattamento, è diminuito il rapporto tra fosfoRBL2/p130 (S941) e RBL2/p130 totale (figura 3A). È interessante notare che i livelli totali di RBL2/p130 sono aumentati in entrambe le linee cellulari, analogamente agli effetti sull'inibitore del ciclo cellulare p27, un noto bersaglio della chinasi AKT, che promuove la sua esportazione nucleare e degradazione (Figura 3A). Per una valutazione approfondita dell'effetto dell'inibizione di AKT su RBL2/p130, i livelli di mRNA di RBL2/p130 sono stati anche analizzati mediante qRT-PCR in tempo reale dopo 24 ore di trattamento con AKTiVIII ai suoi valori di IC50 a 72h, analizzando in parallelo i livelli di CDKN1B, che codifica per p27. L'inibizione di AKT induce i livelli di mRNA di RBL2/p130 e CDKN1B in entrambe le linee cellulari (figura 3B), coerentemente con studi precedenti che mostrano come l’attivazione di AKT in cellule quiescenti induca il rientro del ciclo cellulare inattivando i fattori di trascrizione ‘forkhead’, che aumentano direttamente i livelli trascrizionali sia di p27 che di RBL2/p130. Inoltre, è stato trovato che un trattamento di 3h con AKTiVIII, prima del blocco della traduzione con cicloesimmide, stabilizza i livelli di RBL2/p130 e di p27 aumentandone l'emivita sia in A549 che in MSTO-211H (Figura 3C). Questo effetto è coerente con studi precedenti che dimostrano che l'inattivazione di AKT risulta nella stabilizzazione di p27 ed è probabilmente dovuta alla soppressione della proteolisi mediata dal proteasoma indotta da AKT. Example 3: AKT inhibition increases RBL2 / p130 levels in lung cancer and mesothelioma cell lines. The effect of AKTiVIII treatment on its IC50 values was then analyzed on RBL2 / p130 levels in A549 and MSTO-211H. Twenty-four hours after treatment, the ratio of phosphoRBL2 / p130 (S941) to total RBL2 / p130 decreased (Figure 3A). Interestingly, total levels of RBL2 / p130 increased in both cell lines, similar to the effects on the cell cycle inhibitor p27, a known target of AKT kinase, which promotes its nuclear export and degradation (Figure 3A). For a thorough evaluation of the effect of AKT inhibition on RBL2 / p130, RBL2 / p130 mRNA levels were also analyzed by real-time qRT-PCR after 24 hours of AKTiVIII treatment at its IC50 values at 72h. , analyzing in parallel the levels of CDKN1B, which codes for p27. Inhibition of AKT induces RBL2 / p130 and CDKN1B mRNA levels in both cell lines (Figure 3B), consistent with previous studies showing that AKT activation in quiescent cells induces cell cycle reentry by inactivating factors forkhead transcription, which directly increase transcriptional levels of both p27 and RBL2 / p130. Furthermore, it was found that a 3h treatment with AKTiVIII, before translation block with cycloheximide, stabilizes the levels of RBL2 / p130 and p27 increasing their half-lives in both A549 and MSTO-211H (Figure 3C). This effect is consistent with previous studies showing that AKT inactivation results in stabilization of p27 and is likely due to AKT-induced suppression of proteasome-mediated proteolysis.
Per valutare ulteriormente l'effetto della modulazione di AKT su RBL2/p130, è stato testato l'effetto dell'attivazione fisiologica di AKT ottenuta mediante stimolazione delle cellule con il fattore di crescita IGF1 dopo 24 ore di crescita in basso siero. In entrambe le linee cellulari A549 e MSTO-211H, la stimolazione con IGF1 e la conseguente attivazione di AKT hanno portato alla diminuzione di RBL2/p130, in opposizione all'effetto determinato dall'inibizione dell'AKT (Fig. 3D). To further evaluate the effect of AKT modulation on RBL2 / p130, the effect of physiological activation of AKT achieved by stimulation of cells with growth factor IGF1 after 24 hours of low serum growth was tested. In both A549 and MSTO-211H cell lines, stimulation with IGF1 and subsequent activation of AKT led to decreased RBL2 / p130, as opposed to the effect caused by AKT inhibition (Fig. 3D).
È interessante notare che l'inibizione di AKT aumenta i livelli di RBL2/p130 anche in altre linee cellulari di cancro al polmone non a piccole cellule (NCI-H358) e di mesotelioma (IST-MES2 e NCI-H2052, rispettivamente rappresentative degli istotipi epitelioide e sarcomatoide) (Fig. 3E). Interestingly, AKT inhibition increases RBL2 / p130 levels in other cell lines of non-small cell lung cancer (NCI-H358) and mesothelioma (IST-MES2 and NCI-H2052, respectively, representative of histotypes). epithelioid and sarcomatoid) (Fig. 3E).
Anche la localizzazione subcellulare di RBL2/p130 è stata valutata su cellule di carcinoma polmonare e mesotelioma dopo 24 ore di trattamento con l'inibitore di AKT ai suoi valori di IC50 delle 72 ore. L'inibizione di AKT ha notevolmente aumentato l'espressione nucleare di RBL2/p130 in entrambe le linee cellulari A549 e MSTO-211H e, più debolmente ma in entrambe le linee cellulari e in esperimenti indipendenti, anche la localizzazione nucleare p27 (Fig. 3F). L'upregolazione nucleare di p27 dopo l'inibizione di AKT è anche coerente con dati precedenti degli inventori che hanno mostrato un aumento dell'espressione nucleare di p27 nelle MSTO-211H dopo inibizione della chinasi PI3 e la conseguente inibizione di AKT mediante LY294002. The subcellular localization of RBL2 / p130 was also evaluated on lung cancer and mesothelioma cells after 24 hours of treatment with the AKT inhibitor at its 72-hour IC50 values. Inhibition of AKT markedly increased the nuclear expression of RBL2 / p130 in both A549 and MSTO-211H cell lines and, more weakly but in both cell lines and in independent experiments, also the p27 nuclear localization (Fig.3F ). Nuclear upregulation of p27 after inhibition of AKT is also consistent with previous data from the inventors which showed an increase in nuclear expression of p27 in MSTO-211H after inhibition of PI3 kinase and subsequent inhibition of AKT by LY294002.
Complessivamente, questi risultati indicano che RBL2/p130 è un bersaglio di AKT che influenza molteplici aspetti della sua regolazione. La modulazione di RBL2/p130 da parte di AKT è parallela a quella, più intensamente studiata di p27, e l'inibizione di AKT induce l'attività nucleare di oncosoppressori di entrambe le proteine del ciclo cellulare. Questi dati confermano anche un ruolo precedentemente ipotizzato di RBL2/p130 nel prevenire la degradazione mediata dal proteasoma di p27, probabilmente agendo attraverso un ciclo di feedback positivo in cui sia RBL2/p130 che p27 inibiscono l'azione delle CDK che limita il loro potenziale oncosoppressore. Infatti, il silenziamento di RBL2/p130 attraverso vettori lentivirali che esprimono shRNA, abbassa i livelli di p27 in condizioni basali e impedisce l'aumento di p27 causato dall'inibizione di AKT (Fig. 3G). Collectively, these results indicate that RBL2 / p130 is a target of AKT that affects multiple aspects of its regulation. The modulation of RBL2 / p130 by AKT parallels the more intensely studied modulation of p27, and inhibition of AKT induces the nuclear activity of tumor suppressors of both cell cycle proteins. These data also confirm a previously hypothesized role of RBL2 / p130 in preventing proteasome-mediated degradation of p27, probably by acting through a positive feedback loop in which both RBL2 / p130 and p27 inhibit the action of CDKs which limits their tumor suppressor potential. . Indeed, silencing of RBL2 / p130 by lentiviral vectors expressing shRNA lowers p27 levels in basal conditions and prevents p27 increase caused by AKT inhibition (Fig. 3G).
Esempio 4: l'inibizione di AKT induce l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi nelle linee cellulari di cancro del polmone e mesotelioma Example 4: AKT inhibition induces cell cycle arrest and apoptosis in lung cancer and mesothelioma cell lines
Sono stati quindi valutati gli effetti dell'AKTiVIII sulla progressione del ciclo cellulare di A549 e MSTO-211. Il ciclo cellulare è stato analizzato mediante FACS dopo 24 ore di trattamento con AKTiVIII e, coerentemente con la stabilizzazione di RBL2/p130 e p27, è stato trovato l'accumulo cellulare nella fase G0/G1 (Figura 4A). Per analizzare se AKTiVIII inducesse l'apoptosi in queste linee cellulari è stato eseguito un saggio di annessina V dopo 48 ore di trattamento all'IC50. AKTiVIII ha indotto efficacemente l'apoptosi sia in A549 che in MSTO-211H e l'apoptosi è risultata dipendente dalla caspasi in quanto è stata inibita dal trattamento concomitante con l'inibitore pan-caspasi Z-VAD-FMK (Figura 4B). The effects of AKTiVIII on cell cycle progression of A549 and MSTO-211 were then evaluated. The cell cycle was analyzed by FACS after 24 hours of treatment with AKTiVIII and, consistent with the stabilization of RBL2 / p130 and p27, cell accumulation in the G0 / G1 phase was found (Figure 4A). To investigate whether AKTiVIII induced apoptosis in these cell lines, an annexin V assay was performed after 48 hours of treatment at IC50. AKTiVIII effectively induced apoptosis in both A549 and MSTO-211H and apoptosis was found to be caspase dependent as it was inhibited by concomitant treatment with the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK (Figure 4B).
RBL2/p130 è necessaria per innescare l'apoptosi in seguito all'inibizione di AKT RBL2 / p130 is required to trigger apoptosis following AKT inhibition
Studi recenti suggeriscono un ruolo attivo di RBL2/p130 nell'indurre l'apoptosi in determinati contesti. In particolare, RBL2/p130 è correlata ad un alto indice apoptotico nel retinoblastoma e ha una funzione proapoptotica nell'epitelio polmonare del topo e nelle cellule staminali mesenchimali. Quindi, per definire il ruolo specifico di RBL2/p130 nell'apoptosi indotta dall'inibizione di AKT, A549 e MSTO-211H stabilmente silenziate per l'espressione di RBL2/p130 attraverso la trasduzione con vettori lentivirali che esprimono o shRNAs non-targeting o RBL2 specifici, sono state trattate con AKTiVIII. Nonostante i diversi valori tra cellule parentali e trasdotte, in tutte le cellule silenziate per RBL2/p130 la percentuale di apoptosi dopo trattamento con l'inibitore di AKT era marcatamente diminuita rispetto alle cellule esprimenti RBL2/p130 (Fig. 4C), suggerendo che RBL2/p130 è richiesto per il programma apoptotico innescato da AKTiVIII in queste cellule. Recent studies suggest an active role of RBL2 / p130 in inducing apoptosis in certain contexts. In particular, RBL2 / p130 is related to a high apoptotic index in retinoblastoma and has a proapoptotic function in the mouse lung epithelium and mesenchymal stem cells. Hence, to define the specific role of RBL2 / p130 in AKT inhibition-induced apoptosis, A549 and MSTO-211H stably silenced for RBL2 / p130 expression through transduction with lentiviral vectors expressing either non-targeting shRNAs or RBL2 specific, were treated with AKTiVIII. Despite the different values between parental and transduced cells, in all cells silenced for RBL2 / p130 the rate of apoptosis after treatment with the AKT inhibitor was markedly decreased compared to cells expressing RBL2 / p130 (Fig. 4C), suggesting that RBL2 / p130 is required for the AKTiVIII-triggered apoptotic program in these cells.
Per valutare se la reintroduzione di RBL2/p130 potesse recuperare la capacità delle cellule di entrare in apoptosi in risposta all'inibizione di AKT, sono stati analizzati gli effetti della modulazione di RBL2/p130 nella linea cellulare HEK-293, più facilmente trasfettabile. Anche nelle HEK-293, il silenziamento di RBL2/p130 ha compromesso quasi completamente l'induzione dell'apoptosi innescata da AKTiVIII (Figura 4C). L'osservazione dello stesso ruolo di RBL2/p130 nell'innescare l'apoptosi dopo inibizione di AKT anche in HEK-293 è degna di nota considerando che queste cellule potrebbero contenere fattori capaci di ostacolare la funzione di oncosoppressione correlata al ciclo cellulare di RBL2/p130 (come E1A). Al contrario del suo silenziamento, la ri-espressione di RBL2/p130, dopo trasfezione di un mRNA resistente agli shRNA, ha recuperato la capacità delle cellule di entrare in apoptosi dopo inibizione di AKT, supportando ulteriormente l'ipotesi che RBL2/p130 possa esercitare, direttamente o indirettamente, un ruolo proapoptotico attivo in determinati contesti (figura 4D). To evaluate whether the reintroduction of RBL2 / p130 could recover the ability of cells to enter apoptosis in response to AKT inhibition, the effects of modulation of RBL2 / p130 in the more easily transfectable HEK-293 cell line were analyzed. Also in HEK-293, the silencing of RBL2 / p130 almost completely compromised the induction of apoptosis triggered by AKTiVIII (Figure 4C). The observation of the same role of RBL2 / p130 in triggering apoptosis after AKT inhibition also in HEK-293 is noteworthy considering that these cells may contain factors capable of hindering the cell cycle related oncosuppression function of RBL2 / p130 (like E1A). In contrast to its silencing, the re-expression of RBL2 / p130, after transfection of a shRNA-resistant mRNA, recovered the ability of cells to enter apoptosis after AKT inhibition, further supporting the hypothesis that RBL2 / p130 may exert , directly or indirectly, a proapoptotic role active in certain contexts (Figure 4D).
Poiché questi dati indicano un aumento di RBL2/p130 all'interno del nucleo dopo inibizione di AKT, è stato studiato se questo trattamento potesse influenzare l'espressione mediata da RBL2/p130 di geni coinvolti nell'apoptosi. A questo scopo è stata valutata l'espressione di TP73, che in precedenza abbiamo trovato in grado di innescare l'apoptosi nelle cellule di osteosarcoma in modo dipendente da RBL2/p130. Quindi, i livelli di mRNA di TP73 sono stati valutati in HEK-293 silenziate o meno per RBL2/p130 dopo trattamento con AKTiVIII. È stato trovato che l'inibizione di AKT induce efficacemente l'espressione di TP73 in HEK-293 ma non in cellule RBL2/p130-silenziate, mentre la ri-espressione di RBL2/p130 recupera l'aumento di TP73 dopo trattamento suggerendo che p73 possa contribuire all’apoptosi mediata da RBL2/p130 in questo contesto (Fig. 4E). Since these data indicate an increase in RBL2 / p130 within the nucleus after AKT inhibition, it was investigated whether this treatment could influence the RBL2 / p130-mediated expression of genes involved in apoptosis. For this purpose, the expression of TP73 was evaluated, which we previously found able to trigger apoptosis in osteosarcoma cells in a RBL2 / p130-dependent manner. Hence, TP73 mRNA levels were assessed in HEK-293 silenced or not for RBL2 / p130 after treatment with AKTiVIII. AKT inhibition was found to effectively induce TP73 expression in HEK-293 but not in RBL2 / p130-silenced cells, while re-expression of RBL2 / p130 recovers TP73 increase after treatment suggesting that p73 may contribute to RBL2 / p130-mediated apoptosis in this context (Fig. 4E).
Esempio 5: l'inibizione concomitante di CDK e AKT sinergizza nell’inibire la crescita di linee cellulari tumorali L'iperattivazione aberrante di AKT è alla base sia della tumorigenesi che della resistenza del cancro e influenza negativamente la prognosi di diversi tipi di tumori. Tuttavia, gli inibitori di AKT hanno mostrato una limitata efficacia clinica inducendo tossicità, soprattutto perché le funzioni di AKT sono essenziali anche nelle cellule normali. Uno studio recente ha dimostrato che AKT è direttamente fosforilato e attivato dal complesso CDK2/ciclina A, facendo luce sulla connessione scarsamente esplorata tra la progressione del ciclo cellulare e l'attivazione di AKT. Qui, considerando l'effetto diretto svolto da AKT sulla regolazione di RBL2/p130, è stato analizzato se la concomitante inibizione dell'attività di CDK e AKT, convergenti sulla "riattivazione" del ruolo oncosoppressore di RBL2/p130, potesse sinergizzare nella soppressione delle cellule tumorali. Quindi, la vitalità cellulare di A549 e MSTO-211H è stata testata dopo trattamento con AKTiVIII o in combinazione con la roscovitina, un inibitore di CDK di prima generazione con una buona attività contro CDK2. Prima, è stata determinata la IC50 della roscovitina a 72 ore (figura 5A) su A549 e MSTO-211H e quindi le cellule sono state trattate con entrambi i composti. La combinazione di farmaci è risultata efficace in entrambe le linee cellulari, come dimostrato dalle curve dose-risposta (Fig. 5B) e dall'analisi dell’isobologramma (Fig. 5C), con valori dell'indice di combinazione (CI) sempre inferiori a 1 (Fig. 5D). Ciò suggerisce che trattare il cancro del polmone e le cellule del mesotelioma con inibitori sia di CDK che di AKT potrebbe essere una strategia efficace per sopprimere il cancro riducendo gli effetti tossici. Example 5: the concomitant inhibition of CDK and AKT synergizes in inhibiting the growth of tumor cell lines The aberrant hyperactivation of AKT is the basis of both tumorigenesis and cancer resistance and negatively affects the prognosis of different types of tumors. However, AKT inhibitors have shown limited clinical efficacy by inducing toxicity, especially since AKT functions are essential even in normal cells. A recent study showed that AKT is directly phosphorylated and activated by the CDK2 / cyclin A complex, shedding light on the poorly explored connection between cell cycle progression and AKT activation. Here, considering the direct effect of AKT on the regulation of RBL2 / p130, it was analyzed whether the concomitant inhibition of the activity of CDK and AKT, converging on the "reactivation" of the tumor suppressor role of RBL2 / p130, could synergize in the suppression of cancer cells. Hence, the cell viability of A549 and MSTO-211H was tested after treatment with AKTiVIII or in combination with roscovitin, a first generation CDK inhibitor with good activity against CDK2. First, the IC50 of roscovitin at 72 hours (Figure 5A) on A549 and MSTO-211H was determined and then the cells were treated with both compounds. The drug combination was effective in both cell lines, as demonstrated by the dose-response curves (Fig. 5B) and by the analysis of the isobologram (Fig. 5C), with values of the combination index (CI) always lower. to 1 (Fig.5D). This suggests that treating lung cancer and mesothelioma cells with both CDK and AKT inhibitors could be an effective strategy to suppress cancer by reducing toxic effects.
Infine, è stato valutato se AKTiVIII potesse funzionare in combinazione con il cisplatino, che è il cardine del trattamento sia per il cancro del polmone che per il mesotelioma. Quindi, in base ai rispettivi valori di IC50 (Fig. 5A), sia A549 che MSTO-211H sono state trattate per 72 ore con entrambi i farmaci a diverse concentrazioni in un rapporto costante. I risultati hanno mostrato che l'inibizione di AKT funziona in sinergia anche con il trattamento con cisplatino, suggerendo che tale strategia possa essere ulteriormente esplorata per una rapida traslazione in ambito clinico (Figura 5B-D). È interessante notare che il trattamento concomitante con AKTiVIII e roscovitina o cisplatino (ciascuno utilizzato al massimo valore di IC50 identificato nelle cellule tumorali) non ha mostrato tossicità significativa nelle cellule MET-5A, derivate dal mesotelio normale (Fig. 5E). Finally, it was investigated whether AKTiVIII could work in combination with cisplatin, which is the mainstay of treatment for both lung cancer and mesothelioma. Then, based on their respective IC50 values (Fig. 5A), both A549 and MSTO-211H were treated for 72 hours with both drugs at different concentrations in a constant ratio. The results showed that AKT inhibition also works synergistically with cisplatin treatment, suggesting that this strategy can be further explored for rapid translation into the clinical setting (Figure 5B-D). Interestingly, concomitant treatment with AKTiVIII and roscovitin or cisplatin (each used at the highest IC50 value identified in tumor cells) did not show significant toxicity in normal mesothelium-derived MET-5A cells (Fig. 5E).
Esempio 6: AKT interagisce con RBL1/p107 e fosforila S787. L'analisi in silico della proteina RBL1/p107 (uniprot ID P28749, SEQ ID NO: 5) è stata eseguita come nell'esempio 1 e Ser787 (S787) è stato identificato come un sito putativo di fosforilazione da AKT, inserendo parametri di media stringenza. Example 6: AKT interacts with RBL1 / p107 and phosphorylates S787. The in silico analysis of the RBL1 / p107 protein (uniprot ID P28749, SEQ ID NO: 5) was performed as in Example 1 and Ser787 (S787) was identified as a putative site of phosphorylation by AKT, by entering media parameters stringency.
La presente invenzione pertanto si riferisce anche ad un peptide comprendente SEQ ID NO: 6, cioè RPKRTGXLALFYRK, in cui X è qualsiasi amminoacido eccetto che serina. Questo peptide rappresenta il sito di consenso minimo per la chinasi PKB/AKT su RBL1/p107 con l'amminoacido naturalmente corrispondente alla serina mutato ad un amminoacido che non è fosforilato dalla chinasi. The present invention therefore also refers to a peptide comprising SEQ ID NO: 6, i.e. RPKRTGXLALFYRK, in which X is any amino acid except serine. This peptide represents the minimal consensus site for PKB / AKT kinase on RBL1 / p107 with the amino acid naturally corresponding to serine mutated to an amino acid that is not phosphorylated by the kinase.
Claims (10)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT201800002694A IT201800002694A1 (en) | 2018-02-15 | 2018-02-15 | MOLECULES THAT INHIBIT PKB / AKT BY COMPROMISING THE SER941 PHOSPHORILATION OF RBL2 / p130 |
| PCT/IB2019/051246 WO2019159126A1 (en) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | Molecules inhibiting pkb/akt by impairment of rbl2/p130 ser941 phosphorylation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT201800002694A IT201800002694A1 (en) | 2018-02-15 | 2018-02-15 | MOLECULES THAT INHIBIT PKB / AKT BY COMPROMISING THE SER941 PHOSPHORILATION OF RBL2 / p130 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT201800002694A1 true IT201800002694A1 (en) | 2019-08-15 |
Family
ID=62044907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT201800002694A IT201800002694A1 (en) | 2018-02-15 | 2018-02-15 | MOLECULES THAT INHIBIT PKB / AKT BY COMPROMISING THE SER941 PHOSPHORILATION OF RBL2 / p130 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT201800002694A1 (en) |
| WO (1) | WO2019159126A1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007150077A2 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Immunotope, Inc. | Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer |
| US20090054333A1 (en) * | 2006-10-17 | 2009-02-26 | Antonio Giordano | Peptide inhibitors of cyclin-dependent kinase activity and uses thereof |
-
2018
- 2018-02-15 IT IT201800002694A patent/IT201800002694A1/en unknown
-
2019
- 2019-02-15 WO PCT/IB2019/051246 patent/WO2019159126A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007150077A2 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Immunotope, Inc. | Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer |
| US20090054333A1 (en) * | 2006-10-17 | 2009-02-26 | Antonio Giordano | Peptide inhibitors of cyclin-dependent kinase activity and uses thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| F PENTIMALLI ET AL.: "RBL2/p130 is a direct AKT target and is required to induce apoptosis upon AKT inhibition in lung cancer and mesothelioma cell lines", ONCOGENE, vol. 37, no. 27, 1 July 2018 (2018-07-01), Nature Publishing Group UK, pages 3657 - 3671, XP002783420, ISSN: 0950-9232 * |
| J ZHANG ET AL.: "Inhibition of Rb phosphorylation leads to mTORC2-mediated activation of Akt", MOLECULAR CELL, vol. 62, no. 6, 26 May 2016 (2016-05-26), ELSEVIER, pages 929 - 942, XP029613070, ISSN: 1097-2765 * |
| P INDOVINA ET AL.: "RB1 dual role in proliferation and apoptosis: cell fate control and implication for cancer therapy", ONCOTARGET, vol. 6, no. 20, 18 June 2015 (2015-06-18), pages 17873 - 17890, XP002783419 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019159126A1 (en) | 2019-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Drosten et al. | Targeting the MAPK pathway in KRAS-driven tumors | |
| Zhang et al. | Galangin inhibits tumor growth and metastasis of B16F10 melanoma | |
| Vehlow et al. | Interaction of discoidin domain receptor 1 with a 14-3-3-Beclin-1-Akt1 complex modulates glioblastoma therapy sensitivity | |
| Pechackova et al. | Inhibition of WIP1 phosphatase sensitizes breast cancer cells to genotoxic stress and to MDM2 antagonist nutlin-3 | |
| Nepal et al. | Autophagy induction by leptin contributes to suppression of apoptosis in cancer cells and xenograft model: involvement of p53/FoxO3A axis | |
| Schmieder et al. | Allosteric MEK1/2 inhibitor refametinib (BAY 86-9766) in combination with sorafenib exhibits antitumor activity in preclinical murine and rat models of hepatocellular carcinoma | |
| Lin et al. | Notch-1 activation-dependent p53 restoration contributes to resveratrol-induced apoptosis in glioblastoma cells | |
| Gewirtz et al. | Promotion of autophagy as a mechanism for radiation sensitization of breast tumor cells | |
| Chen et al. | Cdc6 contributes to cisplatin-resistance by activation of ATR-Chk1 pathway in bladder cancer cells | |
| Chen et al. | Dual cyclin‐dependent kinase 4/6 inhibition by PD‐0332991 induces apoptosis and senescence in oesophageal squamous cell carcinoma cells | |
| Wang et al. | Radiosensitization of metformin in pancreatic cancer cells via abrogating the G2 checkpoint and inhibiting DNA damage repair | |
| Gao et al. | Mirk/Dyrk1B mediates G0/G1 to S phase cell cycle progression and cell survival involving MAPK/ERK signaling in human cancer cells | |
| Elhag et al. | The effect of silibinin in enhancing toxicity of temozolomide and etoposide in p53 and PTEN-mutated resistant glioma cell lines | |
| Shi et al. | The PI3K inhibitor GDC-0941 enhances radiosensitization and reduces chemoresistance to temozolomide in GBM cell lines | |
| Park et al. | Dual targeting of angiotensin receptors (AGTR1 and AGTR2) in epithelial ovarian carcinoma | |
| Dai et al. | Targeting PP2A activates AMPK signaling to inhibit colorectal cancer cells | |
| Zhou et al. | Inhibition of Bcl-xL overcomes polyploidy resistance and leads to apoptotic cell death in acute myeloid leukemia cells | |
| Li et al. | c-Myc is a major determinant for antitumor activity of aurora A kinase inhibitor MLN8237 in thyroid cancer | |
| Pentimalli et al. | RBL2/p130 is a direct AKT target and is required to induce apoptosis upon AKT inhibition in lung cancer and mesothelioma cell lines | |
| Stehle et al. | Eribulin synergizes with Polo-like kinase 1 inhibitors to induce apoptosis in rhabdomyosarcoma | |
| Hong et al. | AKT upregulates B-Raf Ser445 phosphorylation and ERK1/2 activation in prostate cancer cells in response to androgen depletion | |
| Kriegs et al. | Radiosensitization of HNSCC cells by EGFR inhibition depends on the induction of cell cycle arrests | |
| Zhivkova et al. | Crucial role of reactive oxygen species (ROS) for the proapoptotic effects of indirubin derivative DKP‐073 in melanoma cells | |
| Liu et al. | Inhibition of IGF1R enhances 2-deoxyglucose in the treatment of non-small cell lung cancer | |
| Hung et al. | p22phox confers resistance to cisplatin, by blocking its entry into the nucleus |