IT201700017594A1 - Nanoparticelle per il rilascio controllato di Sorafenib - Google Patents
Nanoparticelle per il rilascio controllato di SorafenibInfo
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Description
Titolo: "Nanoparticelle per il rilascio controllato di Sorafenib"
Richiedente: Distretto Tecnologico Sicilia Micro e Nano Sistemi S.C.A.R.L.
Descrizione
Formano oggetto della presente invenzione nanoparticelle caricate di Sorafenib (Sorafenib PBB), dove dette nanoparticelle sono nanoparticelle polimeriche PBB, (PHEA-BIB-pButMA, a,β-poli(N-2-idrossietil)-co- { N-2 - etilene-[2-(poli(butiimetacrilato)-isobutirrato]}-D,L-aspartamide e un metodo per il loro ottenimento.
Forma ulteriore oggetto della presente invenzione una formulazione a rilascio controllato di Sorafenib che comprende Sorafenib PBB e l'uso di detta formulazione nel trattamento di patologie tumorali renali, epatiche, tiroidee e/o del glioblastoma ricorrente.
Stato dell'arte
II Sorafenib, 4-[4-[[4-cloro-3-(trifluorometil)fenil]carbamoilammino]fenossi]-N-metilpiridina-2-carbossammide, è un farmaco approvato per il trattamento del carcinoma epatocellulare (HCC). Il meccanismo di azione è mediato dall'attività inibitoria esercitata su chinasi sovraespresse in una serie di pathway molecolari coinvolti nella trasformazione delle cellule normali in cellule tumorali, in particolare recettori con attività chinasica e sulle Rat chinasi. Il farmaco è commercialmente disponibile in compresse, somministrate per via orale. Il Sorafenib è molto poco solubile in acqua e la sua biodisponibilità è bassa a causa di un forte effetto di primo passaggio. Inoltre, alla somministrazione è legata una spesso importante irritazione gastrointestinale (Zhang et al. Preparation , in vi tro release , and pharmacokinetics in rabbi ts of lyophilized inj ection of Sorafenib solid lipid nanoparticles . Int J Nanomed 2012, 7:2901-2910). Altri effetti collaterali quali rash cutaneo, diarrea, ipertensione, limitano fortemente la sua applicazione clinica.
Kim DH et al. in Antitumor activity of Sorafenibincorporated nanoparticles of dextran/poly(dl-lactidecoglycolide) block copolymer. Nanoscale Res Lett 2012, 7, 91, 1-6 hanno descritto nanoparticelle per il rilascio controllato di Sorafenib. Sorafenib è stato incorporato in un copolimero destrano/poli(dl-lactideco-glicolide) (DexbLG), con un rapporto copolimero/Sorafenib compreso tra 40:2 e 40:7, ottenendo nanoparticelle sferiche piuttosto omogenee. La formulazione si è dimostrata citotossica su cellule di colangiocarcinoma con attività simile a quella del Sorafenib libero. Il lavoro non fornisce alcuna indicazione circa una distribuzione preferenziale nel tessuto tumorale per dette nanoparticelle.
Con l'obiettivo di fornire un'alternativa vantaggiosa alle formulazioni ad oggi disponibili nello stato dell'arte, si descrivono qui nanoparticelle polimeriche comprendenti Sorafenib che hanno dimostrato caratteristiche sorprendentemente vantaggiose in termini di efficacia nel rilascio e stabilità nel tempo.
Descrizione dell'invenzione
Formano oggetto della presente invenzione nanoparticelle polimeriche contenenti Sorafenib. Forma ulteriore oggetto della presente invenzione una metodica per la preparazione di dette particelle e l'uso delle stesse nel trattamento di patologie tumorali renali, epatiche, tiroidee e/o del glioblastoma ricorrente.
Le nanoparticelle sono state ottenute a partire da un polimero biocompatibile, 1'a,β-poli(N-2-idrossietil)-D,L-aspartamide (PHEA) (Giammona et al. Reaction of a, β-poly (N-hydroxyethyl) -dl -aspartamide wi th derivatives of carboxylic acids . J Polymer Sci Polymer Chem. 1987, 25:2813-2818; Mendichi et al. Molecular characterization of a, β-poly (N-2-hydroxyethyl) -dl -aspartamide derivatives as potential self-assembling copolymers forming polymeric micelles . Polymer 2003, 44:4871-4879). In sintesi, PHEA è stato derivatizzato con abromoisobutirril bromuro (BIB), ed il derivato così ottenuto è stato usato quale "macroiniziatore" per la polimerizzazione del butil metacrilato (ButMA), polimerizzazione in catena laterale e via Atom Transfer Radicai Polimerization (ATRP), (Cavallaro et al. New Self-Assembling Polyaspartamide-Based Brush Copolymers Obtained by Atom Transfer Radicai Polymerization. Macromolecules 2009, 42:3247-3257; Licciardi et al. PHEA-graft-polybutylmethacrylate copolymer microparticles for delivery of hydrophobic drugs. Int J Pharm 2012, 433:16-24; Licciardi et al. Polymeric nanocarriers for magnetic targeted drug delivery : preparation , characterization and in vi tro and in vivo evaluation . Mol Pharm 2013, 10:4397-4407). Le nanoparticelle così ottenute sono state caricate del farmaco mediante il metodo della dialisi, senza l'utilizzo di tensioattivi, e caratterizzate.
Descrizione delle figure
Figura 1: Struttura chimica di copolimero PHEA-BIB-pButMA (PBB).
Figura 2: Profilo di dissoluzione del Sorafenib libero e di rilascio del Sorafenib dalle nanoparticelle PBB in SGF per 2 ore (A); SIF per 24 ore (B) e PBS per 24 ore (C). I dati riportati si riferiscono alla media valori ± DS (n = 3).
Figura 3: Effetti del Sorafenib in forma libera, PBB e PBB/Sor sulla vitalità cellulare di cellule di carcinoma epatico HepG2 (A) e Hep3B (B). La vitalità cellulare è espressa come percentuale dell'assorbanza misurata rispetto alle cellule controllo. I valori sono espressi come media ± DS dei valori ottenuti in tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in triplicato.
Figura 4: Effetto del Sorafenib in forma libera, PBB e PBB/Sor sulle proteine coinvolte nell'apoptosi e su proteine di segnalazione. I dati mostrati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con risultati comparabili. La freccia indica il frammento della proteina PARP, prodotto in seguito all'attivazione della risposta apoptotica.
Figura 5: Efficacia terapeutica in vivo di Sorafenib PBB in modelli di xenotrapianto di cellule umane di epatocarcinoma Hep3B e confronto con Sorafenib libero. (A) Crescita del tumore * p<0.05. (B) Analisi dell'alterazione del peso corporeo. (C) Indice di proliferazione, mediante analisi dei livelli di espressione della proteina Ki67, di tessuti tumorali provenienti da topi controllo e topi trattati. I dati sono espressi come percentuale di nuclei colorati positivamente/cellule totali. Barra = 50pm. (D) Colorazione ematossilina dei vasi sanguigni nei tessuti tumorali di topi controllo e topi trattati.
Figura 6: ng di farmaco ritrovati nei tessuti indicati dopo esposizione a Sorafenib libero (colonne bianche) o Sorafenib PBB (colonne grigie) * p < 0,05; ** p < 0,01.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Per il caricamento delle nanoparticelle con il farmaco, il copolimero PBB, sintetizzato mediante ATRP come descritto nei citati Cavallaro et al. 2009, Licciardi et al. 2012, Licciardi et al. 2013, è stato disciolto in un solvente, ad esempio selezionato nel gruppo che comprende dimetilformammide (DMF), dimetilsolfossido (DMSO), tetraidrofurano (THF) o loro miscele, in presenza di Sorafenib tosilato, con un rapporto in peso tra copolimero e Sorafenib compreso tra 10:1 e 1:1, preferibilmente tra 6:1 e 1,5:1, ancora più preferibilmente di 2:1, e la soluzione è stata dializzata per tre ore contro acqua bidistillata utilizzando una membrana da dialisi con un cut-off di peso molecolare (PM) superiore al PM del polimero, ovvero superiore a 80.000 Da, preferibilmente superiore o pari a 100.000 Da.
La fase acquosa esterna viene agitata delicatamente con un agitatore magnetico, così da favorire il processo di diffusione. L'acqua bidistillata viene sostituita periodicamente, tipicamente ad intervalli di 5 ore, o di 4 ore, o di 3 ore. La dialisi viene operata in un arco temporale di circa 24 ore. Al termine, viene opzionalmente aggiunto un crioprotettore preferibilmente selezionato nel gruppo che comprende PVP (polivinilpirrolidone) e/o PVA (polivinilalcool) e/o trealosio e/o lattosio e/o loro miscele, preferibilmente in rapporto in peso copolimero/crioprotettore=l:1, e la risultante dispersione è filtrata attraverso un filtro a membrana da 5 μπι, così da rimuovere il materiale insolubile. Il filtrato viene liofilizzato, così da avere nanoparticelle PBB caricate di Sorafenib (Sorafenib PBB) liofilizzate.
La quantità di Sorafenib caricato nelle nanoparticelle PBB, ovvero la frazione di massa delle nanoparticelle occupata dal farmaco { drug loading) , viene determinata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). La drug loading percentuale (DL%) di Sorafenib PBB è stata calcolata secondo l'Equazione (1):
I dati ottenuti dimostrano una DL% compresa tra lo 0,5 e il 30%, preferibilmente tra il 3 e il 20%, ancora più preferibilmente tra il 3 e il 4 %.
E' stata quindi valutata l'efficacia sulla crescita di cellule tumorali di Sorafenib PBB in un saggio in vitro condotto su cellule di epatocarcinoma umano. I risultati, mostrati in Figura 3, dimostrano che 1'intrappolamento di Sorafenib in PBB non solo non causa riduzione dell'attività del farmaco ma addirittura l'aumenta, come mostrato nella tabella 2 che riporta i valori medi di IC50 per Sorafenib libero e Sorafenib PBB ottenuti in cellule di epatocarcinoma HepG2 e Hep3B.
Le nanoparticelle vuote non hanno effetto citotossico sulle cellule testate, come mostrato in Figura 3.
Tabella 2
Sorafenib (μΜ) ± DS Sorafenib PBB (μΜ) ± DS HepG2 5.5 ± 1.0 3.6 ± 1.1
Hep3B 3.5 ± 0.5 3.0 ± 0.3
L'attività di Sorafenib PBB è confermata dai dati di Western blot riportati in Figura 4 che confermano il basso effetto citotossico del carrier e il mantenimento anche a livello molecolare dell'attività di Sorafenib libero da parte di Sorafenib PBB.
Test condotti in vivo, su topi nudi nei quali venivano iniettate cellule di epatocarcinoma, hanno mostrato che Sorafenib PBB potenzia l'attività di Sorafenib nell'inibire la crescita delle cellule tumorali, oltre a favorire un miglioramento complessivo dello stato dell'animale.
L'efficacia sorprendentemente vantaggiosa osservata in vivo è possibile grazie all'accumulo preferenziale delle Sorafenib PBB nella sede tumorale, come mostrato in Figura 6.
Forma ulteriore oggetto della presente invenzione una formulazione per il rilascio controllato di Sorafenib, dove detta formulazione comprende Sorafenib PBB.
Sono qui descritte Sorafenib PBB sorprendentemente vantaggiose per il trattamento di patologie tumorali renali, epatiche, tiroidee e/o del glioblastoma ricorrente, preferibilmente nel trattamento di epatocarcinoma . Sorafenib PBB si sono dimostrate in grado di rilasciare il farmaco preferenzialmente nella sede tumorale, con un conseguente marcato aumento dell'efficacia del farmaco e una riduzione degli effetti collaterali dovuti all'aspecifica e generale distribuzione del farmaco in altri organi.
E' altresì descritto un metodo per il trattamento di un tumore solido in un individuo che comprende la somministrazione a detto individuo di un quantitativo efficace di una composizione che comprende Sorafenib PBB, dove detto metodo riduce la vitalità delle cellule di epatocarcinoma.
In un'ulteriore forma di realizzazione, detto metodo comprende anche la somministrazione di un quantitativo efficace di uno o più ulteriore agente terapeutico.
Un ulteriore vantaggio delle Sorafenib PBB secondo la presente invenzione è da ricercarsi nella stabilità di Sorafenib PBB. Le interazioni fisiche nelle nanoparticelle PBB quando caricate con Sorafenib sono sufficientemente intense da conferire stabilità durante la conservazione a temperature diverse, come mostrato nell'esempio 2 che segue.
Esempi
Esempio 1: Preparazione di nanoparticelle PBB vuote o contenenti Sorafenib.
Il copolimero PBB (10 mg) da solo o con Sorafenib tosilato (6,35 mg) (rapporto in peso tra copolimero e Sorafenib uguale a 2:1) è stato disciolto in 5 mi di DMF e la soluzione è stata dializzata contro 1000 mi di acqua bidistillata per 3 ore utilizzando una membrana da dialisi SpectraPor con un cut-off di peso molecolare 100.000 Da a temperatura ambiente. La fase acquosa esterna è stata agitata delicatamente con un agitatore magnetico per aiutare il processo di diffusione. Quindi, l'acqua bidistillata è stata sostituita ad intervalli di 3 ore durante 24 ore. Dopo la dialisi, il PVP è stato aggiunto alla dispersione colloidale come crioprotettore (rapporto in peso tra copolimero e PVP uguale a 1:1); la risultante dispersione è stata filtrata attraverso un filtro a membrana da 5 pm (Sartorius, filtro per siringa Minisart, Germania) per rimuovere il materiale insolubile ed il filtrato è stato liofilizzato.
Esempio 2: Caratterizzazione delle nanoparticelle PBB La dimensione media, l'indice di polidispersione (PDI) e il potenziale zeta di nanoparticelle PBB vuote o caricate con Sorafenib sono stati valutati mediante misure di Dynamic Light Scattering (DLS) utilizzando lo strumento Malvern Zetasizer NanoZS. Dispersioni di nanoparticelle sono state preparate con il metodo descritto nell'esempio 1 e sono state analizzate a 25°C con una concentrazione del campione di 0,5 mg/ml in acqua bidistillata. I valori PDI e di diametro idrodinamico medio (dimensione in nm) sono stati ottenuti mediante analisi cumulativa della funzione di correlazione. Il valore del potenziale Zeta (mV) è stato calcolato mediante misure della mobilità elettroforetica utilizzando la relazione di Smoluchowsky e supponendo che k-a maggiore o uguale a 1 (dove "k" e "a" sono rispettivamente il parametro di Debye-Huckel e il raggio della particella). Tutte le misure sono state effettuate in triplicato.
I risultati sono riportati in Tabella 1:
Tabella 1
Nanoparticelle Diametro medio PDI Potenziale Zeta (Z average, nm) (mV)
PBB 196+7.6 0.32+0.06 -21.9+4.5
PBB contenenti 240+7.7 0.30+0.07 -28.9+5.7 Sorafenib
Nanoparticelle PBB vuote hanno mostrato un diametro medio di circa 196 nm; nanoparticelle PBB caricate con Sorafenib hanno un diametro medio inferiore a 500 nm, oppure a 300 nm, preferibilmente compreso tra 200 e 280 nm, ancora più preferibilmente di circa 240 nm.
L'incorporazione del farmaco aumenta la dimensione media delle nanoparticelle, presumibilmente per un aumento delle dimensioni nel nucleo idrofobico a causa della presenza del farmaco stesso. I valori del potenziale Zeta per nanoparticelle vuote o contenenti Sorafenib sono negativi, confermando così la stabilità delle nanoparticelle PBB. Poiché il valore del potenziale Zeta non cambia significativamente dopo l'incorporazione del farmaco, questo risultato indica l'assenza di interazioni ioniche tra il Sorafenib e le nanoparticelle PBB. E' stata quindi testata la stabilità fisica delle nanoparticelle PBB contenenti il Sorafenib (Sorafenib PBB). Dispersioni acquose di Sorafenib PBB sono state liofilizzate e conservate a - 20, 4 e 25°C per tre mesi. Nei tre casi, il rapporto tra la dimensione delle particelle dopo la conservazione rispetto alla dimensione iniziale era non superiore a 1.0 ± 0.1, indicando così la stabilità in tutte le condizioni analizzate. Inoltre, è stato trovato che Sorafenib PBB mantengono inalterato il contenuto di Sorafenib nelle condizioni analizzate.
Esempio 3: Determinazione della quantità di Sorafenib caricato
La quantità di Sorafenib caricato nelle nanoparticelle PBB, ovvero la drug loading, è stata determinata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), utilizzando un sistema Agilent 1260 Infinity con un rilevatore di lunghezza d'onda multipla, MWD, operante a 264 nm. La procedura cromatografica è stata condotta in isocratica a 25°C, utilizzando una colonna in fase inversa Gemini C6-fenil 110A (Phenomenex 5 pm, 250x4.60 mm), 90:10 metanolo-acqua come fase mobile, con un flusso di 1 ml/min. 50 μΐ di campione sono stati iniettati nella colonna (Craparo et al. Galactosylated polymeric carriers for liver targeting of Sorafenib . Int J Pharm 2014, 466:172-180). L'analisi dei dati è stata effettuata usando un software di Open Lab Chemstation. Le nanoparticelle liofilizzate contenenti Sorafenib sono state sospese in un'appropriata quantità di metanolo e agitate vigorosamente per 3-4 ore per estrarre il farmaco. La soluzione risultante è stata centrifugata a 6000 rpm per 10 min a 25°C e il surnatante è stato utilizzato per determinare la concentrazione di farmaco mediante una curva di calibrazione ottenuta con soluzione standard di Sorafenib in metanolo nel range 0,4-200 pg/ml (tr= 4,3 min). La DL% è risultata essere pari a 3.8±0.48% p/p.
Esempio 4: Rilascio del Sorafenib da Sorafenib PBB in vitro
Gli studi di rilascio del Sorafenib da Sorafenib PBB sono stati eseguiti in vitro nei seguenti mezzi riceventi: soluzione di acido cloridrico (pH 1) a simulare il liquido gastrico (SGF); tampone fosfato (pH 6,8), a simulare liquido intestinale (SIF) e soluzione tampone fosfato (PBS) (pH 7.4), cioè in fluido fisiologico, utilizzando il metodo del tubo da dialisi con un cut-off di 12000-14000 Da in condizioni sink.
Una quantità adeguata di Sorafenib PBB liofilizzate è stata dispersa in 2 mi del mezzo ricevente a temperatura ambiente. Quindi la dispersione è stata introdotta in un tubo da dialisi che è stato immerso in un recipiente esterno contenente 10 mi dello stesso mezzo in presenza di Tween 80 (1% v/v), aggiunto come solubilizzante di Sorafenib, poco solubile in acqua. Durante l'esperimento, la temperatura è stata mantenuta a 37°C in un agitatore termostatato e con un'agitazione di 100 giri/min. A intervalli di tempo determinato, aliquote da 1 mi sono state prelevate dal mezzo esterno e sostituite con un volume uguale di mezzo ricevente fresco. Il Sorafenib rilasciato è stato quantificato mediante analisi HPLC. Ogni esperimento di rilascio in vitro è stato ripetuto in triplicato.
E' stato altresì effettuato un esperimento di controllo per determinare la dissoluzione del farmaco libero: una quantità appropriata di Sorafenib è stata dispersa nel mezzo ricevente, al fine di avere una concentrazione finale di Sorafenib uguale a quella presente nelle nanoparticelle, quindi la dispersione è stata introdotta in un tubo di dialisi ( cut-off 12000-14000 Da) che è stato immerso in un recipiente contenente il mezzo ricevente. La quantità di Sorafenib nel mezzo ricevente è stata rilevata mediante analisi HPLC.
La quantità di Sorafenib rilasciata è stata espressa come rapporto percentuale tra il peso di farmaco rilasciato e la quantità totale di Sorafenib caricato nelle nanoparticelle. La Figura 2 mostra i profili di rilascio del Sorafenib da Sorafenib PBB e la dissoluzione del farmaco libero in SGF (A), SIF (B) e PBS (C). Si osserva, nel pannello A, che dopo 120 minuti di incubazione in SGF il rilascio cumulativo di Sorafenib dalle nanoparticelle è stato di circa il 75%. Il rilascio cumulativo del Sorafenib nelle 24 ore è stato di circa il 63% in SIF (pannello B) e di circa il 55% in PBS (pannello C). Nelle tre condizioni di rilascio, la dissoluzione di Sorafenib libero è pressoché completa entro le due ore. Pertanto, in tutti i mezzi di rilascio, Sorafenib PBB mostra un rilascio prolungato rispetto alla dissoluzione del Sorafenib libero.
Esempio 5: Saggi biologici in vitro
Linee cellulari
Le linee cellulari di carcinoma epatocellulare umano, HepG2 e Hep3B, sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC). Le cellule sono state tenute in 5% CO2e coltivate in terreno Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (SIGMA, Milano, Italia), supplementato con 10% (v/v) siero fetale bovino (FBS) (Gibco, Life Technologies, Monza MB, Italia), 2 mM L-glutammina, 100 U/ml di penicillina-streptomicina e 1 mM di sodio piruvato (SIGMA, Milano, Italia). Le linee cellulari sono state regolarmente controllate per eventuali contaminazioni da micoplasma.
Saggi di vitalità cellulare
5xl0<3>cellule/pozzetto sono state distribuite in piastre da 96 pozzetti, dispensando 100 μΐ di sospensione cellulare per pozzetto e incubate a 37°C in 5% C02.
Le cellule sono state incubate per ulteriori 72 ore con terreno fresco contenente Sorafenib libero (Sorafenib tosilato solubilizzato in dimetilsolfossido, DMSO), Sorafenib PBB o nanoparticelle PBB vuote. Queste ultime sono state risospese in condizioni di sterilità in H2O sterile, sonicate per 20 min in un sonicatore ad acqua, e diluite con un volume di RPMI completo (2X). Alla fine del trattamento, sono stati eseguiti saggi di vitalità cellulare utilizzando il kit CellTiter acquosa OneSolution (Promega Corporation, Madison, WI, USA). La percentuale di vitalità cellulare è stata calcolata in riferimento all'assorbanza misurata nelle cellule controllo. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i valori espressi come media ± DS di tre esperimenti indipendenti. In nessun campione è stata osservata crescita batterica, confermando la completa sterilità delle condizioni di manipolazione e dei campioni stessi.
I risultati misurati dopo trattamento con concentrazioni crescenti (0,6 - 10 μπι) dei composti indicati sono riportati in Figura 3. La vitalità cellulare è fortemente diminuita in maniera dose-dipendente in presenza di Sorafenib libero e, in modo ancora più marcato, di Sorafenib PBB.
Espressione di proteine coinvolte nel signalling e nell'apoptosi .
3xl0<5>cellule/pozzetto sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e mantenute per 24 ore a 37°C in 5% C02. Le cellule sono quindi state trattate per 24 ore con 2,5, 5 e 7,5 μΜ di Sorafenib libero (solubilizzato in DMSO), nanoparticelle PBB vuote o Sorafenib PBB, solubilizzate come riportato nei saggi di vitalità cellulare. Dopo il trattamento, sono stati ottenuti i U sati cellulari utilizzando il tampone RIPA (Celi Signaling Technologies Ine., Beverly, MA, USA). Le concentrazioni proteiche dei surnatanti sono state determinate con il kit Bio-Rad "Protein assay" (Bio-Rad Laboratories Srl, Milano, Italia) . Le analisi di Western blotting sono state eseguite utilizzando come anticorpi primari anticorpo anti β-actina (SIGMA), anti ERK1/2, anti p-ERKl/2 (fosfo-ERKl/2), anti PARP (poli(ADP)-ribosio polimerasi) e anti Mcl-1 (myeloid celi leukemia 1) (Celi Signaling). Come mostrato in Figura 4, Sorafenib libero e Sorafenib PBB inducono, alle concentrazioni di 5 e 7,5 μΜ, la frammentazione della proteina PARP, indicativo dell'induzione di apoptosi. Analogamente, la diminuzione del segnale p-ERKl/2 è evidente dopo trattamento con Sorafenib libero e dopo trattamento con Sorafenib PBB, soprattutto alla concentrazione di 7,5 μΜ. Una diminuzione dei livelli di espressione di p-ERKl/2 è indicativa di una diminuzione della proliferazione cellulare.
L'inibizione dei livelli di espressione di Mcl-1, proteina anti apoptotica, è evidente alle più alte concentrazioni di Sorafenib libero e di Sorafenib PBB. Il trattamento con il solo carrier (PBB) non mostra alcun effetto sui livelli di espressione di tutte le proteine analizzate.
Esempio 6: Saggi biologici in vivo
Modello murino
Topi nudi maschi atimici (foxl nu/nu) di 4 settimane di vita sono stati acquistati alla Envigo (Udine, Italia) e lasciati ad acclimatare per 1 settimana. Le cellule Hep3B (ΙΟχΙΟ<6>in 0,2 mi PBS), in fase di crescita logaritmica, sono state inoculate nel fianco destro degli animali. Quando i tumori erano palpabili (circa 300 mm<3>), i topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi di cinque animali ciascuno, con i vari volumi tumorali equamente distribuiti tra i quattro gruppi. Ogni gruppo è stato trattato per 17 giorni come di seguito indicato.
Gruppo 1: trattamento giornaliero (6 giorni/settimana) mediante iniezione intraperitoneale (IP) con 10 mg/kg di Sorafenib tosilato risospeso in DMSO ed ulteriormente diluito in una soluzione di 25% di etanolo (DMSO-EtOH). Gruppo 2: solo veicolo (DMSO-EtOH).
Gruppo 3: trattamento giornaliero (6 giorni/settimana) con 10 mg/kg di Sorafenib PBB risospese in RPMI.
Gruppo 4: trattamento giornaliero (6 giorni/settimana) con 10 mg/kg di nanoparticelle PBB vuote risospese in RPMI.
I campioni di nanoparticelle liofilizzate sono stati risospesi e sonicati come riportato nei saggi di vitalità cellulare. I volumi tumorali e il peso corporeo sono stati registrati due volte alla settimana come descritto precedentemente (Cusimano et al., Cytotoxic activi ty of thè novel small molecule AKT inhibi tor SC66 in hepatocellular carcinoma cells . Oncotarget 2015, 6, 1707-1722) . I topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale quando la massa tumorale superava il 10% del peso corporeo degli animali, o quando la massa tumorale si presentava ulcerata o sono state accertate altre condizioni di morbilità, in conformità alle linee guida istituzionali e in conformità con la legge nazionale (D.lgs n. 264-3 -2014) e le leggi e le politiche internazionali (ECC direttiva del Consiglio 86/609, GU L358.1, il 12 dicembre 1987). Questo studio è stato autorizzato dal Ministero della Salute con l'autorizzazione numero 1187/2015-PR. Alla fine della sperimentazione, da ciascun animale sono stati raccolti i tumori, il fegato, i reni, i polmoni e la milza. La metà di ciascun tumore, o organo, è stato congelato in azoto liquido e conservato a -80°C per le analisi di biodistribuzione, mentre l'altra metà è stata fissata in formalina ed utilizzata per le analisi di immunoistochimica .
Analisi di Immunoistochimica
Per quantificare l'espressione del marcatore di proliferazione cellulare Ki-67 è stato utilizzato il software ImmunoRatio® (http://jvsmieroscope.uta.fi/immunoratio/) che, utilizzando un algoritmo di deconvoluzione del colore, calcola la percentuale di area marcata positivamente (zona colorata con diaminobenzidina) verso l'area nucleare totale. Le colorazioni con ematossilina sono state altresì acquisite per analizzare la neo vascolarizzazione tumorale, utilizzando il microscopio Leica DMR dotato di una fotocamera digitale Leica DFC 320.
Come mostrato nella Figura 5A, il trattamento con 10 mg/kg di Sorafenib in forma libera ha ridotto la crescita tumorale rispetto al solo veicolo, anche se questa differenza non era significativa. Il trattamento con Sorafenib PBB ha inibito significativamente la crescita tumorale rispetto al trattamento con il farmaco libero (p < 0.05). Durante il trattamento, sono stati monitorati anche i cambiamenti del peso corporeo dell'animale. Come mostrato nella Figura 5B, i topi trattati con 10 mg/kg di Sorafenib non hanno mostrato una perdita significativa del peso corporeo, rispetto ai topi trattati con il solo veicolo, suggerendo un livello soddisfacente di citotossicità del farmaco alla concentrazione adoperata in questo studio. I topi trattati con Sorafenib PBB mostravano un aumento significativo del loro peso corporeo (p <0.001).
Negli animali trattati è altresì stata valutata la mobilità, osservando una migliore mobilità fisica nel gruppo degli animali trattati con Sorafenib PBB.
Per valutare l'attività anti-proliferativa, sono stati analizzati i livelli di espressione del marcatore nucleare Ki67. Il numero di cellule Ki67-positive diminuisce nei tessuti tumorali provenienti da animali trattati con Sorafenib PBB rispetto a quello nei tessuti tumorali di animali trattati con il farmaco libero, con PBB vuote o con solo veicolo (Figura 5C). Inoltre, la vascolarizzazione tumorale è stata valutata in tessuti tumorali dopo colorazione dei vasi sanguigni con ematossilina (Figura 5D). Il numero e le dimensioni dei vasi sanguigni diminuisce drasticamente nei tessuti tumorali da animali trattati con Sorafenib PBB rispetto a quelli osservati nei tessuti degli animali trattati con farmaco libero, con PBB vuote o con il solo veicolo.
Studi di biodistribuzione
Il Sorafenib è stato estratto dai tessuti degli animali trattati seguendo la procedura descritta in Craparo EF et al. Galactosylated polymeric carriers for liver targeting of Sorafenib. Int J Pharm 2014, 466, 172-180. Brevemente, ogni campione di tessuto è stato mescolato con tampone Tris (2 mi, 1 M, pH 8) in una provetta di vetro da 15 mi e omogeneizzato utilizzando un Ultraturrax T 25 (Janke & Kunkel Ika - Labortechnik) a 20500 giri per 15 min. Quindi, è stato aggiunto metanolo (1 mi) per precipitare le proteine. I campioni sono stati estratti tre volte con etere etilico (2 mi), e ciascuna estrazione è stata seguita da centrifugazione a 4000 rpm per 5 min a temperatura ambiente. Dopo ogni aggiunta di solvente, le provette da centrifuga sono state agitate per 15 min a temperatura ambiente e centrifugate per 5 min a 4000 giri/min. Gli strati organici sono stati trasferiti in una provetta di vetro ed evaporati a secchezza.
Ogni residuo secco è stato trattato con metanolo (0,6 mi) e, dopo agitazione, un volume di 50 μΐ è stato iniettato nel sistema HPLC. I dati mostrati in Figura 6 mostrano sorprendentemente un accumulo di Sorafenib negli organi analizzati quali fegato, milza, polmoni e reni e detto accumulo è diminuito quando gli animali sono trattati con Sorafenib PBB (colonna grigia) rispetto a quando il trattamento è effettuato con Sorafenib libero (colonna bianca). In particolare, la quantità di Sorafenib rilevata quando i topi sono stati trattati con il farmaco libero è significativamente più alta nei reni (p < 0,05), milza (p < 0,05) e polmoni (p<0,01) rispetto all'accumulo che si verifica dopo somministrazione di Sorafenib PBB.
Vantaggiosamente, Sorafenib PBB si accumula preferenzialmente nel tessuto tumorale. Infatti, la quantità di Sorafenib rilevata nel tumore dopo la somministrazione di Sorafenib PBB è risultata essere abbondantemente superiore rispetto a quella rilevata dopo l'iniezione di Sorafenib libero, e questa differenza è altamente significativa (p < 0.01).
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Nanoparticelle caricate di Sorafenib (Sorafenib PBB), dove dette nanoparticelle sono nanoparticelle polimeriche PBB, (PHEA-BIB-pButMA, a,β-poli(N-2-idrossietil)-co- { N-2 - etilene-[2-(poli(butilmetacrilato)-isobutirrato]}-D,L-aspartamide .
- 2. Le nanoparticelle secondo la rivendicazione 1, che hanno un diametro inferiore a 500 nm, oppure a 300 nm, preferibilmente compreso tra 200 e 280 nm, ancora più preferibilmente di circa 240 nm.
- 3. Le nanoparticelle secondo una delle rivendicazioni 1 o 2, che hanno una Drug loading % (DL%) compresa tra lo 0,5 e il 30%, preferibilmente tra il 3 e il 20%, ancora più preferibilmente tra il 3 e il 4%.
- 4. Un metodo per la preparazione di Sorafenib PBB che comprende: a)Mettere a disposizione il copolimero a,β-poli(N-2-idrossietil)-co-{N-2 - etilene-[2-(poli(butilmetacrilato)-isobutirrato]}-D,L-aspartamide (PBB) e Sorafenib o suoi Sali e derivati; b)Disciogliere in un solvente; c)Dializzare contro fase acquosa utilizzando una membrana di dialisi con un cut-off di peso molecolare superiore al PM del polimero, tipicamente superiore a 80.000 Da, preferibilmente superiore o pari a 100.000 Da; d) Filtrare la dispersione colloidale ottenuta in c) ottenendo così Sorafenib PBB.
- 5. Il metodo secondo la rivendicazione 4, dove detto Sorafenib è Sorafenib tosilato.
- 6. Il metodo secondo la rivendicazione 4 o 5, dove detto solvente è DMF (dimetilformammide) o DMSO (dimetilsolfossido) o THF (tetraidrofurano), o loro miscele .
- 7. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 4 a 6, dove dopo detto passaggio c) viene aggiunto un crioprotettore a detta dispersione colloidale, crioprotettore preferibilmente selezionato nel gruppo che comprende PVP (polivinilpirrolidone) e/o PVA (polivinilalcool) e/o trealosio e/o lattosio e/o loro miscele.
- 8. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 4 a 7, dove il rapporto in peso tra detto copolimero PBB e detto Sorafenib è compreso tra 10:1 e 1:1, o tra 6:1 e 1,5:1, più preferibilmente è di 2:1.
- 9. Formulazione a rilascio controllato di Sorafenib che comprende Sorafenib PBB.
- 10.La formulazione secondo la rivendicazione 9 che comprende altresì un quantitativo efficace di uno o più ulteriore agente terapeutico.
- 11.Formulazione secondo la rivendicazione 9 o 10 per l'uso nel trattamento di patologie tumorali renali, epatiche, tiroidee e/o del glioblastoma ricorrente, preferibilmente nel trattamento di epatocarcinoma.
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