IT201700012604A1

IT201700012604A1 - Nuovi regolatori dell’angiogenesi

Info

Publication number: IT201700012604A1
Application number: IT102017000012604A
Authority: IT
Inventors: Ileana Zucchi; Rolland Alvons Reinbold
Original assignee: Consiglio Naz Delle Ricerche Cnr
Priority date: 2017-02-06
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2018-08-06
Also published as: US11566070B2; US20200247882A1; WO2018142362A1; EP3576763C0; EP3576763A1; EP3576763B1

Description

"NUOVI REGOLATORI DELL’ANGIOGENESI"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda agenti che modulano/regolano l’attività della proteina TMEM230 per uso nel trattamento terapeutico di patologie in cui è consigliabile o necessaria una regolazione terapeutica dell’angiogenesi.

La presente invenzione riguarda quindi composizioni farmaceutiche comprendenti uno o più agenti come sopra definiti, e cioè agenti che modulano/regolano l’attività della proteina TMEM230 a livello di espressione (trascrizione, traduzione) del gene TMEM230 o a livello proteico (inibizione, peptidi mimetici o altro) e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile per uso nel trattamento terapeutico di patologie in cui è necessaria una regolazione terapeutica dell’angiogenesi.

La presente invenzione riguarda anche il trattamento terapeutico di patologie in cui è necessaria una regolazione terapeutica dell’angiogenesi mediante somministrazione in dosi terapeuticamente efficaci di uno o più agenti che regolano/modulano come descritto sopra l’attività della proteina TMEM230, o di composizioni farmaceutiche che li comprendono.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

La vasculogenesi è il processo responsabile della iniziale formazione dei vasi sanguigni a partire da cellule progenitrici, dette angioblasti. Essa è essenziale per lo sviluppo degli organi primordiali ed è uno dei processi fondamentali associati con lo sviluppo embrionale. Lo sviluppo embrionale dei vasi sanguigni comporta la differenziazione, la migrazione e la coalescenza delle cellule progenitrici endoteliali di derivazione mesodermica. Dopo il rudimentale assemblaggio dei vasi sanguigni, le cellule endoteliali (ECs) di origine arteriosa subiscono un processo di germinazione che promuove ulteriormente la ramificazione e consente la generazione di nuovi vasi che si formano per germinazione da vasi già esistenti, mediante un processo chiamato angiogenesi. L’ angiogenesi è quindi un processo di rimodellamento e di formazione di nuovi vasi sanguigni da vasi pre-esistenti (Figura 1A). Oltre che durante lo sviluppo embrionale, questa ha luogo nell’adulto durante il normale processo di omeostasi tissutale, oppure in condizioni patologiche come nella malattia chiamata degenerazione maculare (macula degeneration), nelle patologie vascolari, nella progressione tumorale e nel processo di metastatizzazione ed è necessaria nei processi di riparo e rigenerazione tissutale in seguito a ferite (Figura 1B). La formazione di nuovi vasi sanguigni si verifica anche durante la rigenerazione dei tessuti a seguito di lesioni ischemiche o nei disturbi cronici come il diabete. Pertanto il network dei vasi sanguigni è in continuo rimodellamento per rispondere alle richieste del tessuto.

Come avviene nel processo di vasculogenesi embrionale, quando si verificano lesioni tissutali o durante lo sviluppo di tumore, le cellule endoteliali ricevono stimoli che le inducono a proliferare. I vasi funzionali contengono cellule endoteliali che presentano una morfologia poligonale regolare di tipo pavimentoso polarizzato (cobblestone-like) che si mantengono in uno stato di quiescenza fino a quando non rilevano segnali proangiogenici, che le inducono alla perdita dei contatti giunzionali cellula-cellula e alla attivazione di proteasi che degradano la membrana basale circostante, consentendo alle ECs di cambiare morfologia, diventare allungate e acquisire capacità invasive e mobili. Nella normale omeostasi tissutale, i vasi funzionali sono costituiti prevalentemente da cellule endoteliali quiescenti (Figura 2A) e solo un piccolo numero di ECs viene selezionato per guidare la germinazione di nuovi vasi nel tessuto circostante. Queste cellule epiteliali dotate di motilità sono chiamate cellule Tip (TCs), e cioè cellule appuntite, e sono in grado di sviluppare estensioni dinamiche, chiamate fillipodia, essenziali per la migrazione. (Figura 2B) Le cellule quiescenti dei vasi funzionali invece sono chiamate Stalk cells (SCs) e a differenza delle cellule Tip sono in grado di mantenere i contatti cellula-cellula e fornire l'ancoraggio e il supporto strutturale per il corretto funzionamento dei vasi e per la germinazione delle cellule Tip (Figura 2B). Il processo di sprouting continua fino a che la TC si connette con vasi adiacenti con i quali si fonde per anastomosi (Figura 2C). Creata la fusione, le cellule TIP perdono il loro fenotipo mobile, il comportamento sproutong viene soppresso e il fenotipo quiescente ristabilito (Figura 2D). Mentre cicli successivi di angiogenesi permettono la ulteriore espansione del network vascolare, la ridistribuzione laterale delle proteine giunzionali: ZO1 (zonula occludens), claudina 5, CD99 e VE-cadherin (vascular endothelial cadherin) e il ripristino della corretta polarità apico-basale completano il processo di morfogenesi dei vasi neo formati. La combinazione di tali eventi si traduce nella generazione di nuovi vasi sanguigni. L’angiogenesi pertanto richiede l’organizzazione gerarchica e coordinata delle cellule endoteliali in TCs e SCs e uno stretto controllo spaziotemporale dell’espressione genica. Studi effettuati in topo e Zebrafish hanno dimostrato che i pathway VEFG e Notch sono fondamentali per la specificazione delle cellule Tip e Stalk durante i processi di angiogenesi in condizioni fisiologiche e patologiche e che alti livelli di espressione dei fattori pro-angiogenici esogeni come VEGFA e VEGFC (Fattori di crescita autocrini dell’endotelio vascolare) e dei recettori di VEGF-R2 (VEGFR2, Flk1) e/o VEGF-R3 (VEGFR3, FLT4) inducono le cellule Tip ad acquisire il comportamento di germinazione e invasione (Gerhardt et al. 2003; Noguera-Troise et al. 2006; Ridgway et al. 2006; Hellstrom et al.2007b; Leslie et al.2007; Lobov et al.2007; Siekmann and Lawson 2007; Suchting et al.2007; Phng and Gerhardt 2009; Phng et al.2009).

Nelle cellule adiacenti alle cellule Tip, sono stati riscontrati invece alti livelli di espressione di DLL4 (Delta-Like 4-Notch) che inibisce lateralmente il destino di cellula Tip e promuove la stabilità delle strutture dei vasi (Figura 3). Il buon coordinamento di tutti i fattori che regolano il signalling di Notch è essenziale per formare nuovi vasi e mantenere funzionali quelli esistenti. È stato dimostrato che l’attivazione costitutiva della via Notch induce la formazione di vasi difettivi o addirittura la rottura dei vasi esistenti (Noguera-Troise et al.2006; Ridgway J. et al. Nature 2006).

Il processo di sprouting delle cellule endoteliali nel tessuto embrionale o nel tessuto adulto, nei casi di malattia cronica o nelle lesioni vascolari acute, è quindi regolato da diversi fattori che inibiscono o promuovono il pathway di signaling di Notch/VEGF ed è un processo assimilabile alla transizione epitelio mesenchimale (EMT). La transizione EMT, processo mediante il quale le cellule epiteliali acquisiscono caratteristiche migratorie e invasive è considerata un evento fondamentale durante l’embriogenesi, per la morfogenesi e la generazione di organi e tessuti in vertebrati e invertebrati. Un processo simile si verifica durante l’invasione tumorale e la formazione di metastasi.

La ricerca corrente è fortemente orientata alla identificazione di geni che possano modulare il comportamento della cellula TIP e della cellula Stalk al fine di poter influenzare lo sprouting a scopo terapeutico.

L’angiogenesi rappresenta un paradigma per altri tipi di processi morfogenetici come ad esempio il processo che porta alla formazione del lume nei tessuti caratterizzati dalla presenza di cellule che si differenziano in strutture tubulari e vanno incontro a branching morphogenesis come le cellule luminali ghiandolari, come il processo di migrazione delle cellulare tumorali ad organi e tessuti distanti dal sito di origine o come i processi che regolano la meccano-trasduzione e l’orientamento degli assoni nelle cellule neurali (Adams RH, Eichmann A.2010; Herber SP, Stainier DYR.2011). Molti dei fattori di signaling che controllano l'angiogenesi controllano infatti anche la formazione del lume delle strutture epiteliali duttali e alveolari e la migrazione delle cellule neurali (Adams RH, Eichmann A.2010; Herber SP, Stainier DYR.2011). Inoltre, il comportamento migratorio e invasivo e le fasi iniziali associate alla formazione delle metastasi utilizzano gli stessi geni e pathways che sono stati dimostrati coinvolti nella formazione dei vasi sanguigni.

Nel caso dei tumori, ad esempio, è noto che la crescita e lo sviluppo di tumori solidi dipende fortemente dalla formazione di nuovi vasi che circondano la massa tumorale.

Una crescita anomala di nuovi vasi sanguigni si osserva anche in altre patologie come ad esempio l’artrite reumatoide, la retinopatia diabetica e la psoriasi.

In altre condizioni patologiche, come nelle patologie ischemiche cardiache o cerebrali o in caso di danni che coinvolgono il sistema circolatorio, l’induzione di angiogenesi ha invece un effetto terapeutico.

L' angiogenesi consiste nello sviluppo di nuovi vasi sanguigni a partire da quelli preesistenti, contrariamente alla vasculogenesi primaria, che avviene durante lo sviluppo embrionale, in cui le cellule endoteliali si formano dalle cellule staminali. Analogamente a quanto avviene durante la crescita degli assoni, le cellule Tip sono in grado rispondere a segnali attrattivi e repulsivi con la finalità di definire la traiettoria in cui il nuovo sprout dovrà orientarsi (Gerhardt et al. 2003) e sono in grado di formare nuove connessioni tra sprout differenti per generare nuovi circuiti vascolari funzionali (Isogai et al.2003).

L'angiogenesi è un processo di fondamentale importanza in molti processi fisiologici, quali la normale crescita del tessuto, lo sviluppo embrionale, la cicatrizzazione delle ferite, il ciclo mestruale (ovulazione), la formazione della placenta.

D’altro canto, l’angiogenesi è anche un processo basilare in molti processi patologici. Le patologie associate al processo angiogenico possono essere dovute ad una basa attività angiogenica, come il danneggiamento dei tessuti in seguito a ischemia o l’insufficienza cardiaca e oppure ad un’alta attività angiogenica come le infiammazioni croniche tra cui l’artrite reumatoide, la malattia di Crohn, la retinopatia diabetica, la psoriasi, l’endometriosi e il cancro.

Lo sviluppo di un vaso sanguigno è infatti una fase essenziale nella crescita e nello sviluppo di un tumore. Le cellule tumorali producono (o inducono le cellule vicine a produrli) fattori di crescita che stimolano la formazione di vasi sanguigni. Nel 1971 Folkman ipotizzò che, la prevenzione dell'angiogenesi, privando le cellule dei nutrienti vitali, avrebbe potuto inibire la crescita tumorale.

L'angiogenesi è anche una componente essenziale nella formazione delle metastasi. I nuovi vasi sanguigni neoformati, associati alla massa tumorale permettono che le cellule tumorali lascino il sito di origine e raggiungano organi distanti attraverso il torrente circolatorio. Così più alta è la densità di nuovi vasi sanguigni all'interno dei tumori, più alto è il rischio di metastasi.

Poiché l’angiogenesi è un processo fondamentale per la crescita di un tumore, molti dei farmaci antitumorali in studio in questi anni hanno la potenzialità di inibire l'angiogenesi e quindi limitare la crescita tumorale. La trombospondina ad esempio è stato il primo inibitore ad essere scoperto nel 1989. Altri due inibitori l'angiostatina e l’endostatina sono stati poi identificati tra il 1994 e il 1997.

Il processo angiogenico è caratterizzato da modificazioni dell’endotelio e della matrice extracellulare che possono essere cosi riassunte:

1. destabilizzazione dei vasi preesistenti in seguito ad un aumento della permeabilità vasale e ad una perdita delle connessioni tra le cellule endoteliali.

2. proliferazione e migrazione delle cellule endoteliali in una zona del tessuto dove si necessita la formazione di nuovi vasi.

3. aumento della permeabilità dei vasi sanguigni; produzione di enzimi proteolitici che degradano la matrice cellulare e facilitano la migrazione delle cellule endoteliali.

4. differenziazione delle cellule endoteliali caratterizzata da un arresto della proliferazione cellulare e dalla formazione di capillari primitivi.

È stato dimostrato che il Notch/VEGF signaling è di fondamentale importanza nell’angiogenesi per la realizzazione dello sprouting cioè la germinazione dei capillari. Nel processo di sprouting Notch promuove la formazione di leading “tip” endothelial cells e determina la distinzione tra “tip” e le growing “stalk” cells che formeranno il capillare. Il Notch/VEGF signalling pathway è un meccanismo evolutivamente conservato che svolge un ruolo cruciale nel controllo della differenziazione delle cellule e del cell-fate determination durante lo sviluppo embrionale. La ricerca corrente suggerisce che il Notch/VEGF signaling non è solo attivo durante lo sviluppo ma è fondamentale anche per il mantenimento delle cellule staminali adulte, mentre il suo malfunzionamento è associato alla patogenesi di varie malattie umane, tra cui il cancro. Il Notch/VEGF pathway infatti controlla la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali, così come la progressione tumorale ed è infatti spesso aberrantemente attivato in molti tumori metastatici.

Nei mammiferi sono stati identificati quattro geni omologhi al gene Notch identificato inizialmente in drosofila. I 4 geni Notch (Notch 1-4) codificano per recettori che riconoscono i ligandi Delta-like1, 3, e 4 e Jagged 1 e 2 (Bray, 2006). Tali recettori sono particolarmente espressi in cellule dotate di potenzialità staminale, ne determinano il loro differenziamento ed hanno un ruolo in una serie di processi tra cui la funzione e lo sviluppo dei neuroni, la formazione dei somitomeri, l'angiogenesi, l'espansione delle staminali emopietiche, lo sviluppo dell'osso. I recettori Notch sono inoltre costitutivamente espressi in alcuni tumori e sono coinvolti in vari meccanismi patogenetici come la sclerosi multipla, la leucemia linfoblastica acuta, la sindrome di Alagille e la tetralogia di Fallot.

Il percorso del Notch signalling è costituito dal recettore di transmembrana Notch e dai suoi ligandi Delta e/o Jagged. Appena sintetizzati i recettori Notch vengono scissi da una proteasi nell’apparato del Golgi e trasportati verso la superficie cellulare. Questa scissione genera un recettore che è composto da una regione extracellulare (N<EC>) e da una regione citoplasmatica (N<TM>). La via del segnale Notch prende inizio con l’interazione ligando-recettore tra cellule adiacenti. L’interazione tra recettore e ligando della stessa cellula (interazione cis) conduce la cellula a non generare un segnale, a causa della degradazione di entrambe le proteine. L'interazione tra il recettore di una cellula con il ligando di una cellula vicina (trans interazione) porta al rilascio del dominio intracellulare di Notch (N<iCD>) nel citoplasma. Il N<ICD>quindi entra nel nucleo dove si associa con il fattore di trascrizione CSL con conseguente successiva attivazione di geni bersaglio. Studi recenti infatti hanno rivelato l’esistenza di un grande numero di geni che possono essere direttamente regolati dal Notch (Krejci et al., 2009; Weng et al., 2006). Durante lo sviluppo dei vertebrati e nei processi di tumorigenesi, l’inibizione o l’induzione del differenziamento e l’avvio dei processi di proliferazione rappresentano le funzioni più importanti del Notch signaling.

Quindi, vi è un interesse sempre maggiore nel bloccare o attivare il segnale Notch in differenti contesti e in generale, poiché il processo di formazione di un vaso sanguigno, o la sua distruzione, sono alla base dell'insorgenza di molte malattie che colpiscono l'uomo, riuscire a controllare tale processo è molto importante per la terapia di molte malattie, oltre ai tumori.

Data l’importanza della regolazione dell’angiogenesi nel trattamento di numerose patologie, è sentita nella tecnica la necessità di identificare nuovi bersagli biologici che permettano una regolazione dell’angiogenesi a scopo terapeutico.

È nota in letteratura la sequenza genomica e dell’mRNA della proteina TMEM230 (anche transmembrane protein 230) murina e umana. TMEM230 è una proteina transmembrana che non ha omologia con altri geni o proteine conosciute e di cui non è nota la funzione. In un recentissimo studio è dimostrato che il gene TMEM230 è mutato in pazienti affetti da malattia di Parkinson e che la proteina TMEM230 co-localizza con la proteina syntaxin 6 nel trans Golgi network (TGN) e nelle vescicole pre-sinaptiche, con RAB5A negli endosomi e con MAP1LC3A negli autofagosomi di neuroni di topo (Deng HX et al. Nat. Genet.2016).

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Gli autori della presente invenzione hanno determinato che la proteina TMEM230 (identificata con precisione nel glossario) in cellule embrionali e adulte, ha un ruolo nella regolazione della germinazione (sprouting) delle cellule endoteliali, nella transizione epitelio mesenchimale delle cellule epiteliali, nell'invasione e nella migrazione di cellule epiteliali tumorali e nella morte cellulare anoikis dipendente. Mentre è riportato che il gene umano TMEM230, quando mutato, è associato alla eziologia della malattia di Parkinson (Deng HX et al. Nat. Genet. 2016) il suo ruolo nelle cellule endoteliali e nelle cellule epiteliali non è ancora stato descritto. Gli inventori della presente invenzione dimostrano che il gene TMEM230 codifica per una proteina di membrana che localizza nelle vescicole secretorie e contribuisce al mantenimento e alla regolazione di strutture che contengono lume, come le strutture vascolari e tubulo-alveolari epiteliali. I risultati sono stati inizialmente generati utilizzando il sistema modello in vivo di Zebrafish, e successivamente utilizzando cellule endoteliali umane ottenute da pazienti, tessuti tumorali mammari e di rene e linee cellulari luminali umane normali e tumorali. Gli autori hanno dimostrato che a seconda dei livelli di espressione, TMEM230 regola ed è necessario per la crescita e la stabilità dei vasi ed il fatto che i livelli di TMEM230 possano essere modulati fa di TMEM230 un eccellente target biologico per fini terapeutici.

Mentre la sequenza genomica e dell’mRNA di TMEM230 umano e murino sono annotate in banca dati, e mutazioni nella sequenza del gene sono state identificate in pazienti affetti dalla malattia di Parkinson (Deng HX et al. Nat. Genet. 2016) il ruolo di TMEM230 in cellule epiteliali e endoteliali, non è mai stato descritto. Le cellule endoteliali formano la parete dei vasi sanguigni mentre le cellule epiteliali formano la parete dei tubuli, dei dotti e degli alveoli di molti organi e tessuti. Le cellule endoteliali e le cellule epiteliali separano il sangue e i liquidi corporei da altre componenti tissutali e costituiscono una barriera a permeabilità selettiva, raggiunta mediante la coordinata apertura e chiusura delle giunzioni cellula-cellula. Tali giunzioni hanno un ruolo critico nella trasduzione dei segnali meccanici e chimici che regolano l’inibizione della crescita da contatto, l’apoptosi, l’espressione genica e la formazione e la stabilità dei vasi.

Le cellule endoteliali si dividono raramente (una volta ogni 3 anni) tuttavia quando la situazione lo richiede, l’attivazione del processo di angiogenesi può indurle a dividersi.

Gli autori hanno dimostrato per la prima volta che TMEM230 è un regolatore della via del Notch/VEGF signaling e può compensare, correggere e modulare il pathway Notch/VEGF. Pertanto la modulazione di TMEM230 può essere utilizzata a fini terapeutici in tutte quelle cellule e in quelle condizioni in cui sia necessaria la regolazione del Notch/VEGF pathway, sia nell’ambito della medicina rigenerativa sia nella terapia antitumorale.

In particolare, gli autori hanno determinato che il gene TMEM230 è un regolatore della via di signaling di Notch in vari tipi di cellule, come ad esempio le cellule endoteliali e le cellule epiteliali e ghiandolari che formano strutture luminali associate con la formazione di strutture tubulari/duttali e alveolari. Gli autori inoltre hanno dimostrato che TMEM230 ha anche un ruolo indipendente dal pathway di Notch ed è coinvolto nella regolazione dei processi coinvolti con la migrazione cellulare, l’invasione e lo sprouting di cellule epiteliali ed endoteliali e regola la morte cellulare anoikis dipendente.

Gli autori hanno anche dimostrato che la modulazione del livello di espressione di TMEM230 può essere utilizzata per promuovere lo stato di quiescenza oppure per indurre sprouting, migrazione e invasione cellulare e che, quindi, la modulazione dell’attività di TMEM230 (a livello di espressione genica, di trascrizione o proteico) può essere utilizzata non solo per inibire o indurre l’angiogenesi, ma anche per favorire o prevenire l’acquisizione del comportamento invasivo e migratorio da parte delle cellule.

I dati ottenuti dagli autori della presente invenzione hanno quindi evidenziato che in caso di patologie in cui sia desiderato un aumento dell’angiogenesi, cicli alterni di sovraregolazione transiente dell’espressione di TMEM230 seguiti da una sua riduzione producono l’effetto desiderato.

Poiché’ i dati prodotti dagli autori dimostrano che TMEM230 regola sprouting, invasione e migrazione nell’ambito di Notch/VEGF pathway ma che TMEM230 ha anche un ruolo nella regolazione dello sprouting e dell’invasione cellulare indipendentemente da Notch/VEGF e che livelli specifici di TMEM230 sono necessari e sufficienti per il controllo della quiescenza e del comportamento di sprouting, gli autori suggeriscono che il livello di espressione di TMEM230 e la direzione della sua modulazione devono essere determinati dal clinico esperto nel settore per ciascun paziente in cui si ritenga necessaria una regolazione terapeutica dell’angiogenesi .

Nella presente domanda di brevetto quando si dice “alti” o “bassi” livelli di espressione ci si riferisce ai livelli riscontrati nella controparte sana dello stesso organo, tessuto o cellula. Nel caso specifico ci riferisce ad esempio ai livelli di TMEM230 rilevati nelle cellule endoteliali dei vasi in condizioni non patologiche, o nelle cellule epiteliali di tessuti normali. La sovra-regolazione o la sotto-regolazione di tali livelli di espressione di TMEM230, rispetto ai livelli di espressione che si riscontrano nelle cellule sane, sono responsabili dell’instaurarsi di condizioni patologiche che si traducono in malattie associate a difetti nei processi angiogenici, che a loro volta sono riconducibili a bassa attività angiogenica, come ad esempio il danneggiamento dei tessuti in seguito a ischemia o l’insufficienza cardiaca e di condizioni patologiche dovute ad alta attività angiogenica come le infiammazioni croniche, l’artrite reumatoide, la malattia di Crohn, la retinopatia diabetica, macular degeneration correlata con l’età, la psoriasi, l’endometriosi e il cancro.

Nella presente descrizione, quando si dice che l’espressione di TMEM230 viene sovra o sotto regolata o anche aumentata o diminuita, s’intende che l’espressione del gene o della proteina TMEM230 viene regolata in modo positivo o negativo rispetto a quella presente nel paziente trattato in quel momento, pertanto una regolazione positiva porterà ad una aumento dell’espressione o dell’attività di TMEM230 nel tessuti trattati del paziente mentre una regolazione negativa porterà ad una diminuzione dell’espressione o dell’attività di TMEM230 nei tessuti trattati del paziente. La regolazione potrà essere realizzata a livello di acidi nucleici o a livello proteico.

Patologie in cui è richiesta la formazione di nuovi vasi sanguigni.

Per la formazione di nuovi vasi sanguigni gli autori hanno dimostrato (come dettagliato nella sezione degli esempi) che in cellule endoteliali umane derivate da paziente, cicli alternati in cui alti livelli di espressione del gene, del mRNA o della proteina TMEM230 che si succedono a cicli in cui detti livelli di espressione sono mantenuti bassi, inducono la formazione di nuovi vasi sanguigni. La sovra-regolazione dei livelli di espressione del gene, dell’mRNA o della proteina TMEM230 nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni esistenti si traduce nella loro destabilizzazione per aumento della permeabilità “locale” dovuta alla perdita dei contatti cellula-cellula. Tutto questo avviene solo in una piccola minoranza di cellule, quelle selezionate per diventare le cellule Tip. La perdita dei contatti cellula-cellula è seguita dallo sprouting delle cellule Tip. Lo sprouting delle cellule Tip è seguito dalla loro proliferazione, ma affinché la formazione del nuovo vaso vada a compimento esse devono essere riconvertite in cellule non-Tip, nonproliferanti e i contatti cellula-cellula devono essere ricreati, per prevenire la distruzione dei vasi esistenti. Pertanto i livelli di espressione di TMEM230 devono essere ristabiliti o attraverso la rimozione dell’agente utilizzato per indurre la sovra-regolazione di TMEM230, oppure con un agente che ne permetta la transiente sotto-regolazione in modo da consentire la riduzione dell’espressione del gene, dell’mRNA o della proteina TMEM230 e permettere la formazione delle cellule Stalk e la ricostituzione dei contatti intercellulari che operano la chiusura delle pareti dei nuovi vasi e la loro stabilizzazione che porterà alla definizione del nuovo lume.

Quindi, un’alternanza tra alti e bassi livelli di espressione di TMEM230 come descritta sopra e nella presente descrizione, ha l’effetto terapeutico di promozione dell’angiogenesi in quelle malattie o condizioni patologiche in cui è desiderata la formazione di nuovi vasi sanguigni e un aumento dell’angiogenesi.

Patologie in cui è richiesta la riduzione dell’angiogenesi

Nelle patologie, invece, in cui si riscontra una elevata attività angiogenica in cui è desiderata una riduzione dell’angiogenesi, la riduzione dell’espressione di TMEM230 può produrre tale effetto. Poiché’ alti livelli di TMEM230 inducono sprouting mentre la riduzione dei livelli di espressione di TMEM230 promuove lo stato di quiescenza e il mantenimento dei contati cellula-cellula, indispensabili per mantenere e stabilizzare le strutture 3D contenenti lume (vasi, tubuli, dotti, alveoli e acini) e poiché TMEM230 può avere anche un ruolo indipendente dal Nocth/VEGF pathway, gli autori suggeriscono che il livello di espressione di TMEM230 e la direzione in cui TMEM230 debba essere modulato, devono essere determinati paziente per paziente.

Angiogenesi tumorale

Nelle patologie tumorali perché un tumore si sviluppi è necessario che i vasi sanguigni formino un esteso network di nuove ramificazioni che si integrano nella massa tumorale allo scopo di portare al tumore sostanze nutritizie e ossigeno (Figura 4A). Nei tumori la modulazione di TMEM230 può essere realizzata con molteplici finalità: 1. per inibire l’angiogenesi tumorale. 2. per distruggere i vasi sanguigni che già pervadono il tumore.3. per impedire la crescita tumorale, grazie alla capacità di TMEM230 di inibire la migrazione cellulare e quindi bloccare l’accesso delle cellule tumorali al sistema circolatorio, attraverso il quale esse iniziano a circolare come circulating cancer cells per raggiungere organi e tessuti lontani dal tumore primitivo. 4. Inibire l’invasione e la metastatizzazione associata alla migrazione delle cellule tumorali.

Gli autori hanno sorprendentemente scoperto infatti che nelle fasi precoci della formazione del tumore, quando il tumore non ha ancora sviluppato una rete propria di capillari che sostengono la sua crescita ed espansione, una diminuzione transiente dell’espressione o comunque dell’attività di TMEM230 (a livello di DNA, di mRNA o proteico) ha l’effetto, sia di inibire la neo angiogenesi, poiché impedisce la generazione e ramificazione di nuovi vasi verso la massa tumorale (Figura 4B), sia di bloccare la migrazione delle cellule luminali tumorali impedendo alle stesse di invadere e raggiungere il circolo ematico. Inoltre la sotto-espressione transiente di TMEM230 ha l’effetto di rendere incapaci le cellule tumorali, (che per circolare nei liquidi corporei hanno bisogno di crescere in sospensione) di vivere in condizioni ancoraggio-indipendente, facilitandone quindi la morte cellulare per anokis. Quindi la sotto-regolazione di TMEM230 ha lo scopo di inibire la germinazione di nuovi vasi in direzione del tumore, e di contrastare la capacità delle cellule tumorali di vivere in condizioni ancoraggio indipendenti, rendendole incapaci di circolare in sospensione del torrente circolatorio, peraltro destabilizzato.

Al contrario, nelle fasi più avanzate del tumore (Figura 4B), un aumento localizzato dei livelli di espressione di TMEM230 porta alla destabilizzazione/distruzione/disgregazione dei vasi sanguigni esistenti. In questo caso si effettua una inibizione dell’angiogenesi mediante distruzione dei vasi, dovuta alla perdita della loro integrità che si ottiene aumentando l’espressione a livello di DNA o mRNA o proteico, e conseguentemente i livelli, di TMEM230.

Una sovra-espressione transiente (protratta fino all’ottenimento dell’effetto desiderato) dell’espressione o comunque dell’attività di TMEM230 nelle cellule endoteliali dei vasi che irrorano il tumore provoca la rottura dei vasi sanguigni con il conseguente arresto della crescita tumorale per distruzione delle cellule tumorali.

La sovra regolazione dei livelli di espressione o comunque di attività di TMEM230 in tumori già dotati di una efficiente rete di vasi sanguigni può avere valenze multiple quindi, e cioè 1. può portare alla distruzione i vasi sanguigni esistenti che forniscono nutrienti e ossigeno al tumore, 2. può prevenire la formazione di metastasi in quanto le cellule tumorali non potendo circolare all'interno dei vasi sanguigni che in questo modo vengono distrutti, non potranno diffondersi in altri organi e tessuti.

Pertanto, sulla base di quanto qui divulgato per la prima volta, risulta che TMEM230 è un bersaglio ideale per terapie antitumorali secondo due modalità:

1. nelle lesioni neoplastiche precoci, per evitare che i tumori diventino più grandi e che le cellule tumorali possano raggiungere organi e tessuti distanti dal sito di origine, per evitare la formazione di nuovi vasi sanguigni è necessario prevenire lo sprouting e la formazione di cellule Tip. Per fare questo è fondamentale mantenere per il tempo in cui è effettuata la terapia antitumorale bassi livelli di TMEM230 in tutte le cellule endoteliali di tutti i vasi sanguigni del tumore. Senza neo angiogenesi il tumore non può crescere e le cellule tumorali non potranno invadere nuovi tessuti (Figura 4C). Ridotti livelli di TMEM230 nelle cellule epiteliali tumorali, re-vertendo il fenotipo mesenchimale ad un fenotipo più simile a quello epiteliale, inducono la perdita delle capacità invasive, promuovendo cioè la transizione mesenchimo- epiteliale (MET). Poiché le cellule invasive sono associate ad un fenotipo più simile a quello mesenchimale, quando la cellula riacquisisce il fenotipo epitelio-simile, perde le capacità migratorie e invasive e la resistenza all’anoikis, perdendo quindi la capacità di sopravvivere in sospensione non sarà in grado di circolare nei liquidi corporei non potrà raggiungere siti lontani dal sito di origine (Figura 4C, pannello a).

2. Nei tumori in fase avanzata in cui i vasi sanguigni associati al tumore sono invece già formati è necessario che i livelli di espressione di TMEM230 siano mantenuti alti per indurre lo sprouting, ottenere la distruzione dei contatti cellula-cellula e la destabilizzazione e la rottura dei vasi sanguigni stessi. Privando gli endoteli dei contatti cellula-cellula si formeranno fenditure lungo i vasi con la conseguente perdita della loro non-funzionalità. I livelli di espressione di TMEM230 in questa condizione devono quindi essere mantenuti sovra-regolati fino a quando necessario per evitare che le cellule degli endoteli possano riconquistare i contatti cellula-cellula e quindi ricostituire il lume dei vasi.

Sebbene la sovra-regolazione di TMEM230 nelle cellule luminali dei vasi associati al tumore possa comportare nelle cellule luminali tumorali, un guadagno delle capacità invasive, queste cellule non potranno comunque sopravvivere in quanto non avranno a disposizione sostanze nutritizie in loco, ed essendo la massa tumorale priva di vasi sanguigni funzionali, esse non potranno raggiungere organi e tessuti lontani dal sito di origine in quanto non potranno accedere a vasi che si stanno disgregando (Figura 4C, pannello b).

In conclusione, nelle fasi precoci della formazione del tumore (tumore iniziale) e’ necessaria una riduzione dell’espressione di TMEM230 per bloccare la neo angiogenesi e impedire la formazione della cellule Tip e la ramificazione di nuovi vasi sanguigni, e quindi per impedire alle cellule tumorali di invadere e raggiungere il circolo ematico. Nelle fasi avanzate del tumore una sovra regolazione dei livelli di espressione di TMEM230 nelle cellule endoteliali che costituiscono i vasi associati al tumore, provoca la rottura dei vasi sanguigni con il conseguente arresto della crescita tumorale.

Sono quindi oggetto dell’invenzione, agenti che modulano/regolano l’attività della proteina TMEM230 per uso nel trattamento di patologie in cui è necessaria o consigliabile una regolazione dell’angiogenesi; una composizione farmaceutica per uso nel trattamento di patologie in cui è necessaria o consigliabile una regolazione dell’angiogenesi comprendente uno o più agenti che modulano/regolano l’attività della proteina TMEM230 e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile; un kit farmaceutico per uso sequenziale nel trattamento di patologie in cui è necessaria una regolazione dell’angiogenesi comprendente almeno un contenitore contenente un regolatore di TMEM230 che induce sovra regolazione transiente di TMEM230 e almeno un contenitore comprendente un regolatore di TMEM230 che induce una sotto regolazione transiente di TMEM230 cui detta patologia è un tumore; un trattamento terapeutico che prevede la somministrazione di dosi farmacologicamente efficaci di uno o più agenti che modulano/regolano l’attività della proteina TMEM230 contemporaneamente o in sequenza, in un soggetto affetto da una patologia in cui è necessaria o consigliabile una regolazione dell’angiogenesi.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE

Figura 1. Rappresentazione schematica del processo di angiogenesi. A. Formazione di nuovi vasi sanguigni da vasi esistenti. B. L’angiogenesi è necessaria nei processi di riparo e rigenerazione tissutale in seguito a ferite.

Figura 2. Rappresentazione del processo di sprouting attivato da fattori proangiogenici. A. Vaso formato da cellule endoteliali quiescenti. B. Durante lo sprouting le cellule endoteliali adottano il fenotipo Tip e il fenotipo Stalk. C. Migrazione e proliferazione permettono alle cellule Tip di connettersi e formare il nuovo lume. D. Il vaso neoformato va poi incontro a maturazione e stabilizzazione.

Figura 3 Schema illustrativo del pathway di Notch

Figura 4A. Esempio di angiogenesi tumorale. A. Nelle fasi iniziali del tumore le cellule tumorali crescono in assenza di un network vascolare proprio. B. Man mano che la massa tumorale si sviluppa in condizioni di ipossia, fattori pro-angiogenici vengono rilasciati dal tumore allo scopo di indurre la germinazione di nuovi vasi.

Figura 4B. Le nuove ramificazioni migrano in direzione della massa tumorale e si integrano con essa allo scopo di portare al tumore sostanze nutritizie e ossigeno e facilitarne la crescita. Il network di nuovi vasi permetterà anche alle cellule tumorali di allontanarsi dal tumore, entrare nel circolo ematico e raggiungere altri organi e tessuti dove potranno attecchire e dare origine a tumori metastatici

Figura 4C. La sovra regolazione di TMEM230 induce riduzione della massa tumorale.

a. Nelle fasi precoci del tumore la sotto-regolazione di TMEM230 contrasta lo sprouting. b. Nelle fasi avanzate del tumore la sovra-espressione di TMEM230 induce destabilizzazione dei capillari che irrorano il tumore, il che porta ad una conseguente riduzione della massa tumorale per assenza di nutrienti. In concomitanza si avrà anche un blocco della formazione di metastasi perché’ le cellule epiteliali non saranno in grado di invadere ed entrare nel torrente circolatorio che risulta compromesso. In entrambi i casi il risultato è una riduzione della massa tumorale.

Figura 5. Struttura del gene Tmem230 di Zebrafish, conservazione nelle specie e analisi di espressione per ibridazione in situ con sonda complementare a mRNA-Tmem230a. Pannello A: Rappresentazione della struttura del gene Tmem230a e del gene paralogo Tmem230b in zebrafish. Gli introni sono rappresentati da linee, gli esoni da rettangoli. Le regioni non tradotte sono rettangoli scuri, mentre le regioni codificanti sono rettangoli chiari. Pannello B: L’analisi comparativa della sequenza della proteina mostra che le proteine Tmem230 sono evolutivamente conservate. Pannello C: Analisi dell’espressione di mRNA-Tmem230 ottenuta per ibridazione in situ in embrioni di zebrafish. Le sezioni sono state ibridate con una sonda complementare alla sequenza dell’mRNA di Tmem-230a. Embrioni a 26 ore dopo la fertilizzazione (26hpf) rivelano l’espressione di Tmem230a a livello del tronco (pannello a sinistra) e della coda (pannello al centro). Embrioni a 2 giorni dopo la fertilizzazione (2dpf) rivelano l’espressione di Tmem230a a livello della coda (pannello a destra). L'analisi istologica mostra l'espressione di Tmem230a nell'aorta dorsale (DA) in cui ha luogo l’angiogenesi precoce, nella vena posteriore cardinale (PCV) nella vena caudale (CV) e nella notocorda (NC) e mostra il ruolo di Tmem230a nella vasculogenesi e nell’angiogenesi.

Figura 6. Tmem230a regola i modulatori chiave della via di signaling di Notch in Zebrafish. Quadro A: Iniezioni di morfolino oligos contro Tmem230a (MO2) producono un aumento del numero delle cellule endoteliali (pannello b) rispetto a quanto si verifica dopo iniezione di morfolino oligos di controllo (pannello a) (std-MO). L’iniezione di mRNA di Tmem230a ripristina il corretto numero di cellule endoteliali che formano i vasi intersegmentali (ISV) (pannello c). Quadro B: Iniezioni di dosi subcritiche di morfolino oligos contro Tmem230a (MO1) e contro dll4 (dll4-MO) sinergicamente riducono il numero di cellule ISV (pannello c) rispetto a quanto si osserva con iniezioni indipendenti di dosi subcritiche di morfolino MO2 controTmem230a (non mostrato) o di morfolino contro dll4 (dll4-MO) (pannello b). La co-iniezione di mRNA Tmem230a ripristina il numero corretto di cellule endoteliali (pannello d). Gli embrioni sono stati iniettati con morfolino oligos standard (std-MO) e con dosi subcritiche di MO1 (Tmem2301a) o di Dll4-MO, e di MO1 e Dll4-MO insieme. Quadro C: il fenotipo Tmem230a-MO1 (pannello b) è recuperato dalla iniezione del morfolino vegfc-MO (pannello d) e dal morfolino FLT4-MO (pannello f). Gli embrioni sono stati iniettati con: std-MO (pannello a), Tmem230a-MO1 (pannello b), vegfc-MO (pannello c), Tmem230a-MO1 e vegfc-MO insieme (pannello d), FLT4-MO (pannello e) e Tmem230-MO1 e FLT4-MO insieme (pannello f). Le immagini al microscopio confocale mostrano il numero di cellule endoteliali nei ISV a 29 hpf in embrioni ottenuti dalla linea tg (fli1: nEGFP) y7. Il numero (n) indica gli embrioni iniettati ed è riportato nell'istogramma. Quadro D: schema riassuntivo.

Figura 6bis. Summary del ruolo di Tmem230a in Zebrafish

Figura 7. Analisi dell’espressione della proteina umana TMEM230. A. Espressione della proteina TMEM230 in cellule HUVEC (human embryonic umbilical vein, linea 1) in tumore di rene ottenuto da paziente (linea 2) e in una linea cellulare tumorale derivata da cervice uterina (HeLa, linea 3). B. Analisi immunoistochimica della proteina TMEM230 in cellule HUVEC coltivate in adesione.

Figura 8. Costrutti lentivirali inducibili progettati e realizzati per ottenere un efficiente aumento dei livelli di TMEM230. L’aumento del livello di espressione della proteina TMEM230 è stato valutato con analisi di Western, utilizzando cellule HEK (cellule embrionali renali umane) in cui il costrutto era stato trasdotto. L’actina è stata utilizzata come proteina controllo di caricamento del gel.

Figura 9. Costrutti lentivirali inducibili progettati e realizzati per ottenere una efficiente riduzione dei livelli di TMEM230.

Figura 9 bis. Costrutti generati in laboratorio per la sotto-regolazione stabile di Tmem230, utilizzando sequenze siRNA e dimostrazione per RTPCR della avvenuta sotto-regolazione del mRNA di TMEME230 (a destra).

Costrutti per l’ espressione stabile della proteina TMEM230 come proteina fusa con la proteina eGFP (a sinistra) e analisi di Western per verifica dell’espressione della proteina in cellule HeLa

Figura 10. Modulazione della proteina TMEM230 e valutazione del suo ruolo nel modulare sprouting e migrazione indotta da VEGF in cellule HUVEC. Immagini rappresentative di sferoidi generati da cellule HUVEC trasdotte con costrutti lentivirali che esprimono il transgene che esprime solo (eGFP eGreen Fluorescent Protein) usato come controllo (pannelli A e C) o con il trangene TMEM230 co-espresso con il transgene che esprime la eGFP (pannelli B e D); con il trangene che esprime si-RNA-controllo (sh-GFP, pannelli E e G) e siRNA-TMEM230 (pannelli F e H) A. Sferoide generato da cellule HUVEC in presenza di VEGF. B. La sovra-regolazione di TMEM230 in cellule HUVEC in presenza di fattori pro-angiogenici (VEGF) induce un aumento di sprouting e migrazione rispetto al controllo A in cui TMEM230 non è stato sovra-regolato (suggerendo che TMEM230 e VEGF sono sinergici). C. Sferoide generato da cellule HUVEC in assenza di VEGF. D. La sovra-regolazione di TMEM230 in assenza di VEGF, aumenta lo sprouting e la migrazione rispetto alla condizione in cui TMEM230 non è stato sovra-regolato (C), mostrando che TMEM230 è sufficiente da solo a promuovere uno sprouting nelle cellule endoteliali umane, analogo a quello indotto dallo stimolo pro-angiogenico. E. Sferoide generato da HUVEC in presenza di VEGF. F. La sotto-regolazione di TMEM230 indotta da lentivirus esprimenti siRNA che abbattono TMEM230, in presenza di VEGF reduce significativamente lo sprouting associato all’angiogenesi, mostrando che TMEM230 è sufficiente a reprimere e modulare lo sprouting ed è necessario per lo sprouting angiogenico VEGF-dipendente. G. Sferoide generato da cellule HUVEC in assenza di VEGF H. La sotto-regolazione di TMEM230 in assenza di fattori pro angiogenici (VEGF) reduce il livello basale di sprouting rispetto al controllo, mostrando che la riduzione dei livelli di TMEM230 può reprimere migrazione e invasione cellulare.

Figura 11. Analisi quantitativa dello sprouting per gli esperimenti mostrati in Figura 10 ottenuta mediante microscopic differential bright field density image analysis. La sovraregolazione di TMEM230 ha un effetto positivo sullo sprouting in condizioni basali (Colonna 4) e un effetto sinergico con VEGF sullo sprouting (colonna 2). La sottoregolazione di TMEM230 riduce significativamente lo sprouting sia in condizioni basali (colonna 8) sia in presenza i VEGF (colonna 6).

Figura 12. L’angiogenesi indotta da VEGF è associata alla regolazione inversa di TMEM230 e di VE Caderina nelle cellule HUVEC. PCR quantitativa è stata utilizzata per valutare l’espressione di TMEM230 e di E Caderina in cellule trattate e non-trattate con VEGF, dimostrando che VEGF induce la sotto regolazione di VE-Caderina e la sovraregolazione di TMEM230.

Figura 13. Espressione di VE Caderina in HUVEC con TMEM230 stabilmente sovraregolato o sotto-regolato

Figura 14. La sotto-regolazione dei livelli di espressione di TMEM230 riduce la proliferazione di cellule HUVEC coltivate in condizioni di aderenza che promuovono la crescita. Una diminuzione del numero di cellule si osserva dopo riduzione dei livelli di espressione di TMEM230 nelle colture di cellule HUVEC mostrando che TMEM230 oltre che a modulare lo sprouting e la migrazione potrebbe avere un ruolo nella proliferazione.

Figura 15. Effetto della modulazione di TMEM230 sulla formazione di acini generati da MCF7v. La sovra-espressione costitutiva del transgene TMEM230 o la riduzione della proteina TMEM230 nativa nelle cellule mammarie tumorali MCF7 induce una riduzione della formazione di acini. La formazione di cisti è un modello per studiare la formazione di strutture 3D e organoidi.

Figura 16. Analisi quantitative del numero di acini formati da MCF7v nel saggio illustrato in Figura 15. Analisi quantitative del numero di acini formati da MCF7v in cui I livelli di espressione di TMEM230 sono stati modulati secondo il saggio descritto in Figura 15.

Figura 17. La sotto-regolazione di TMEM230 comporta una riduzione nel numero di cellule MCF7v cresciute in sospensione. Le cellule ottenute dalla dissociazione degli acini generati in Figura 15 sono state contate. La riduzione dei livelli di TMEM230 comporta la generazione di meno acini e più piccoli.

Figura 18. La riduzione dei livelli di espressione dell’mRNA di TMEM230 in MCF7v si traduce in una riduzione della capacità delle cellule di formare colonie in soft agar.

Colonie generate da MCF7v in cui TMEM230 è stato sottoregolato (sh-RNA TMEM230) o sovra-regolato (TMEM230mRNA) rispetto ai controlli.

Figura 19. Analisi quantitativa del numero di colonie in soft agar generate da MCF7v

Figura 20. Espressione di TMEM230 e E-caderina in MCF7v indotte con TGF-beta

Figura 21. Elevata espressione del TMEM230 è stata riscontrata in tessuti tumorali umani rispetto alla controparte sana.

La valutazione dei livelli di espressione di TMEM230 è stata effettuata in tessuti di rene e mammari umani normali e tumorali mediante PCR quantitativa. Poiche’ i vasi sanguigni normali funzionali contengono cellule con bassi livelli di TMEM230 e poiche’ la sovraespressione transiente di TMEM230 nelle cellule endoteliali promuove l’angiogenesi e la germinazione delle cellule endoteliali, l’elevata espressione di TMEM230 riscontrata nei tumori umani mammari e di rene umani potrebbe suggerire che i tessuti tumorali contengono più vasi sanguigni funzionali rispetto al tessuto normale.

Figura 22. Espressione di TMEM230 in campioni ematici tumorali

Figura 23. L’espressione di TMEM230 è più alta in campioni ematici derivati da pazienti con tumori metastatici rispetto a pazienti affetti da tumori senza metastasi

Sono state utilizzate cellule endoteliali umane derivate da paziente e colture di cellule epiteliali umane organotipiche come modelli in vitro per modulare i livelli di TMEM230 al fine di comprenderne la funzione. Quando TMEM230 è sovra-regolato promuove lo sprouting, la migrazione e l’invasione delle cellule, funzioni necessarie per la formazione di strutture 3D contenenti lume (vasi, tubuli, dotti, acini e alveoli) strutture essenziali per la funzione di organi e tessuti, e per la loro ramificazione (branching morphogenesis). La modulazione controllata di TMEM230 può avere un ruolo terapeutico nella cura delle malattie in cui sia necessaria una modulazione terapeutica dell’angiogenesi, nella cura del tumore e nella prevenzione delle metastasi, e nella medicina rigenerativa. Quando TMEM230 è sotto-regolato blocca la transizione EMT, favorendo l’acquisizione di un fenotipo (endo/epithelial–like) endotelio-/epitelio-simile, proprietà desiderabile per il mantenimento di strutture vascolari funzionali, al fine di reprimere la disseminazione delle cellule tumorali a organi distanti dal sito di origine del tumore e inibire l’invasione e la migrazione delle cellule tumorali e la neo-angiogenesi indotta da tumore.

La ricerca degli inventori sostiene che la modulazione di TMEM230 è necessaria e sufficiente per promuovere o inibire l’angiogenesi in vitro ed in vivo.

Le culture ex situ di cellule endoteliali e epiteliali dimostrano che TMEM230 in dipendenza dei suoi livelli di espressione è in grado di indurre o reprimere lo sprouting endoteliale e la formazione di strutture luminali, tubulari, duttali e alveolari, la ridondanza dei fattori associati al pathway di Notch/VEGF e al meccanismo di transizione epiteliomesenchimale sono ben caratterizzati mediante

Studi ex situ ed in vivo utilizzando tessuti primari linee cellulari umane e il sistema modello di Zebrafish dimostrano che la modulazione di TMEM230 è necessaria e sufficiente per attivare o reprimere lo sprouting.

GLOSSARIO

TMEM230. Ai fini della presente invenzione per TMEM230 s’intende il gene umano o una qualsiasi delle isoforme proteiche espresse da tale gene come indicate nel dettaglio sotto.

La proteina TMEM230 è codificata dal gene TMEM230 che ha ID 15876 sulla banca dati HGNC e ID: 29058 sulla banca dati NCBI.

A differenza di Zebrafish dove la proteina tmem230 viene codificata da 2 geni paraloghi: tmem 230a che mappa sul cromosoma 10 e tmem230b che mappa sul cromosoma 8, distinguibili tra loro per sequenza, nell’uomo e nel topo un solo gene codifica per la proteina TMEM230. Nell’uomo il gene mappa nel cromosoma 20 e da’ luogo a 9 varianti generate da splicing alternativi che generano 9 trascritti di lunghezze predette diverse, comprese tra 1468 e 1754 nt. Le 9 varianti di splicing predette sono formate da 5 esoni che vengono assemblati diversamente, per la precisione, 8 varianti generano tutte una stessa proteina di 120 aminoacidi, codificata dai 3 esoni centrali (3-4-5), questi 8 mRNA invece hanno lunghezze diverse in quanto includono in combinazioni diverse gli esoni 1 e 2. Le diverse lunghezze dei messaggeri sono inoltre dovute alla presenza di porzioni diverse del 5’ UTR, mentre il 3’URT è uguale per tutti i 9 trascritti. Una sola variante di splicing genera una proteina di 183 aa, Numero d’accesso: NP_001009923.1 GI: 58331120183 aa proteina codificata da tutti i 5 esoni. La proteina di 120 aa che corrisponde al 95% delle isoforme TMEM230 ed è altamente conservata. Ai fini della presente invenzione per modulazione/regolazione dell’attività della proteina TMEM230, s’intende la modulazione/regolazione a livello di DNA, di RNA o di proteina per tutte le isoforme espresse dal gene TMEM230 sotto riportato.

Sono quindi riportati i numeri di riferimento per il gene e per tutte le varianti di trascrizione attualmente note che rientrano nella definizione, secondo la presente invenzione di “TMEM230”. Per tutte le sequenze si fa riferimento, ai fini della presente descrizione, a quelle disponibili nelle banche dati con i numeri di riferimento forniti, come disponibili al pubblico alla data di deposito della presente invenzione.

Gene TMEM230:

HGNC Nome intero ufficiale della proteina transmembrana HGNC: HGNC:15876 Ensembl: ENSG00000089063; HPRD:12762; Vega:OTTHUMG00000031796 anche noto come HSPC274; C20orf30; dJ1116H23.2.1

Trascritti previsti per TMEM230:

Homo sapiens proteina transmembrana 230 (TMEM230) Numero d’accesso: XM_011529229.1 GI: 768013713;

variante di trascrizione X5, mRNA 1591 bp Numero d’accesso: XM_011529228.1 GI: 768013708; variante di trascrizione X4, mRNA 1754 bp Numero d’accesso: XM_006723561.2 GI: 768013705; variante di trascrizione X3, mRNA 1371 bp Numero d’accesso: XM_011529227.1 GI: 768013703; variante di trascrizione X2, mRNA 1688 bp Numero d’accesso: XM_005260713.2 GI: 768013700; variante di trascrizione X1, mRNA 1646 bp Numero d’accesso: NM_001009925.1 GI: 58331123; variante di trascrizione 4, mRNA 1468 bp Numero d’accesso: NM_001009924.1 GI: 58331121; variante di trascrizione 2, mRNA 1792 bp Numero d’accesso: NM_001009923.1 GI: 58331119; variante di trascrizione 1, mRNA 1574 bp Numero d’accesso: NM_014145.4 GI: 58331118; variante di trascrizione 3, mRNA 1699 bp.

PROTEINA PREVISTA TMEM230 : proteina transmembrana 230 isoforma X1 [Homo sapiens]

Numero d’accesso: XP_011527531.1 GI: 768013714120 aa proteina

Numero d’accesso: XP_011527530.1 GI: 768013709120 aa proteina

Numero d’accesso: XP_011527529.1 GI: 768013704120 aa proteina

Numero d’accesso: XP_006723624.1 GI: 578835403120 aa proteina

Numero d’accesso: XP_005260770.1 GI: 530425717120 aa proteina

Numero d’accesso: NP_001009925.1 GI: 58331124120 aa proteina

Numero d’accesso: NP_001009924.1 GI: 58331122120 aa proteina

Numero d’accesso: NP_001009923.1 GI: 58331120183 aa proteina

Isoforma 2 prevista per la proteina transmembrana 230 [Homo sapiens] Numero d’accesso: NP_054864.3 GI: 42476068 120 aa proteina. Per “modulare/regolare TMEM230” s’intende modulare e/o regolare l’attività della transmembrane protein 230 (TMEM230) a livello di espressione del gene codificante per la transmembrane protein 230, oppure a livello del RNA o del mRNA del gene TMEM230 o anche a livello della proteina transmembrane protein 230 in cui questa modulazione può essere sia in positivo (aumentando quindi l’attività di TMEM230 nei tessuti o nelle cellule in cui è esercitata) sia in negativo (diminuendo perciò l’attività di TMEM230 nei tessuti o nelle cellule in cui è esercitata):

Agente che modula/regola l’attività di TMEM230 ai fini della presente invenzione significa una qualsiasi molecola o composto in grado di esercitare una modulazione di sovra o sotto regolazione dell’attività della proteina transmembrana 230 in cui questa sovra o sotto regolazione finale può essere ottenuta mediante regolazione a livello di DNA (espressione), di RNA mRNA (trascrizione) o direttamente a livello proteico. Ai fini della presente invenzione agente che modula/regola l’attività di TMEM230 è un agente che reprime o aumenta l’espressione del gene codificante per TMEM230, un agente che agisce a livello di RNA o mRNA di TMEM230, come ad esempio un miRNA, un siRNA, un shRNA un iRNA o simili, o un agente che agisce a livello della proteina TMEM230 influenzandone l’attività, ad esempio inibendola (anticorpo o frammento di anticorpo che lega TMEM230 in modo specifico, e cioè lega solo TMEM230 e non lega altre proteine o addirittura lega una sua isoforma in modo specifico senza legare le altre), o aumentandola, ad esempio con mRNA che specificatamente genera la proteina TMEM230 o con un peptide mimetico. Sprouting: processo angiogenetico dovuto a condizioni di ipossia alla quale molte cellule parenchimali rispondono secernendo VEGF-A.

Tip cells: cellule endoteliali, che emettono fillopodi i quali si allungano verso la zona ipossica digerendo la matrice extracellulare (ECM); le Tip cells (cellule appuntite) trascinano le altre cellule endoteliali le quali entrano in attiva proliferazione.

Fillopodi: Filamenti emessi dalle cellule endoteliali provvisti di recettori per il VEGF-A che si modellano in dipendenza del gradiente VEGF-A, dirigendosi dove e più concentrato, aprendosi un varco attraverso la matrice. Trascinano le altre cellule endoteliali.

Stalk cells. Le cellule non Tip che formano il vaso.

LISTA DI SEQUENZE DI INIBITORI DI TMEM230

SEQ ID 1: SASI_HS02_00305720 GAAACUAUAGCUGAGGACU[dT][dT]

SEQ ID 2: SASI_HS02_00305720 As AGUCCUCAGCUAUAGUUUC[dT][dT]

SEQ ID 3: SASI_Hs02_00305721GGUCCUUCCCAAAGAUGUU[dT][dT]

SEQ ID 4: SASI_Hs02_00305721 As AACAUCUUUGGGAAGGACC[dT][dT]

SEQ ID 5: SASI_Hs01_00039897 GAUGUUAAGUGAACCUACA[dT][dT]

SEQ ID 6: SASI_Hs01_00039897 As UGUAGGUUCACUUAACAUC[dT][dT])

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Come detto nel sommario sopra, gli autori della presente invenzione hanno caratterizzato per la prima volta la funzione del gene TMEM230 nei mammiferi e in modelli animali anche di pesci (zebrafish). La caratterizzazione dell’attività di questo gene ha permesso di identificare un nuovo bersaglio terapeutico per la cura di patologie che richiedono una regolazione dell’angiogenesi, in positivo (induzione dell’angiogenesi) o in negativo (inibizione dell’angiogenesi).

La presente invenzione fornisce quindi, per la prima volta, agenti che modulano/regolano l’attività della proteina transmembrana 230 per uso nel trattamento di patologie in cui è necessaria una regolazione dell’angiogenesi. - qui divulgato per la prima volta il concetto di utilizzare agenti che modulano/regolano l’attività della proteina transmembrana 230 nel trattamento di patologie che richiedono una regolazione in positivo o in negativo dell’angiogenesi a fini terapeutici e cioè quelle malattie in cui una induzione o una inibizione dell’angiogenesi ha un effetto terapeutico sul decorso della malattia. Per effetto terapeutico s’intende che la modulazione/regolazione dell’attività di TMEM230 induce una risposta biologica o medica in un sistema tissutale, animale o umano, che è desiderata da un ricercatore, veterinario, medico generico o altro medico clinico, che include l’alleviamento dei sintomi della malattia o del disturbo da trattare.

In una forma di realizzazione dell’invenzione tali agenti modulano/regolano l’attività della proteina transmembrana 230 umana, mentre in altre forme di realizzazione, tali agenti possono esercitare la loro modulazione/regolazione sull’espressione di omologhi o paraloghi di detta proteina in altri mammiferi.

Il temine “agente che modula/regola l’attività della proteina transmembrana 230” come sopra indicato, ai fini della presente invenzione significa una qualsiasi molecola o composto in grado di esercitare una modulazione sull’espressione, la trascrizione, la traduzione del gene TMEM230, del suo RNA, del suo mRNA o a livello proteico che risulta in una sovra o sotto regolazione dell’attività della proteina transmembrana 230 (TMEM230) come sopra definita mediante le sequenze sopra indicate.

In altre parole, secondo l’invenzione l’agente che modula/regola l’attività di TMEM230 può essere un qualsiasi agente farmacologicamente accettabile che è in grado di modulare l’attività di TMEM230 agendo a livello di DNA, di RNA, di mRNA o proteico.

Ai fini della presente invenzione un agente che modula/regola l’attività di TMEM230 può essere scelto tra: un agente che reprime o aumenta l’espressione del gene codificante per TMEM230, un agente (regolatore) che agisce a livello di RNA o mRNA di TMEM230 o un agente (regolatore) che agisce a livello della proteina TMEM230.

In una forma di realizzazione dell’invenzione, il l’agente che modula/regola l’attività di TMEM230 è un agente che regola l’espressione, la trascrizione, la traduzione del gene TMEM230. Esempi non limitativi di agenti che reprimono o aumentano l’espressione del gene TMEM230 possono essere un agente che attiva il promotore del gene, un agente che inibisce il promotore del gene e simili.

Alternativamente, l’agente che modula/regola l’attività della proteina transmembrana 230 (TMEM230) secondo l’invenzione può essere un inibitore di RNA o di mRNA scelto tra oligonucleotidi miRNA, shRNA e siRNA, opzionalmente modificati chimicamente aventi una sequenza complementare ad almeno parte della sequenza di mRNA codificante per la proteina di membrana TMEM230.

Sono presenti numerosi miRNA in letteratura che possono inibire TMEM230 ad esempio a livello di mRNA, esempi non limitativi tra questi comprendono il miR134 ID Entrez 406924, il miR-181 ID Entrez 406955, il miR-200 ID Entrez 406983 e il miR-203 ID Entrez 406986.

In una forma non limitativa dell’invenzione, possibili oligonucleotidi per ridurre l’espressione di TMEM230 e quindi esercitare una modulazione che abbassa i livelli di tale proteina, possono essere usati una o più coppie di oligonucleotidi aventi, rispettivamente, SEQ ID 1-2, 3-4, 5-6 come riportato nella lista di sequenze.

In ogni caso si possono utilizzare, a tal fine, oligo a doppio filamento di RNA disegnati nella sequenza del mRNA di TMEM230 umano per abbattere il messaggero TMEM230. Secondo tecniche standard oligo vengono poi “annilati” seguendo il protocollo in uso nel laboratorio, secondo il quale (ad esempio incubando ogni singolo filamento ad una concentrazione di circa 20 mM, in tampone idoneo, come ad esempio un tampone contenente 100 mM potassio acetato 30 mM HEPES-KOH a pH 7.4 e 2 mM di acetato di magnesio, per il tempo necessario a temperature elevate, come ad esempio 1 min a 90 ° C tenendo successivamente gli oligo per ca.1 ora a ca.37 ° C).

Essendo nota la sequenza mRNA del gene TMEM230, disponibile anche nelle sue possibili varianti, nelle banche dati pubbliche (numeri d’accesso riportati sopra e sotto) l’esperto del settore potrà facilmente disegnare oligonucleotidi antisenso shRNA o siRNA o reperire miRNA in banche dati, mediante tecniche standard utilizzando programmi disponibili al pubblico (Targetscan, Pictar, Miranda, DIANA) o acquistando questi nucleotidi presso aziende specializzate in questo settore.

L’esperto del settore potrà disegnare, partendo da quanto comunemente noto nello stato della tecnica, diversi oligonucleotidi idonei alla realizzazione dell’invenzione.

Le modifiche comunemente utilizzate nello stato della tecnica comprendono, ad esempio, modifiche allo zucchero del nucleotide, modifiche alla base nucleica, modifiche al legame internucleotidico.

Come noto nello stato della tecnica, gli oligonucleotidi per inibizione di RNA, e quindi anche i siRNA e gli shRNA, possono essere modificati chimicamente in vari modi, che sono noti al tecnico del settore e che possono anche essere disegnati e realizzati come prodotti commerciali da fornitori specializzati (come ad esempio le aziende Ribotask, Riboxx Life Sciences, Dharmacon GE Healthcare, Exiqon, miRIDIAN Hairpin inhibitor design; Dharmacon Products, Thermo Fisher Scientific). Esempi di modifiche chimiche applicabili agli oligonucleotidi inibitori di RNA, non limitativi della presente invenzione, includono una o più delle seguenti modifiche: coniugazione al 3’ dell’oligonucleotide a colesterolo; uso nella costruzione dell’oligonucleotide di Locked nucleic acid (LNA) e cioè un analogo biciclico del RNA in cui il ribosio è bloccato in una conformazione C3’-endo mediante introduzione di un ponte 2’-O, 4’-C metilene; uso di nucleotidi modificati sulla posizione 2’ della molecola di ribosio come 2’-fluoro (2’-F), 2’-O-metossietile (2’-O-MOE), 2’-O-metile (2’-O-Me); uso di nucleotidi modificati mediante sostituzione del ribosio con un anello morfolino a 6 elementi; uso di nucleotidi con legame fosfotioato (PS linkage) modificati mediante sostituzione di uno degli atomi di ossigeno nel gruppo fosfato (non facenti parte del legame) con un atomo di zolfo come rappresentato negli schemi sotto.

Come noto al tecnico medio del settore, le modifiche chimiche sopra elencate possono anche essere combinate nello stesso oligonucleotide, si possono ad esempio realizzare inibitori che presentano più modifiche, come ad esempio, oligonucleotidi coniugati a colesterolo in 3’, i cui nucleotidi sono nucleotidi 2’-O-MOE, oppure oligonucleotidi che contengono nucleotidi 2’-O-MOE e nucleotidi 2’F, oppure oligonucleotidi che contengono nucleotidi LNA e desossiribonucleotidi (DNA), o anche brevi oligonucleotidi (ad esempio costituiti dalla sequenza complementare alla sequenza seed) costituiti da nucleotidi LNA, in cui le combinazioni sopra elencate possono avere legami PO o anche legami PS e altre combinazioni. In una forma di realizzazione della presente invenzione possono essere quindi utilizzati agenti che modulano/regolano l’attività della proteina TMEM230 che agiscono sull’espressione della proteina TMEM230 a livello di RNA o mRNA, costituiti da oligonucleotidi aventi una sequenza complementare al mRNA codificante la transmembrane protein 230 come riportato nelle banche date disponibili, ad esempio numero d’accesso: XM_011529229.1 GI: 768013713; numero d’accesso: XM_011529228.1 GI: 768013708; numero d’accesso: XM_006723561.2 GI: 768013705; numero d’accesso: XM_011529227.1 GI: 768013703; numero d’accesso: XM_005260713.2 GI: 768013700; numero d’accesso: NM_001009925.1 GI: 58331123; numero d’accesso: NM_001009924.1 GI: 58331121 numero d’accesso: NM_001009923.1 GI: 58331119 numero d’accesso: NM_014145.4 GI: 58331118), dove NM e XM sono i numeri d’accesso NCBI, e GI è un acronimo per GENE ID o ad una sua parte, in cui detti oligonucleotidi possono essere chimicamente modificati con una o più delle modifiche chimiche esemplificate sopra.

In altri termini, l’agente che modula/regola l’attività della proteina TMEM230 agendo sull’espressione di TMEM230 inibendo il suo RNA o mRNA della presente invenzione è preferibilmente rappresentato da un oligonucleotide come definito sopra, comprendente una o più modifiche chimiche scelte nel gruppo rappresentato da uno o più legami internucleosidici modificati, una o molecole di ribosio modificate o sostituite, una o più basi modificate, legame ad una molecola carrier, come ad esempio coniugazione con una molecola di colesterolo.

In una forma di realizzazione detti legami internucleosidici possono essere legami fosfotioato (PS) come definiti sopra, dette molecole di ribosio modificate possono essere molecole in cui il ribosio è bloccato in una conformazione C3’-endo mediante introduzione di un ponte 2’-O, 4’-C metilene; uso di nucleotidi modificati sulla posizione 2’ della molecola di ribosio come 2’-fluoro (2’-F), 2’-O-metossietile (2’-O-MOE), 2’-O-metile (2’-O-Me); dette molecole di ribosio sostituite possono essere sostituite da un anello morfolino a 6 elementi.

Le modifiche indicate sopra sono alcune tra le più comuni modifiche note al tecnico del settore nel campo degli RNA interferenti (quindi per uso come inibitori), è evidente che altre modifiche comunemente utilizzate sono da considerarsi incluse nelle forme di realizzazione della presente invenzione.

Come detto sopra tali modifiche hanno lo scopo di aumentare l’affinità dell’agente dell’invenzione con l’RNA bersaglio, di aumentarne la biodisponibilità in vivo, di aumentarne la resistenza alla degradazione, di aumentarne la stabilità in forma duplex, quindi quando legate al RNA bersaglio e simili.

L’esperto del settore, sulla base delle informazioni qui fornite e di protocolli standard, potrà realizzare facilmente oligonucleotidi inibitori specifici per l’RNA o il mRNA codificante la proteina TMEM230 (che quindi ibridano solamente con detto RNA o mRNA) come sopra definiti. Sono inoltre disponibili metodi e programmi che permettono di valutare la specificità degli stessi; tra questi, sono ad esempio disponibili programmi comunemente utilizzati dal tecnico del settore per valutare il possibile crosslinking e quindi la specificità del antimiR, come BLAST, Vmatch, and RNAhybrid. Il programma CrossLink, ad esempio, può essere utilizzato per valutare le potenziali interazioni tra gli oligonucleotidi per l’inibizione del mRNA e la loro sequenza bersaglio.

In una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, l’agente che modula/regola l’espressione di TMEM230 può essere un agente che modula l’attività della proteina transmembrana 230 e può essere scelto tra un anticorpo o un frammento di anticorpo che lega in modo selettivo la proteina TMEM230, o un peptide bioattivo, e cioè modula l’attività di TMEM230, che può essere ad esempio un mimetico dell’attività della proteina TMEM230 oppure agire da dominante negativo, inibendone la funzione.

Per quanto riguarda gli anticorpi, sono disponibili in commercio numerosi anticorpi idonei ad esempio, ma non solo, presso Life Span BioSciences, Atlas Antibodies, Origene, Santa Cruz Biotechnology, Aviva Systems Biology, AbcaM, Novus Biologicals, Abnova Corporation, United States Biological, GeneTex.

Secondo la presente invenzione, le patologie in cui è necessaria una regolazione dell’angiogenesi sono patologie in cui una regolazione positiva o negativa dell’angiogenesi esercita un effetto terapeutico che riduce, allevia o elimina i sintomi della malattia o del disturbo da trattare.

Tali patologie possono essere patologie in cui un aumento o una diminuzione dell’angiogenesi risulta in un effetto terapeutico, ad esempio ma senza limitazione a queste, ischemie indotte da disturbi vascolari e nelle malattie come diabete, insufficienza arteriosa, malattie delle arterie periferiche, ictus, degenerazione vascolare indotta da invecchiamento, degenerazione maculare; nelle infiammazioni croniche tra cui artrite reumatoide, malattia di Crohn, psoriasi, endometriosi, nelle arteriopatie degli arti inferiori, trombosi venosa profonda, vasculopatie di Reynaud, arteriopatie croniche obliteranti, ulcere vascolari, retinopatia diabetica e tutte le complicanze vascolari del diabete incluse le arteriopatie del piede diabetico, le trombosi delle arterie retiniche, i traumi vascolari acuti, l’ischemia del miocardio il danno ischemico al miocardio, le ischemie cuore infartuato, le patologie occlusive delle arterie cerebrali e l’infarto ischemico cerebrale, demenza di tipo arteriosclerotico legata al sistema vascolare, tumori solidi in stato avanzato, tumori solidi in fase precoce, e altre patologie note al tecnico del settore che traggono beneficio da una induzione dell’angiogenesi.

Secondo l’invenzione, tali patologie, possono essere trattate realizzando una sovra-regolazione transiente dell’attività della proteina TMEM230 che può essere ottenuta mediante agenti che modulano/regolano in modo positivo (stimolano) l’espressione della stessa a livello di DNA, RNA, mRNA o che agiscono direttamente a livello proteico come qui descritti, seguita da una regolazione negativa dell’attività della proteina che, a seconda dei casi, può essere ottenuta o mediante la sospensione del trattamento che induce lo stimolo, oppure mediante la somministrazione di agenti che modulano in modo negativo (reprimono) l’espressione di TMEM230 a livello di DNA, RNA, mRNA o la sua attività a livello proteico come qui descritti.

Modulazione positiva dell’angiogenesi.

Nei casi di danno al tessuto vascolare, quando sia richiesta una modulazione positiva dell’angiogenesi, l’induzione di angiogenesi può essere ottenuta utilizzando combinazioni di agenti modulatori/regolatori somministrati in sequenza, il primo che aumenta livelli di espressione di TMEM230 per indurre sprouting e proliferazione delle cellule endoteliali e il secondo che li riduce per favorire la ricostituzione delle pareti dei vasi e completare il processo di angiogenesi. Per la modulazione positiva secondo l’invenzione si possono utilizzare agenti che agiscono positivamente sull’espressione della proteina o trasfezioni ripetute di mRNA di TMEM230.

L’RNA può essere prodotto per via sintetica da compagnie specializzate, oppure preparato in laboratorio mediante la generazione di costrutti ad hoc per l’espressione del cDNA di interesse. Tali vettori sono dotati delle sequenze specifiche dei promotori T7 o SP6 che consentono la trascrizione in vitro della sequenza del cDNA in essi clonata. Il messaggero d’interesse deve essere sintetizzato con alta efficienza e la purificazione del messaggero prodotto viene facilmente eseguita seguendo protocolli di routine.

In una forma di realizzazione, quindi, gli agenti secondo l’invenzione possono essere utilizzati per indurre l’angiogenesi. In questo caso, secondo l’invenzione, si utilizza in una prima fase un agente che modula/regola in modo positivo l’attività di TMEM230, regolando, positivamente l’espressione della proteina TMEM230 (a livello di DNA, RNA, mRNA o proteico) a cui segue una seconda fase in cui si utilizza un agente che modula/regola in modo negativo l’attività di TMEM230 (a livello di DNA, RNA, mRNA o proteico). Gli agenti secondo l’invenzione utilizzati come descritto inducono l’angiogenesi e hanno un effetto terapeutico in patologie scelte tra malattie croniche che inducono danni al tessuto vascolare come ad esempio nel caso delle patologie sopra citate, ovvero nelle arteriopatie degli arti inferiori, trombosi venosa profonda, vasculopatie di Reynaud, arteriopatie croniche obliteranti, ulcere vascolari, retinopatia diabetica e tutte le complicanze vascolari del diabete incluse le arteriopatie del piede diabetico, le trombosi delle arterie retiniche, i traumi vascolari acuti, l’ischemia del miocardio il danno ischemico al miocardio, e le ischemie cuore infartuato, le patologie occlusive delle arterie cerebrali e l’infarto ischemico cerebrale, vasculopatie cerebrali, demenza di tipo arteriosclerotico legata al sistema vascolare.

Modulazione negativa dell’angiogenesi.

Secondo la presente invenzione, in quelle patologie in cui un aumento dell’angiogenesi esacerba i sintomi della malattia e ne accelera il decorso, come ad esempio nelle infiammazioni croniche tra cui l’artrite reumatoide, la malattia di Crohn, la retinopatia diabetica, la psoriasi, l’endometriosi o i tumori solidi in fase precoce e in tutte quelle patologie in cui è terapeutica la modulazione negativa dell’angiogenesi è utile un agente che modula/regola negativamente (quindi diminuendola) l’attività di TMEM230. A seconda della gravità della patologia e dell’entità dell’inibizione, l’inibizione dell’angiogenesi può anche essere realizzata mediante agenti che promuovono la sovraregolazione dei livelli di espressione di TMEM230.

In una forma di realizzazione gli agenti secondo l’invenzione sono utilizzati per inibire l’angiogenesi e distruggere vasi sanguigni. In questa forma di realizzazione, detto agente che modula/regola l’attività di TMEM230 a livello di DNA, RNA, mRNA o proteico, è un agente come qui descritto che modula detta attività in modo positivo, promuovendo la distruzione dei vasi e l’inibizione dell’angiogenesi.

Inibizione dell’angiogenesi tumorale.

Secondo una ulteriore forma di realizzazione, tra le patologie in cui è necessaria una regolazione negativa dell’angiogenesi sono inclusi i tumori solidi. Gli autori della presente invenzione hanno riscontrato che per quanto riguarda i tumori solidi in fase precoce, è sufficiente una riduzione dei livelli di espressione di TMEM230 (e quindi una regolazione negativa) che risulta, come sopra descritto, in una inibizione dello sprouting (Figura 4). Infatti nelle fasi precoci della formazione del tumore (tumore iniziale) è necessaria una diminuzione transiente dell’espressione di TMEM230 per bloccare la neoangiogenesi, (impedendo la formazione delle cellule Tip e la ramificazione di nuovi vasi sanguigni) e per inibire la migrazione delle cellule tumorali, impedendo alle stesse di invadere e raggiungere il circolo ematico (Figura 4C, pannello a).

Il regolatore/modulatore, che diminuisce l’attività di TMEM230 in questo caso può quindi essere utilizzato nelle terapie anticancro come agente anti-angiogenico antimetastatico. In tutte le forme di realizzazione dell’invenzione, il termine cellule tumorali circolanti include le cellule staminali tumorali.

Nelle fasi avanzate del tumore è chiaramente terapeutica una regolazione negativa dell’angiogenesi volta alla distruzione del sistema di vasi che li nutre. Gli autori suggeriscono la sovra-espressione di TMEM230 che induce destabilizzazione dei capillari che irrorano il tumore, il che porta ad una conseguente riduzione della massa tumorale per assenza di nutrienti. In concomitanza si avrà anche un blocco della formazione di metastasi perché le cellule epiteliali non saranno in grado di entrare nel network circolatorio che ne risulta compromesso.

I tumori contro i quali la regolazione di TMEM230 può avere effetto terapeutico, in stadio precoce mediante diminuzione dell’espressione, o in stadio avanzato mediante aumento della sua espressione, includono tumori invasivi originati da cellule trasformate di origine mesenchimale: osso, cartilagine, muscoli, vasi; tumori invasivi originati da cellule trasformate di origine epiteliale/ectodermica: cancro al seno, al colon, al rene, alla prostata, al fegato, alla tiroide, all’ovaio, al cervello e al polmone.

In tutte le forme di realizzazione sopra indicate, sono preferite modalità di regolazione a carattere transiente.

L’invenzione riguarda anche una composizione farmaceutica per uso nel trattamento di patologie in cui è necessaria una regolazione dell’angiogenesi comprendente uno o più agenti che modulano/regolano l’attività di TMEM230 (a livello di DNA, RNA, mRNA o proteico come sopra descritto) come definito in una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra descritte e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile.

Il tecnico del settore saprà definire i tempi di trattamento, i dosaggi e gli eccipienti necessari a seconda del modo di somministrazione scelto e della patologia da trattare.

Sono disponibili in letteratura manuali di preparazione di composizioni farmaceutiche che il tecnico del settore potrà consultare con facilità per la scelta degli eccipienti necessari alla preparazione di composizioni farmaceutiche comprendenti, come principio attivo, uno o più modulatori secondo l’invenzione.

E’ anche oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica o un kit farmaceutico per uso sequenziale nel trattamento di patologie in cui è necessaria una regolazione dell’angiogenesi comprendente almeno un contenitore contenente almeno un dosaggio terapeutico di un agente che modula/regola l’attività di TMEM230 in modo positivo (a livello di DNA, RNA, mRNA o proteico come sopra descritto) risultando quindi in un aumento dell’attività della proteina transmembrane protein 230 e almeno un contenitore contenente almeno un dosaggio terapeutico di un agente che modula/regola l’attività di TMEM230 in modo negativo (a livello di DNA, RNA, mRNA o proteico come sopra descritto) risultando quindi in una diminuzione dell’attività della proteina transmembrane protein 230 in cui detta patologia è un tumore in cui i gli agenti sono come sopra definiti.

È infine oggetto dell’invenzione un metodo terapeutico per la cura di patologie in cui è necessaria una regolazione dell’angiogenesi, come definite sopra, comprendente il passaggio di somministrare ad un soggetto umano che ne abbia bisogno, un agente che modula/regola l’attività TMEM230 (a livello di DNA, RNA, mRNA o proteico come sopra descritto) come sopra descritto.

Quanto sopra descritto relativamente agli agenti secondo l’invenzione, alle modalità di modulazione e alle patologie si applica al metodo terapeutico oggetto dell’invenzione.

Poiché gli autori dell’invenzione hanno dimostrato che TMEM230 è, oltre che un target terapeutico, anche un marcatore di metastasi rilevabile nel sangue o nel plasma, è anche oggetto dell’invenzione un metodo per la diagnosi di metastasi in pazienti affetti da cancro comprendente il passaggio di

quantificare l’espressione di TMEM230 in un campione di sangue o di siero di un paziente affetto da cancro

confrontare l’espressione di TMEM230 in detto campione rispetto a quella rilevata in un campione di controllo rappresentante i valori di espressione di TMEM230 in sangue o siero di un individuo sano

in cui, quando l’espressione di TMEM230 nel campione del paziente analizzato è pari ad almeno 2 volte, preferibilmente 4 volte, preferibilmente 6 volte l’espressione di TMEM230 nel campione di controllo, corrisponde alla presenza di metastasi e/o di cellule cancerose circolanti o cellule metastatiche in detto paziente.

Il metodo qui evidenziato può essere ovviamente inserito in un metodo terapeutico in cui la diagnosi della presenza di cellule cancerose circolanti o cellule metastatiche può consentire un trattamento personalizzato per il paziente, in cui il medico potrà scegliere la terapia più opportuna in base al tipo di cancro, all’età, al sesso, al peso e allo stato complessivo di salute del paziente. La terapia potrà comprendere trattamenti mediante regolazione dell’espressione di TMEM230, opzionalmente in combinazione con trattamenti con antitumorali convenzionali.

L’invenzione riguarda quindi anche un kit per la diagnosi di cellule tumorali circolanti o cellule metastatiche in pazienti affetti da cancro comprendente uno o più reagenti per la quantificazione di TMEM230 in campioni di siero o di sangue, uno o più campioni di controllo rappresentanti i valori di espressione di TMEM230 in sangue o siero di un individuo sano.

Il campione di controllo potrà essere rappresentato da siero di individui sani o da soluzioni in cui TMEM230 (in forma di acido nucleico o di proteina o di loro parte) potrà essere calibrato in modo da avere una concentrazione pari a quella rilevabile in un pool di campioni sani.

I reagenti per la rivelazione di TMEM230 potranno essere uno qualsiasi dei reagenti descritti nella presente descrizione a seconda che la rilevazione sia a livello di acidi nucleici o proteico.

I seguenti esempi hanno lo scopo di illustrare le basi scientifiche dell’invenzione.

ESEMPI SPERIMENTALI

Zebrafish come modello per scoprire la funzione di TMEM230

Sebbene in un recentissimo lavoro sia riportato che il gene TMEM230 e’ stato trovato mutato in pazienti affetti da Prakinson, la funzione del gene TMEM230 non era mai stata mai descritta prima, quindi, in primo luogo gli inventori hanno studiato la funzione del gene durante lo sviluppo embrionale, utilizzando Zebrafish (Danio rerio) come modello in vivo e tessuti umani e linee cellulari derivate da pazienti o linee continue come modelli in vitro.

Il modello di Zebrafish è un sistema ideale, perché, rispetto al modello di topo, possiede una combinazione unica di caratteristiche che lo rendono particolarmente adatto ad essere utilizzato come modello per studi genetici e funzionali che riguardano lo sviluppo dei vertebrati, negli ultimi anni inoltre sono state messe a punto e perfezionate numerose metodologie che permettono di sfruttarne tutti i vantaggi. Zebrafish, da un singolo uovo fecondato va incontro rapidamente allo sviluppo dello stadio adulto, quindi geni che regolano lo sviluppo iniziale di organi e tessuti possono essere studiati in Zebrafish in una frazione temporale di giorni, pertanto la modulazione transitoria dell'espressione di un gene d’interesse può facilmente essere mediata da siRNA oligos anziché da tecnologie transgeniche che essendo basate sulla integrazione genomica di un DNA esogeno potrebbero comportare la dis-regolazione di altri geni e risultare nocive. Inoltre, la formazione di organi e tessuti e dei difetti ad essi impartiti dalla sottoregolazione di uno specifico gene può essere facilmente, costantemente e direttamente visualizzata grazie al fatto che zebrafish è trasparente nelle prime fasi di sviluppo. A 24 ore dopo la fertilizzazione (hpf nel testo per hours post fertilization) gli embrioni mostrano quasi tutti i tessuti ed i precursori di molti organi già formati, ognuno dei quali può essere facilmente osservato mediante l’utilizzo di un semplice microscopio a trasmissione (Weinstein 2002). La microiniezione di oligonucleotidi antisenso, chiamati morpholino (MOs), si è rivelata utile per indagare in vivo la funzione di un gene mediante l’inibizione specifica della sua traduzione o modificando gli eventi di splicing cui va incontro il premRNA (Ekker 2000; Nasevicius and Ekker 2000; Kole and Sazani 2001). L’utilizzo di Zebrafish permette inoltre di condurre saggi di perdita di funzione di 2 geni simultaneamente, iniettando 2 MOs diversi e di re-vertere il fenotipo ottenuto iniettando uno dei due MO in combinazione con l’mRNA dell’altro gene. La trasparenza e l’accessibilità degli embrioni di Zebrafish permettono l’applicazione efficiente di metodi sperimentali anche per l’analisi in vivo dello sviluppo vascolare (Weinstein, Stemple et al.

1995). Grazie alle ridotte dimensioni gli embrioni di Zebrafish ricevono sufficiente ossigeno per sopravvivere tramite diffusione passiva dal medium esterno continuando a svilupparsi in modo normale per diversi giorni, persino in completa assenza di circolazione sanguigna, permettendo l’analisi fenotipica anche in quei casi in cui i difetti circolatori si sono rilevati letali in altri organismi (Stainier 2001). Queste caratteristiche hanno permesso di eseguire screening di mutanti su larga scala al fine di isolare mutazioni embrionali che colpiscono il sistema cardiovascolare e/o nervoso generando modelli di diverse malattie umane (Driever, Solnica-Krezel et al.1996; Haffter, Granato et al.1996).

Per determinare la funzione di TMEM230 gli inventori hanno pertanto condotto gli studi iniziali utilizzando il modello di Zebrafish e il gene zgc:101123 (genbank BC080236) ortologo di Zebrafish del gene Tmem230 espresso nei mammiferi. Il gene zgc:101123 codifica per una proteina il cui allineamento con le proteine TMEM230 umana e di topo ha mostrato rispettivamente il 76% di identità e l’88% di similarità. L’analisi nella banca dati genomica ensemble ha evidenziato che nel genoma di zebrafish sono presenti 2 geni tmem230, tmem230a (zgc:101123) sul cromosoma 10, e tmem230b (zgc:162251) sul cromosoma 8 (Figura 6, panello A).

I due geni codificano per proteine altamente correlate tra loro che mostrano infatti alte percentuali di identità e similarità (83% e 93% rispettivamente, pannello B). Utilizzando la PCR qualitativa, è stata valutata l’espressione temporale di entrambi i geni durante le fasi di sviluppo embrionale e larvale precoce di zebrafish e in organi e tessuti adulti ed è stato dimostrato che i trascritti sono espressi in tutti gli stadi di sviluppo analizzati, dalle prime fasi di segmentazione fino a 120 hpf. È stata inoltre rilevata l’espressione sia di Tmem230a che Tmem230b in tutti gli organi adulti analizzati (cervello, occhi, branchie, apparato digerente, cuore, fegato e muscolo). L’analisi dell’espressione mediante ibridazione in situ whole-mount ha mostrato che dallo stadio di tarda somitogenesi a 26 hpf, Tmem230a è maggiormente espresso nel sistema vascolare in via di sviluppo (pannello C) rispetto a Tmem230b, pertanto lo studio per la caratterizzazione della funzione del gene è stato condotto esclusivamente per Tmem230a e il ruolo identificato è l’oggetto del presente brevetto.

Per analizzare il ruolo di Tmem230a durante lo sviluppo di zebrafish, gli inventori hanno effettuato saggi di perdita di funzione iniettando separatamente 2 diversi morpholino-oligos. Il morfolino, Tmem230a-MO (MO1) disegnato per bloccare la traduzione di Tmem230a e uno splicing-blocking morpholino (MO2), disegnato a cavallo della giunzione esone2/introne2 che porta alla produzione di un messaggero aberrante, privo dell’esone 2. Poiché l’iniezione dello splicing-blocking morfolino-oligo MO2, produce risultati qualitativamente simili a quelli ottenuti a seguito dell’iniezione del morfolino MO1, lo studio è stato effettuato utilizzando MO1, e con il termine “morfanti” si sono indicati gli embrioni di zebrafish iniettati con tale oligo alla dose 0.3 pmol/embrione. A tale dose MO1 non causa sostanzialmente difetti a carico della morfologia e della circolazione negli embrioni iniettati.

Per confermare il ruolo di Tmem230a a livello del sistema vascolare è stato analizzato il pattern di espressione di marcatori vascolari nei morfanti e negli embrioni di controllo allo stadio di 29 hpf. A questo stadio di sviluppo la vasculogenesi è terminata, la circolazione sanguigna e lo sprouting angiogenico dei vasi intersomitici arteriosi (ISA) sono avviati e i vasi intersomitici arteriosi sono costituiti da 3 o 4 cellule endoteliali con distinti destini posizionali (Isogai Lawson et al. 2003). Una cellula Tip a forma di T che è posizionata più dorsalmente e contribuisce alla formazione della Dorsal Longitudinal anastomotic Vessel (DLAV) una cellula di connessione che si trova a livello della metà del somite e una cellula basale che si connette alla aorta dorsale. Allo stadio di 29hpf è stata analizzata l’espressione di ephrin-B2 e del suo recettore ephB4, specificamente espressi rispettivamente a livello dell’endotelio arterioso e venoso, e l’espressione di 3 marcatori specifici delle cellule Tip: flk1, recettore 2 di vegf, flt4 recettore 3 di vegf e dll4 ligando delta-like 4 di Notch (Fouquet, Weinstein et al.1997) (Wang 1998; Adams, Wilkinson et al.

1999; Gerety, Wang et al.1999) (Shutter, Scully et al.2000; Siekmann and Lawson 2007). (Thompson, Ransom et al.1998).

L’espressione di tali marcatori nelle cellule Tip nei morfanti Tmem230a è risultata più elevata rispetto agli embrioni di controllo (83% n=57; 79% n=52; 53% n=44 rispettivamente). Questi risultati hanno mostrato che Tmem230a ha un ruolo chiave nella determinazione del destino artero-venoso e nel governare il comportamento delle cellule durante l’angiogenesi.

Conclusione 1.

Gli studi iniziali in Zebrafish hanno dimostrato che 1) il gene e la proteina TMEM230 sono conservati nei vertebrati, 2) che in Zebrafish l’espressione di Tmem230 è necessaria per mantenere la normale funzione dei vasi sanguigni e 3) che la funzione della proteina Tmem230 è quella di regolare lo sprouting, cioè la germinazione delle cellule endoteliali (Figure 6).

Per quantificare il numero delle cellule ISA gli inventori hanno quindi utilizzato embrioni di Zebrafish ottenuti da una linea transgenica in cui la Green Fluorescent Protein (EGFP) sotto il controllo del promotore del gene vascolare fli1 (tg(fli1:nEGFP)<y7>(Roman, Pham et al. 2002) presenta una localizzazione nucleare, permettendo la visualizzazione delle cellule che costituiscono i vasi intersomitici arteriosi che al microscopio a fluorescenza appaiono verdi. Il numero delle cellule endoteliali costituenti i primi 10 ISA nei morfanti Tmem230a allo stadio di 29 hpf ha rilevato un aumento statisticamente significativo nel numero delle cellule costituenti gli ISA rispetto ai controlli (Figura 6, quadro A pannello b), similmente a quanto osservato da Siekmann e Lawson in seguito alla perdita di funzione di dll4 dopo iniezione del morfolino contro dll4 (dll4-MO) (Siekmann and Lawson 2007). Per valutare se esistesse sinergia tra Tmem230 e dll4 nell’indurre l’aumento del numero delle cellule costituenti gli ISA, morfolini contro Tmem230a e contro dll4 furono iniettati a basse dosi. Mentre iniezioni indipendenti dei 2 morfolino a basse dosi non hanno causato alterazioni del numero di cellule che formano gli ISA negli embrioni iniettati (non mostrato in figura 3), co-iniezioni degli stessi a basse dosi ha avuto come conseguenza un aumento significativo del numero di cellule che formano gli ISA, come riscontrato nei doppi morfanti rispetto ai controlli e ai morfanti singoli (Figura 6, quadro B, pannello c). Inoltre l’iniezione di mRNATmem230a in embrioni iniettati con dll4-MO ha ristabilito il normale numero di cellule endoteliali a livello degli ISA, (quadro B pannello d) suggerendo che l’mRNATmem230 è in grado di re-vertere il fenotipo causato dalla downregolazione di dll4 ottenuta mediante iniezione di dll4-MO (pannello b). In esperimenti successivi gli inventori hanno inoltre bloccato il Notch signaling utilizzando l’inibitore della γ secretase, DAPT (Geling, Steiner et al.2002) e hanno dimostrato che gli embrioni trattati con DAPT presentano un aumento del numero di cellule degli ISA rispetto agli embrioni controllo. Gli embrioni iniettati con mRNA-Tmem230a e successivamente trattati con DAPT hanno mostrato un numero di cellule costituenti gli ISA paragonabile al numero delle cellule contate negli embrioni di controllo (esperimento non mostrato), indicando che mRNA-Tmem230a è anche in grado di re-vertere il fenotipo causato dal DAPT.

Durante l’angiogenesi diversi segnali guidano una cellula endoteliale e la indirizzano al comportamento Tip o Stalk. Le cellule Tip esprimono i recettori Vegfa (Vegfr-2) e Vegfc (Vegfr-3/Flt4). Vegfa induce nelle cellule Tip l’espressione di dll4, ligando di Notch, e l’attivazione di Notch inibisce nelle cellule Stalk il comportamento Tip, in parte, inibendo l’espressione di flt4 (Gerhardt, Golding et al. 2003; Covassin 2006; Siekmann and Lawson 2007; Tammela, Zarkada et al. 2008). E’ stato dimostrato che embrioni di zebrafish come quelli di topo in cui viene inibito dll4 mostrano un eccessivo branching dei vasi e eccessiva proliferazione endoteliale che possono essere normalizzati riducendo il Vegfr-3/flt4 signaling (Siekmann and Lawson 2007; Tammela, Zarkada et al.

2008; Hogan 2009) Hellstrom 2007; Siekmann and Lawson 2007). Basandosi su questi risultati gli inventori hanno co-iniettato Tmem230a-MO separatamente e insieme sia con vegfc-MO, sia con flt4-MO. Gli embrioni iniettati solo con il morfolino vegfc-MO (Figura 6, quadro C pannello c) o con solo con il morfolino flt4-MO (quadro C, pannello e) mostrano un ridotto numero di cellule delle ISA rispetto ai controlli (pannello a) e agli embrioni iniettati con Tmem230a-MO (MO1) dove il numero delle endoteliali delle ISA (pannello b). Diversamente, la co-iniezione di Tmem230a-MO (MO1) con il morfolino contro vegfc (pannello d) e contro il morfolino contro flt4 (pannello f) causa in entrambe le condizioni il recupero del fenotipo. Anche quest’ultimo risultato ricapitola i risultati ottenuti a seguito della co-iniezione del morfolino dll4-MO e del morfolino vegfc/flt4, descritti da Hogan e colleghi (2009) e da Siekmann e Lawson su embrioni Rbpsuh-deficient (Siekmann and Lawson 2007).

Conclusione 2.

I saggi di perdita di funzione indicano fortemente che in Zbrafish, in assenza di Tmem230a le cellule endoteliali esibiscono un comportamento da cellula Tip, che ha come conseguenza un aumento del numero delle cellule endoteliali che costituiscono i vasi intersomitici arteriosi. Tali risultati sono simili a quelli ottenuti in embrioni iniettati con il morfolino dll4-MO, infatti in assenza del dll4/notch signaling tutte le cellule endoteliali diventano di tipo Tip. Similmente, quando il Notch signaling è bloccato mediante l’inibitore della γ-secretasi DAPT, gli embrioni presentano un aumentato numero di cellule nelle ISA. In entrambi i casi l’iniezione di dell’mRNATmem230a porta al recupero del fenotipo normale. Inoltre l’iniezione del morfolino Tmem230a-MO re-verte il fenotipo ottenuto in seguito all’iniezione del morfolino vegfc-MO e del morfolino flt4-MO, riproducendo i risultati ottenuti dagli esperimenti di iniezione di dll4-MO.

Poiché la perdita o la sotto-regolazione del mRNATmem230 induce nelle cellule il comportamento Tip e favorisce la formazione di nuovi vasi sanguigni, ricapitolando lo scenario precedentemente osservato in embrioni in cui era stato inibito il dll4/Notch signaling, gli inventori suggeriscono che in Zebrafish Tmem230 è coinvolto nella specificazione dell’identità delle cellule costituenti i vasi intersomitici e che agisce da master regulator dei fattori che controllano il Notch signaling durante la germinazione delle cellule endoteliali.

Studi con sistemi modello basati su cellule umane

Dal momento che il gene TMEM230 è evolutivamente conservato e il Notch pathway regola molti tipi di cellule, gli inventori hanno ipotizzato che, in quanto regolatore della via del signaling di Notch, TMEM230 dovrebbe essere associato ad altri tipi di cellule e hanno preso in considerazione diversi tipi cellulari e specie diverse, compreso l’uomo. Per identificare il ruolo di TMEM230 nelle cellule umane, i livelli dell’RNA e della proteina TMEM230 sono stati innanzitutto determinati in cellule endoteliali e in cellule epiteliali normali e tumorali isolate da pazienti e in linee cellulari. In accordo con i risultati ottenuti in Zebrafish, l’espressione della proteina TMEM230 è stata identificata nelle cellule HUVEC, (cellule endoteliali della vena ombelicale embrionale umana) utilizzate in vitro come modello per identificare fattori regolatori della formazione dei vasi nei processi di neo di angiogenesi nell’uomo (Figura 7). Colture di HUVEC in 3D ricapitolano gli steps iniziali associati al processo di neo-angiogenesi e sono state utilizzate come modello per studiare branching e morfogenesi dei vasi endoteliali. Per valutare il ruolo di TMEM230 nelle cellule HUVEC costrutti lentivirali condizionali sono stati generati e utilizzati per aumentare o ridurre I livelli di espressione di TMEM230. La repressione di TMEM230 è stata ottenuta attraverso costrutti in cui sequenze antisenso (SIRNA) che abbattono l’mRNA di TMEM230, mentre la sovra-regolazione di TMEME230 è stata ottenuta clonando mRNA di TMEM230 negli stessi vettori (Figure 8 e 9).

Modulazione di TMEM230 in cellule endoteliali umane

Gli esperimenti su Zebrafish hanno dimostrato che con la sotto-regolazione di Tmem230 ottenuta dalla applicazione del morfolino, vi è un aumento del numero di cellule nella regione inter-segmentale della aorta dorsale. L’aumento del numero di cellule poteva essere interpretato come un aumento della proliferazione vero e proprio, inteso come una cellula generata da una cellula madre, oppure poteva essere il risultato di cambiamento della morfologia di una cellula in un'altra, cioè un cambiamento di una cellula che non ha caratteristiche migratorie in una cellula capace di migrare. Gli inventori hanno quindi messo a punto saggi simili utilizzando cellule endoteliali umane derivate da cordone ombelicale (HUVEC) e hanno dimostrato che in colture tridimensionali (3D) la sovra regolazione di TMEM230 induce le cellule ad acquisire capacità migratorie (Figura 10). Pertanto, gli inventori hanno ipotizzato che alti livelli di TMEM230 demoliscono i contatti cellula-cellula e favoriscono l’acquisizione di un comportamento invasivo e migratorio, mentre la perdita di TMEM230, ottenuta per riduzione dei livelli del messaggero TMEM230, induce il mantenimento del fenotipo epiteliale e dei contatti cellula-cellula.

Gli inventori hanno inoltre osservato che la sotto-regolazione di TMEM230 nelle cellule HUVEC coltivate in 3D sembra essere in grado di indurre morte cellulare precoce, il che suggerisce che la riduzione dei livelli di TMEM230 potrebbe indurre la morte cellulare mediata da anoikis. Pertanto, la perdita o la sotto-regolazione di TMEM230 può fornire un approccio terapeutico per colpire le cellule tumorali circolanti che mostrano alta sopravvivenza e quindi elevata resistenza all’anoikis, in condizioni inospitali, come in condizioni di ipossia, nel sangue o nei vasi linfatici.

Gli inventori hanno quindi progettato e costruito vettori lentivirali per sovraesprimere la proteina umana TMEM230 o per sotto-regolarla, e hanno dimostrato che in accordo con i risultati ottenuti utilizzando il sistema modello di Zebrafish, la modulazione dell’espressione di TMEM230 è necessaria e sufficiente per attivare o reprimere lo sprouting indotto da VEGF nelle cellule HUVEC.

Colture 3D in vitro in cui sprouting e migrazione sono state indotte da VEGF in presenza di livelli basali di TMEM230 o in presenza di TMEM230 sovra-regolato o sottoregolato hanno mostrato che TMEM230, quando sotto-regolato riduce lo sprouting e la migrazione indotta da VEGF (Figura 10F), mentre quando sovra-regolato ha un effetto additivo con VEGF nella regolazione dello sprouting (Figura 10B) rispetto ai controlli.

La sotto-regolazione di TMEM230 produce inibizione dello sprouting indotto da VEGF supportando l’idea che TMEM230 possa essere utilizzato come target per il disegno di farmaci per terapie di tipo pro/anti-angiogenico e nella terapia antitumorale per la sua capacità di inibire la neo-angiogenesi. L’inibizione della formazione di nuovi vasi è la chiave essenziale per impedire il flusso di ossigeno e nutrienti al tumore e quindi per procurarne l’arresto della crescita. In oltre inibire la formazione dei vasi e impedire che i vasi raggiungano e pervadano la massa tumorale significa che le cellule tumorali invasive non avranno accesso al circolo sistemico, non potranno quindi raggiungere siti lontani dal sito di origine e dar luogo alla formazione di tumori secondari (Figura 4C).

In conclusione lo studio di modulazione di TMEM230 nelle HUVEC ha dimostrato che TMEM230 quando sovra-regolato promuove la migrazione e lo sprouting delle cellule endoteliali cooperando con VEGF in modo sinergico, mentre in assenza di VEGF la sovraregolazione di TMEM230 induce sprouting e migrazione in modo VEGF-indipendente (Figura 10D).

Dal momento che la sovra-regolazione di TMEM230 è sufficiente nel promuovere e ricapitolare lo sprouting angiogenico in medium basale, indipendentemente dall’induzione con VEGF (Figura 10D) gli autori hanno valutato se l’espressione di TMEM230 fosse sovra-regolata in cellule endoteliali dopo induzione con VEGF. Analisi di espressione quantitativa (RT-PCR) ha mostrato che l’induzione di soprouting angiogenico e la migrazione dipendente da VEGF sono associati con la sovra-regolazione di TMEM230 (Figura 12) e che TMEM230 è parte integrante nel network regolatorio dell’angiogenesi.

Questi dati supportano che TMEM230 è sufficiente per indurre il primo step associato all’angiogenesi e potrebbe essere cruciale quando VEGF o altri fattori proangiogenici sono assenti o non funzionali a causa di mutazioni o a causa di modificazioni di tipo epigenomico.

In conclusione TMEM230 è un target per il disegno di farmaci e la sua modulazione potrebbe essere utile nel controllo dell’angiogenesi e nella medicina rigenerativa.

La diminuzione del numero di cellule proliferanti osservata con la repressione dell’espressione di TMEM230 nelle cellule HUVEC stimolate con VEGF, suggerisce che TMEM230 oltre a promuovere lo sprouting e la migrazione, in dipendenza del suo livello di espressione, potrebbe avere anche un ruolo nel controllo della proliferazione cellulare.

Poiché l’induzione di nuovi vasi sanguigni è fondamentale per il mantenimento della massa tumorale e per promuovere la crescita del tumore, ed è stato dimostrato che nei tumori si verifica un aumento della densità dei vasi sanguigni funzionali che hanno il ruolo di supportare con sostanze nutritive e ossigeno la crescente massa tumorale (Figura 4A), l’inibizione dell'angiogenesi si è recentemente rivelata una delle strategie terapeutiche più promettenti per attuare il blocco della progressione tumorale e impedire la formazione delle metastasi. Gli inventori hanno quindi valutato l’espressione di TMEM230 nei tumori mammari umani e nella controparte sana e hanno riscontrato livelli più elevati di mRNA di TMEM230 nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali (Figura 21).

Modulazione di TMEM230 in cellule epiteliali mammarie

Dal momento che il gene TMEM230 può sia inibire che promuovere l'angiogenesi e la formazione dei vasi sanguigni, gli inventori propongono TMEM230 anche come potenziale gene target per terapie antitumorali e anti-metastasi e suggeriscono che per inibire la formazione di nuovi vasi sanguigni nei tumori precoci TMEM230 debba essere mantenuto a bassi livelli nelle cellule endoteliali (Figura 4C, pannello a). Al contrario, per dis-assemblare i vasi sanguigni esistenti ed interrompere i contatti cellule-cellula in una massa tumorale in fase avanzata, TMEM230 dovrebbe essere transitoriamente sovraregolato (pannello b) e cicli alterni di sovra-regolazione e sotto-regolazione potrebbero aumentare l’efficacia del trattamento.

Visto che una marcata sovra-espressione di TMEM230 è stata riscontrata in tumori umani mammari e di rene e in linee cellulari umane normali e tumorali (Figura 21) per studiare il ruolo di TMEM230 nel regolare pathways associati all’invasione e all’ EMT è stato utilizzato un sottoclone derivato in laboratorio delle MCF7 (linea cellulare isolata da tumore mammario invasivo). Le cellule del clone MCF7v, quando coltivate in condizioni di sospensione in 3D generano acini, (organoidi che ricapitolano le strutture che si formano durante il differenziamento terminale delle cellule epiteliali mammarie al momento della gravidanza) e vanno incontro a cambiamenti morfologici simili alla transizione EMT dopo trattamento con TGFbeta.

Per determinare se la modulazione di TMEM230 promuove o reprime la formazione di strutture organoidi TMEM230 è stato sovra-espresso e sotto-espresso rispetto ai controlli in cui TMEM230 era espresso a livello basale. Sia la sovra-regolazione che la sotto-regolazione di TMEM230 in MCF7v coltivate in condizioni di sospensione liquida in 3D ha portato alla formazione di un numero inferiore di acini rispetto al controllo (Figura 15).

La diminuzione nel numero di acini osservata con la sovra-espressione di TMEM230 poteva essere attribuita alla diminuzione dell’espressione della E-Caderina (CDH1) che promuove la perdita delle giunzioni cellula-cellula, analogamente a quanto osservato con la sovra-espressione di TMEM230 nelle HUVEC (Figura 12). Inoltre, dal momento che il TGFbeta promuove la transizione EMT, con conseguente perdita delle giunzioni intracellulari e concomitante sotto-regolazione di E-caderina, un’analisi di espressione di mRNA è stata condotta in MCF7v dopo trattamento con TGFbeta. È stato osservato che il trattamento con TGFbeta induce la sovra-regolazione di TMEM230 (Figura 20) e che il trattamento con TGFbeta o la sovra-espressione di TMEM230, indotta per trasduzione del costrutto lentivirale esprimente TMEM230, provocano la sottoregolazione della E-Caderina (Figura 13). Poiché’ la formazione di acini richiede una perfetta morfologia di tipo epiteliale con polarità apicale e baso-laterale ben definite e strettamente regolate, la riduzione della formazione di acini potrebbe essere dovuta alla sotto-ragolazione della E-Caderina e alla conseguente incapacità delle cellule di mantenere solidi i contatti cellula-cellula.

Per validare l’ipotesi secondo la quale la diminuzione dei livelli di TMEM230 induce la perdita di resistenza alla anoikis, osservata negli esperimenti con le cellule endoteliali, TMEM230 è stato sotto-regolato nelle MCF7v, coltivate in sospensione. La sottoregolazione di TMEM230 mostra un significativo aumento della morte cellulare, confermando l’ipotesi iniziale. Gli inventori hanno inoltre dimostrato che anche in MCF7v coltivate in condizioni di aderenza la down regolazione di TMEM230 induce una diminuzione del numero di cellule che può essere associata ad una inibizione della proliferazione e/o della vitalità delle cellule.

Poiché’ il trattamento con TGFbeta delle MCF7v provoca una sovra-regolazione di TMEM230, questo suggerisce che TMEM230 è un componente del pathway TGFbeta e che TMEM230 è essenziale per indurre la transizione EMT-like, necessaria per la migrazione e l’invasione delle cellule luminali.

Il comportamento invasivo è stato testato utilizzando cellule luminali derivate da ghiandola mammaria umana che hanno la capacità di formare colonie in soft agar. La sovra-espressione del transegne TMEM230 ha portato all’acquisizione da parte delle cellule del comportamento di sprouting (Figura18) come osservato nelle cellule HUVEC (Figura 10B).

In contrasto, la sotto-regolazione di TMEM230 nelle cellule epiteliali mammarie che formano organoidi ha indotto la repressione dello sprouting, ancora come già osservato nelle HUVEC (Figura 10H). L’inibizione del comportamento EMT nelle cellule tumorali è essenziale per reprimere la formazione di metastasi nei pazienti affetti da tumore. Poiché’ alti livelli di TMEM230 nelle HUVEC e nelle cellule epiteliali tumorali derivate da paziente inducono le cellule ad acquisire comportamento invasivo e migratorio, ridurre tali livelli, o impedire che alti livelli di espressione vengano raggiunti, potrebbe inibire la capacità di formare metastasi, innanzitutto impedendo la formazione di nuovi vasi e in secondo luogo impedendo che le cellule epiteliali tumorali acquisiscano comportamento invasivo, necessario per raggiungere il sistema circolatorio (Figura 4B).

La riduzione delle capacità di formare acini in seguito alla sotto-regolazione di TMEM230 nelle MCF7v potrebbe essere dovuta anche ad una inibizione della proliferazione o alla maggior suscettibilità’ delle cellule alla morte cellulare anoikis dipendente. In accordo è stato evidenziato che il numero di cellule negli acini che si formano negli esperimenti in sospensione era minore nelle condizioni in cui TMEM230 era stato sotto-regolato rispetto ai controlli (Figura 19). Le MCF7 in cui TMEM230 era stato sotto-regolato, se coltivate in condizioni che promuovono la formazione di colonie in soft agar, formano meno colonie e più piccole, in accordo con l’osservazione che la sottoregolazione di TMEM230 promuove una diminuzione della proliferazione e aumenta la suscettibilità alla morte cellulare anoikis-dipendente.

La diminuzione del numero di colonie in soft agar e la diminuzione del numero di acini in sospensione suggerisce che la repressione dell’espressione di TMEM230 potrebbe inibire la disseminazione delle cellule in altri loci e quindi inibire la formazione di tumore metastatico in siti lontani dal sito di origine.

Per determinare se pazienti con tumori mammari abbiano alti livelli di TMEM230 nel sangue, una PCR quantitativa è stata eseguita su una serie di campioni ematici ottenuti da pazienti con neoplasie mammarie e renali. TMEM230 è risultato significativamente più elevato (10 volte) nei campioni tumorali rispetto a controlli sani.

Conclusione 3.

In conclusione, poiché’ TMEM230 e’ stato trovato sovra-regolato in tumori mammari e tumori di rene rispetto alla controparte sana dello stesso paziente e sovraregolato in cellule tumorali circolanti isolate con i marcatori di superficie (EPCAM) da sangue di pazienti cui erano state diagnosticate metastasi, gli autori suggeriscono che alti livelli di espressione TMEM230 in campioni tumorali potrebbero indicare che il livello di espressione di TMEM230 potrebbe essere correlato con una alta densità di vasi sanguigni nel tumore, o con un numero maggiore di cellule epitelili tumorali nel tumore rispetto al controllo sano. Inoltre altri livelli di TMEM230 nel tumore potrebbero suggerire che TMEM230 potrebbe indurre proprietà tumorali specifiche come la capacità di migrazione e di soprouting o di invasione.

Pazienti disagnosticati con tumori mammari metastatici hanno evidenziato elevati livelli di TMEM230 nella massa tumorale e nel sangue rispetto a pazienti in cui non erano state diagnosticate metastasi (Figura 23). Alti levelli ematici di TMEM230 suggeriscono che TMEM230 potrebbe essere associato a cellule tumorali circolanti e/o a cellule endoteliali con alti livelli di espressione di TMEM230 o a frammenti di cellule derivati da cellule epiteliali e/o endoteliali con alto TMEM230. Cellule circolanti sono state isolate per FACS da sangue di pazienti con neoplasia utilizzando il marcatore EPCAM. Le cellule endoteliali circolanti o frammenti di cellule sono facilmente derivati da sprouting e/o da cellule del sistema vascolare associate al tumore, danneggiate o distrutte.

Collettivamente, questi risultati dimostrano che la sotto-regolazione di TMEM230 può rappresentare un approccio terapeutico per colpire le cellule staminali tumorali o cellule tumorali circolanti e indirizzarle alla distruzione, contrastando la loro resistenza all’anoikis e che TMEM230 può essere usato come marcatore tumorale per la detection, la prognosi e la diagnosi e che potrebbe essere un marcatore a valore diagnostico e pronostico per la stadiazione del tumore e la valutazione del rischio di formazione di metastasi.

La sovra-regolazione di TMEM230 può essere richiesta in una specifica area localizzata del tumore, in modo che una sovra-regolazione della proteina possa essere mirata e non generalizzata per evitare che la sovra-espressione di TMEM230 in cellule tumorali non provochi l’acquisizione da parte loro di uno stato invasivo. Per esempio, i vasi sanguigni ad una certa distanza dalla massa tumorale possono essere targhettati per la sovra-regolazione di TMEM230 e quindi la loro specifica distruzione, mentre i vasi sanguigni all'interno della massa tumorale non saranno il target per la sovra-regolazione di TMEM230 Sarebbe sufficiente interrompere e distruggere la capacità circolatoria al di fuori della massa tumorale.

Inoltre, esistono tecnologie di delivery che permettono specificamente di targhettare vasi sanguigni specifici cui indirizzare la sovra-regolazione di TMEM230 evitando altre cellule epiteliali normali o tumorali. Per esempio, un anticorpo vettore che si lega specificamente a proteine di membrana delle cellule endoteliali può portare un agente che induce specificamente la sovra-regolazione farmacologica di TMEM230 in cellule endoteliali che delimitano la massa tumorale. L’applicazione di tali tecnologie è compresa nelle forme di realizzazione della presente invenzione.

In ottemperanza dall’Art. 170bis comma 2 C.P:I e in accordo all’Art. 21 comma 2 del Regolamento di attuazione del C.P.I. adottato con D:M. 13.1.2010 n.33 e in ottemperanza dall’Art. 170bis comma 3 C.P:I, nonché dall’Art. 5 comma 3 del d.l. 10 gennaio 2006 n.3 convertito con modificazioni dalla legge del 22 febbraio 2009 n.78, e in accordo all’Art.22 comma 5 del Regolamento di attuazione del C.P.I. adottato con D:M.

13.1.2010 n.33 :

si dichiara che:

il materiale cellulare descritto a titolo esemplificativo nella presente domanda è di provenienza umana e che

le cellule e i tessuti descritti nella presente domanda e non facenti comunque parte dell’oggetto dell’invenzione, sono stati ottenuti da campioni di tessuti tumorali di pazienti, in accordo ai principi della ricerca medica in accordo con quanto stabilito dal comitato etico della struttura ospedaliera in cui il prelievo è stato effettuato a seguito del consenso libero e informato sottoscritto dai pazienti.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Agente che modula/regola l’attività della proteina TMEM230 per uso nel trattamento di patologie in cui è necessaria o consigliabile una regolazione dell’angiogenesi.
2. Agente per l’uso secondo la rivendicazione 1 in cui detta attività è regolata/modulata a livello di espressione, trascrizione o traduzione mediante regolazione di DNA, di RNA, di mRNA, o a livello proteico.
3. Agente per l’uso secondo la rivendicazione 2 in cui detto agente attiva o inibisce il promotore del gene TMEM230.
4. Agente per l’uso secondo la rivendicazione 2 in cui detto agente è un anticorpo monoclonale o policlonale, o un suo frammento attivo come anticorpo anti-TMEM230, un peptide mimetico di TMEM230 o un peptide dominant negative di TMEM230.
5. Agente per l’uso secondo la rivendicazione 2 in cui detto agente è un inibitore di RNA scelto tra miRNA, oligonucleotidi shRNA o siRNA, opzionalmente modificati chimicamente aventi una sequenza complementare ad almeno parte della sequenza di mRNA codificante per la proteina di membrana TMEM230.
6. Agente secondo la rivendicazione 5 in cui detto oligonucleotide è scelto tra uno o più oligonucleotidi aventi SEQ ID 1-6 o un miRNA scelto tra miR134, miR181, miR200 e miR203.
7. Agente per l’uso secondo la rivendicazione 5 o 6 in cui detti oligonucleotidi chimicamente modificati comprendono nucleotidi con una o più modifiche chimiche scelte nel gruppo: uno o più legami internucleosidici modificati, una o molecole di ribosio modificate o sostituite, una o più basi modificate, legame ad una molecola carrier.
8. Agente per l’uso secondo la rivendicazione 7 in cui detti legami internucleosidici sono legami fosforotioato (PS), dette molecole di ribosio modificate sono scelte tra molecole in cui il ribosio è bloccato in una conformazione C3’-endo mediante introduzione di un ponte 2’-O, 4’-C metilene (nucleotidi LAN); molecole in cui il ribosio è modificato in posizione 2’ con una delle seguenti modifiche: 2’-fluoro (2’-F), 2’-O-metossietile (2’-O MOE), 2’-O-metile (2’-O-Me); dette molecole di ribosio sostituite sono molecole di ribosio sostituite da un anello morfolino a 6 elementi.
9. Agente per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui detta patologia è scelta tra malattie croniche che inducono danni al tessuto vascolare; trauma vascolare acuto, arteriopatie degli arti inferiori, trombosi venosa profonda, le vasculopatie di Reynaud, arteriopatie croniche obliteranti, ulcere vascolari, retinopatia diabetica e tutte le complicanze vascolari del diabete incluse le arteriopatie del piede diabetico, le trombosi delle arterie retiniche, i traumi vascolari acuti, l’ischemia del miocardio il danno ischemico al miocardio, e le ischemie cuore infartuato, le patologie occlusive delle arterie cerebrali e l’infarto ischemico cerebrale, vasculopatie cerebrali, demenza di tipo arteriosclerotico legata al sistema vascolare, ischemie indotte da disturbi vascolari e nelle malattie come diabete, insufficienza arteriosa, malattie delle arterie periferiche, ictus, degenerazione vascolare indotta da invecchiamento, degenerazione maculare; nelle infiammazioni croniche tra cui artrite reumatoide, malattia di Crohn, psoriasi, endometriosi, tumori solidi in fase precoce o avanzata.
10. Agente per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 in cui detto agente regola in modo negativo l’attività di TMEM230 e in cui detta patologia è un tumore solido invasivo originato da cellule trasformate di origine mesenchimale: osso, cartilagine, muscoli, vasi; o un tumore solido invasive originato da cellule trasformate di origine epiteliale/ectodermica: cancro, al seno, al colon, alla tiroide, all’ovaio e al polmone, in fase avanzata in cui la neo angiogenesi è già iniziata e il tumore presenta cellule tumorali circolanti.
11. Agente per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui detto agente modula/regola in modo positivo l’attività di TMEM230 e in cui detta patologia è un tumore solido in fase precoce.
12. Composizione farmaceutica per uso nel trattamento di patologie in cui è necessaria o consigliata una regolazione dell’angiogenesi comprendente un agente che modula/regola l’attività di TMEM230 come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile.
13. Kit farmaceutico per uso sequenziale nel trattamento di patologie in cui è necessaria o consigliata una induzione dell’angiogenesi comprendente almeno un contenitore contenente agente che regola in modo negativo l’attività di TMEM230 come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 e almeno un contenitore comprendente un agente che regola/modula in modo positivo l’attività dei TMEM230 come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui detta patologia è patologia è scelta tra malattie croniche che inducono danni al tessuto vascolare; trauma vascolare acuto, arteriopatie degli arti inferiori, trombosi venosa profonda, le vasculopatie di Reynaud, arteriopatie croniche obliteranti, ulcere vascolari, retinopatia diabetica e tutte le complicanze vascolari del diabete incluse le arteriopatie del piede diabetico, le trombosi delle arterie retiniche, i traumi vascolari acuti, l’ischemia del miocardio il danno ischemico al miocardio, e le ischemie cuore infartuato, le patologie occlusive delle arterie cerebrali e l’infarto ischemico cerebrale, vasculopatie cerebrali, demenza di tipo arteriosclerotico legata al sistema vascolare, ischemie indotte da disturbi vascolari e nelle malattie come diabete, insufficienza arteriosa, malattie delle arterie periferiche, ictus, degenerazione vascolare indotta da invecchiamento, degenerazione maculare; nelle infiammazioni croniche tra cui artrite reumatoide, malattia di Crohn, psoriasi, endometriosi, tumori solidi in fase precoce o avanzata.
14. Metodo per la diagnosi di cellule tumorali circolanti o cellule metastatiche in pazienti affetti da cancro comprendente il passaggio di quantificare l’espressione di TMEM230 in un campione di sangue o di siero di un paziente affetto da cancro confrontare l’espressione di TMEM230 in detto campione rispetto a quella rilevata in un campione di controllo rappresentante i valori di espressione di TMEM230 in sangue o siero di un pool di individui sani in cui, quando l’espressione di TMEM230 nel campione del paziente analizzato è pari ad almeno 2 volte, preferibilmente 4 volte, preferibilmente 6 volte l’espressione di TMEM230 nel campione di controllo, è indicativa della presenza di cellule tumorali circolanti e/o di cellule metastatiche in detto paziente.
15. Kit per la diagnosi di metastasi in pazienti affetti da cancro comprendente uno o più reagenti per la quantificazione di TMEM230 in campioni di siero o di sangue, uno o più campioni di controllo rappresentanti i valori di espressione di TMEM230 in sangue o siero di un individuo sano.