IT201600115036A1 - Metodo per la diagnosi in vitro di infertilità maschile. - Google Patents

Description

Metodo per la diagnosi in vitro di infertilità maschile

La presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi in vitro di infertilità maschile.

Più dettagliatamente l’invenzione riguarda un metodo per la diagnosi in vitro di infertilità maschile o per la valutazione della qualità degli spermatozoi nel liquido seminale crioconservato mediante la determinazione, nel liquido seminale, del contenuto di composti antiossidanti, vitaminici, rappresentativi di stress ossidativo/nitrosativo e del metabolismo purinico, pirimidinico ed energetico.

Com’è noto, secondo statistiche recenti, in Italia si celebrano circa 240.000 nuovi matrimoni/anno: a 2 anni, circa 48.000 coppie scoprono di avere difficoltà a concepire, per cui oltre 20.000 nuove coppie all’anno chiedono consulenza medica per infertilità e circa la metà si sottopone a trattamenti di fecondazione assistita (1, 2). Anche a livello del mondo occidentale è stimato che l’infertilità interessa circa il 15-20% delle coppie (3). I dati epidemiologici (4) indicano anche che l’infertilità di coppia è da attribuire a: • una causa maschile, per il 30-40%;

• una patologia femminile, per il 30-40%;

• un problema sanitario di entrambi, per il 20%;

• una causa idiopatica, per il restante 10-20%.

Riferendosi all’infertilità maschile, è possibile ottenere dati epidemiologici che indicano i range percentuali delle cause di tale patologia (4):

Infezioni - 6,6-26

Varicocele 12,3-39

Anomalie cromosomiche 3-12

Criptorchidismo 3-8,5

Endocrinopatie 9 0,6-8,9

Ostruzioni 1,5-7

Idiopatica 30-48,5

Sessuale 1,7-5,7

K. testicolo 0-2,3

Malattie sistemiche 0-5,0

Risulta immediatamente chiaro che una percentuale molto elevata (circa il 35%) risulta a eziologia sconosciuta (idiopatica), cioè non sono note le cause e la diagnosi si basa ESCLUSIVAMENTE sull’impossibilità dell’individuo colpito a procreare. Ovvia conseguenza è che, per tutti questi casi, non esiste alcun approccio terapeutico valido che sia in grado di modificare il quadro patologico.

Se si escludono i casi di infertilità maschile diagnosticabili attraverso il semplice esame obiettivo, il percorso diagnostico prevede lo spermiogramma come esame centrale di laboratorio (4). Questo esame viene condotto seguendo indicazioni precise dettate da linee guida della World Health Organization (WHO) (5), che si possono riassumere come riportato di seguito.

Innanzitutto, vanno osservate scrupolosamente le indicazioni pre-esame; è indispensabile che, prima dell’indagine, sia mantenuta un’astinenza sessuale compresa fra 3 e 5 giorni, per ridurre le variazioni casuali, in quanto la produzione del liquido seminale e la concentrazione degli spermatozoi sono soggette a notevole variabilità e per tale motivo, inoltre, è utile che sia ripetuto 2 o 3 volte. Preferibilmente, la raccolta andrebbe fatta presso il laboratorio, per una lettura entro un’ora dall’emissione; eccezionalmente, su motivata richiesta, può essere fatta in ambiente domestico, proteggendo il campione da escursioni termiche, (20°C - > 37°C) e in un idoneo contenitore, come quello sterile per esame urine. I parametri da considerare nella valutazione del liquido seminale, la cui alterazione è spesso indicativa di specifiche patologie, sono:

1. volume; deve essere > 2 ml; riduzioni del volume (iposia) possono ritrovarsi nell’eiaculazione retrograda, nell’assenza delle vescicole seminali, nell’ipogonadismo o nelle alterazioni del sistema simpatico;

2. pH; è compreso fra 7,2 e 8;

3. fluidificazione; fisiologicamente avviene in un tempo compreso fra i 10 e 60 minuti;

4. viscosità; quando è aumentata può essere definita con graduazione (+, +, ++);

5. numero di spermatozoi; sono indicati per numero/ml (normale > 20 milioni/ml) e per concentrazione/eiaculato (normale > 40 milioni);

6. motilità; è valutata a fresco in camera di Makler, dopo un’ora dall’emissione e distinguendo il movimento degli spermatozoi in: a. lineare veloce; b. lineare lenta; c. discinetica o non lineare; d. agitatoria in loco o in situ; e. immobili. Valori di riferimento per la normalità sono “a+b” ≥ 50% o “a” ≥ 25%. Le anomalie della motilità sono spesso determinate da flogosi, anticorpi antispermatozoo, alterazioni strutturali dello spermatozoo, varicocele, ostruzione parziale delle vie seminali, ecc.;

7. morfologia; dovrà indicare, oltre che gli spermatozoi con forma tipica (> 30%), anche le atipie distinte fra quelle della testa, collo e coda degli spermatozoi;

8. valutazione della componente cellulare non nemaspermica; emazie, elementi della linea germinativa, cellule epiteliali di sfaldamento, zone di spermioagglutinazione, corpuscoli prostatici; i leucociti, quando aumentati (> 1 milione/ml), sono espressione di flogosi delle vie seminali;

9. test opzionali; fra i più importanti si segnalano il test di vitalità (con colorazione all’eosina per rilevare la percentuale di spermatozoi vivi, normale per valori > 70%) ed il MAR (Mixed Antiglobuline Reaction) test per la ricerca degli anticorpi antispermatozoo.

Nella valutazione finale bisogna tener conto che la spermatogenesi dura circa 85 giorni e, pertanto, episodi di tipo febbrile (> 38,5°C), trattamenti chirurgici, e una certa quantità di farmaci possono, anche transitoriamente, alterare gli esiti di uno spermiogramma.

La terminologia usata nella descrizione degli esiti dello spermiogramma è riportata di seguito.

Normozoospermia: esito dei valori nell’ambito della norma.

Oligozoospermia: concentrazione nemaspermica < 20 milioni/ml.

Astenozoospermia: < 50% spermatozoi con motilità rapida e lenta (a+b) oppure < 25% con motilità progressiva rapida (a).

Teratozoospermia: < 30% di spermatozoi con forma normale.

Oligo-asteno-teratozoospermia: anomalia di tutte e tre le variabili precedenti.

Azoospermia: assenza di spermatozoi nell’eiaculato.

Iposia: diminuzione del volume dell’eiaculato (< 1-1,5 ml).

Aspermia: assenza di eiaculazione.

Da quanto sopra indicato risulta evidente che le analisi di laboratorio dedicate alla ricerca delle cause di infertilità maschile non prevedono alcun tipo di indagine biochimica e biochimico-clinica per la ricerca di specifici indicatori biologici correlati alle cause di infertilità. Va anche sottolineato che lo spermiogramma si fonda, prevalentemente, sulla valutazione di parametri determinati dall’operatore. Cioè, la componente soggettiva di chi effettua l’analisi è preponderante nel risultato finale dell’esame, rendendo molto ampia la variabilità dell’analisi da laboratorio a laboratorio, e anche da operatore a operatore. Va ulteriormente ricordato che risultati anomali nell’analisi dello spermiogramma non sempre individuano la causa dell’infertilità maschile e, quindi, non indirizzano eventuali trattamenti terapeutici (4). In ultimo, una larga percentuale di infertilità maschile idiopatica presenta spermiogramma normale, indicando la necessità di introdurre analisi di tipo biochimico sul liquido seminale che permettano di individuare alterazioni di specifici composti collegati a funzioni biochimiche note.

Negli ultimi anni, è stata intrapresa una serie di ricerche sperimentali finalizzate alla caratterizzazione biochimica del liquido seminale di donatori sani e di soggetti con problemi di infertilità, allo scopo di evidenziare una o più sostanze presenti in concentrazioni alterate nei soggetti con infertilità e che potessero, quindi, essere utilizzate come biomarkers nella diagnosi di infertilità maschile (6). In tutti questi studi, le varie sostanze nel liquido seminale sono state analizzate con metodiche ad elevata riproducibilità e sensibilità al fine di avere test diagnostici oggettivi (non dipendenti dalla valutazione dell’operatore) che potessero permettere di colmare le lacune analitiche esistenti nel tradizionale spermiogramma. Alcuni di questi studi hanno adottato il cosiddetto approccio proteomico per il quale sono stati misurati i profili proteici del liquido seminale normale e patologico, ricercando una o più molecole proteiche con valori anomali nei liquidi seminali di soggetti con infertilità (6-14). Altri studi si sono viceversa basati sull’utilizzo del cosiddetto approccio metabolomico “untargeted”, per il quale vengono misurate le concentrazioni di un gran numero di composti a basso peso molecolare, indipendentemente dal loro ruolo biochimico e dalla loro funzione biologica. Anche in questo caso, lo scopo è stato quello di evidenziare una o più molecole presenti in concentrazioni anomale nel liquido seminale patologico rispetto a quello normale. I risultati di tali studi hanno evidenziato alcune sostanze potenzialmente utili per la diagnosi di infertilità maschile (15-20). In alcuni studi è stata adottata la strategia di misurare specifici composti indicativi di stress ossidativo (21-24), valutando, in alcuni casi, le concentrazioni di composti antiossidanti quali coenzima Q10 e alfatocoferolo (25).

La limitazione dell’approccio proteomico è collegata all’elevato costo analitico (strumentazione e reagenti necessari per le analisi molto costosi), alla difficile standardizzazione dei risultati e alla necessità di avere personale altamente qualificato sia per l’esecuzione delle analisi che per l’interpretazione dei risultati analitici.

Analoghe limitazioni sono riscontrabili nell’approccio metabolomico “untargeted” per l’analisi del liquido seminale, per il quale sono necessarie strumentazioni a costo molto elevato (NMR, LC/MS-MS, GC/MS-MS) e di difficile reperimento nei laboratori di biochimica e biochimica-clinica.

Alla luce di quanto sopra esposto, risulta, pertanto, evidente l’esigenza di poter disporre di nuovi biomarcatori per la diagnosi di infertilità misurabili nel liquido seminale con metodi analitici affidabili, caratterizzati da basso costo e facilità di esecuzione.

In questo contesto viene ad inserirsi la soluzione secondo la presente invenzione, che si propone di fornire un metodo per la diagnosi di infertilità maschile mediante l’analisi biochimica del liquido seminale, o di valutazione della fertilità degli spermatozoi crioconservati mediante un approccio metabolomico “mirato” e dedicato alla valutazione di specifici composti antiossidanti, vitaminici, rappresentativi di stress ossidativo/nitrosativo, rappresentativi del metabolismo purinico, pirimidinico ed energetico.

Secondo la presente invenzione, sono state determinate le concentrazioni di una serie di composti appartenenti alle classi chimiche sopraccitate in campioni di liquido seminale di donatori sani e con problemi di infertilità e analisi di spermiogramma patologico. Più in particolare, la popolazione di soggetti con problemi di infertilità era rappresentata da un primo gruppo di individui con normozoospermia (infertilità idiopatica), un secondo gruppo con oligozoospermia, un terzo gruppo con astenozoospermia e un quarto gruppo con teratozoospermia, sulla base dell’analisi dello spermiogramma condotta e valutata secondo i criteri indicati dalla WHO.

I risultati hanno evidenziato che alcuni dei composti misurati sono correlati ad anomalie nello spermiogramma e, cosa ancora più rilevante, risultano alterati in casi di infertilità idiopatica con spermiogramma pressoché normale.

L’analisi è stata condotta utilizzando una metodica analitica come la cromatagrafia liquida ad elevate prestazioni (HPLC) caratterizzata da sensibilità, riproducibilità, specificità, costi analitici contenuti, facilità di esecuzione, ampia diffusione nei laboratori di biochimica e biochimica clinica.

Sulla base dei risultati ottenuti, è immediatamente rilevabile che GSH, acido ascorbico, all-trans retinolo, luteina, alfa-tocoferolo, malondialdeide, coenzima Q10, nitriti, nitrati, 8-idrossi-2’-desossi-guanosina (8-OHdG), creatinina, creatinfosfato, citosina, ipoxantina, xantina, uridina, acido urico, inosina, guanina, guanosina e adenosina sono i composti risultati in concentrazione alterata rispetto ai controlli, nel liquido seminale di tutti i gruppi di pazienti con infertilità. Si può quindi affermare che questo pannello di ventuno sostanze, appartenenti agli antiossidanti idrosolubili (GSH e acido ascorbico) e liposolubili (all-trans retinolo, luteina, alfa-tocoferolo e coenzima Q10), ai composti rappresentativi di stress ossidativo/nitrosativo (malondialdeide, 8-OHdG, nitriti e nitrati), al metabolismo pirimidinico (citosina e uridina), purinico (ipoxantina, xantina, acido urico, inosina guanina, guanosina e adenosina) e al metabolismo energetico (creatininina e creatinfosfato) permettono di discriminare i soggetti sani da quelli con infertilità, assumendo pertanto il significato biochimico e biochimico-clinico di biomarcatori oggettivi per la diagnosi di infertilità.

Inoltre, i dati sperimentali mostrano che è anche possibile evidenziare come esistano altri parametri, oltre ai ventuno summenzionati, che risultano alterati non in tutti i gruppi di pazienti con infertilità. Ad esempio, nei pazienti con oligozoospermia, astenozoospermia e teratozoospermia, il coenzima Q10, la luteina, la malondialdeide, la 8-OHdG, i nitrati, la creatinina, il creatinfosfato, la citosina, l’acido urico, l’inosina e l’adenosina sono risultati significativamente alterati non solo rispetto ai controlli (p < 0.01), ma anche rispetto al gruppo normozoospermico (p < 0.05). All’atto pratico, ciò indica la possibilità di effettuare una diagnosi differenziata di infertilità sulla base dei differenti profili dei metaboliti di interesse, quantificati nel liquido seminale dei differenti donatori infertili.

I risultati, ottenuti mediante la misurazione di questo pannello di sostanze a basso peso molecolare, non hanno soltanto una rilevanza da un punto di vista diagnostico ma anche terapeutico. Infatti, dato il significato biochimico dei diversi composti che giocano un ruolo di biomarcatori, è possibile affermare che tutti i soggetti con infertilità (compresa quella idiopatica dei soggetti con normozoospermia) presentano un deficit di specifiche sostanze ad azione antiossidante (GSH, acido ascorbico, all-trans retinolo, luteina, alfa-tocoferolo, coenzima Q10) che può essere corretto attraverso la somministrazione mirata di opportuni cocktail contenenti gli antiossidanti in difetto. Allo stesso modo, le concentrazioni alterate di composti purinici (guanosina, inosina, adenosina, guanina, ipoxantina, xantina e acido urico), pirimidinici (uridina e citosina) e di quelli collegati al metabolismo energetico (creatinina e creatinfosfato) possono essere anch’esse opportunamente corrette attraverso regimi alimentari ad hoc o attraverso la somministrazione di farmaci, nutraceutici, integratori, ecc. La correzione del profilo dei diversi metaboliti, misurati nel liquido seminale di soggetti con infertilità, può quindi risultare in una risoluzione della difficoltà alla procreazione, accrescendo enormemente la valenza dell’analisi biochimica secondo la presente invenzione.

Va sottolineato che, rispetto agli approcci proteomici (6-14), metabolomici (15-24, 35), molecolari (36, 37), il pannello analitico secondo la presente invenzione può essere determinato con metodiche ad altissima sensibilità che necessitano di strumentazione correntemente in uso nei laboratori biochimici e biochimico-clinici e dai costi contenuti. Inoltre, le metodiche utilizzabili sono di facile esecuzione e le strumentazioni necessitano di una manutenzione dai costi anch’essi molto contenuti. In ultimo, il costo di una singola analisi, rispetto alle analisi proteomiche, metabolomiche, molecolari è dalle 10 alle 20 volte inferiore rendendo applicabile su larga scala il metodo della presente invenzione.

Nello studio secondo la presente invenzione, le sostanze sono state analizzate con metodiche HPLC (26-34). Tuttavia, va menzionato che possono essere usate numerose metodiche alternative di tipo colorimetrico, enzimatico, immunochimico, in spettrometria di massa, in gas-cromatografia, che permettono la quantificazione dei composti di interesse nel liquido seminale, ottenendo i risultati relativi al pannello di composti che permette la diagnosi biochimica di infertilità mediante la loro valutazione nel liquido seminale.

Forma, pertanto, oggetto specifico della presente invenzione un metodo per la diagnosi in vitro di infertilità maschile o di valutazione in vitro della qualità degli spermatozoi crioconservati (o del liquido seminale crioconservato), detto metodo comprendendo o essendo consistente nella determinazione, mediante analisi biochimica di un campione di liquido seminale, della concentrazione di almeno uno dei seguenti composti scelti tra guanosina, guanina, adenosina, uridina, creatinina e creatinfosfato, in cui la concentrazione di guanosina, guanina, adenosina, uridina e creatinfosfato in campioni di liquido seminale di soggetti infertili è minore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili, mentre la concentrazione di creatinina in campioni di liquido seminale di soggetti infertili è maggiore rispetto alla concentrazione dello stesso composto nei controlli fertili.

I composti guanosina, guanina, e adenosina sono composti del metabolismo purinico, uridina è un composto del metabolismo pirimidinico, creatinina e creatinfosfato sono composti del metabolismo energetico.

Il metodo secondo la presente invenzione può essere impiegato anche per il monitoraggio dell’efficacia terapeutica di farmaci volti al trattamento dell’infertilità maschile o al miglioramento di detti composti nel liquido seminale.

Secondo il metodo della presente invenzione si possono determinare le concentrazioni di almeno due o di almeno tre, o di almeno quattro, o di cinque di detti composti o tutti detti composti.

Secondo una forma particolare di realizzazione preferibilmente viene determinata la concentrazione di uridina da sola o anche degli altri composti.

Il metodo secondo la presente invenzione può comprendere ulteriormente la determinazione nel liquido seminale della concentrazione di uno dei, più o tutti i composti scelti nel gruppo consistente in glutatione ridotto, acido ascorbico, all trans retinolo, luteina, alfa tocoferolo, coenzima Q10, 8-OHdG, nitriti, nitrati, malondialdeide, citosina, ipoxantina, xantina, acido urico e inosina in cui la concentrazione di 8-OHdG, nitriti, nitrati, malondialdeide, ipoxantina, xantina, acido urico e inosina in liquidi seminali di soggetti infertili è maggiore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili mentre la concentrazione di glutatione ridotto, acido ascorbico, all trans retinolo, luteina, alfa tocoferolo, coenzima Q10, in liquidi seminali di soggetti infertili è minore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili.

Inoltre, il metodo secondo la presente invenzione può comprendere o consistere nella determinazione, in un campione di liquido seminale, della concentrazione di tutti i seguenti composti: antiossidanti, quali glutatione ridotto, acido ascorbico, gamma-tocoferolo, alfa-tocoferolo, luteina, coenzima Q10(ubidecarenone), di composti appartenenti alla classe delle vitamine idro- e liposolubili, quali vitamina C (acido ascorbico), vitamina E (gamma- e alfa-tocoferolo), vitamina A (all-trans-retinale e acido retinoico alltrans), vitamina D3(25-idrossicolecalciferolo) e vitamina K1(fillochinone), di composti rappresentativi di stress ossidativo/nitrosativo quali malondialdeide, 8-OHdG, nitrito e nitrato, di composti rappresentativi del metabolismo purinico quali ipoxantina, xantina, adenina, acido urico, inosina, adenosina, guanina e guanosina, di composti rappresentativi del metabolismo pirimidinico uracile, beta-pseudouridina, uridina, citidina, citosina e acido orotico e di composti collegati al metabolismo energetico quali creatinina, e creatinfosfato.

La presente invenzione concerne anche un metodo, che può essere combinato con il precedente o eseguito indipendentemente da questo, che consente la diagnosi in vitro di infertilità dei tipi oligozoospermico, astenozoospermico e teratozoospermico, e quindi di distinguere questi tipi di infertilità rispetto al tipo idiopatico con normozoospermia. Il metodo comprende o consiste nella determinazione nel liquido seminale della concentrazione di uno o più o tutti i composti scelti nel gruppo consistente in luteina, coenzima Q10, malondialdeide, 8-OHdG, nitrati, creatinina, creatinfosfato, citosina, acido urico, adenosina, in cui la concentrazione di malondialdeide, 8-OHdG, nitrati, creatinina o acido urico in liquidi seminali di soggetti infertili dei tipi oligozoospermico, astenozoospermico e teratozoospermico è maggiore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili, mentre la concentrazione di luteina, coenzima Q10, creatinfosfato, citosina e adenosina in liquidi seminali di soggetti infertili dei tipi oligozoospermico, astenozoospermico e teratozoospermico è minore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili.

I metodi secondo la presente invenzione possono essere condotti mediante HPLC con rivelatore spettrofotometrico o fluorimetrico o spettrometrico di massa, mediante misurazioni spettrofotometriche dirette o accoppiate a reazioni colorimetriche e a dosaggi enzimatici, mediante test immunochimici, mediante analisi di risonanza magnetica nucleare. Può, inoltre, essere impiegata qualunque altra metodica o tecnica analitica atta alla determinazione nel liquido seminale di uno o tutti i composti di interesse da utilizzare per la diagnosi di infertilità maschile o per il monitoraggio dell’efficacia terapeutica di farmaci volti al trattamento dell’infertilità maschile o al miglioramento di detti composti nel liquido seminale.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica o integratore alimentare comprendente o consistente nei composti guanosina, guanina, adenosina, uridina, creatinfosfato, o precursori di detti composti, o stimolatori della biosintesi di detti composti finalizzata all’aumento nel liquido seminale (ad es., ribosio, adenina, uracile, creatina), come principi attivi, in associazione con uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili, detta composizione farmaceutica o integratore alimentare essendo per l’uso nella terapia dell’infertilità.

La composizione farmaceutica o integratore alimentare secondo la presente invenzione può comprendere ulteriormente almeno uno o tutti i composti scelti nel gruppo che consiste negli antiossidanti glutatione ridotto, acido ascorbico, all trans retinolo, luteina, coenzima Q10e alfa tocoferolo, o nei loro precursori quale ad esempio beta carotene o analoghi quali ad esempio zeaxantina, cantaxantina, capsantina, citranaxantina, gamma tocoferolo, delta tocoferolo, tocoferolo acetato.

L’invenzione verrà descritta nel seguito a titolo illustrativo, ma non limitativo, con particolare riferimento ad alcuni esempi illustrativi.

Esempio 1: Studio sulla correlazione tra le concentrazioni di composti del liquido seminale e l’infertilità maschile

Materiali e i metodi

Popolazione studiata. Sono stati reclutati 50 donatori sani senza problemi di infertilità (tutti i donatori avevano procreato), di età compresa tra 28 e 55 anni di età. La popolazione di soggetti con problemi di infertilità era rappresentata da 15 individui con normozoospermia (infertilità idiopatica), 25 con oligozoospermia, 30 con astenozoospermia e 30 con teratozoospermia, sulla base dell’analisi dello spermiogramma condotta e valutata secondo i criteri indicati dalla WHO.

L’eiaculato fresco, dopo 30 minuti a 37 °C per favorire la liquefazione, è stato sottoposto a centrifugazione per 15 minuti a 1860 x g, allo scopo di ottenere il liquido seminale privo di spermatozoi e eventuali altre specie cellulari.

La deproteinizzazione dei campioni di liquido seminale è stata effettuata con una nuova metodica che permette di ottenere un estratto privo di proteine, utilizzabile per analizzare composti a basso peso molecolare sia di natura liposolubile che di natura idrosolubile. A tale scopo, 500 µl di liquido seminale sono stati aggiunti a 1 ml di acetonitrile (HPLC-grade), vorticati vigorosamente per 60 secondi e incubati a 37 °C per 1 ora in bagnetto termostatico. Al termine dell’incubazione, il campione è stato centrifugato a 21680 x g per 15 minuti a 10 °C, per permettere la sedimentazione del precipitato proteico. Il sopranatante è stato raccolto e diviso in due aliquote. Una è stata direttamente analizzata per la determinazione quantitativa di composti a basso peso molecolare liposolubili, l’altra (300 µl) è stata addizionata con 1.5 ml di cloroformio (HPLC-grade), agitata vigorosamente per 90 secondi e centrifugata a 21680 x g per 15 minuti a 10 °C. Questo passaggio permette il passaggio della fase organica (acetonitrile) nel cloroformio, lasciando, dopo la centrifugazione, una fase acquosa superiore contenente i composti a basso peso molecolare di natura idrosolubile (26).

A scopo esemplificativo, ma non limitativo, nello studio condotto i composti di interesse di natura liposolubile presenti nell’estratto organico di liquido seminale (gamma-tocoferolo, alfa-tocoferolo, luteina, coenzima Q10, all-trans-retinale, acido retinoico alltrans, 25-idrossicolecalciferolo, fillochinone, betacarotene) sono stati separati e quantificati mediante HPLC in fase inversa, utilizzando una metodica cromatografica messa a punto dagli inventori. La colonna cromatografica era una Gold ODS C-18 (ThermoFisher Scientific, Milano, Italia) di 4.6 mm di diametro interno e 10 cm di lunghezza, con particelle di 5 µm di diametro e pori di 120 Å, provvista di precolonna di 2 cm e contenente la stessa fase della colonna separativa.

La separazione dei composti di interesse è stata effettuata utilizzando due eluenti: eluente A, composto da 70% di metanolo 30% di acqua; eluente B composto da 100% acetonitrile. E’ stato anche adottata una separazione in gradiente, così costitutito: 0.5 minuti al 100% di A; 8 minuti fino al 100% di B; 17 minuti con il 100% di B. Il flusso della corsa cromatografica è stato di 1 ml/minuto e la temperatura della colonna cromatografica è stata costantemente mantenuta a 25 °C. I composti di interesse di natura idrosolubile presenti nell’estratto acquoso di liquido seminale deproteinizzato (glutatione ridotto, acido ascorbico, malondialdeide, 8-OHdG, nitrito, nitrato, ipoxantina, xantina, adenina, acido urico, inosina, adenosina, guanina, guanosina, uracile, beta-pseudouridina, uridina, citidina, citosina, acido orotico, creatinina, creatinfosfato) sono stati separati e quantificati mediante HPLC ad accoppiamento ionico, utilizzando la metodica precedentemente descritta e applicata in numerosi lavori sperimentali e clinici per separare le sostanze summenzionate (27-34) in campioni di tessuto e di fluidi biologici a scopo diagnostico e di monitoraggio clinico. La colonna utilizzata è stata una Hypersil ODS C-18, con diametro di 4.6 mm, lunghezza di 25 cm, particelle di 5 µm e pori di 120 Å, equipaggiata con una precolonna da 2 cm riempita della stessa fase stazionaria. La separazione dei composti è stata effettuata in isocratica, con un eluente composto da uno ione ammonio quaternario (tetrabutilammonio) alla concentrazione di 12 mM, un solvente organico polare (metanolo) allo 0,125%, un sale di acido debole (fosfato bisodico) alla concentrazione di 10 mM, pH 7,00. Alla fine di ogni corsa cromatografica, la colonna è stata lavata con un eluente composto da acetonitrile (40%), metanolo (30%) e acqua (30%). Il flusso delle corse cromatografiche è stato di 1.2 ml/minuto e la colonna è stata termostatata a 10 °C.

Per entrambe le separazioni, la colonna cromatografica era collegata a un sistema HPLC formato da una pompa a 4 vie con miscelazione degli eluenti a bassa pressione, un degassatore a membrana degli eluenti e un autocampionatore termostatato. Il rivelatore utilizzato era di tipo spettrofotometrico a serie di diodi ad elevata sensibilità (equipaggiato con cella di flusso da 5 cm), selezionato per acquisire i dati cromatografici tra le lunghezze d’onda di 200 e 400 nm. Il sistema HPLC era controllato da un PC equipaggiato con un software per la gestione degli strumenti e per l’acquisizione e l’elaborazione dei dati delle corse cromatografiche.

Nel caso dell’analisi dei composti liposolubili, sono stati caricati in colonna 200 µl dell’estratto deproteinizzato di liquido seminale in acetonitrile, senza alcuna diluizione. Nel caso dell’analisi dei composti idrosolubili, i campioni sono stati diluiti 20 volte con acqua e, successivamente, 200 µl sono stati cricati in colonna.

La concentrazione dei diversi composti da quantificare è stata calcolata rapportando le aree dei picchi cromatografici delle corse dei campioni di liquido seminale con le corrispondenti aree dei picchi cromatografici di corse di standard ultrapuri a concentrazione nota.

I dati relativi alle variabili in esame sono stati trasformati in logaritmi per effettuare il test preliminare di normalità e, successivamente, calcolare gli intervalli di riferimento dei singoli composti (intervalli di confidenza a un livello di probabilità del 95%). I confronti tra i valori riscontrati nel liquido seminali dei diversi gruppi di donatori sono stati effettuati utilizzando l’analisi della varianza a due vie per misure ripetute (2-way ANOVA for repente measures). Il test di Fisher protetto dei minimi quadrati è stato utilizzato come post-hoc test. Valori di p < 0.05 a due code sono stati considerati statisticamente significativi.

RISULTATI

Nella Tabella 1 sono riportati i valori medi ± deviazione standard (D.S) e gli intervalli di riferimento dei composti di interesse determinati in campioni di liquido seminale di 50 donatori sani.

Tabella 1. Valori medi ± (D.S) e intervalli di riferimento al 95% dei composti di interesse determinati in campioni di liquido seminale di 50 donatori sani, espressi in µmoli/L.

MEDIA ± D.S. INTERVALLI DI µmoli/L RIFERIMENTO

µmoli/L

Glutatione ridotto (GSH) 15.56 ± 5.17 8.00 – 28.00

Acido ascorbico 197.19 ± 76-03 100.00 – 350.00

Acido all-trans retinoico 0.001 ± 0.001 0.000 – 0.003

all-trans retinolo 0.066 ± 0.035 0.03 – 0.12

25-idrossicolecalciferolo 0.001 ± 0.001 0.000 – 0.003

Alfa-tocoferolo 3.38 ± 1.56 1.50 – 5.00

Gamma-tocoferolo 0.08 ± 0.03 0.04 – 0.10

Luteina 0.018 ± 0.06 0.01 – 0.03 Fillochinone 0.000 0.000 – 0.001

Beta-carotene 0.002 ± 0.001 0.000 - 0.002

Coenzima Q10 0.03 ± 0.01 0.02 – 0.06

Malondialdeide (MDA) 0.03 ± 0.03 0.02 – 0.10

8-idrossi-2’desossi-guanosina (8-OHdG) 0.01 ± 0.01 0.00 – 0.02

Nitriti (-NO2-) 2.89 ± 1.14 2.00 – 6.00

Nitrati (-NO -

3 ) 24.59 ± 6.11 15.00 – 50.00

Creatinina 175.23 ± 78.98 100.00 – 300.00

Creatinfosfato 755.36 ± 216.28 450.00 – 1000.00

Citosina 1.07 ± 0.08 0.10 – 2.00

Citidina 1.54 ± 0.67 0.50 – 3.00

Uracile 5.38 ± 2.58 1.50 – 8.00

Beta-pseudouridina 6.65 ± 4.22 2.00 – 10.00

Ipoxantina 4.21 ± 1.02 2.00 – 12.00

Xantina 30.44 ± 6.28 25.00 – 55.00

Uridina 1735.04 ± 316.03 1200.00 – 2000.00

Acido Urico 188.28 ± 46.75 120.00 – 250.00

Inosina 1.87 ± 0.54 1.00 – 4.00

Guanina 48.31 ± 14.59 20.00 – 80.00

Guanosina 69.31 ± 22.06 30.00 – 90.00

Acido orotico 53.82 ± 19.51 20.00 – 70.00

Adenosina 31.40 ± 9.66 15.00 – 60.00

I dati ottenuti sui volontari sani hanno permesso di determinare la concentrazione dei composti di interesse in campioni di liquido seminale che possono essere definite come “condizioni fisiologiche di normalità”, in quanto ottenute su donatori senza nessun problema alla procreazione. Le concentrazioni delle singole sostanze in questi campioni sono servite per effettuare il confronto con i valori determinati in campioni di liquido seminale di 100 donatori con problemi di infertilità. Il primo confronto statistico è stato condotto senza suddividere i soggetti infertili in base alle anomalie riscontrate allo spermiogramma, ed è riportato nella Tabella 2.

Tabella 2. Valori medi ± (D.S) dei composti di

interesse determinati in campioni di liquido seminale

di 50 donatori sani e di 100 pazienti con problemi di

infertilità, espressi in µmoli/L.

CONTROLLI PAZIENTI

n = 50 n = 100

MEDIA ± D.S. MEDIA ± D.S.

µmoli/L µmoli/L

Glutatione ridotto (GSH) 15.56 ± 5.17 6.97 ±2.15

Acido ascorbico 197.19 ± 76-03 86.10 ± 32.54

Acido all-trans retinoico 0.001 ± 0.001 0.001 ± 0.001

all-trans retinolo 0.066 ± 0.035 0.03 ± 0.01

25-idrossicolecalciferolo 0.001 ± 0.001 0.00

Alfa-tocoferolo 3.38 ± 1.56 1.28 ± 0.48

Gamma-tocoferolo 0.08 ± 0.03 0.05 ± 0.03

Luteina 0.018 ± 0.06 0.007 ± 0.002

Fillochinone 0.000 0.000

Beta-carotene 0.001 ± 0.001 0.001 ± 0.001

Coenzima Q10 0.043 ± 0.011 0.018 ± 0.00

Malondialdeide (MDA) 0.03 ± 0.03 0.10 ± 0.04

8-idrossi-2’desossi-guanosina (8-OHdG) 0.01 ± 0.01 0.18 ± 0.08

Nitriti (-NO2 -) 2.89 ± 1.14 13.50 ± 3.95

Nitrati (-NO3 -) 24.59 ± 6.11 41.24 ± 12.60

Creatinina 175.23 ± 78.98 329.45 ± 103.57

Creatinfosfato 755.36 ± 216.28 389.57 ± 115.88

Citosina 1.07 ± 0.08 0.59 ± 0.26

Citidina 1.54 ± 0.67 1.57 ± 0.53

Uracile 5.38 ± 2.58 4.88 ± 1.47

Beta-pseudouridina 6.65 ± 4.22 5.17 ± 2.91

Ipoxantina 4.21 ± 1.02 21.00 ± 6.27

Xantina 30.44 ± 6.28 75.53 ± 15.31

Uridina 1735.04 ± 316.03 959.36 ± 164.56

Acido Urico 188.28 ± 46.75 330.64 ± 68.46

Inosina 1.87 ± 0.54 5.47 ± 0.53

Guanina 48.31 ± 14.59 25.89 ± 8.62

Guanosina 69.31 ± 22.06 25.51 ± 6.11

Acido orotico 53.82 ± 19.51 39.97 ± 9.30

Adenosina 31.40 ± 9.66 21.75 ± 6.69

Nella colonna dei pazienti infertili, i valori in grassetto sono risultati significativamente differenti rispetto alle corrispondenti concentrazioni riscontrate nei controlli (p < 0.01).

A questo punto, avendo riscontrato numerose anomalie biochimiche nei soggetti infertili, questi ultimi sono stati suddivisi in 4 sottogruppi (normozoospermia, oligozoospermia, astenozoospermia, teratozoospermia), sulla base delle risultanze dell’analisi dello spermiogramma. Lo scopo è stato quello di evidenziare sia anomalie biochimche comuni a tutte le infertilità, sia di riscontrare profili biochimici specifici per uno o più sottogruppi. I risultati di questi confronti statistici sono riassunti nella Tabella 3.

Tabella 3. Valori medi ± (D.S) dei composti di interesse determinati in campioni di liquido seminale di donatori sani, con normozoospermia (infertilità idiopatica), oligozoospermia, astenozoospermia e teratozoospermia, espressi in µmoli/L.

CONTROLLI NORMO- OLIGO- ASTENO- TERATO-n = 50 ZOOSPERMIA ZOOSPERMIA ZOOSPERMIA ZOOSPERMIA n = 15 n = 25 n = 30 n = 30 MEDIA ± MEDIA ± D.S. MEDIA ± D.S. MEDIA ± D.S. MEDIA ± D.S. D.S. µmoli/L µmoli/L µmoli/L µmoli/L µmoli/L

Glutatione ridotto 15.56 ± 5.17 8.53 ± 2.67 6.47 ± 1.18 5.36 ± 2.01 7.53 ± 2.72 (GSH)

Acido ascorbico 197.19 ± 76- 136.59 ± 34.34 88.67 ± 31.40 67.47 ± 31.32 51.66 ± 23.09

03

Acido all-trans 0.001 ± 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 retinoico

all-trans retinolo 0.066 ± 0.035 0.035 ± 0.018 0.014 ± 0.007 0.028 ± 0.006 0.036 ± 0.011 25- 0.001 ± 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 idrossicolecalciferolo

Alfa-tocoferolo 3.38 ± 1.56 1.85 ± 0.56 0.96 ± 0.38 1.21 ± 0.34 1.09 ± 0.65 Gamma-tocoferolo 0.08 ± 0.03 0.08 ± 0.05 0.02 ± 0.01 0.03 ± 0.01 0.07 ± 0.03 Luteina 0.018 ± 0.06 0.014 ± 0.006 0.012 ± 0.004 0.006 ± 0.002 0.010 ± 0.005 Fillochinone 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Beta-carotene 0.001 ± 0.001 0.001 ± 0.001 0.001 ± 0.001 0.001 ± 0.001 0.001 ± 0.001 Coenzima Q10 0.043 ± 0.011 0.031 ± 0.009 0.019 ± 0.006 0.013 ± 0.002 0.011 ± 0.001 Malondialdeide 0.03 ± 0.03 0.04 ± 0.02 0.15 ± 0.06 0.09 ± 0.04 0.12 ± 0.04 (MDA)

8-idrossi-2’desossi- 0.01 ± 0.01 0.02 ± 0.02 0.09 ± 0.04 0.14 ± 0.04 0.22 ± 0.09 guanosina (8-OHdG)

Nitriti (-NO2-) 2.89 ± 1.14 6.31 ± 2.09 9.28 ± 4.47 20.10 ± 5.76 18.30 ± 3.48 Nitrati (-NO3 -) 24.59 ± 6.11 24.18 ± 10.71 68.16 ± 18.54 42.06 ± 13.50 40.54 ± 7.63 Creatinina 175.23 ± 78.98 162.54 ± 46.38 476.16 ± 358.60 ± 320.48 ± 62.39

169.05 136.44 Creatinfosfato 755.36 ± 216.28 498.22 ± 343.51 ± 287.68 ± 99.55 366.15 ±

167.45 109.41 100.12 Citosina 1.07 ± 0.08 1.32 ± 0.84 0.54 ± 0.12 0.17 ± 0.05 0.33 ± 0.01 Citidina 1.54 ± 0.67 1.78 ± 0.79 1.44 ± 0.76 1.39 ± 0.11 1.65 ± 0.47 Uracile 5.38 ± 2.58 4.31 ± 2.01 3.66 ± 1.22 4.38 ± 1.19 7.17 ± 1.45 Beta-pseudouridina 6.65 ± 4.22 4.34 ± 3.55 5.03 ± 2.19 6.15 ± 3.88 5.16 ± 2.03 Ipoxantina 4.21 ± 1.02 15.12 ± 1.11 17.13 ± 6.20 20.21 ± 8.26 31.54 ± 9.50 Xantina 30.44 ± 6.28 88.07 ± 10.44 55.84 ± 9.63 70.44 ± 19.65 87.78 ± 21.53 Uridina 1735.04 ± 968.83 ± 636.12 ± 846.74 ± 98.01 1385.76 ±

316.03 294.35 114.22 151.64 Acido Urico 188.28 ± 46.75 192.56 ± 65.38 506.16 ± 98.68 337.28 ± 33.46 298.54 ± 76.33 Inosina 1.87 ± 0.54 4.12 ± 0.57 5.33 ± 1.14 6.01 ± 0.89 6.45 ± 0.51 Guanina 48.31 ± 14.59 13.56 ± 11.09 30.88 ± 7.73 31.49 ± 10.36 27.63 ± 5.31 Guanosina 69.31 ± 22.06 13.63 ± 6.31 23.73 ± 6.07 27.12 ± 3.89 37.55 ± 8.15 Acido orotico 53.82 ± 19.51 35.14 ± 17.78 35.32 ± 13.14 43.64 ± 7.13 45.76 ± 9.13 Adenosina 31.40 ± 9.66 29.82 ± 7.69 17.60 ± 4.32 19.07 ± 8.56 20.51 ± 6.17

Anche in questo caso, i valori indicati in

grassetto sono risultati significativamente differenti

rispetto ai controlli (p < 0.01).

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Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1) Metodo per la diagnosi in vitro di infertilità maschile o di valutazione in vitro della qualità degli spermatozoi crioconservati, detto metodo comprendendo o essendo consistente nella determinazione, mediante analisi biochimica di un campione di liquido seminale, della concentrazione di almeno uno dei composti scelti tra guanosina, guanina, adenosina, uridina, creatinina e creatinfosfato, in cui la concentrazione di guanosina, guanina, adenosina, uridina e creatinfosfato in campioni di liquido seminale di soggetti infertili è minore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili, mentre la concentrazione di creatinina in campioni di liquido seminale di soggetti infertili è maggiore rispetto alla concentrazione dello stesso composto nei controlli fertili.
2. 2) Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui sono determinate le concentrazioni di almeno due o di almeno tre, o di almeno quattro, o di cinque di detti composti o di tutti detti composti.
3. 3) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, che comprende ulteriormente la determinazione nel liquido seminale della concentrazione di uno dei, più o tutti i composti scelti nel gruppo consistente in glutatione ridotto, acido ascorbico, all trans retinolo, alfa tocoferolo, luteina, coenzima Q10, 8-OHdG, nitriti, nitrati, malondialdeide, citosina, ipoxantina, xantina, acido urico e inosina in cui la concentrazione di 8-OHdG, nitriti, nitrati, malondialdeide, ipoxantina, xantina, acido urico e inosina in liquidi seminali di soggetti infertili è maggiore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili mentre la concentrazione di glutatione ridotto, acido ascorbico, all trans retinolo, alfa tocoferolo, luteina, coenzima Q10, in liquidi seminali di soggetti infertili è minore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili.
4. 4) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, detto metodo comprendendo o essendo consistente nella determinazione, in un campione di liquido seminale, della concentrazione di tutti i seguenti composti: antiossidanti, quali glutatione ridotto, acido ascorbico, gamma-tocoferolo, alfa-tocoferolo, luteina, coenzima Q10, di composti appartenenti alla classe delle vitamine idro- e liposolubili, quali vitamina C, vitamina E, vitamina A, vitamina D3e vitamina K1, di composti rappresentativi di stress ossidativo/nitrosativo quali malondialdeide, 8-OHdG, nitrito e nitrato, di composti rappresentativi del metabolismo purinico quali ipoxantina, xantina, adenina, acido urico, inosina, adenosina, guanina e guanosina, di composti rappresentativi del metabolismo pirimidinico uracile, beta-pseudouridina, uridina, citidina, citosina e acido orotico e di composti collegati al metabolismo energetico quali creatinina, e creatinfosfato.
5. 5) Metodo per la diagnosi in vitro di infertilità dei tipi oligozoospermico, astenozoospermico e teratozoospermico, rispetto al tipo idiopatico con normozoospermia, mediante la determinazione nel liquido seminale della concentrazione di uno o più o tutti i composti scelti nel gruppo consistente in luteina, coenzima Q10, malondialdeide, 8-OHdG, nitrati, creatinina, creatinfosfato, citosina, acido urico, adenosina in cui la concentrazione di malondialdeide, 8-OHdG, nitrati, creatinina o acido urico in liquidi seminali di soggetti infertili dei tipi oligozoospermico, astenozoospermico e teratozoospermico è maggiore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili, mentre la concentrazione di luteina, coenzima Q10, creatinfosfato, citosina e adenosina in liquidi seminali di soggetti infertili dei tipi oligozoospermico, astenozoospermico e teratozoospermico è minore rispetto alla concentrazione degli stessi composti nei controlli fertili.
6. 6) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, detto metodo essendo condotto mediante HPLC con rivelatore spettrofotometrico o fluorimetrico o spettrometrico di massa, mediante misurazioni spettrofotometriche dirette o accoppiate a reazioni colorimetriche e a dosaggi enzimatici, mediante test immunochimici, mediante analisi di risonanza magnetica nucleare.
7. 7) Composizione farmaceutica o integratore alimentare comprendente o consistente nei composti guanosina, guanina, adenosina, uridina, creatinfosfato, o precursori di detti composti, o stimolatori della biosintesi di detti composti, come principi attivi, in associazione con uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili, detta composizione farmaceutica o integratore alimentare essendo per l’uso nella terapia dell’infertilità.
8. 8) Composizione farmaceutica o integratore alimentare secondo la rivendicazione 7, per l’uso secondo la rivendicazione 7, comprendente ulteriormente almeno uno o tutti i composti scelti nel gruppo che consiste negli antiossidanti glutatione ridotto, acido ascorbico, all trans retinolo, luteina, coenzima Q10e alfa tocoferolo, o nei loro precursori quale ad esempio beta carotene o analoghi quali ad esempio zeaxantina, cantaxantina, capsantina, citranaxantina, gamma tocoferolo, delta tocoferolo, tocoferolo acetato.