IL276789B2 - Food additives containing saponin and methods of their production and use - Google Patents

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4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 1 - T I T L E : S a p o n i n C o n t a i n i n g F e e d A d d i t i v e s a n d M e t h o d s o f P r o d u c i n g a n d U s i n g S a m e F I E L D O F T H E I N V E N T I O N T h e i n v e n t i o n i s i n t h e f i e l d o f f e e d a n d / o r f e e d a d d i t i v e s f o r l i v e s t o c k . B A C K G R O U N D O F T H E I N V E N T I O N 5 M o d e r n a g r i c u l t u r e r e l i e s o n h i g h d e n s i t y p r o d u c t i o n f a c i l i t i e s . I n m a n y c a s e s t h e p r o d u c t i o n c y c l e i s l o n g a n d w a s t e f r o m l i v e s t o c k h o u s e d i n t h e f a c i l i t y a c c u m u l a t e s i n t h e f a c i l i t y f o r l o n g p e r i o d s . T h e a c c u m u l a t e d w a s t e b e c o m e s a b r e e d i n g g r o u n d f o r f l i e s a n d o t h e r i n s e c t s . F o r e x a m p l e , l a y i n g h e n s a r e o f t e n h o u s e d f o r m a n y m o n t h s i n a c l o s e d f a c i l i t y . I n 10 m a n y c a s e s w a s t e i s n o t r e m o v e d f r o m t h e f a c i l i t y d u r i n g t h i s e n t i r e p e r i o d . F l i e s l a y e g g s i n t h e w a s t e . T h e e g g s h a t c h i n t o l a r v a a n d t h e l a r v a t u r n t o p u p a w h i c h m a t u r e i n t o f l i e s w h i c h t h e n m a t e a n d l a y m o r e e g g s . I f t h e f l y p o p u l a t i o n i s n o t c o n t r o l l e d , c o n d i t i o n s i n t h e f a c i l i t y q u i c k l y b e c o m e i n t o l e r a b l e f o r a n i m a l s a n d / o r h u m a n s . C u r r e n t f l y p o p u l a t i o n c o n t r o l m e a s u r e s r e l y o n c h e m i c a l i n s e c t i c i d e s a n d / o r t r a p s . 15 U s e o f c h e m i c a l i n s e c t i c i d e s i n c o m m e r c i a l a g r i c u l t u r e i s c o n t r o v e r s i a l d u e t o c o n c e r n s a b o u t t h e p o s s i b i l i t y o f t o x i c r e s i d u e s i n f o o d p r o d u c t s . S U M M A R Y O F T H E I N V E N T I O N O n e a s p e c t o f s o m e e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n r e l a t e s t o a f e e d a d d i t i v e i n c l u d i n g 20 e n t e r i c c o a t e d p a r t i c l e s c o n t a i n i n g s a p o n i n . I n s o m e e m b o d i m e n t s Y u c c a p o w d e r s e r v e s a s a s o u r c e o f s a p o n i n . T h e e n t e r i c c o a t i n g i s f o r m u l a t e d t o a l l o w t h e p a r t i c l e s t o p a s s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t o f l i v e s t o c k a n d b e d e p o s i t e d i n t h e w a s t e w i t h o u t t h e s a p o n i n b e i n g i n a c t i v a t e d a n d / o r a b s o r b e d . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e p a r t i c l e s h a v e a d i a m e t e r r a n g e o f 5 0 0 m i c r o n s t o 1 4 0 0 m i c r o n s w i t h 1 0 0 0 m i c r o n s a v e r a g e d i a m e t e r a s d e t e r m i n e d b y s i e v i n g 25 t h r o u g h a s e r i e s o f s i e v e s w i t h d e c r e a s i n g m e s h s i z e s . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e s a p o n i n i n t h e w a s t e e x e r t a l a r v a s t a t i c a n d / o r l a r v i c i d a l e f f e c t . B e c a u s e w a s t e i s a c c u m u l a t i n g e v e r y d a y , t h e l a r v i c i d e i s a p p l i e d a u t o m a t i c a l l y t h r o u g h o u t t h e p r o d u c t i o n c y c l e s o l o n g a s t h e e n t e r i c c o a t e d p a r t i c l e s c o n t a i n i n g s a p o n i n a r e p r e s e n t i n t h e f e e d . A n o t h e r a s p e c t o f s o m e e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n r e l a t e s t o m e t h o d s o f 30 m a n u f a c t u r i n g t h e e n t e r i c c o a t e d p a r t i c l e s c o n t a i n i n g s a p o n i n . I n s o m e e m b o d i m e n t s Y u c c a p o w d e r s e r v e s a s a s o u r c e o f s a p o n i n . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e m a n u f a c t u r i n g m e t h o d i n c l u d e s w e t g r a n u l a t i o n . A c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n w e t g r a n u l a t i o n f o r m u l a t i o n s i n c l u d e Y u c c a p o w d e r a n d / o r C o r n s t a r c h a n d / o r m a l t o d e x t r i n a n d / o r 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 2 - C a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e ( C M C ) a n d / o r s o d i u m a l g i n a t e . I n o t h e r e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , a d r y g r a n u l a t i o n i s e m p l o y e d i n a f o r m u l a t i o n w h i c h i n c l u d e s m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( M C C ) . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n v a r i o u s e m b o d i m e n t s t h e m a n u f a c t u r i n g p r o c e s s i n c l u d e s e n t e r i c c o a t i n g b y h y d r o x y p r o p y l m e t h y l c e l l u l o s e p h t h a l a t e ( H P - 5 5 ) i n a n o r g a n i c s o l u t i o n ( e . g . a c e t o n e a n d / o r m e t h a n o l ) o r e n t e r i c c o a t i n g b y s t e a r i c a c i d . 5 A n o t h e r a s p e c t o f s o m e e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n r e l a t e s t o u s i n g t h e a n i m a l a s a v e h i c l e t o d i s t r i b u t e t h e p e s t c o n t r o l l i n g m a t e r i a l t o t h e t a r g e t a r e a . T h e f o r m u l a t i o n o f t h e s a p o n i n s o u r c e i n a w a y t h a t p r e v e n t i t s i n a c t i v a t i o n i s r e q u i r e d a s u n p r o t e c t e d s a p o n i n i s i n a c t i v a t e d i n t h e a c i d i c p o r t i o n o f t h e d i g e s t i v e t r a c t . A n o t h e r a s p e c t o f s o m e e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n r e l a t e s t o a n a d d i t i o n a l c o a t i n g 10 t h a t p r o t e c t s s a p o n i n f r o m i n a c t i v a t i o n i n t h e r u m e n . I t w i l l b e a p p r e c i a t e d t h a t t h e v a r i o u s a s p e c t s d e s c r i b e d a b o v e r e l a t e t o s o l u t i o n o f t e c h n i c a l p r o b l e m s a s s o c i a t e d c o n t r o l l i n g u n w a n t e d i n s e c t m u l t i p l i c a t i o n i n a n a g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n f a c i l i t y . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i t w i l l b e a p p r e c i a t e d t h a t t h e v a r i o u s a s p e c t s d e s c r i b e d 15 a b o v e r e l a t e t o s o l u t i o n o f t e c h n i c a l p r o b l e m s r e l a t e d t o p r e v e n t i n g p e s t i c i d e r e s i d u e s f r o m a c c u m u l a t i n g i n l i v e s t o c k d e r i v e d f o o d p r o d u c t s s u c h a s m e a t a n d e g g s . I n s o m e e m b o d i m e n t s u s i n g s a p o n i n f r o m a n a t u r a l s o u r c e e l i m i n a t e s o r r e d u c e s t h e n e e d t o u s e s y n t h e t i c p e s t i c i d e s t o p r e v e n t t h e g r o w t h o f i n s e c t s i n t h e a g r i c u l t u r a l f a c i l i t y . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a f e e d a d d i t i v e 20 i n c l u d i n g : ( a ) a c o r e i n c l u d i n g a s a p o n i n s o u r c e a n d a d h e s i v e m a t e r i a l s ; a n d ( b ) a n e n t e r i c c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n a s t h e f e e d a d d i t i v e p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e f e e d a d d i t i v e i n c l u d e s a t l e a s t 2 % s a p o n i n b y w e i g h t . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s h y d r o x y p r o p y l m e t h y l c e l l u l o s e p h t h a l a t e ( H P - 5 5 ) . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n 25 s o m e e m b o d i m e n t s t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s s t e a r i c a c i d . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e s a p o n i n s o u r c e i n c l u d e s Y u c c a d e r i v e d m a t e r i a l . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e f e e d a d d i t i v e i n c l u d e s a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n i n a r u m e n . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s a f a t c o a t i n g ( e . g . 30 t r i s t e a r i n ) f a t c o a t i n g . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s a t l e a s t o n e r u m e n s t a b l e c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e c e l l u l o s e d e r i v a t i v e i s a n i t r o g e n - c o n t a i n i n g d e r i v a t i v e . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 3 - e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s z e i n , a h y d r o p h o b i c s u b s t a n c e , a n d a n i n o r g a n i c f i l l e r p r e s e n t i n a m o u n t s t h a t r e n d e r t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g s t a b l e i n t h e r u m e n . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a m e t h o d o f p r o d u c i n g a f e e d a d d i t i v e i n c l u d i n g : ( a ) p r e p a r i n g a c o r e i n c l u d i n g a s a p o n i n s o u r c e a n d 5 a d h e s i v e m a t e r i a l s ; a n d ( b ) a p p l y i n g a n e n t e r i c c o a t i n g ( t o t h e c o r e ) t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n a s t h e s a p o n i n p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t ( o f t h e a n i m a l ) . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e p r e p a r i n g i n c l u d e s w e t g r a n u l a t i o n . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e p r e p a r i n g i n c l u d e s d r y g r a n u l a t i o n . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s H P - 5 5 ( h y d r o x y p r o p y l 10 m e t h y l c e l l u l o s e p h t h a l a t e ) . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s s t e a r i c a c i d . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e s a p o n i n s o u r c e i n c l u d e s Y u c c a d e r i v e d m a t e r i a l . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e m e t h o d i n c l u d e s a p p l y i n g a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n i n a r u m e n . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e 15 a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s a f a t c o a t i n g ( e . g . t r i s t e a r i n ) A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s a t l e a s t o n e r u m e n s t a b l e c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e i s a n i t r o g e n - c o n t a i n i n g d e r i v a t i v e . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s z e i n , a h y d r o p h o b i c s u b s t a n c e , a n d a n i n o r g a n i c f i l l e r p r e s e n t i n a m o u n t s t h a t r e n d e r t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g s t a b l e 20 i n t h e r u m e n . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a m e t h o d o f p r o d u c i n g a f e e d a d d i t i v e i n c l u d i n g : p r e p a r i n g a g r a n u l a t e i n c l u d i n g a s a p o n i n s o u r c e a n d a d h e s i v e m a t e r i a l s i n c l u d i n g o n e o r m o r e a l g i n a t e s . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e p r e p a r i n g i n c l u d e s w e t g r a n u l a t i o n . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e m e t h o d 25 i n c l u d e s a p p l y i n g a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n i n a r u m e n . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s a f a t c o a t i n g ( e . g . t r i s t e a r i n ) . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s a t l e a s t o n e r u m e n s t a b l e c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e c e l l u l o s e d e r i v a t i v e i s a n i t r o g e n - c o n t a i n i n g d e r i v a t i v e . A l t e r n a t i v e l y 30 o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g c o m p r i s e s z e i n , a h y d r o p h o b i c s u b s t a n c e , a n d a n i n o r g a n i c f i l l e r p r e s e n t i n a m o u n t s t h a t r e n d e r t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g s t a b l e i n t h e r u m e n . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 4 - I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a n i n s e c t c o n t r o l m e t h o d i n c l u d i n g : f e e d i n g l i v e s t o c k f e e d c o n t a i n i n g > 1 0 0 P P M e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n ; w h e r e i n t h e e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n a r e p r o t e c t e d f r o m i n a c t i v a t i o n a s t h e s a p o n i n p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a l i v e s t o c k f e e d 5 i n c l u d i n g c o n v e n t i o n a l f e e d i n g r e d i e n t s a n d > 1 0 0 P P M e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n ; w h e r e i n t h e e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n a r e p r o t e c t e d f r o m i n a c t i v a t i o n a s t h e s a p o n i n p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d p o u l t r y m a n u r e i n c l u d i n g c o n v e n t i o n a l m a n u r e c o m p o n e n t s ; a n d > 1 0 0 P P M s a p o n i n . 10 U n l e s s o t h e r w i s e d e f i n e d , a l l t e c h n i c a l a n d s c i e n t i f i c t e r m s u s e d h e r e i n h a v e t h e s a m e m e a n i n g a s c o m m o n l y u n d e r s t o o d b y o n e o f o r d i n a r y s k i l l i n t h e a r t t o w h i c h t h i s i n v e n t i o n b e l o n g s . A l t h o u g h s u i t a b l e m e t h o d s a n d m a t e r i a l s a r e d e s c r i b e d b e l o w , m e t h o d s a n d m a t e r i a l s s i m i l a r o r e q u i v a l e n t t o t h o s e d e s c r i b e d h e r e i n c a n b e u s e d i n t h e p r a c t i c e o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n . I n c a s e o f c o n f l i c t , t h e p a t e n t s p e c i f i c a t i o n , i n c l u d i n g d e f i n i t i o n s , w i l l c o n t r o l . A l l 15 m a t e r i a l s , m e t h o d s , a n d e x a m p l e s a r e i l l u s t r a t i v e o n l y a n d a r e n o t i n t e n d e d t o b e l i m i t i n g . A s u s e d h e r e i n , t h e t e r m s " c o m p r i s i n g " a n d " i n c l u d i n g " o r g r a m m a t i c a l v a r i a n t s t h e r e o f a r e t o b e t a k e n a s s p e c i f y i n g i n c l u s i o n o f t h e s t a t e d f e a t u r e s , i n t e g e r s , a c t i o n s o r c o m p o n e n t s w i t h o u t p r e c l u d i n g t h e a d d i t i o n o f o n e o r m o r e a d d i t i o n a l f e a t u r e s , i n t e g e r s , a c t i o n s , c o m p o n e n t s o r g r o u p s t h e r e o f . T h i s t e r m i s b r o a d e r t h a n , a n d i n c l u d e s t h e t e r m s " c o n s i s t i n g 20 o f " a n d " c o n s i s t i n g e s s e n t i a l l y o f " a s d e f i n e d b y t h e M a n u a l o f P a t e n t E x a m i n a t i o n P r o c e d u r e o f t h e U n i t e d S t a t e s P a t e n t a n d T r a d e m a r k O f f i c e . T h u s , a n y r e c i t a t i o n t h a t a n e m b o d i m e n t " i n c l u d e s " o r " c o m p r i s e s " a f e a t u r e i s a s p e c i f i c s t a t e m e n t t h a t s u b e m b o d i m e n t s " c o n s i s t e s s e n t i a l l y o f " a n d / o r " c o n s i s t o f " t h e r e c i t e d f e a t u r e . T h e p h r a s e " c o n s i s t i n g e s s e n t i a l l y o f " o r g r a m m a t i c a l v a r i a n t s t h e r e o f w h e n u s e d 25 h e r e i n a r e t o b e t a k e n a s s p e c i f y i n g t h e s t a t e d f e a t u r e s , i n t e g e r s , s t e p s o r c o m p o n e n t s b u t d o n o t p r e c l u d e t h e a d d i t i o n o f o n e o r m o r e a d d i t i o n a l f e a t u r e s , i n t e g e r s , s t e p s , c o m p o n e n t s o r g r o u p s t h e r e o f b u t o n l y i f t h e a d d i t i o n a l f e a t u r e s , i n t e g e r s , s t e p s , c o m p o n e n t s o r g r o u p s t h e r e o f d o n o t m a t e r i a l l y a l t e r t h e b a s i c a n d n o v e l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c l a i m e d c o m p o s i t i o n , d e v i c e o r m e t h o d . 30 T h e p h r a s e " a d a p t e d t o " a s u s e d i n t h i s s p e c i f i c a t i o n a n d t h e a c c o m p a n y i n g c l a i m s i m p o s e s a d d i t i o n a l s t r u c t u r a l l i m i t a t i o n s o n a p r e v i o u s l y r e c i t e d c o m p o n e n t . T h e t e r m " m e t h o d " r e f e r s t o m a n n e r s , m e a n s , t e c h n i q u e s a n d p r o c e d u r e s f o r a c c o m p l i s h i n g a g i v e n t a s k i n c l u d i n g , b u t n o t l i m i t e d t o , t h o s e m a n n e r s , m e a n s , t e c h n i q u e s a n d 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 5 - p r o c e d u r e s e i t h e r k n o w n t o , o r r e a d i l y d e v e l o p e d f r o m k n o w n m a n n e r s , m e a n s , t e c h n i q u e s a n d p r o c e d u r e s b y p r a c t i t i o n e r s o f a r c h i t e c t u r e a n d / o r c o m p u t e r s c i e n c e . F o r p u r p o s e s o f t h i s s p e c i f i c a t i o n a n d t h e a c c o m p a n y i n g c l a i m s , t h e t e r m s " e n c a p s u l a t e d " , " p r o t e c t e d " a n d " e n t e r i c c o a t e d " a r e u s e d i n t e r c h a n g e a b l y . I t i s n o t e d t h a t a l t h o u g h t h e s e t e r m s a r e c o m m o n i n t h e n u t r i t i o n a l l i t e r a t u r e t h e i r m e a n i n g v a r i e s w i d e l y . I n 5 t h i s a p p l i c a t i o n i t i s d e m o n s t r a t e d e x p e r i m e n t a l l y t h a t > 1 5 0 P P M o f e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n f e e d p r o d u c e s l a r v i c i d a l e f f e c t s i m i l a r t o > 1 5 0 P P M o f s a p o n i n i n m a n u r e . T h u s t h e t e r m s " e n c a p s u l a t e d " , " p r o t e c t e d " a n d " e n t e r i c c o a t e d " s h o u l d b e i n t e r p r e t e d t o r e f l e c t t h a t f a c t . P e r c e n t a g e s ( % ) o f c h e m i c a l s a n d / o r i n g r e d i e n t s a r e W / W ( w e i g h t p e r w e i g h t ) u n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d . 10 D E T A I L E D D E S C R I P T I O N O F E M B O D I M E N T S E m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n r e l a t e t o l i v e s t o c k f e e d a d d i t i v e s , l i v e s t o c k f e e d s c o n t a i n i n g t h o s e a d d i t i v e s , a n d m e t h o d s o f m a k i n g a n d u s i n g t h e m . S p e c i f i c a l l y , s o m e e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n c a n b e u s e d t o d e p o s i t s a p o n i n i n w a s t e a c c u m u l a t i n g i n a l i v e s t o c k p r o d u c t i o n f a c i l i t y . T h e s a p o n i n h a s a l a r v a s t a t i c / l a r v i c i d a l 15 e f f e c t a n d h e l p s c o n t r o l t h e r a t e o f m u l t i p l i c a t i o n o f f l i e s a n d / o r o t h e r i n s e c t s i n t h e f a c i l i t y T h e p r i n c i p l e s a n d o p e r a t i o n o f a f e e d a d d i t i v e s a n d / o r f e e d s a n d t h e i r m e t h o d s o f p r o d u c t i o n a n d u s e a c c o r d i n g t o e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n m a y b e b e t t e r u n d e r s t o o d w i t h r e f e r e n c e t o e x p e r i m e n t a l E x a m p l e s p r e s e n t e d h e r e i n b e l o w . B e f o r e e x p l a i n i n g a t l e a s t o n e e m b o d i m e n t o f t h e i n v e n t i o n i n d e t a i l , i t i s t o b e 20 u n d e r s t o o d t h a t t h e i n v e n t i o n i s n o t l i m i t e d i n i t s a p p l i c a t i o n t o t h e d e t a i l s s e t f o r t h i n t h e f o l l o w i n g d e s c r i p t i o n o r e x e m p l i f i e d b y t h e E x a m p l e s . T h e i n v e n t i o n i s c a p a b l e o f o t h e r e m b o d i m e n t s o r o f b e i n g p r a c t i c e d o r c a r r i e d o u t i n v a r i o u s w a y s . A l s o , i t i s t o b e u n d e r s t o o d t h a t t h e p h r a s e o l o g y a n d t e r m i n o l o g y e m p l o y e d h e r e i n i s f o r t h e p u r p o s e o f d e s c r i p t i o n a n d d o e s n o t l i m i t t h e s c o p e o f t h e i n v e n t i o n w h i c h i s d e f i n e d s o l e l y b y t h e c l a i m s . 25 E x e m p l a r y F e e d A d d i t i v e I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a f e e d a d d i t i v e i n c l u d i n g a c o r e w h i c h c o n t a i n s a s a p o n i n s o u r c e a n d a d h e s i v e m a t e r i a l s a n d a n e n t e r i c c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n a s t h e f e e d a d d i t i v e p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . A c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e f e e d 30 a d d i t i v e i n c l u d e s a t l e a s t 2 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 3 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 4 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 5 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 6 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 7 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 8 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 9 % s a p o n i n b y w e i g h t , a t l e a s t 1 0 % s a p o n i n b y w e i g h t o r i n t e r m e d i a t e o r g r e a t e r p e r c e n t a g e s o f s a p o n i n . A l t e r n a t i v e l y o r 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 6 - a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s h y d r o x y p r o p y l m e t h y l c e l l u l o s e p h t h a l a t e ( H P - 5 5 ) . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s s t e a r i c a c i d . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , a c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s H y d r o x y p r o p y l m e t h y l c e l l u l o s e a c e t a t e s u c c i n a t e a n d / o r S o d i u m A l g i n a t e a n d / o r c a l c i u m A l g i n a t e a n d / o r Z e i n 5 a n d / o r S h e l l a c ( e s t e r s o f a l e u r t i c a c i d ) a n d / o r C e l l u l o s e a c e t a t e p h t h a l a t e ( C A P ) a n d / o r P o l y ( m e t h a c r y l i c a c i d - c o - m e t h y l m e t h a c r y l a t e ) a n d / o r C e l l u l o s e a c e t a t e t r i m e l l i t a t e ( C A T ) a n d / o r P o l y ( v i n y l a c e t a t e p h t h a l a t e ) ( P V A P ) . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , t h e s a p o n i n s o u r c e i n c l u d e s Y u c c a d e r i v e d m a t e r i a l . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , Y u c c a d e r i v e d m a t e r i s 10 e m p l o y e d a s a s a p o n i n s o u r c e b e c a u s e i t i s c o m m o n l y e m p l o y e d a s a n i n g r e d i e n t i n c o m m e r c i a l f e e d f o r m u l a t i o n s a n d / o r b e c a u s e i t i s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e i n a s t a b l e f o r m a n d / o r b e c a u s e i t c o n t a i n s a r e l a t i v e l y h i g h l e v e l o f s a p o n i n i n d r y p o w d e r f o r m ( t y p i c a l l y 8 % t o 1 2 % ) a n d / o r b e c a u s e i t s p r i c e m a k e s i t f e a s i b l e t o i n c l u d e i n t h e r e q u i r e d a m o u n t s . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , b e c a u s e Y u c c a p o w d e r i s r o u t i n e l y u s e d i n c o m m e r c i a l f e e d 15 p r e p a r a t i o n , t h e r e i s n o p r o b l e m w i t h t o x i c i t y a n d / o r r e g u l a t o r y a p p r o v a l . F e e d a d d i t i v e s d e s c r i b e d h e r e i n a b o v e i n t h i s s e c t i o n a r e s u i t a b l e f o r u s e i n m o n o g a s t r i c a n i m a l s , i n c l u d i n g b u t n o t l i m i t e d t o p o u l t r y . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n i n a r u m e n i s e m p l o y e d . T h e a d d i t i o n a l c o a t i n g 20 r e n d e r s t h e f e e d a d d i t i v e s u i t a b l e f o r u s e i n r u m i n a n t s s u c h a s c a t t l e ( d a i r y o r b e e f ) , s h e e p a n d g o a t s . E x e m p l a r y a d d i t i o n a l c o a t i n g s I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g i n c l u d e s a f a t ( e . g . t r i s t e a r i n ) . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e f a t i s f o r m u l a t e d w i t h c o l l o i d a l k a o l i n a n d / o r 25 l i q u i d u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d . A d d i t i o n a l c o a t i n g s o f t h i s t y p e a r e k n o w n t o i m p a r t p r o t e c t i o n t o a c o r e w h i c h t h e y c o a t i n t h e r u m e n ( W . C h a l u p a ( 1 9 7 5 ) J . D a i r y S c i . 5 8 ( 8 ) : 1 1 9 8 - 1 2 - 1 8 ) . T h e C h a l u p a a r t i c l e i s b o t h w e l l k n o w n t o t h o s e o f o r d i n a r y s k i l l i n t h e a r t a n d f u l l y i n c o r p o r a t e d h e r e i n b y r e f e r e n c e . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g i n c l u d e s a t 30 l e a s t o n e r u m e n s t a b l e c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e d e r i v a t i v e i s a n i t r o g e n c o n t a i n i n g d e r i v a t i v e . R u m e n s t a b l e n i t r o g e n - c o n t a i n i n g c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e s a n d t h e i r u s e i n f e e d a n d / o r f e e d a d d i t i v e f o r m u l a t i o n a r e d e s c r i b e d i n U S 3 5 6 2 8 0 6 w h i c h i s b o t h w e l l k n o w n t o t h o s e o f s k i l l i n t h e a r t a n d f u l l y i n c o r p o r a t e d h e r e i n b y r e f e r e n c e . B r i e f l y , r u m e n s t a b l e 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 7 - n i t r o g e n - c o n t a i n i n g c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e s a r e p r o d u c e d b y r e a c t i o n o f u n s a t u r a t e d d e r i v a t i v e o f c e l l u l o s e w i t h a n o r g a n i c b a s e c o n t a i n i n g a t l e a s t o n e H - N g r o u p i n i t s m o l e c u l e . A c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e u n s a t u r a t e d c e l l u l o s e d e r i v a t i v e s a r e s e l e c t e d f r o m t h e g r o u p c o n s i s t i n g o f u n s a t u r a t e d c e l l u l o s e e s t e r s , u n s a t u r a t e d c e l l u l o s e e t h e r s , a n d u n s a t u r a t e d c e l l u l o s i c m i x e d e t h e r - e s t e r s . 5 A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s a d d i t i o n a l c o a t i n g i n c l u d e s z e i n , a h y d r o p h o b i c s u b s t a n c e a n d a n i n o r g a n i c f i l l e r p r e s e n t i n a m o u n t s t h a t r e n d e r t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g s t a b l e i n t h e r u m e n . O p t i o n a l l y , t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g i n c l u d e s a n o n - w a t e r - s o l u b l e p o l y m e r i n a n a m o u n t t h a t a c o m b i n a t i o n o f t h e f o u r i n g r e d i e n t s i s s t a b l e i n t h e r u m e n . U S 5 0 9 8 7 1 8 , w h i c h i s b o t h w e l l k n o w n t o t h o s e o f s k i l l i n t h e a r t a n d f u l l y i n c o r p o r a t e d h e r e i n b y 10 r e f e r e n c e , d e s c r i b e s a d d i t i o n a l c o a t i n g s o f t h i s t y p e i n d e t a i l . E x e m p l a r y P r o d u c t i o n M e t h o d I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a m e t h o d o f p r o d u c i n g a f e e d a d d i t i v e . T h e m e t h o d i n c l u d e s p r e p a r i n g a c o r e i n c l u d i n g a s a p o n i n s o u r c e a n d a d h e s i v e m a t e r i a l s a n d a p p l y i n g a n e n t e r i c c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m 15 i n a c t i v a t i o n a s t h e s a p o n i n p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . A c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n p r e p a r i n g i n c l u d e s w e t g r a n u l a t i o n a n d / o r d r y g r a n u l a t i o n . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , t h e e n t e r i c c o a t i n g i n c l u d e s H P - 5 5 ( h y d r o x y p r o p y l m e t h y l c e l l u l o s e p h t h a l a t e ) . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s t h e e n t e r i c c o a t i n g c o m p r i s e s s t e a r i c a c i d . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i n s o m e e m b o d i m e n t s 20 t h e s a p o n i n s o u r c e i n c l u d e s Y u c c a d e r i v e d m a t e r i a l . I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , t h e m e t h o d i n c l u d e s a p p l y i n g a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n i n a r u m e n . A c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g i s a s d e s c r i b e d h e r e i n a b o v e u n d e r " E x e m p l a r y a d d i t i o n a l c o a t i n g s " . 25 A d d i t i o n a l E x e m p l a r y P r o d u c t i o n M e t h o d I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a m e t h o d o f p r o d u c i n g a f e e d a d d i t i v e i n c l u d i n g p r e p a r i n g a g r a n u l a t e i n c l u d i n g a s a p o n i n s o u r c e a n d a d h e s i v e m a t e r i a l s i n c l u d i n g o n e o r m o r e a l g i n a t e s . A c c o r d i n g t o t h e s e e m b o d i m e n t s t h e o n e 30 o r m o r e a l g i n a t e s p r o v i d e e n t e r i c p r o t e c t i o n t o t h e s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e . T h e e n t e r i c p r o t e c t i o n r e d u c e s o r e l i m i n a t e s i n a c t i v a t i o n o f t h e s a p o n i n a s i t p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . I n s o m e e m b o d i m e n t s t h e p r e p a r i n g i n c l u d e s w e t g r a n u l a t i o n . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 8 - I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n , t h e m e t h o d i n c l u d e s a p p l y i n g a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n i n t h e s a p o n i n s o u r c e f r o m i n a c t i v a t i o n i n a r u m e n . A c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e a d d i t i o n a l c o a t i n g i s a s d e s c r i b e d h e r e i n a b o v e u n d e r " E x e m p l a r y a d d i t i o n a l c o a t i n g s " . 5 E x e m p l a r y i n s e c t c o n t r o l m e t h o d I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a n i n s e c t c o n t r o l m e t h o d i n c l u d i n g f e e d i n g l i v e s t o c k f e e d c o n t a i n i n g > 1 0 0 P P M e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n . A c c o r d i n g t o v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f s a p o n i n i n t h e f e e d a d d i t i v e i s > 1 0 0 P P M , > 1 5 0 P P M , > 2 0 0 P P M , > 2 5 0 P P M , > 3 0 0 P P M , > 4 0 0 P P M , > 5 0 0 P P M , > 6 0 0 10 P P M o r i n t e r m e d i a t e o r h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s . A c c o r d i n g t o t h e m e t h o d , t h e e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n a r e p r o t e c t e d f r o m i n a c t i v a t i o n a s t h e s a p o n i n p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . A s d e m o n s t r a t e d i n e x p e r i m e n t a l e x a m p l e s h e r e i n b e l o w , s a p o n i n i n m a n u r e h a v e a d r a m a t i c l a r v i c i d a l e f f e c t s t a r t i n g a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 p p m o r 2 0 0 p p m i n m a n u r e . T h i s c o r r e s p o n d s t o a 1 0 0 p p m t o 2 0 0 p p m c o n c e n t r a t i o n o f 15 e n c a p s u l a t e d s a p o n i n i n t h e f e e d . W h i l e t h e e x p e r i m e n t a l e x a m p l e s w e r e p e r f o r m e d o n l a y i n g h e n s , i t i s e x p e c t e d t h a t s i m i l a r r e s u l t s c a n b e a c h i e v e d w i t h o t h e r t y p e s o f p o u l t r y i n c l u d i n g b u t n o t l i m i t e d t o b r o i l e r s , t u r k e y s , d u c k s a n d g e e s e . M e n t i o n l i v e s t o c k m a y b e p o u l t r y s u c h a s c h i c k e n s , t u r k e y s o r d u c k s . F u r t h e r , i t i s e x p e c t e d t h a t s i m i l a r r e s u l t s c a n b e a c h i e v e d w i t h o t h e r m o n o g a s t r i c a n i m a l s s u c h a s s w i n e , r a b b i t s , h o r s e s , d o g s o r r o d e n t s . 20 A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , b y a d d i n g a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s t h e s a p o n i n f r o m d e g r a d a t i o n i n a r u m e n , i t i s e x p e c t e d t h a t s i m i l a r r e s u l t s c a n b e a c h i e v e d w i t h r u m i n a n t s s u c h a s c a t t l e s h e e p a n d g o a t s . E x e m p l a r y l i v e s t o c k f e e d I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d a l i v e s t o c k f e e d 25 i n c l u d i n g : c o n v e n t i o n a l f e e d i n g r e d i e n t s a n d > 1 0 0 P P M e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n . A s d e s c r i b e d h e r e i n a b o v e a n d d e m o n s t r a t e d i n e x a m p l e s h e r e i n b e l o w , t h e e n t e r i c c o a t e d s a p o n i n a r e p r o t e c t e d f r o m i n a c t i v a t i o n a s t h e s a p o n i n p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t . I t i s e x p e c t e d t h a t d u r i n g t h e l i f e o f t h i s p a t e n t m a n y s a p o n i n s o u r c e s a n d / o r e n t e r i c c o a t i n g m a t e r i a l s w i l l b e d e v e l o p e d a n d t h e s c o p e o f t h e i n v e n t i o n i s i n c l u d e s a l l s u c h n e w 30 t e c h n o l o g i e s a p r i o r i . A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , i t i s e x p e c t e d t h a t d u r i n g t h e l i f e o f t h i s p a t e n t m a n y a d d i t i o n a l c o a t i n g t y p e s w i l l b e d e v e l o p e d a n d t h e s c o p e o f t h e i n v e n t i o n i s i n c l u d e s a l l s u c h n e w t e c h n o l o g i e s a p r i o r i . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 9 - E x e m p l a r y l a r v i c i d a l m a n u r e I n s o m e e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n t h e r e i s p r o v i d e d p o u l t r y m a n u r e i n c l u d i n g : c o n v e n t i o n a l m a n u r e c o m p o n e n t s a n d > 1 0 0 P P M s a p o n i n . 5 A s s a y i n g S a p o n i n C o n c e n t r a t i o n P e r c e n t a g e s o f s a p o n i n a r e a s s a y e d b y a s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y a s s e t f o r t h h e r e . T h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y g i v e s a t o t a l s a p o n i n c o n t e n t . T h i s m e t h o d i s r o b u s t a n d e a s y f o r q u a n t i f i c a t i o n o f s a p o n i n i n p l a n t e x t r a c t s a n d f e e d s . I t r e q u i r e s o n l y c o m m o n s o l v e n t s t o e x t r a c t t h e s a p o n i n s p l a n t m a t e r i a l s u c h a s y u c c a p o w d e r o r f r o m p r e m i x e s o r f e e d s . T h e 10 m e t h o d i s s e t f o r t h b r i e f l y a n d a d d i t i o n a l d e t a i l s a r e a v a i l a b l e i n J o u r n a l o f A O A C I n t e r n a t i o n a l , ( 2 0 0 0 ) V o l 8 3 ( 6 ) , 1 4 5 1 - 1 4 5 4 a n d i n J o u r n a l o f N a n o m e d i c i n e R e s e a r c h ( 2 0 1 9 ) V o l 8 ( 1 ) , 6 - 1 2 e a c h o f w h i c h i s w i d e l y k n o w n a n d e a c h o f w h i c h i s f u l l y i n c o r p o r a t e d h e r e i n b y r e f e r e n c e . I n i t i a l l y s a p o n i n i s e x t r a c t e d i n t o a w a t e r / e t h a n o l m i x t u r e . T h e e t h a n o l i s r e m o v e d b y e v a p o r a t i o n a n d s a p o n i n s a r e b a c k e x t r a c t e d f r o m t h e w a t e r p h a s e i n t o 3 a l i q u o t s o f n - 15 b u t a n o l . T h e c o m b i n e d n - b u t a n o l f r a c t i o n i s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s a t 9 0 ° C . T h e e x t r a c t i s t h e p u r i f i e d w i t h H P - 2 0 r e s i n a n d s a p o n i n f r a c t i o n i s e l u t e d b y 9 5 % m e t h a n o l s o l u t i o n . T h e m e t h a n o l e l u a t e c o n t a i n i n g s a p o n i n i s t h e n c o n c e n t r a t e d b y e v a p o r a t i o n o f m e t h a n o l a n d h y d r o l y z e d w i t h a m i x t u r e o f H C l 2 M / e t h a n o l ( 1 : 1 ) t o p r o d u c e t w o f r a c t i o n s : a s a p o g e n i n ( s t e r o i d ) a n d a s u g a r m o i e t y . 20 T h e s a p o g e n i n i s e x t r a c t e d w i t h d i e t h y l e t h e r a n d d e h y d r a t e d w i t h s o d i u m s u l f a t e . T h e e t h e r i s e v a p o r a t e d a n d t h e r e m a i n i n g r e s i d u e i s d i s s o l v e d i n e t h y l a c e t a t e f o r s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y . P - a n i s a l d e h y d e a n d s u l f u r i c a c i d a r e u s e d a s r e a g e n t f o r c o l o r d e v e l o p m e n t . S a p o g e n i n e x t r a c t , s t a n d a r d ( S a r a s a p o g e n i n f r o m S i g m a - A l d r i c h ) a n d b l a n k ( E t h y l a c e t a t e ) a r e 25 s i m u l t a n e o u s l y i n c u b a t e d a t 6 0 ° C i n a s h a k i n g w a t e r b a t h w i t h t h e c o l o r d e v e l o p m e n t r e a g e n t s . A f t e r c o o l i n g , a b s o r b a n c e i s m e a s u r e d a t 4 3 0 n m a n d t h e t o t a l s a p o n i n c o n t e n t i s t h e n e x p r e s s e d i n m g o f s t a n d a r d e q u i v a l e n t s p e r g r a m o f s a m p l e . I t i s b e l i e v e d t h a t t h e l o w e s t d e t e c t a b l e l e v e l o f s a p o n i n w i t h t h i s a s s a y i s 1 P P M . D i r e c t a s s a y s o f s a p o n i n i n d r i e d g r o u n d m a n u r e a r e b e l i e v e d t o b e p o s s i b l e b u t h a v e 30 n o t y e t b e e n p e r f o r m e d . E x e m p l a r y t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n o f d e g r e e o f s a p o n i n p r o t e c t i o n 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 10 - U s i n g t h e % o f f e e d d i g e s t i b i l i t y i n l a y e r s ( w h i c h i s a k n o w n q u a n t i t y ) i t i s p o s s i b l e t o e s t i m a t e t h e a m o u n t o f e x c r e m e n t p e r u n i t f e e d c o n s u m e d . I f t h e a m o u n t o f S a p o n i n i n t h e f e e d i s k n o w n , t h e a m o u n t o f s a p o n i n i n m a n u r e c a n b e c a l c u l a t e d . T h e c a l c u l a t i o n f o r a 1 0 0 p p m d o s e o f s a p o n i n i n f e e d i s a s f o l l o w s : A l a y i n g h e n c o n s u m e s a p p r o x i m a t e l y 1 2 0 g r o f f e e d p e r d a y c o n t a i n i n g 0 . 0 1 2 g r 5 s a p o n i n ( 1 0 0 p p m ) . T h e f e e d c o n t a i n s a b o u t 1 0 % m o i s t u r e . R o u g h l y 4 0 % o f t h e d r y m a t t e r i n f e e d i s e x c r e t e d m e a n i n g a b o u t 4 3 g r a m o f d r y m a t t e r e x c r e t e d . T h e m a n u r e c o n t a i n s r o u g h l y 6 5 % m o i s t u r e . T h i s m e a n s 4 3 g r a m o f d r y m a t t e r f r o m f e e d i s a b o u t 3 5 % o f t h e w e t m a n u r e . T h e a m o u n t o f m a n u r e t h a t 1 b i r d e x c r e t e d p e r d a y i s a b o u t 1 2 3 g r o f w e t m a t e r i a l ( d r y m a t t e r + m o i s t u r e ) . A s s u m i n g t h a t t h e e x c r e t a c o n t a i n s a l l t h e s a p o n i n o r i g i n a l l y p r e s e n t i n t h e f e e d 10 t h a t t h e h e n c o n s u m e d , 0 . 0 1 2 g r , i t m e a n s t h e e x c r e t a c o n t a i n s 0 . 0 1 % s a p o n i n o r 1 0 0 m g / k g o f w e t m a n u r e . T h i s c o r r e s p o n d s t o 1 0 0 P P M o n a w e t b a s i s o r a b o u t 2 8 5 p p m o n a d r y m a t t e r b a s i s . T h i s c a l c u l a t i o n w a s b a s e d o n c o n j e c t u r e a s i t i s u n k n o w n h o w m u c h o f t h e e n c a p s u l a t e d s a p o n i n g r a n u l e s s t a y i n t a c t a f t e r t h e p a s s a g e t h r o u g h t h e d i g e s t i v e s y s t e m . 15 R e s u l t s p r e s e n t e d i n e x a m p l e s 6 t h r o u g h 1 0 s h o w t h a t t h i s c o n j e c t u r e w a s c o r r e c t . A l t h o u g h t h e i n v e n t i o n h a s b e e n d e s c r i b e d i n c o n j u n c t i o n w i t h s p e c i f i c e m b o d i m e n t s t h e r e o f , i t i s e v i d e n t t h a t m a n y a l t e r n a t i v e s , m o d i f i c a t i o n s a n d v a r i a t i o n s w i l l b e a p p a r e n t t o t h o s e s k i l l e d i n t h e a r t . A c c o r d i n g l y , i t i s i n t e n d e d t o e m b r a c e a l l s u c h a l t e r n a t i v e s , m o d i f i c a t i o n s a n d v a r i a t i o n s t h a t f a l l w i t h i n t h e s p i r i t a n d b r o a d s c o p e o f t h e a p p e n d e d c l a i m s . 20 S p e c i f i c a l l y , a v a r i e t y o f n u m e r i c a l i n d i c a t o r s h a v e b e e n u t i l i z e d . I t s h o u l d b e u n d e r s t o o d t h a t t h e s e n u m e r i c a l i n d i c a t o r s c o u l d v a r y e v e n f u r t h e r b a s e d u p o n a v a r i e t y o f e n g i n e e r i n g p r i n c i p l e s , m a t e r i a l s , i n t e n d e d u s e a n d d e s i g n s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e v a r i o u s e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n . A d d i t i o n a l l y , c o m p o n e n t s a n d / o r a c t i o n s a s c r i b e d t o e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n a n d d e p i c t e d a s a s i n g l e u n i t m a y b e d i v i d e d i n t o s u b u n i t s . 25 C o n v e r s e l y , c o m p o n e n t s a n d / o r a c t i o n s a s c r i b e d t o e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n a n d d e p i c t e d a s s u b - u n i t s / i n d i v i d u a l a c t i o n s m a y b e c o m b i n e d i n t o a s i n g l e u n i t / a c t i o n w i t h t h e d e s c r i b e d / d e p i c t e d f u n c t i o n . A l t e r n a t i v e l y , o r a d d i t i o n a l l y , f e a t u r e s u s e d t o d e s c r i b e a m e t h o d c a n b e u s e d t o c h a r a c t e r i z e a n a p p a r a t u s a n d f e a t u r e s u s e d t o d e s c r i b e a n a p p a r a t u s c a n b e u s e d t o 30 c h a r a c t e r i z e a m e t h o d . I t s h o u l d b e f u r t h e r u n d e r s t o o d t h a t t h e i n d i v i d u a l f e a t u r e s d e s c r i b e d h e r e i n a b o v e c a n b e c o m b i n e d i n a l l p o s s i b l e c o m b i n a t i o n s a n d s u b - c o m b i n a t i o n s t o p r o d u c e a d d i t i o n a l 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 11 - e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n . T h e e x a m p l e s g i v e n a b o v e a r e e x e m p l a r y i n n a t u r e a n d a r e n o t i n t e n d e d t o l i m i t t h e s c o p e o f t h e i n v e n t i o n w h i c h i s d e f i n e d s o l e l y b y t h e f o l l o w i n g c l a i m s . E a c h r e c i t a t i o n o f a n e m b o d i m e n t o f t h e i n v e n t i o n t h a t i n c l u d e s a s p e c i f i c f e a t u r e , p a r t , c o m p o n e n t , m o d u l e o r p r o c e s s i s a n e x p l i c i t s t a t e m e n t t h a t a d d i t i o n a l e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n n o t i n c l u d i n g t h e r e c i t e d f e a t u r e , p a r t , c o m p o n e n t , m o d u l e o r p r o c e s s e x i s t . 5 A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , v a r i o u s e x e m p l a r y e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n e x c l u d e a n y s p e c i f i c f e a t u r e , p a r t , c o m p o n e n t , m o d u l e , p r o c e s s o r e l e m e n t w h i c h i s n o t s p e c i f i c a l l y d i s c l o s e d h e r e i n . S p e c i f i c a l l y , t h e i n v e n t i o n h a s b e e n d e s c r i b e d i n t h e c o n t e x t o f p o u l t r y b u t m i g h t a l s o b e u s e d i n t h e c o n t e x t o f o t h e r m o n o g a s t r i c a n i m a l s s u c h a s s w i n e , r a b b i t s , d o g s a n d h o r s e s . 10 A l t e r n a t i v e l y o r a d d i t i o n a l l y , b y a d d i n g a n a d d i t i o n a l c o a t i n g t h a t p r o t e c t s s a p o n i n f r o m i n a c t i v a t i o n i n a r u m e n , i t i s b e l i e v e d t h e i n v e n t i o n c a n b e i m p l e m e n t e d i n r u m i n a n t s s u c h a s c a t t l e , s h e e p a n d g o a t s . A l l p u b l i c a t i o n s , r e f e r e n c e s , p a t e n t s a n d p a t e n t a p p l i c a t i o n s m e n t i o n e d i n t h i s s p e c i f i c a t i o n a r e h e r e i n i n c o r p o r a t e d i n t h e i r e n t i r e t y b y r e f e r e n c e i n t o t h e s p e c i f i c a t i o n , t o 15 t h e s a m e e x t e n t a s i f e a c h i n d i v i d u a l p u b l i c a t i o n , p a t e n t o r p a t e n t a p p l i c a t i o n w a s s p e c i f i c a l l y a n d i n d i v i d u a l l y i n d i c a t e d t o b e i n c o r p o r a t e d h e r e i n b y r e f e r e n c e . I n a d d i t i o n , c i t a t i o n o r i d e n t i f i c a t i o n o f a n y r e f e r e n c e i n t h i s a p p l i c a t i o n s h a l l n o t b e c o n s t r u e d a s a n a d m i s s i o n t h a t s u c h r e f e r e n c e i s a v a i l a b l e a s p r i o r a r t t o t h e p r e s e n t i n v e n t i o n . T h e t e r m s " i n c l u d e " , a n d " h a v e " a n d t h e i r c o n j u g a t e s a s u s e d h e r e i n m e a n " i n c l u d i n g 20 b u t n o t n e c e s s a r i l y l i m i t e d t o " . A d d i t i o n a l o b j e c t s , a d v a n t a g e s , a n d n o v e l f e a t u r e s o f v a r i o u s e m b o d i m e n t s o f t h e i n v e n t i o n w i l l b e c o m e a p p a r e n t t o o n e o r d i n a r i l y s k i l l e d i n t h e a r t u p o n e x a m i n a t i o n o f t h e f o l l o w i n g e x a m p l e s , w h i c h a r e n o t i n t e n d e d t o b e l i m i t i n g . A d d i t i o n a l l y , e a c h o f t h e v a r i o u s e m b o d i m e n t s a n d a s p e c t s o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n a s d e l i n e a t e d h e r e i n a b o v e a n d a s c l a i m e d 25 i n t h e c l a i m s s e c t i o n b e l o w f i n d s e x p e r i m e n t a l s u p p o r t i n t h e f o l l o w i n g e x a m p l e s . E X A M P L E S R e f e r e n c e i s n o w m a d e t o t h e f o l l o w i n g e x a m p l e s , w h i c h t o g e t h e r w i t h t h e a b o v e d e s c r i p t i o n , i l l u s t r a t e s t h e i n v e n t i o n i n a n o n - l i m i t i n g f a s h i o n . 30 E X A M P L E 1 : F i r s t w e t g r a n u l a t i o n p r o c e s s 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 12 - I n o r d e r t o p r o d u c e g r a n u l e s f o r u s e a s a f e e d a d d i t i v e , Y u c c a p o w d e r ( Y u c c a S c h i d i g e r a ) d r y p l a n t p o w d e r c o n t a i n i n g > 1 0 % s a p o n i n s ( A g r o i n , M e x i c o ) ) w a s m i x e d w i t h a d h e s i v e s m a t e r i a l s a s i n t a b l e 1 . T a b l e 1 : f i r s t w e t g r a n u l a t i o n f o r m u l a t i o n 5 B o i l i n g w a t e r w a s a d d e d a t 2 5 % o f t o t a l w e i g h t w h i l e m i x i n g . T h e s e m i d r y m a t e r i a l 10 w a s p a s s e d t h r o u g h a s c r e e n t o r e c e i v e p a r t i c l e s o f 5 0 0 - 1 4 0 0 m i c r o n s i n s i z e . A f t e r d r y i n g t o 1 0 % L O D t h e p a r t i c l e s w e r e r e a d y f o r c o a t i n g a t t h i s s t a g e . E X A M P L E 2 : A l g i n a t e w e t g r a n u l a t i o n p r o c e s s 15 I n o r d e r t o p r o d u c e g r a n u l e s f o r u s e a s a f e e d a d d i t i v e Y u c c a p o w d e r ( a s i n E x a m p l e 1 ) w a s m i x e d w i t h a d h e s i v e s m a t e r i a l s a s i n t a b l e 2 . T a b l e 2 : A l g i n a t e w e t g r a n u l a t i o n f o r m u l a t i o n 20 T a p w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e w a s a d d e d a t 2 5 % o f t o t a l w e i g h t w h i l e m i x i n g . T h e s e m i d r y m a t e r i a l w a s p a s s e d t h r o u g h a s c r e e n t o r e c e i v e p a r t i c l e s o f 5 0 0 - 1 4 0 0 m i c r o n s i n s i z e . A f t e r d r y i n g t o 1 0 % L O D t h e p a r t i c l e s a r e r e a d y f o r u s e . 25 E X A M P L E 3 : D r y g r a n u l a t i o n p r o c e s s I n o r d e r t o p r o d u c e g r a n u l e s f o r u s e a s a f e e d a d d i t i v e Y u c c a p o w d e r ( a s i n p r e v i o u s 30 e x a m p l e s ) w a s m i x e d w i t h a d h e s i v e s m a t e r i a l s a s i n t a b l e 3 . T a b l e 3 : d r y g r a n u l a t i o n f o r m u l a t i o n I n g r e d i e n t % ( W / W ) Y u c c a p o w d e r > 1 0 % s a p o n i n 5 0 C o r n s t a r c h 2 5 M a l t o d e x t r i n 2 5 C M C c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e 0 . 0 0 3 3 I n g r e d i e n t % ( W / W ) Y u c c a p o w d e r > 1 0 % s a p o n i n 5 0 - 7 5 S o d i u m a l g i n a t e ( A l g a i a , F r a n c e ) 5 0 - 2 5 I n g r e d i e n t % ( W / W ) Y u c c a p o w d e r > 1 0 % s a p o n i n 6 0 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 13 - A R o l l e r C o m p a c t o r w a s u s e d t o c o m p a c t t h e m i x o f Y u c c a p o w d e r a n d M C C . T h e 5 c o m p a c t e d m a t e r i a l w a s g r o u n d t h r u a s c r e e n o f 1 5 0 0 m i c r o n s t o g e t p a r t i c l e s o f 5 0 0 - 1 4 0 0 m i c r o n s . T h e p a r t i c l e s a r e r e a d y f o r c o a t i n g a t t h i s s t a g e . E X A M P L E 4 : H P e n t e r i c c o a t i n g 10 A f l u i d b e d c o a t e r ( F L P - 3 c o a t e r , C h a n g z h o u J i a f a , C h i n a ) w i t h a W u r s t e r i n s e r t w a s u s e d t o c o a t t h e g r a n u l e s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o a n y o f E x a m p l e s 1 o r 3 . O n e t o t w o k g o f t h e g r a n u l e s w e r e f l u i d i z e d i n t h e f l u i d b e d c o a t e r a t t h e b o t t o m s p r a y e d c o n f i g u r a t i o n w i t h a n o r g a n i c ( a c e t o n e – m e t h a n o l , 1 : 1 ) s o l u t i o n o f 9 . 1 % h y d r o x y p r o p y l m e t h y l c e l l u l o s e p h t h a l a t e ( H P - 5 5 ) ( L o t t e f i n e c h e m i c a l , S o u t h K o r e a ) t o a c h i e v e a 2 5 % c o a t i n g ( w / w ) . T h e f l u i d i z i n g a i r 15 w a s h e a t e d t o 7 0 0 C i n o r d e r t o e v a p o r a t e t h e o r g a n i c s o l v e n t s . E X A M P L E 5 : S t e a r i c a c i d E n t e r i c c o a t i n g A l t e r n a t i v e l y , c o a t i n g o f t h e g r a n u l e s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o a n y o f E x a m p l e s 1 o r 3 w a s a c c o m p l i s h e d b y s p r a y i n g a m e l t e d s t e a r i c a c i d o n t h e g r a n u l e s i n q u a n t i t y o f 5 0 % o f t o t a l 20 w e i g h t . A f l u i d b e d c o a t e r ( F L P - 3 c o a t e r , C h a n g z h o u J i a f a , C h i n a ) w i t h a W u r s t e r i n s e r t w a s u s e d t o c o a t t h e g r a n u l e s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o a n y o f E x a m p l e s 1 o r 3 . O n e t o t w o k g o f t h e g r a n u l e s w e r e f l u i d i z e d i n t h e f l u i d b e d c o a t e r a t t h e b o t t o m s p r a y e d c o n f i g u r a t i o n . T h e i n l e t t e m p e r a t u r e o f t h e f l u i d i z i n g a i r w a s 2 5 0 C a n d t h e s t e a r i c a c i d w a s m e l t e d a t 1 0 0 0 C . E X A M P L E 6 : 25 E f f e c t o f S a p o n i n a d d e d d i r e c t l y t o P o u l t r y W a s t e o n E g g s a n d L a r v a e o f H o u s e F l i e s I n o r d e r t o e v a l u a t e t h e a c t i v i t y a n d i n f l u e n c e o f s a p o n i n e x t r a c t f r o m Y u c c a p l a n t ( Y u c c a s c h i d i g e r a ) o n t h e v i t a l i t y a n d s u r v i v a l o f h o u s e f l i e s ’ e g g s a n d l a r v a e t h e a c t i v i t y o f d i f f e r e n t y u c c a ’ s s a p o n i n e x t r a c t s w a s c o m p a r e d . 30 T h e t e s t e d e x t r a c t s w e r e : - B u t a n o l e x t r a c t o f S a p o n i n f r o m y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . - W a t e r e x t r a c t o f S a p o n i n f r o m y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . T h e t e m p e r a t u r e o f t h e w a t e r w a s 4 0 ˚ a n d t h e s o l u t i o n s t a y e d i n s t i r r e r f o r 4 8 h o u r s . M i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( M C C ) 4 0 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 14 - - C o m m e r c i a l Y u c c a ’ s S a p o n i n e x t r a c t p o w d e r – S a r a s a p o n i n ( 3 0 % s a p o n i n s ) C o m m e r c i a l l a y i n g h e n e x c r e m e n t w a s c o l l e c t e d , f r o z e n , d r i e d a n d g r o u n d i n o r d e r t o e l i m i n a t e a n y e g g s / l a r v a e / p u p a e o f f l i e s / o t h e r i n s e c t s o r i g i n a t i n g f r o m t h e f a r m . T h e g r o u n d e x c r e m e n t w a s s p r e a d i n 8 2 d i s p o s a b l e c u p s , 1 0 c u p s r e p l i c a t e f o r A - G g r o u p a n d 6 c u p r e p l i c a t e s f o r t r e a t m e n t s H - I . 5 T h e c u p s w e r e f i l l e d w i t h 3 0 g r a m s o f w a s t e t h a t w a s m i x e d w i t h 7 0 m l o f w a t e r / e x t r a c t s o l u t i o n ( a c c o r d i n g t o t h e t r e a t m e n t g r o u p s b e l o w ) , s o t h e h u m i d i t y o f t h e w a s t e w i l l b e 7 0 % a s i n a t y p i c a l c o m m e r c i a l p o u l t r y f a r m . T h e c u p s w e r e m a r k e d w i t h t h e g r o u p l e t t e r s a n d r e p e a t n u m b e r . T r e a t m e n t g r o u p s : 10 ( A ) N e g a t i v e c o n t r o l ( g r o u n d e x c r e m e n t w i t h o u t a n y s a p o n i n s u p p l e m e n t ) ( B ) Y u c c a p o w d e r , s a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m ( 0 . 0 5 % ) i n f e e d : 0 . 5 g r y u c c a p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) i n 1 0 0 g r w e t w a s t e ( C ) W a t e r S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . S a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m : 7 . 1 4 2 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n 15 ( D ) W a t e r S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . S a p o n i n d o s e o f 3 5 0 p p m : 5 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n . ( E ) B u t a n o l S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . S a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m : 7 . 1 4 2 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n . ( F ) B u t a n o l S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . 20 S a p o n i n d o s e o f 3 5 0 p p m : 5 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n . ( G ) S a r s a p o n i n ( 3 0 % s a p o n i n s ) - c o m m e r c i a l Y u c c a ’ s S a p o n i n e x t r a c t p o w d e r . S a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m : 2 . 3 8 g r i n 1 0 0 0 m l w a t e r . ( H ) P o s i t i v e c o n t r o l - L A R V A D E X ( 0 . 5 % C y r o m a z i n e ) - d o s e e q u i v a l e n t t o 1 0 0 0 g r / t o n f e e d : 5 4 0 m g i n 1 0 0 0 m l w a t e r . 25 ( I ) B i o l o g y a c t i v i t y n e g a t i v e c o n t r o l – w a s t e w i t h o u t a n y l a r v i c i d e s u p p l e m e n t . N o f l y e g g s / l a r v a e s e e d e d i n t h e w a s t e . Y u c c a p o w d e r i s i n s o l u b l e i n w a t e r , t h e r e f o r e t h e y u c c a p o w d e r o f g r o u p B m i x e d w i t h t h e d r i e d w a s t e a n d n o t a s a s o l u t i o n . F o r h o m o g e n e i t y , t h e m i x i n g m a d e w i t h m e c h a n i c a l m i x e r f o r 5 m i n u t e s . 30 I n o r d e r t o e v a l u a t e t h e p e s t i c i d e e f f e c t o n l a r v a a n d e g g s , e a c h g r o u p h a d t w o t e s t s : 1 . F i v e c u p s ( r e p e a t s n u m b e r 1 - 5 ) o f e a c h g r o u p w e r e s e e d e d w i t h 5 0 e g g s o f h o u s e f l y 2 . F i v e c u p s ( r e p e a t s n u m b e r 6 - 1 0 ) o f e a c h g r o u p w e r e s e e d e d 2 4 h o u r s l a t e r w i t h 5 0 h o u s e f l y ’ s 1 S t s t a g e l a r v a e . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 15 - A f t e r a w e e k t h e e x c r e m e n t w a s w a s h e d a n d f i l t e r e d t h r o u g h a s i e v e . T h e l a r v a e a n d p u p a e w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e s i e v e a n d c o u n t e d . S t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n w a s d o n e w i t h J u m p 0 7 s o f t w a r e . A n a l y s i s o f v a r i a n c e d o n e u s i n g A n o v a t e s t a n d t h e c o m p a r i s o n o f m e a n s d o n e w i t h T u k e y - K r a m e r t e s t , s i g n i f i c a n c e l e v e l - α = 0 . 0 5 . 5 R e s u l t s : T a b l e 4 : T h e n u m b e r o f v i t a l l a r v a e a n d p u p a e ( t h e l a r v a e t h a t c o u n t e d a l l l o o k e d v i t a l a n d i n a s u i t a b l e s i z e f o r t h e i r a g e ) i n e a c h c u p - g r o u p r e p l i c a t e e g g s s e e d e d c u p s l a r v a e s e e d e d c u p T r e a t m e n t A v e r a g e v i t a l l a r v a e % s u r v i v a l A v e r a g e v i t a l l a r v a e % s u r v i v a l A v e r a g e S D A v e r a g e S D A 2 6 a 5 2 a 6 . 3 4 8 a 9 5 a 1 . 6 7 B 1 b 2 b 1 . 7 3 3 b 7 b 4 . 5 6 C 3 6 a 6 8 a 1 4 . 8 6 4 6 a 9 2 a 4 . 9 8 D 2 8 a 6 0 a 1 1 . 9 3 4 8 a 9 6 a 1 . 4 1 E 2 8 a 5 6 a 1 1 . 9 7 4 9 a 9 7 a 3 . 7 4 F 2 2 a 4 5 a 7 . 9 3 4 7 a 9 4 a 1 . 4 1 G 3 0 a 6 0 a 6 . 6 5 4 5 a 9 1 a 4 . 3 8 H 0 0 0 0 0 0 I 0 0 0 0 0 0 P v a l 0 . 0 0 0 2 < 0 . 0 0 0 1 < 0 . 0 0 0 1 < 0 . 0 0 0 1 R e s u l t s s u m m a r i z e d i n t a b l e 4 i n d i c a t e : 10 i n t h e l a r v a e s e e d s c u p s , t h e r e w a s a l m o s t n o l a r v a c i d a l e f f e c t t o t h e t r e a t m e n t s , b e s i d e t r e a t m e n t B ; a s e x p e c t e d , n o l i v e l a r v a e / p u p a w e r e s e e n i n t h e c u p s o f g r o u p H a n d I i n t h e e g g s s e e d s c u p s a n d i n t h e l a r v a e s e e d s c u p s ; a n d i n t h e c u p s o f g r o u p B , t h e Y u c c a p o w d e r t r e a t m e n t , t h e r e w e r e l o t s o f d e a d l a r v a e ( i n 15 d i f f e r e n t s t a g e s ) i n t h e l a r v a e a n d e g g s s e e d e d c u p s . T a b l e 5 : P u p a a n d l a r v a e ( v i t a l , u n d e v e l o p e d , d e a d ) i n e g g s s e e d e d c u p s % S u r v i v a l V i t a l p u p a e D e a d l a r v a e & p u p a e U n d e v e l o p e d l a r v a e V i t a l l a r v a e T r e a t m e n t S D A v e r a g e 1 2 . 6 5 1 . 6 a 7 . 2 a b 0 b 2 1 8 . 6 a b A 3 . 5 2 b 0 . 8 b 5 . 8 a 9 . 2 0 . 2 b B 2 5 . 5 6 8 . 4 a 2 . 2 a b 0 b 0 3 2 a C 2 3 . 9 5 9 . 6 a 2 . 2 a b 0 . 6 b 0 . 4 2 6 . 2 a D 2 3 . 9 5 5 . 6 a 2 . 6 a b 0 b 1 . 2 2 5 . 2 a E 1 5 . 8 4 4 . 8 a 9 . 2 a 0 b 0 . 4 1 3 . 2 a b F 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 16 - R e s u l t s s u m m a r i z e d i n t a b l e 5 i n d i c a t e t r e a t m e n t g r o u p B , y u c c a p o w d e r w i t h 5 0 0 p p m s a p o n i n d o s e h a d a l m o s t n o l i v i n g l a r v a e a n d p u p a e a n d w a s t h e g r o u p w i t h h i g h e s t n u m b e r o f d e a d l a r v a e a n d p u p a e . T h i s w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t f r o m t h e r e s t o f t h e t r e a t m e n t g r o u p 5 b u t n o t f r o m t h e p o s i t i v e c o n t r o l w i t h L A R V A D E X . I t i s n o t c l e a r w h y i n t h e l a r v a e s e e d s c u p s t h e s u r v i v a l r a t e w a s h i g h e r t h a n t h a t o f t h e e g g s s e e d s c u p . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e a v e r a g e l a r v a e s u r v i v a l r a t e w a s 9 5 % a t t h e n e g a t i v e c o n t r o l l a r v a e s e e d e d c u p s , w h i l e i n t h e s e e d e d e g g s c u p s , a t t h a t g r o u p , t h e s u r v i v a l r a t e w a s 10 o n l y 5 2 % . O u t o f a l l t h e e x a m i n e d g r o u p s , g r o u p B , t h e Y u c c a p o w d e r w i t h a 5 0 0 - p p m d o s e , h a d t h e b e s t p e s t i c i d e e f f e c t w i t h s u r v i v a l r a t e o f 2 % - 7 % m e a n i n g 9 3 - 9 8 % m o r t a l i t y . T h i s r e s u l t w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . T h e B u t a n o l e x t r a c t a n d w a t e r e x t r a c t p r e p a r e d f r o m b i o p o w d e r h a d n o s i g n i f i c a n t 15 l a r v i c i d e e f f e c t . A m o n g t h e e x t r a c t s t r e a t m e n t , t r e a t m e n t F - B u t a n o l S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r a t a S a p o n i n d o s e o f 3 5 0 p p m , s h o w e d t h e m o s t l a r v i c i d e e f f e c t w i t h a m o r t a l i t y r a t e o f 5 5 % . R e s u l t s o f t h i s e x a m p l e d e m o n s t r a t e t h a t a l t h o u g h Y u c c a e x t r a c t s w e r e n o t e f f e c t i v e i n k i l l i n g l a r v a e . 20 I n s h a r p c o n t r a s t , Y u c c a p l a n t p o w d e r w i t h a n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n i n m a n u r e 5 0 0 p p m s a p o n i n h a s s i g n i f i c a n t l a r v i c i d a l a c t i v i t y t o t h e m a n u r e . T h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n i n m a n u r e i s p r e s u m e d t o b e l o w e r t h a n t h i s . T h i s s u g g e s t s t h a t i f S a p o n i n c o u l d b e i n c o r p o r a t e d i n t o f e e d i n w a y t h a t a l l o w s i t t o p a s s t h o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t w i t h o u t i n a c t i v a t i o n , i t c o u l d f u n c t i o n a s a l a r v a c i d e i n m a n u r e . 25 E X A M P L E 7 : A d d i t i o n a l e x p e r i m e n t E f f e c t o f S a p o n i n a d d e d d i r e c t l y t o P o u l t r y W a s t e o n E g g s a n d L a r v a e o f H o u s e F l i e s E x a m p l e 6 d e m o n s t r a t e d t h a t 5 0 0 p p m o f S a p o n i n f r o m Y u c c a p l a n t p o w d e r ( Y u c c a 30 S c h i d i g e r a ) , s h o w e d a l a r v a c i d a l a c t i v i t y o f a l m o s t 1 0 0 % o n l a r v a e ( s u r v i v a l r a t e w a s 2 % - 7 % ) . 1 3 . 3 5 9 . 6 a 0 . 8 b 0 b 0 2 9 a G 0 . 0 0 0 0 0 0 H 0 . 0 0 b 0 b 0 0 0 b I < 0 . 0 0 1 0 . 0 0 5 7 0 . 0 0 1 0 . 2 3 3 2 0 . 0 0 1 5 P v a l 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 17 - A n a d d i t i o n a l s t u d y w a s c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e t h e M i n i m a l I n h i b i t o r y C o n c e n t r a t i o n ( M I C ) o f S a p o n i n f r o m Y u c c a p l a n t p o w d e r f o r l a r v a e . I n a d d i t i o n , y u c c a s a p o n i n e x t r a c t w a s t e s t e d a g a i n . E x p e r i m e n t d e s i g n : E x c r e m e n t f r o m c o m m e r c i a l l a y i n g h e n s w a s c o l l e c t e d a n d f r o z e n , d r i e d a n d g r o u n d a s 5 i n t h e p r e v i o u s e x a m p l e . T h e d r i e d g r o u n d e x c r e m e n t w a s s p r e a d i n 6 0 d i s p o s a b l e c u p s , 6 c u p s r e p l i c a t e f o r A - I g r o u p t r e a t m e n t s a n d 3 c u p r e p l i c a t e s f o r t r e a t m e n t s J - K . T h e c u p s w e r e f i l l e d w i t h 3 0 g r a m s o f e x c r e m e n t t h a t w a s m i x e d w i t h 7 0 m l o f w a t e r / e x t r a c t s o l u t i o n ( a c c o r d i n g t o t h e t r e a t m e n t g r o u p s b e l o w ) , s o t h e h u m i d i t y o f t h e 10 e x c r e m e n t w i l l b e 7 0 % a s i n a t y p i c a l l a y i n g h o u s e . T h e c u p s w e r e m a r k e d w i t h t h e g r o u p l e t t e r s a n d r e p l i c a t e n u m b e r . S t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n w a s d o n e w i t h J u m p 0 7 s o f t w a r e . A n a l y s i s o f v a r i a n c e d o n e w i t h A n o v a t e s t a n d t h e c o m p a r i s o n o f m e a n s d o n e w i t h T u k e y - K r a m e r t e s t , s i g n i f i c a n c e l e v e l - α = 0 . 0 5 . 15 T r e a t m e n t g r o u p s : ( A ) N e g a t i v e c o n t r o l ( w a s t e w i t h o u t a n y l a r v a c i d s u p p l e m e n t ) ( B ) Y u c c a p o w d e r , s a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m ( 0 . 0 5 % ) i n f e e d : 0 . 5 g r y u c c a p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) i n 1 0 0 g r w e t w a s t e ( C ) Y u c c a p o w d e r , s a p o n i n d o s e o f 3 5 0 p p m ( 0 . 0 3 5 % ) i n f e e d : 0 . 3 5 g r y u c c a 20 p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) i n 1 0 0 g r w e t w a s t e ( D ) Y u c c a p o w d e r , s a p o n i n d o s e o f 2 0 0 p p m ( 0 . 0 2 % ) i n f e e d : 0 . 2 g r y u c c a p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) i n 1 0 0 g r w e t w a s t e ( E ) Y u c c a p o w d e r , s a p o n i n d o s e o f 1 5 0 p p m ( 0 . 0 1 5 % ) i n f e d : 0 . 1 5 g r y u c c a p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) i n 1 0 0 g r w e t w a s t e 25 ( F ) C o m m e r c i a l e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t ( * 8 - 1 2 % s a p o n i n c o m p l e x , B A J A Y U C C A C O M P A N Y ) . S a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m : 7 . 1 4 2 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n ( G ) B u t a n o l S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . S a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m : 7 . 1 4 2 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n . ( H ) W a t e r + E t h a n o l S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 30 1 0 % s a p o n i n s ) . S a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m : 7 . 1 4 2 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n . ( I ) W a t e r S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r ( B i o p o w d e r y u c c a 1 0 % s a p o n i n s ) . S a p o n i n d o s e o f 5 0 0 p p m : 7 . 1 4 2 g r y u c c a p o w d e r i n 1 0 0 0 m l s o l u t i o n . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 18 - ( J ) P o s i t i v e c o n t r o l - L a r v a d e x ( 0 . 5 % C y r o m a z i n e ) - d o s e e q u i v a l e n t t o 1 0 0 0 g r / t o n o f f e e d : 5 4 0 m g i n 1 0 0 0 m l w a t e r . ( k ) B i o l o g y a c t i v i t y n e g a t i v e c o n t r o l – w a s t e w i t h o u t a n y l a r v i c i d e s u p p l e m e n t . N o f l y e g g s / l a r v a e s e e d e d i n t h e w a s t e . Y u c c a p o w d e r i s i n s o l u b l e i n w a t e r ; t h e r e f o r e , t h e y u c c a p o w d e r o f g r o u p s B - E w a s 5 m i x e d w i t h t h e d r i e d w a s t e . F o r h o m o g e n e i t y , t h e m i x i n g m a d e w i t h m e c h a n i c m i x e r f o r 5 m i n u t e s . A l l d i s p o s a b l e c u p s w e r e s e e d e d w i t h 3 0 h o u s e f l y ’ s 1 S t s t a g e l a r v a e . A f t e r a w e e k t h e w a s t e w a s w a s h e d a n d f i l t e r e d t h r o u g h a s i e v e . T h e l a r v a e a n d p u p a e w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e s i e v e a n d c o u n t e d . 10 R e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 6 . T a b l e 6 : L a r v a e , p u p a e a n d s u r v i v a l p e r c e n t a g e b y t r e a t m e n t g r o u p % S u r v i v a l V i t a l p u p a e D e a d l a r v a e & p u p a e U n d e v e l o p e d l a r v a e V i t a l l a r v a e T r e a t m e n t S D A v e r a g e 3 7 . 9 8 9 . 2 a 1 0 . 2 0 b 2 1 0 . 2 a b A 0 . 0 0 b 0 0 b 0 . 4 0 c B 2 . 9 1 . 7 b 0 . 5 6 . 2 a b 0 . 5 0 c C 2 . 9 1 . 2 b 0 . 2 0 . 5 b 0 . 5 0 . 2 c D 9 . 0 4 . 8 b 0 . 3 9 a b 0 . 3 1 . 2 b c E 1 1 . 4 8 8 a 5 1 . 6 b 0 2 1 . 4 a F 2 1 . 9 7 8 . 3 a 3 . 3 3 b 0 2 0 . 2 a G 8 . 2 8 . 3 b 2 . 5 1 2 . 2 a 5 0 c H 4 . 0 2 . 2 ` b 0 . 7 1 2 . 2 a 5 . 3 0 c I 0 0 0 0 b 0 0 c J 0 0 b 0 0 b 0 0 c K < 0 . 0 0 1 0 . 0 7 8 5 < 0 . 0 0 1 0 . 0 0 9 8 < 0 . 0 0 1 P v a l A s s h o w n i n T a b l e 6 , t h e y u c c a p o w d e r w a s e f f e c t i v e i n a l l t e s t e d d o s e s ( 1 5 0 p p m - 5 0 0 p p m s a p o n i n ) , w i t h 0 % - 4 . 8 % s u r v i v a l r a t e . T h e s e r e s u l t s a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e 15 n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p , c o m m e r c i a l e x t r a c t g r o u p a n d t h e B u t a n o l e x t r a c t g r o u p . T a b l e 6 a l s o s h o w s t h a t t h e c o m m e r c i a l e x t r a c t w a s i n e f f e c t i v e w i t h a n a v e r a g e s u r v i v a l r a t e o f 8 8 % , n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e n e g a t i v e c o n t r o l a n d t h e B u t a n o l e x t r a c t . T a b l e 6 a l s o s h o w s t h a t B u t a n o l e x t r a c t w a s i n e f f e c t i v e w i t h , a s u r v i v a l r a t e o f 7 8 . 3 % , n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e n e g a t i v e c o n t r o l a n d t h e c o m m e r c i a l e x t r a c t . 20 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 19 - T a b l e 6 a l s o s h o w s t h a t t h e e x t r a c t w i t h w a t e r a n d t h e e x t r a c t w i t h w a t e r + e t h a n o l ( e a c h 5 0 0 P P M s a p o n i n ) w e r e b o t h e f f e c t i v e w i t h a s u r v i v a l r a t e o f 2 . 2 % a n d 8 . 3 % r e s p e c t i v e l y , s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e n e g a t i v e c o n t r o l , c o m m e r c i a l e x t r a c t g r o u p a n d t h e B u t a n o l e x t r a c t g r o u p . T h i s d o s e d e p e n d e n c e s t u d y s h o w s t h a t s a p o n i n f r o m Y u c c a p l a n t p o w d e r h a d a d i s t i n c t 5 l a r v i c i d a l a c t i v i t y e v e n a t t h e l o w e s t d o s e o f 1 5 0 p p m s a p o n i n i n m a n u r e . T h i s t r i a l , l i k e E x a m p l e 7 , s h o w e d t h a t Y u c c a e x t r a c t , w h e t h e r a c o m m e r c i a l o n e o r m a d e b y t h e i n v e s t i g a t o r ' s h a d n o l a r v i c i d a l e f f e c t e x c e p t f o r t h e w a t e r S a p o n i n e x t r a c t i o n o f y u c c a p l a n t p o w d e r a t a d o s e o f 5 0 0 p p m . R e s u l t s o f E x a m p l e s 6 a n d 7 s u g g e s t t h a t i f t h e f o r m u l a t i o n s o f e x a m p l e s 1 t o 6 c a n d e l i v e r 10 > 1 5 0 p p m o f S a p o n i n i n m a n u r e w h e n f e d t o b i r d s , t h e r e w i l l b e a l a r v i c i d a l e f f e c t . E X A M P L E 8 : E f f e c t o f P r o t e c t e d S a p o n i n i n F e e d o n E g g s a n d L a r v a e o f H o u s e F l i e s i n R e s u l t a n t W a s t e I n o r d e r t o p r o t e c t t h e s a p o n i n m o l e c u l e s a n d k e e p i t s a c t i v i t y t h r o u g h o u t t h e d i g e s t i v e 15 s y s t e m o f t h e l a y i n g h e n s i t n e e d s t o b e g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d . M o r e o v e r , t h e s a p o n i n n e e d t o s t a y s t a b l e i n t h e d i g e s t i v e t r a c t a n d t o b e r e l e a s e d a n d a c t i n t h e m a n u r e o f t h e b i r d s , w h e r e f l i e s l a y t h e i r e g g s . F o r t h i s r e a s o n a g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d Y u c c a p o w d e r p r o d u c t , p r e p a r a t i o n Y u c c a 1 3 4 ( p r e p a r e d a s i n E x a m p l e 4 a b o v e ) w a s e v a l u a t e d t o d e t e r m i n e i t s b i o l o g i c a l e f f i c a c y i n a 20 r e l e v a n t a g r i c u l t u r a l c o n t e x t . Y u c c a 1 3 4 i s a g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d Y u c c a p o w d e r , p a r t i c l e s i z e 5 0 0 - 1 4 0 0 m i c r o n c o n t a i n i n g 3 . 6 % S a p o n i n . F o r t h i s e x p e r i m e n t 1 2 L o h m a n l a y i n g h e n s , h o u s e d i n c o n v e n t i o n a l c a g e s , w e r e d i v i d e d i n t o 3 g r o u p s , f o u r l a y e r p e r g r o u p 2 h e n s i n a c a g e . T h e f e e d w a s b a s e d o n c r u s h e d p e l l e t e d l a y e r s f e e d ( 1 7 . 5 % p r o t e i n ) , w i t h n o a n t i b i o t i c 25 g r o w t h p r o m o t o r , m i x e d w i t h t h e t e s t e d m a t e r i a l , b y t h e g r o u p s d e s c r i b e d b e l o w . T h e l a y i n g h e n s w e r e f e d f o r t w o w e e k s w i t h f e e d s b y t h e t r e a t m e n t s d e s c r i b e d b e l o w a n d 5 0 0 g r a m s o f e x c r e m e n t w a s c o l l e c t e d f r o m e a c h t r e a t m e n t g r o u p . T h e c o l l e c t e d e x c r e m e n t w a s f r o z e n f o r 7 2 h o u r s i n o r d e r t o e l i m i n a t e a n y l a r v a e / e g g s t h a t o r i g i n a t e d f r o m t h e f a r m . 30 S o m e w a s t e f r o m g r o u p C w a s n o t f r o z e n , t o c o n t r o l f o r t h e p o s s i b i l i t y t h a t f r e e z i n g t h e Y u c c a w i l l a f f e c t i t s p o t e n c y . T r e a t m e n t g r o u p s : A . N e g a t i v e c o n t r o l ( f e e d w i t h o u t a n y L a r v a c i d a l s u p p l e m e n t ) 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 20 - B . P o s i t i v e c o n t r o l - f e e d c o n t a i n i n g L a r v a d e x ( 0 . 5 % C y r o m a z i n e ) - 1 k g / t o n C . Y u c c a 1 3 4 - S a p o n i n d o s e : 2 0 0 p p m ( 5 . 6 g r / k g p r e p a r a t i o n ) . E a c h g r o u p h a d 5 r e p l i c a t e s : 5 d i s p o s a b l e c u p s w e r e f i l l e d w i t h 8 0 g r a m s o f e x c r e m e n t . T h e c u p s w e r e m a r k e d w i t h t h e g r o u p l e t t e r s a n d r e p l i c a t e n u m b e r . A l l c u p s w e r e s e e d e d w i t h 3 0 1 S t s t a g e l a r v a e o f h o u s e f l y ( M u s c a D o m e s t i c a ) w h i c h i s t h e c o m m o n f l y a t l a y e r h o u s e s . 5 A f t e r a w e e k t h e e x c r e m e n t w a s f i l t e r e d t h r o u g h a s i e v e a n d t h e l a r v a e a n d p u p a e w e r e c o u n t e d f o r s u r v i v a l c a l c u l a t i o n . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 21 - T a b l e 7 : L a r v a e a n d P u p a e s u r v i v a l r a t e b y t r e a t m e n t g r o u p % s u r v i v a l N o o f d e a d l a r v a e / p u p a e N o o f l i v e p u p a e N o o f l i v e l a r v a e T r e a t m e n t g r o u p S D A v e r a g e 7 . 9 9 7 . 3 a 0 b 2 6 . 8 a 4 a A 0 . 0 0 b 0 b 0 b 0 b B 7 . 5 4 . 7 b 1 1 . 8 a 1 . 2 b 0 . 2 a b C 4 . 3 2 . 7 b 2 . 4 b 0 . 8 b 0 b C f r e s h w a s t e < 0 . 0 0 1 < 0 . 0 0 1 < 0 . 0 0 1 0 . 0 2 2 4 P v a l S t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n w a s d o n e w i t h J u m p 0 7 s o f t w a r e . A n a l y s i s o f v a r i a n c e d o n e w i t h A n o v a t e s t a n d t h e c o m p a r i s o n o f m e a n s d o n e w i t h T u k e y - K r a m e r t e s t , s i g n i f i c a n c e l e v e l - α = 0 . 0 5 . 5 R e s u l t s s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 i n d i c a t e t h a t Y u c c a 1 3 4 p r e p a r a t i o n ( 2 0 0 P P M p r o t e c t e d s a p o n i n / K g o f f e e d ) f e d t o l a y i n g h e n s h a s a l e t h a l e f f e c t f o r l a r v a e a n d p u p a e i t h e r i n t h e f r o z e n w a s t e o r i n t h e f r e s h w a s t e , w i t h s u r v i v a l r a t e o f 4 . 7 % a n d 2 . 7 % r e s p e c t i v e l y . T h e r e s u l t s a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t f r o m t h e n e g a t i v e c o n t r o l . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t g r a n u l a t i o n a n d e n c a p s u l a t i o n o f Y u c c a p o w d e r , i n Y u c c a 1 3 4 10 p r e p a r a t i o n , p r o t e c t e d t h e Y u c c a s a p o n i n f r o m i n a c t i v a t i o n i n t h e d i g e s t i v e s y s t e m o f t h e b i r d s . T h e s a p o n i n a p p e a r t o h a v e b e e n g r a d u a l l y r e l e a s e d i n t h e m a n u r e . T h e Y u c c a 1 3 4 p r e p a r a t i o n a p p e a r s e f f e c t i v e a s a f l y l a r v a c i d a l f e e d a d d i t i v e f o r l a y i n g h e n s a t 2 0 0 p p m s a p o n i n i n t h e f e e d . T h e f r e e z i n g o f t h e e x c r e m e n t d i d n o t d e c r e a s e t h e s a p o n i n p o t e n c y o f Y u c c a 1 3 4 . 15 E X A M P L E 9 : M i n i m a l I n h i b i t o r y C o n c e n t r a t i o n ( M I C ) f o r F l y L a r v a e i n v i v o o f g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d s a p o n i n s o u r c e I n o r d e r t o d e t e r m i n e a m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n f o r g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d s a p o n i n ( Y u c c a 1 3 4 ) i n f e e d a n e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d . I n a d d i t i o n , t h e e f f e c t 20 o f f r e s h e x c r e m e n t a s o p p o s e d t o f r o z e n e x c r e m e n t w a s e x a m i n e d . Y u c c a 1 3 4 ( a s d e s c r i b e d i n E x a m p l e 8 ) , w a s u s e d a s a S a p o n i n s o u r c e . 3 2 L o h m a n l a y i n g h e n s w e r e d i v i d e d i n t o 8 t r e a t m e n t g r o u p s , 4 l a y e r p e r g r o u p . T h e t e s t m a t e r i a l w a s m i x e d i n a c r u s h e d p e l l e t e d l a y e r f e e d ( 1 7 . 5 % p r o t e i n ) , w i t h n o a n t i b i o t i c g r o w t h p r o m o t o r . 25 T r e a t m e n t g r o u p s a r e l i s t e d i n T a b l e 8 . T a b l e 8 : t r e a t m e n t g r o u p s 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 22 - T r e a t m e n t g r o u p S a p o n i n i n f e e d ( P P M ) Y u c c a 1 3 4 i n f e e d ( g r / t o n ) ( A ) N e g a t i v e c o n t r o l N / A N / A ( B ) P o s i t i v e c o n t r o l - f e e d c o n t a i n i n g L a r v a d e x ( 0 . 5 % c y r o m a z i n e ) - 1 k g / t o n N / A N / A ( C ) 3 0 0 8 3 3 0 ( D ) 2 0 0 5 6 0 0 ( E ) 1 5 0 4 2 0 0 ( F ) 1 0 0 2 8 0 0 ( G ) 5 0 1 4 0 0 ( H ) Y u c c a 2 3 3 - 2 - 2 0 g r a n u l a t e d Y u c c a p o w d e r 2 0 0 N o t e n c a p s u l a t e d N A ( I ) B i o l o g y a c t i v i t y n e g a t i v e c o n t r o l N o f l y l a r v a e s e e d e d i n t h e f e c e s . 0 0 0 N A F o r o n e w e e k b e f o r e s t a r t i n g t h e t r i a l a n d w h i l e f e e d i n g t h e h e n s w i t h t h e t r i a l f e e d s ( A ) t h r o u g h ( I ) a s l i s t e d i n t a b l e 5 , l a y i n g p e r c e n t a n d t h e s i z e o f t h e e g g s ( g r ) w a s m o n i t o r e d t o e n s u r e t h a t t h e p r e p a r a t i o n i s n o t c a u s i n g a n y d a m a g e . H e n s w e r e 7 9 w e e k s o l d a t t h e b e g i n n i n g o f t h e t r i a l t h e a v e r a g e e g g s s i z e w a s 6 9 g r a n d t h e a v e r a g e l a y i n g p e r c e n t w a s 5 9 0 . 8 % . A f t e r t w o w e e k s o f f e e d i n g t h e h e n s t r i a l f e e d s ( A ) t h r o u g h ( I ) a s l i s t e d i n t a b l e 5 , e x c r e m e n t w a s c o l l e c t e d – 8 0 0 g r a m s f o r e a c h g r o u p . 4 0 0 g r a m s o f e x c r e m e n t w a s f r o z e n f o r 7 2 h o u r s i n o r d e r t o e l i m i n a t e a n y c o n t a i n e d l a r v a e / e g g s . 10 F o r e a c h g r o u p 4 d i s p o s a b l e c u p s w e r e f i l l e d w i t h 8 0 g r a m s o f w a s t e + 2 0 m l o f w a t e r i n o r d e r t o g e t t h e l a r v a e g r o w i n g s u b s t r a t e t o a 6 0 - 7 0 % m o i s t u r e . T h e c u p s w e r e m a r k e d w i t h t h e g r o u p l e t t e r s a n d r e p l i c a t e n u m b e r . F o r t h e Y u c c a t r e a t m e n t s C , D , E F a n d G , f o u r a d d i t i o n a l c u p s w e r e m a d e f o r e a c h g r o u p c o n t a i n i n g f r e s h e x c r e m e n t t h a t h a s n o t b e e n f r o z e n – i n o r d e r t o t e s t t h e e f f e c t i v e n e s s 15 o f t h e p r e p a r a t i o n i n a n a t u r a l , u n s t e r i l e g r o w t h s u b s t r a t e . A l l c u p s w e r e s e e d e d w i t h 3 0 1 S t s t a g e l a r v a e o f h o u s e f l y ( M u s c a D o m e s t i c a ) . A f t e r 1 0 d a y s o f i n c u b a t i o n , t h e w a s t e w a s f i l t e r e d t h r o u g h a s i e v e a n d t h e l a r v a e a n d p u p a e w e r e c o u n t e d f o r s u r v i v a l c a l c u l a t i o n . S t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n w a s d o n e w i t h J u m p 0 7 s o f t w a r e . A n a l y s i s o f v a r i a n c e d o n e u s i n g 20 A n o v a t e s t a n d t h e c o m p a r i s o n o f m e a n s d o n e w i t h T u k e y - K r a m e r t e s t , s i g n i f i c a n c e l e v e l - α = 0 . 0 5 . R e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 9 . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 23 - T a b l e 9 : e f f e c t o f s a p o n i n i n f r e s h a n d f r o z e n e x c r e m e n t o n f l y s u r v i v a l F r o z e n w a s t e F r e s h w a s t e % s u r v i v a l L i v e p u p a e D e a d l a r v a e & p u p a e L i v e l a r v a e % s u r v i v a l L i v e p u p a e D e a d l a r v a e & p u p a e L i v e l a r v a e T r e a t m e n t g r o u p S D A v e r a g e S D A v e r a g e 8 . 4 9 2 . 2 a 2 7 . 7 a 0 b 0 b 9 . 4 6 7 . 5 b 1 7 . 3 a 0 c 2 b A 0 . 0 0 c 0 d 0 b 0 0 . 0 0 d 0 c 0 c 0 b B 0 . 0 0 c 0 d 0 . 8 b 0 b 1 . 7 0 . 3 d 1 c 0 . 5 c 0 b C 0 . 0 0 c 0 d 3 b 0 b 0 . 0 0 d 0 c 0 . 5 c 0 b D 9 . 6 5 . 8 c 1 c d 1 0 . 5 a b 0 . 8 b 0 . 0 0 d 0 c 1 b c 0 b E 2 5 . 2 2 0 . 8 b c 5 . 5 c d 1 7 . 3 a 0 . 8 b 1 1 . 2 1 0 c d 2 c 1 2 . 8 a 1 b F 3 3 . 8 6 5 a b 1 1 . 8 b c 8 . 8 a b 7 . 7 5 a 2 3 . 9 5 3 . 3 b c 1 0 . 3 b 5 . 8 b 5 . 8 b G 3 0 . 2 5 6 . 7 a b 1 6 . 8 a b 7 a b 0 . 3 b 8 3 . 9 1 4 5 . 8 a 0 c 0 c 4 3 . 8 a H 0 . 0 0 c 0 d 0 b 0 b 0 . 0 0 d 0 c 0 c 0 b I < 0 . 0 0 1 < 0 . 0 0 1 0 . 0 0 2 3 0 . 0 1 1 3 < 0 . 0 0 1 < 0 . 0 0 1 < 0 . 0 0 1 0 . 0 0 3 8 P v a l R e s u l t s p r e s e n t e d i n T a b l e 6 i n d i c a t e t h a t g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d Y u c c a p o w d e r ( Y u c c a 1 3 4 ) i s l a r v i c i d a l a t 1 5 0 p p m d o s e o r h i g h e r ( G r o u p s E , D a n d C ) . R e s u l t s f o r t h e s e 5 g r o u p s a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p , t h e 5 0 p p m d o s e g r o u p ( G ) a n d t h e g r a n u l a t e d w i t h n o e n c a p s u l a t i o n g r o u p . T h i s i s t r u e i n b o t h f r o z e n a n d f r e s h e x c r e m e n t . T h e 1 0 0 p p m g r o u p ( F ) a l s o h a d a l a r v a c i d a l e f f e c t w i t h s u r v i v a l r a t e o f 2 0 . 8 % a n d 1 0 . 3 % r e s p e c t i v e l y . T h i s r e s u l t i s s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t h e n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p , b u t n o t f r o m 10 t h e 5 0 p p m d o s e g r o u p a n d t h e g r a n u l a t e d w i t h n o e n c a p s u l a t i o n g r o u p . A g a i n , r e s u l t s w e r e s i m i l a r f o r f r o z e n a n d f r e s h e x c r e m e n t . A t 5 0 p p m ( g r o u p ( G ) l a r v i c i d a l e f f e c t i v e n e s s w a s d e c r e a s e d a n d s u r v i v a l r a t e w a s 5 3 % - 6 5 % . T h e g r a n u l a t e d , n o t e n c a p s u l a t e d , Y u c c a p o w d e r s h o w e d 5 6 % s u r v i v a l i n t h e f r e s h w a s t e . 15 T h e s u r v i v a l r a t e i n t h e f r o z e n w a s t e w a s h i g h e r t h a n 1 0 0 % w h i c h i n d i c a t e a p o s s i b l e c o u n t i n g m i s t a k e w h e n s e e d i n g t h e e g g s . I n t h i s g r o u p t h e r e w e r e n o p u p a e . E v e n a t t h e h i g h e s t t e s t e d s a p o n i n c o n c e n t r a t i o n ( 3 0 0 P P M , G r o u p C ) t h e r e w a s n o n e g a t i v e e f f e c t a v e r a g e e g g s i z e o r l a y i n g p e r c e n t a g e . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 24 - T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e l o w e s t l a r v i c i d a l d o s e o f e n c a p s u l a t e d S a p o n i n i s 1 0 0 P P M i n f e e d w h i c h c o r r e s p o n d s t o 2 . 8 K g . o f Y u c c a 1 3 4 p e r t o n o f f e e d . T h i s a m o u n t a l l o w e d o n l y 1 5 % o f f l i e s t o s u r v i v e a n d a p p e a r s t o b e t h e M I C o f p r o t e c t e d s a p o n i n i n f e e d T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s o f e x a m p l e 8 w h i c h d e m o n s t r a t e d t h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f 2 0 0 P P M o f p r o t e c t e d s a p o n i n i n f e e d . 5 T h e e f f e c t o f s a p o n i n o n o t h e r i n s e c t s , s u c h a s b e e t l e s w a s n o t a s s a y e d a l t h o u g h t h e y w e r e o b s e r v e d i n t h e e x c r e m e n t w h i l e p r e p a r i n g t h e c u p s . E X A M P L E 1 0 : A d d i t i o n a l M i n i m a l I n h i b i t o r y C o n c e n t r a t i o n ( M I C ) s t u d y f o r F l y L a r v a e i n v i v o T h e p u r p o s e o f t h i s e x p e r i m e n t w a s t o e v a l u a t e t h e M I C f o r f l y l a r v a e o f t h e 10 g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d Y u c c a p o w d e r ( p r e p a r a t i o n Y u c c a 1 3 4 ) a f t e r e x p o s i n g t h e p r o t e c t e d s a p o i n i n t o c o n d i t i o n s t h a t m i m i c t h e c o n d i t i o n s o f c o m m e r c i a l f e e d p r o c e s s i n g . 3 6 L o h m a n l a y i n g h e n s w e r e d i v i d e d t o 9 g r o u p s , f o u r h e n s p e r g r o u p . C r u s h e d l a y e r s f e e d ( 1 7 . 5 % p r o t e i n ) w i t h n o a n t i b i o t i c g r o w t h p r o m o t o r w a s m i x e d w i t h t h e t e s t e d m a t e r i a l . F o r e a c h t r e a t m e n t g r o u p 1 8 k i l o g r a m s o f f e e d w a s m i x e d . 15 T r e a t m e n t ( I ) p u r p o s e w a s t o t e s t t h e b i o a c t i v i t y o f t h e p r e p a r a t i o n a f t e r e x p o s i n g i t t o h e a t a n d m o i s t u r e t h a t a r e s i m i l a r t o t h e c o n d i t i o n s o f f e e d p r o c e s s i n g . I n t r e a t m e n t I g r a n u l a t e d a n d e n c a p s u l a t e d Y u c c a p o w d e r ( Y u c c a 1 3 4 ) w a s m i x e d w i t h c o r n a n d w a s p e l l e t e d i n h i g h t e m p e r a t u r e ( 8 0 ˚ ) w i t h 1 2 % m o i s t u r e , c r u s h e d a n d m i x e d w i t h t h e l a y e r s f e e d . Y u c c a 1 3 4 a s d e s c r i b e d i n p r e v i o u s e x a m p l e s s e r v e d a s a s o u r c e o f e n c a p s u l a t e d 20 s a p o n i n . T r e a t m e n t g r o u p s a r e d e s c r i b e d i n T a b l e 7 . 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 25 - T a b l e 1 0 : t r e a t m e n t g r o u p s T r e a t m e n t g r o u p S a p o ni n i n f e e d ( P P M ) Y uc c a 134 i n f e e d ( g r / t o n) ( A ) N e g a t i v e c o nt r o l N / A N / A ( B ) P o s i t i v e c o nt r o l - f e e d c o nt a i ni ng L a r v a de x ( 0. 5% c y r o m a z i ne ) - 1 kg / t o n N / A N / A ( C ) 2 0 0 5 6 0 0 ( D ) 1 0 0 2 8 0 0 ( E ) 70 2000 ( F ) 5 0 1 4 0 0 ( G ) Y uc c a 132 - 6 - 19: g r a nul a t e d Y uc c a p o w de r , , 200 n o e n c ap s u l at i o n N / A ( H ) y u c c a p o w de r ( 10 % s a p o ni n) 200 n o e n c ap s u l at i o n N / A ( I ) y uc c a p o w de r g r a nu l a t e d , e nc a p s u l a t e d a nd p e l l e t e d ( 9 % y u c c a e nc a p s u l a t e d ) 100 3100 ( J ) B i o l o gy a c t i v i t y ne g a t i v e c o nt r o l – f e e d w i t ho ut a ny l a r v a c i d s u pp l e m e nt . N o f l y l a r v a e s e e de d i n t he l i t t e r . N / A N / A A f t e r t w o w e e k s o f f e e d i n g t h e h e n s , 5 0 0 g r a m s o f w a s t e w a s c o l l e c t e d f r o m e a c h t r e a t m e n t g r o u p . T h e w a s t e w a s f r o z e n f o r 7 2 h o u r s i n o r d e r t o e l i m i n a t e a n y c o n t a i n e d l a r v a e / e g g s f r o m t h e f a r m . 5 F o r e a c h g r o u p 5 d i s p o s a b l e c u p s w e r e f i l l e d w i t h 6 0 g r a m s o f w a s t e . S i n c e t h e l i t t e r w a s v e r y d r y 4 0 m l w a t e r a d d e d t o e a c h c u p , a n d a f t e r 4 d a y s a n a d d i t i o n a l 1 0 m l o f w a t e r w a s a d d e d . T h e c u p s w e r e m a r k e d w i t h t h e g r o u p l e t t e r s . A l l c u p s w e r e s e e d e d w i t h 3 0 1 S t s t a g e l a r v a e o f h o u s e f l y ( M u s c a d o m e s t i c a ) . A f t e r a w e e k t h e w a s t e w a s f i l t e r e d t h r o u g h a s i e v e a n d t h e l a r v a e a n d p u p a e w e r e 10 c o u n t e d f o r s u r v i v a l c a l c u l a t i o n . S t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n w a s d o n e w i t h J u m p 0 7 s o f t w a r e . A n a l y s i s o f v a r i a n c e d o n e w i t h A n o v a t e s t a n d t h e c o m p a r i s o n o f m e a n s d o n e w i t h T u k e y - K r a m e r t e s t , s i g n i f i c a n c e l e v e l - α = 0 . 0 5 . 15 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 26 - T a b l e 1 1 : L a r v a l s u r v i v a l r a t e b y t r e a t m e n t g r o u p % s u r v i v a l D e a d p u p a e L i v e p u p a e D e a d l a r v a e L i v e l a r v a e T r e a t m e n t g r o u p S D A v e r a g e 9 . 3 9 5 . 3 3 a 0 b 3 b c 0 b 2 5 . 6 a A 0 . 0 0 . 0 0 b 0 b 0 c 0 b 0 c B 5 . 6 4 . 6 7 b 2 . 2 a b 0 . 6 b c 3 . 4 a 0 . 8 c C 1 3 . 4 7 9 . 3 3 a 4 . 6 a 1 b c 0 . 2 b 2 2 . 8 a b D 1 5 . 4 8 1 . 3 3 a 3 . 8 a b 1 . 8 b c 0 . 2 b 2 2 . 6 a b E 1 5 . 7 8 2 . 0 0 a 2 . 6 a b 1 1 . 4 a 0 . 2 b 1 3 . 2 b F 7 . 1 9 3 . 3 3 a 0 b 4 . 8 b c 0 b 2 3 . 2 a b G 1 1 . 8 8 3 . 3 3 a 0 b 1 . 6 b c 0 . 6 b 2 3 . 4 a b H 1 7 . 6 8 4 . 6 7 a 1 a b 6 a b 0 . 2 b 1 9 . 4 a b I 0 . 0 0 0 0 0 0 J < 0 . 0 0 1 0 . 0 0 3 5 < 0 . 0 0 1 0 . 0 0 2 9 < 0 . 0 0 1 P v a l R e s u l t s s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 1 i n d i c a t e t h a t l e s s t h a n 2 0 0 p p m e n c a p s u l a t e d s a p o n i n i n f e e d w a s n o t l a r v a c i d i c . R e s u l t s f r o m G r o u p s D , E a n d F w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t h e n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p . 5 G r o u p C w i t h 2 0 0 p p m e n c a p s u l a t e d s a p o n i n w a s s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t h e r e s t o f t h e t r e a t m e n t g r o u p s w i t h s u r v i v a l r a t e o f o n l y 5 % . T h i s r e s u l t i s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h 0 . 5 % c y r o m a z i n e i n G r o u p B . T h e e n c a p s u l a t e d p e l l e t e d Y u c c a p o w d e r o f G r o u p I a l s o s h o w e d n o l a r v i c i d a l e f f e c t . A s e x p e c t e d , t h e n o n - e n c a p s u l a t e d p r e p a r a t i o n s o f g r o u p s G a n d H d i d n o t h a v e a l a r v i c i d a l e f f e c t 10 d e s p i t e a n o m i n a l s a p o n i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e f e e d o f 2 0 0 P P M . R e s u l t s s u m m a r i z e d i n T a b l e 8 c o n f i r m t h a t 2 0 0 p p m e n c a p s u l a t e d s a p o n i n i s l a r v i c i d a l f o r f l y l a r v a e . T h e s e r e s u l t s d o n o t c o n t r a d i c t t h e r e s u l t s o f E x a m p l e 9 w h i c h s u g g e s t e d t h a t t h e M I C o f s a p o n i n i s 1 0 0 P P M . R e s u l t s s u m m a r i z e d i n T a b l e 8 c o n f i r m t h e i m p o r t a n c e o f e n c a p s u l a t i o n i n v i v o . T h e 15 u n - e n c a p s u l a t e d y u c c a p r e p a r a t i o n s w e r e i n e f f e c t i v e , e v e n a t t h e s a m e n o m i n a l s a p o n i n c o n c e n t r a t i o n . T h e e n c a p s u l a t e d p e l l e t e d Y u c c a p o w d e r o f g r o u p ( I ) a l s o s h o w e d n o e f f e c t p r o b a b l y b e c a u s e t h e 1 0 0 p p m s a p o n i n c o n c e n t r a t i o n i s b e l o w t h e M I C d e t e r m i n e d i n t h i s e x p e r i m e n t . E x a m p l e s 8 t h r o u g h 1 0 s h o w t h a t a m o u n t s > 1 0 0 P P M o f p r o t e c t e d S a p o n i n i n f e e d 20 d e m o n s t r a t e a l a r v i c i d a l e f f e c t i n m a n u r e . E x a m p l e s 6 a n d 7 s h o w t h a t t h e e q u i v a l e n t o f > 1 5 0 4 0 6 3 1 / I L / 2 0 - 27 - P P M a s i f i n f e e d p l a c e d d i r e c t l y i n m a n u r e p r o d u c e d a l a r v i c i d a l e f f e c t ( a s s u m i n g 1 0 0 % p a s s e s t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t ) . E x a m p l e s 6 t h r o u g h 1 0 t o g e t h e r s u g g e s t t h a t i n c o r p o r a t i o n o f > 1 0 0 P P M o f p r o t e c t e d S a p o n i n i n f e e d l e a d s t o a p p e a r a n c e o f l a r v i c i d a l e f f e c t o f > 1 5 0 P P M ( s i m u l a t e d i n f e e d ) o f s a p o n i n i n m a n u r e . I t i s n o t c l e a r a t t h i s s t a g e w h e t h e r f e e d s a p o n i n t h a t a p p e a r s i n t h e m a n u r e i s p r o t e c t e d o r u n p r o t e c t e d . 5

Claims (21)

IL 276789/3- 28 -

1.CLAIMS: 1. A feed additive comprising:(a) a core including a saponin source and adhesive materials; and(b) an enteric coating that protects saponin in the saponin source from inactivation as the feedadditive passes through the digestive tract.

2. A feed additive according to claim 1 comprising at least 2% saponin by weight.

3. A feed additive according to claim 1 or claim 2, wherein said enteric coating compriseshydroxypropyl methylcellulose phthalate (HP-55).

4. A feed additive according to any one of claims 1 to 3, wherein said enteric coatingcomprises stearic acid.

5. A feed additive according to any one of claims 1 to 4, wherein said saponin sourcecomprises Yucca derived material.

6. A feed additive according to any one of claims 1 to 5, comprising;an additional coating that protects saponin in the saponin source from inactivation ina rumen.

7. A feed additive according to claim 6 wherein said additional coating comprises fat.

8. A feed additive according to claim 6, wherein said additional coating comprises atleast one rumen stable cellulosic derivative.

9. A feed additive according to claim 6, wherein said additional coating comprises zein,a hydrophobic substance, and an inorganic filler present in amounts that render the additionalcoating stable in the rumen.

10. A method of producing a feed additive comprising:(a) preparing a core including a saponin source and adhesive materials; and(b) applying an enteric coating to said core that protects saponin in the saponin source frominactivation as the saponin passes through the digestive tract . IL 276789/3- 29 -

11. A method according to claim 10, wherein said preparing comprises wet granulation.

12. A method according to claim 10 or claim 11, wherein said preparing comprises drygranulation.

13. A method according to any one of claims 10 to 12, wherein said enteric coatingcomprises HP-55 (hydroxypropyl methylcellulose phthalate).

14. A method according to any one of claims 10 to 12, wherein said enteric coatingcomprises stearic acid.

15. A method according to any one of claims 10 to 14, wherein said saponin sourcecomprises Yucca derived material.

16. A method according to any one of claims 10 to 15, comprising;applying an additional coating that protects saponin in the saponin source frominactivation in a rumen.

17. A method according to claim 16 wherein said additional coating comprises a fat.

18. A method according to claim 16, wherein said additional coating comprises at leastone rumen stable cellulosic derivative.

19. A method according to claim 16, wherein said additional coating comprises zein, ahydrophobic substance, and an inorganic filler present in amounts the render the additionalcoating stable in the rumen.

20. An insect control method comprising:feeding livestock feed containing >100 PPM enteric coated saponin; wherein said entericcoated saponin are protected from inactivation as the saponin passes through the digestivetract.

21. A livestock feed comprising: conventional feed ingredients; and IL 276789/3- 30 - >100 PPM enteric coated saponin;wherein said enteric coated saponin are protected from inactivation as the saponin passesthrough the digestive tract.