HUT78047A - Expansion of bone marrow stromal cells - Google Patents
Expansion of bone marrow stromal cells Download PDFInfo
- Publication number
- HUT78047A HUT78047A HU9900825A HU9900825A HUT78047A HU T78047 A HUT78047 A HU T78047A HU 9900825 A HU9900825 A HU 9900825A HU 9900825 A HU9900825 A HU 9900825A HU T78047 A HUT78047 A HU T78047A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- bone marrow
- cells
- medium
- stromal cells
- marrow stromal
- Prior art date
Links
Abstract
Description
CSONTVELŐ-STRÓMASEJTEK EXPANZIÓJAEXPANSION OF BONE STROOM CELLS
A találmány csontvelő-strómasejtek tenyésztésére vonatkozik.The present invention relates to the cultivation of bone marrow stromal cells.
A csontvelő egy összetett és dinamikus szervrendszer, amely hematopoietikus sejtekből, csontvelő-strómasejtekből és extracelluláris mátrixból áll. A többféle hatású vázsejtek a csontvelőn belül elszaporodnak, és különböző sejttípusokká differenciálódnak, amelyekre példaként említhetők az eritrociták és leukociták. Ismert, hogy a vázsejtek és a strómasejtek kölcsönhatása kritikus az említett folyamat vonatkozásában. A sejttenyésztéses vizsgálatok igazolták, hogy az összetapadt strómasejtekből egy rétegnek kell kialakulni ahhoz, hogy a hematopoietikus vázsejtek növekedjenek és differenciálódjanak.Bone marrow is a complex and dynamic organ system consisting of hematopoietic cells, bone marrow-stromal cells and extracellular matrix. Multiple acting skeletal cells proliferate within the bone marrow and differentiate into different cell types, such as erythrocytes and leukocytes. The interaction between skeletal cells and stromal cells is known to be critical for this process. Cell culture assays have shown that adherent stromal cells must form a single layer in order for hematopoietic skeletal cells to grow and differentiate.
A csontvelő-strómasejtek heterogén populációt képeznek, amelyen belül az egyes sejtek morfológiai és funkcionális különbségeket mutatnak. Sok esetben jellemző, orsó alakú morfológiát mutatnak, és növekedési faktorokat és extracelluláris mátrixot képező komponenseket választanak ki. Kimutatták, hogy a strómasejtek tenyészetben osztódnak az epidermális növekedési faktor (EGF) hatására (Kimura és munkatársai: Br. J. Hematol. 69, 9-12 (1988)), vérlemezkékből származó növekedési faktor (PDGF) hatására (Kimura és munkatársai fent idézett műve.), valamint bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) hatására (Kimura és munkatársaiBone marrow stromal cells form a heterogeneous population within which each cell exhibits morphological and functional differences. In many cases, they exhibit typical spindle-shaped morphology and select growth factors and components that form extracellular matrix. Stromal cells have been shown to divide in culture by epidermal growth factor (EGF) (Kimura et al., Br. J. Hematol. 69, 9-12 (1988)) and platelet derived growth factor (PDGF) (Kimura et al., Supra). ) and basic fibroblast growth factor (bFGF) (Kimura et al.
88097-2444/SL • · · · · ·88097-2444 / SL • · · · · ·
- 2 fent idézett műve; Olivér és munkatársai: Growth Factors, 3, 231-236 (1990)).- 2 of his works quoted above; Oliver et al., Growth Factors, 3: 231-236 (1990).
A fibroblaszt növekedési faktorokat azon megfigyelés alapján fedezték fel, hogy agyextraktumokkal stimulálható a fibroblasztok szétválása (Thomas: FASEB J., 1, 434-440 (1987)). Azóta különböző FGF változatokat izoláltak, és ez a család pillanatnyilag legalább hét tagból áll, ilyenek például a savas és bázikus FGF (aFGF és bFGF). Ezt a két faktort különböző, egyetlen másolatban jelenlévő gének kódolják, és aminosav szekvenciájuk csak 55 %-ban azonos (Thomas fent idézett műve).Fibroblast growth factors have been discovered by the observation that brain extracts can stimulate fibroblast separation (Thomas: FASEB J., 1, 434-440 (1987)). Since then, various variants of FGF have been isolated and this family currently comprises at least seven members, such as acidic and basic FGF (aFGF and bFGF). These two factors are encoded by different single copy genes and have only 55% identical amino acid sequence (Thomas, cited above).
A legtöbb növekedési faktorhoz hasonlóan az FGF faktorok is sejtfelületi receptorhoz történő kötődés által fejtik ki mitogén aktivitásukat. Jelenleg négy megfelelő FGF receptort azonosítottak (FGFR1-FGFR4). Minden FGF receptor különböző formákban fordulhat elő, és az aFGF és bFGF relatív affinitása mindenegyes receptorra más (Burgess és munkatársai: Ann. Rév. Biochem., 58, 575-606 (1989);Like most growth factors, FGF factors express their mitogenic activity by binding to a cell surface receptor. Currently, four suitable FGF receptors (FGFR1-FGFR4) have been identified. Each FGF receptor can exist in different forms and the relative affinities of aFGF and bFGF for each receptor are different (Burgess et al., 1989, Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606;
Dionne és munkatársai: Ann. N.Y. Acad. Sci. 638. 161-166 (1991); Johnson és munkatársai: Adv. Cancer Rés., 60.. 1-41 (1993)). A lúgos és savas FGF eltér egymástól ezenkívül a heparínnal szemben mutatott válasz vonatkozásában is. Sejttenyészetben a heparin komplexet képez mindkét FGF-fel, de lényegesen csak az aFGF mitogén aktivitását fokozza (Thomas fent idézett műve).Dionne et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 638: 161-166 (1991); Johnson et al., Adv. Cancer Rev. 60: 1-41 (1993). In addition, alkaline and acidic FGFs differ in their response to heparin. In cell culture, heparin complexes with both FGFs but significantly enhances the mitogenic activity of aFGF only (Thomas, cited above).
A csontvelő átültetés vagy -beültetés ígéretes terápia számos olyan betegségnél, amelyben résztvesznek a hematopoietikus sejtek. Az átültetés felhasználható olyan sejtek helyettesítésére, amelyeket a belső sérülés, így anémia el• · ·· · · · · • ·Bone marrow transplantation or implantation is a promising therapy for many diseases in which hematopoietic cells are involved. Transplants can be used to replace cells that have an internal injury such as anemia.
- 3 roncsolt, vagy abban az esetben, ha a hematopoietikus sejteket kemoterápiás vagy sugárterápiás kezeléssel roncsolták el. Az átültetés lehet autológ, vagyis a beteg önmaga donoraként szolgál. Alternatív módon, a beteg csontvelőt kaphat hisztokompatibilis donortól is. A csontvelősejtek, elsősorban a csontvelő-strómasejtek tenyésztésének körülményei azonban még nincsenek kidolgozva annak ellenére, hogy ezek felhasználhatók lennének átültetéshez és számos génterápiához. A strómasejtek módosításán alapuló génterápia fő akadálya, hogy ehhez nagymennyiségű strómasejtre lenne szükség. Ennek következtében a csontvelő átültetés sikerei ellenére a csontvelő-strómasejtek sikeres átültetésén alapuló génterápia még nem valósult meg.- 3 disrupted, or in the case of haematopoietic cells disrupted by chemotherapy or radiotherapy. Transplantation can be autologous, that is, the patient acts as a donor himself. Alternatively, the patient may receive bone marrow from a histocompatible donor. However, conditions for culturing bone marrow cells, particularly bone marrow stromal cells, have not yet been developed, although they could be used for transplantation and numerous gene therapies. The major obstacle to gene therapy based on modifying stromal cells is the need for large quantities of stromal cells. As a result, despite the success of bone marrow transplantation, gene therapy based on the successful transplantation of bone marrow stromal cells has not yet been implemented.
A találmány tárgya új eljárás csontvelő-strómasejtek tenyésztésére, amelynek alapját az a felismerés képezi, hogy a savas FGF (aFGF) vagy az aFGF és heparin kombinációja jelentős mértékben fokozza a csontvelő-strómasejtek megerősödését, és ezt követő expanzióját. Az eljárás alkalmazásával a csontvelő-strómasejtek tenyészetben expandálhatok olyan mértékben, ami korábban nem volt megvalósítható, és ami egyértelműen előnyös a terápiás alkalmazás szempontjából. Ennek következtében ez a tenyésztési eljárás lehetővé teszi a csontvelő-strómasejtek felhasználását a különböző génterápiás eljárásokban.The present invention relates to a novel method for culturing bone marrow stromal cells based on the recognition that acidic FGF (aFGF) or a combination of aFGF and heparin significantly enhances bone marrow stromal cell enhancement and subsequent expansion. By using this method, bone marrow stromal cells can be expanded in culture to an extent that was not previously feasible and that is clearly advantageous for therapeutic use. As a result, this culture method allows the use of bone marrow stromal cells in a variety of gene therapy approaches.
A csontvelő-strómasejtek találmány szerinti expandálásával összesen legalább 107, előnyösen legalább 109 csontvelő-strómasejtet állítunk elő. Az eljárás során úgy járunk el, hogy (a) csontvelő-strómasejteket nyerünk, például csontvelő megcsapolásával, (b) a csontvelő-strómasejteket • · · « • ·· ··· • · ··By expanding bone marrow stromal cells according to the invention, a total of at least 10 7 , preferably at least 10 9 bone marrow stromal cells are produced. The process involves (a) obtaining bone marrow stromal cells, for example by dripping bone marrow, (b) bone marrow stromal cells.
- 4 belső felületén zselatinnal, például 1,0 tömeg% zselatint tartalmazó vizes eleggyel bevont, és savas fibroblaszt növekedési faktor polipeptidet (aFGF) tartalmazó tenyészközeggel töltött edénybe visszük, és (c) a strómasejteket nagymennyiségű csontvelő-strómasejt előállításához szükséges körülmények között és időn keresztül a tenyészközegben expandáljuk. Az eljárásban a tenyészközeg további komponensként előnyösen legalább 0,05 egység/ml heparint tartalmaz. Az edény belső felületét adott esetben magzati borjúszérummal is bevonjuk a csontvelő-strómasejtek adagolása előtt.- transferring onto its inner surface a vessel coated with gelatin, such as an aqueous mixture containing 1.0% by weight gelatin and filled with culture medium containing acid fibroblast growth factor polypeptide (aFGF), and (c) under conditions and for the time necessary to produce large quantities of bone marrow stromal cells. expanding in the culture medium. Preferably, the culture medium further comprises at least 0.05 units / ml heparin as an additional component. Optionally, the inside surface of the vessel is coated with fetal calf serum prior to administration of bone marrow stromal cells.
A tenyészközeg előnyösen 1,0-50,0 térfogat% magzati borjúszérumot, 0,01-100,0 ng/ml aFGF polipeptidet, és 0,05100 egység/ml heparint tartalmaz. Különösen előnyös az a tenyészközeg, amely 16,0 térfogat% magzati borjúszérumot, 1,0 ng/ml aFGF polipeptidet és 5,0 egység/ml heparint tartalmaz.The culture medium preferably contains 1.0-50.0% v / v fetal bovine serum, 0.01-100.0 ng / ml aFGF polypeptide, and 0.05100 units / ml heparin. Especially preferred is a culture medium containing 16.0% v / v fetal calf serum, 1.0 ng / ml aFGF polypeptide and 5.0 units / ml heparin.
A találmány szerinti eljárás (c) expandálási lépését előnyösen úgy végezzük, hogy (i) a tenyészközeget és az össze nem tapadt sejteket az edényből eltávolítjuk, (ii) az edényhez friss tenyészközeget adunk, (iii) a tenyészközeget és az össze nem tapadt sejteket az edényből eltávolítjuk, és ezeket centrifugálva össze nem tapadt sejtpelletet állítunk elő, (iv) az össze nem tapadt sejtpelletet az edényből vett tenyészközegben szuszpendáljuk, és így össze nem tapadt sejtelegyet képezünk, és (v) az össze nem tapadt sejtelegyet az edénybe visszajuttatjuk. Ennél az eljárásnál a (ii) lépésben alkalmazott friss tenyészközeg mennyisége és az (iv) lépésben az össze nem tapadt sejtpellet szuszpendálásához • · · · · · • · · ·«·♦·· • · · · · · • · · · ····*Preferably, step (c) of the process of the invention is carried out by (i) removing the culture medium and non-adherent cells from the vessel, (ii) adding fresh culture medium, (iii) the culture medium and the non-adherent cells to the culture medium. removing from the vessel and centrifuging to form a non-adherent cell pellet, (iv) suspending the non-adherent cell pellet in the culture medium taken from the vessel to form a non-adherent cell mixture, and (v) returning the non-adherent cell mixture to the vial. In this procedure, the amount of fresh culture medium used in step (ii) and the non-adherent cell pellet used in step (iv) were used to suspend the non-adherent cell pellet. · · · *
- 5 az edényből kivett tenyészközeg mennyisége előnyösen azonos. Előnyösen úgy járunk el, hogy az (i) lépést a strómasejteknek az edény belső felületére történő megtapadása után végezzük, és a (ii) és (iii) lépéseket mintegy egy héttel az (i) lépés után végezzük.Preferably, the amount of culture medium removed from the vessel is the same. Preferably, step (i) is performed after adherence of the stromal cells to the inner surface of the vessel, and steps (ii) and (iii) are performed about one week after step (i).
A fent ismertetett valamennyi eljárásnál csontvelő-strómasejtként előnyösen friss strómasejteket használunk, amit gerincesek, például emlősök csontvelejéből vett primer megcsapolásból nyerünk, ahol a donor lehet élő vagy halott, vagy gerincesekből eltávolított csontból nyerünk, ahol a gerinces lehet például humán, nem-humán főemlős, szarvasmarha, kutya, sertés vagy más állat. A csontvelő-strómasejtek kinyerhetők továbbá csontvelő-strómasejt-tenyészetből vagy fagyasztott csontvelő-strómasejt-törzsből.Preferably, all of the methods described above use fresh stromal cells as bone marrow stromal cells obtained from primary taping of the bone marrow of vertebrates, such as mammals, wherein the donor may be living or dead or removed from vertebrates, such as human, non-human primates, cattle, dogs, pigs or other animals. The bone marrow stromal cells can also be obtained from a bone marrow stromal cell culture or frozen bone marrow stromal cell strain.
A találmány tárgyát képezi továbbá a teljes csontvelőstrómasejt-közeg, ami legalább 12,5 térfogat% magzati borjúszérumot, savas fibroblaszt növekedési faktor polipeptidet (aFGF) és heparint tartalmaz. A közeg előnyösen 12,6-50 térfogat% magzati borjúszérumot, 0,01-100,0 ng/ml aFGF polipeptidet és 0,05-100 egység/ml heparint tartalmaz. Különösen előnyös az a közeg, amely 16 térfogat% magzati borjúszérumot, 1,0 ng/ml aFGF polipeptidet és 5,0 egység/ml heparint tartalmaz. A közeg további komponensként tartalmazhat fungicidet, például 25 pg/ml Fungizont (amphotericinThe present invention further provides a complete bone marrow stromal cell medium containing at least 12.5% v / v fetal bovine serum, acidic fibroblast growth factor polypeptide (aFGF), and heparin. Preferably, the medium contains 12.6-50% v / v fetal bovine serum, 0.01-100.0 ng / ml aFGF polypeptide and 0.05-100 units / ml heparin. Particularly preferred is a medium containing 16% v / v fetal bovine serum, 1.0 ng / ml aFGF polypeptide and 5.0 units / ml heparin. The medium may further contain a fungicide such as 25 pg / ml of Fungizone (amphotericin).
B), és egy vagy több antibiotikumot, például 25 pg/ml gentamicint, 100 egység/ml penicillint és 100 pg/ml sztreptomicin-szulfátot.B) and one or more antibiotics such as 25 pg / ml gentamycin, 100 units / ml penicillin and 100 pg / ml streptomycin sulfate.
A találmány tárgya továbbá készlet csontvelő-strómasejtek szelektálására és expandálására. A készlet tartalmaz •·· ··· • · · · • · · • · · · · · ·· · · ·· ··«The invention also relates to a kit for selecting and expanding bone marrow stromal cells. The set includes · ····· · · · · · · ·
- 6 egy vagy több tenyészedényt, amely belső felületén zselatinnal, például 1,0 tömeg% zselatint tartalmazó vizes elegygyel van bevonva, és aFGF polipeptidet, valamint heparint tartalmazó csontvelő-strómasejteket tartalmaz. A közeg lehet folyékony vagy liofilizált por, és lehet az edényen belül vagy attól külön.6 one or more culture vessels coated on the inner surface with gelatin, e.g., an aqueous mixture containing 1.0% by weight of gelatin, and containing bone marrow stromal cells containing the FGF polypeptide and heparin. The medium may be a liquid or lyophilized powder and may be contained within or apart from the container.
A fenti értelmezésben az aFGF polipeptid lehet bármely olyan polipeptid, amelynek aminosav szekvenciája azonos vagy lényegében azonos a természetes eredetű aFGF fehérjével vagy annak részével, és amely lényegében azonos funkcióval rendelkezik, mint a természetes vagy teljes hosszúságú rekombináns aFGF fehérje, amit a jelen leírásban a csontvelő-strómasejtekkel összefüggésben ismertettünk. Ennek megfelelően használható rekombináns aFGF (például Life Technologies Inc., Grand Island, N.Y., USA; katalógusszám: 13241-013), aFGF analóg, például aFGF mutáns formája, valamint a teljes hosszúságú aFGF fehérje és analóg természetes és szintetikus polipeptid fragmense, amennyiben ezek az analógok és fragmensek lényegében azonos funkcióval rendelkeznek, mint a természetes vagy teljes hosszúságú rekombináns aFGF a csontvelő-strómasejtek vonatkozásában. Ezeknél az analógoknál és fragmenseknél egyszerű vizsgálattal eldönthető, hogy a találmány szerinti tenyésztési eljárásban használhatók-e. Az olyan savas FGF analógok és fragmensek, amelyek alkalmazása esetén a találmány szerinti eljárással nem termelhető legalább 107 sejt, nem tartoznak ebbe a körbe.As used herein, aFGF polypeptide may be any polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the naturally occurring aFGF protein, and having substantially the same function as the natural or full-length recombinant aFGF protein as used herein for bone marrow -stroma cells. Accordingly, recombinant aFGF (e.g., Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA; Cat. No. 13241-013), a mutant form of an FGF analog such as aFGF, and natural and synthetic polypeptide fragments of the full-length aFGF protein and analog may be used. analogs and fragments have essentially the same function as natural or full-length recombinant aFGF for bone marrow stromal cells. For these analogs and fragments, it is easy to determine whether they can be used in the culture method of the invention. Acid FGF analogs and fragments which, when used in accordance with the present invention, cannot produce at least 10 7 cells are not included.
Hasonlóképpen, hepar/n-ként alkalmazható bármely olyan glikóz-amino-glikán, amely ismétlődő diszaccharid • ♦ · · · · • · · ·*···« • · · · · · ♦ · · · · · ··«Similarly, any glycosaminoglycan that is a repetitive disaccharide can be used as hepar / n. «·« «« «« «« «« «
- 7 szekvenciát tartalmaz, és amely azonos vagy lényegében azonos a természetes eredetű heparinnal vagy annak részével, és amely lényegében azonos funkcióval rendelkezik, mint a természetes heparin az ismertetett csontvelő-strómasejtek vonatkozásában. Ennek megfelelően, alkalmazható természetes heparin vagy kémiailag módosított természetes heparin, például nátrium-heparin (Elkins Sinn Inc., Cherry Hill, NJ, USA), valamint a teljes hosszúságú heparin és analógjai természetes vagy szintetikus fragmensei, amennyiben ezek az analógok és fragmensek lényegében azonos funkcióval rendelkeznek, mint a természetes heparin a csontvelőstrómasejtek vonatkozásában. A heparin funkciója az ismertetett tenyésztési eljárással vizsgálható.- comprising 7 sequences which is identical or substantially identical to or naturally occurring heparin and which has substantially the same function as natural heparin with respect to the bone marrow stromal cells described. Accordingly, natural heparin or chemically modified natural heparin, such as sodium heparin (Elkins Sinn Inc., Cherry Hill, NJ, USA), as well as natural or synthetic fragments of full-length heparin and its analogs may be used, provided that these analogs and fragments are substantially the same. have the same function as natural heparin for bone marrow stromal cells. The function of heparin can be assayed by the culture method described.
Polipeptid alatt aminosavak tetszőleges láncát értjük, függetlenül annak hosszától vagy poszt-transzlációs módosításától, például a glikozilálástól, foszforilálástól vagy kémiai módosítástól, és ennek megfelelően alkalmazhatók természetes vagy szintetikus peptidek és proteinek.A polypeptide is understood to mean any chain of amino acids, regardless of its length or post-translational modification, such as glycosylation, phosphorylation or chemical modification, and natural or synthetic peptides and proteins may be used accordingly.
Az aFGF mutáns formája lehet olyan polipeptid, amely aminosav szekvenciájában tetszőleges változtatásokat tartalmaz a természetes eredetű proteinhez képest, amennyiben a mutáns forma lényegében azonos funkcióval rendelkezik, mint a természetes vagy teljes hosszúságú rekombináns protein a csontvelő-strómasejtek vonatkozásában. A változtatások megvalósíthatók például spontán módon, kémiai energia, így röntgensugár hatására, vagy más mutáció segítségével, például géntechnológiai úton, valamint párosítással, vagy az aFGF polipeptidet kódoló genetikai információ más módon történő kicserélésével. A mutáció lehet például ··· ···The mutant form of aFGF may be a polypeptide that contains any alteration in its amino acid sequence relative to the native protein, provided that the mutant form has substantially the same function as the natural or full-length recombinant protein for bone marrow stromal cells. The changes can be effected, for example, spontaneously, by chemical energy such as X-rays, or by other mutations, such as genetic engineering and mating, or by alternately exchanging genetic information encoding the aFGF polypeptide. For example, the mutation may be ··· ···
- 8 helyettesítés, kiiktatás, beépítés, felcserélés, áthelyezés vagy megkettőzés. Mutációként előnyös a szokásos helyettesítés, például a következő aminosavak közötti helyettesítés: glicin és alanin; valin, izoleucin és leucin; aszpartámsav, glutaminsav, aszparagin és glutamin; szerin és treonin; lizin és arginin; valamint fenil-alanin és tirozin.- 8 substitutions, deletions, insertions, exchanges, transfers or duplications. As a mutation, conventional substitution is preferred, for example, substitution between the following amino acids: glycine and alanine; valine, isoleucine and leucine; aspartic acid, glutamic acid, asparagine and glutamine; serine and threonine; lysine and arginine; and phenylalanine and tyrosine.
A polipeptidek vonatkozásában alkalmazott azonos kifejezés azt jelenti, hogy a két polipeptid aminosav szekvenciája hasonló. Ha egy aminosav pozíciót mindkét polipeptidnél azonos aminosav foglal el, akkor ezek az adott pozícióban azonosak. Ennek megfelelően, a lényegében azonos kifejezés azt jelenti, hogy az aminosav szekvencia legalább 80 %, előnyösen legalább 85 %, különösen előnyösen 90 %, elsősorban 95 % terjedelemben azonos a referencia aminosavval, és azonos funkcionális aktivitást mutat, mint a referencia szekvencia. Az aminosav szekvenciák közötti azonosságot általában szekvencia analízis programmal (például Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705, USA) határozzuk meg.The same term used for polypeptides means that the two polypeptides have similar amino acid sequences. If an amino acid position is occupied by the same amino acid in both polypeptides, they are identical at that position. Accordingly, substantially identical terms mean that the amino acid sequence is at least 80%, preferably at least 85%, particularly preferably 90%, in particular 95% identical to the reference amino acid and exhibits the same functional activity as the reference sequence. Identity between amino acid sequences is generally determined by a sequence analysis program (e.g., Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Center for Biotechnology, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, USA).
A sejtek expanziója vagy expandálása azt jelenti, hogy a sejteket annyi időn keresztül és olyan körülmények között tenyésztjük, ami a sejteknél nemcsak a növekedést és a fejlődést biztosítja, de lehetővé teszi a szaporodást, és így az expanzió végén nagyobb számú sejtet kapunk, mint az expanzió elején.Expanding or expanding cells means culturing the cells for a period of time and under conditions that not only allow the cells to grow and develop, but also to proliferate, so that at the end of the expansion, more cells are obtained than expansion. beginning.
Az átvitel kifejezés azt a folyamatot jelöli, amelynek során az adott számot vagy adott sűrűséget elért sejteket az « · V · · ·The term transfer refers to the process by which cells reaching a given number or specific density are transferred to the cells of the "· V · · ·
9 9 ·** ··* • · · · · · ·· · * ·· *·*9 9 · ** ·· * • · · · · · · · · · · ·
- 9 összefolyás előtt, során vagy után eltávolítjuk a tenyészedényből, aggregátum, például centrifugálással kialakított pellet formájában összegyűjtjük, és a tenyészközegben újból szuszpendáljuk. A szuszpenziót ezután tenyészedények, így lemezek vagy palackok között megosztjuk, és így a sejtek növekedéséhez és osztódásához összességében nagyobb felületet biztosítunk, mint ami korábban rendelkezésre állt. Ez megvalósítható a tenyészedények számának növelésével, így például, egy tenyészedényben növesztett sejtek elválaszthatók, összegyüjthetők, szuszpendálhatók, és két vagy több tenyészedény között megoszthatók. Ez az eljárás megvalósítható úgy is, hogy a sejtekhez megfelelő térfogatban tenyészközeget adunk, ami elősegíti a celluláris növekedést és osztódást.- 9, before, during or after confluence, is removed from the culture vessel, collected in the form of aggregates, such as pellets by centrifugation, and resuspended in the culture medium. The suspension is then divided between culture vessels, such as plates or bottles, to provide an overall larger area for cell growth and division than was previously available. This can be accomplished by increasing the number of culture vessels, for example, cells grown in a culture vessel may be separated, harvested, suspended, and split between two or more culture vessels. This method may also be accomplished by adding a sufficient volume of culture medium to the cells to promote cellular growth and division.
Ellenkező értelmű megjelölés hiányában valamennyi technikai és tudományos kifejezést a szakember számára ismert, szokásos értelmezésben használunk. A találmány szerint megoldás megvalósításához vagy vizsgálatához alkalmazhatók azonban az ismert eljárásokhoz és anyagokhoz hasonló és ekvivalens eljárások és anyagok is. Az előnyösen alkalmazható eljárásokat és anyagokat a leírásban ismertetjük. Az ismertetett eljárások, anyagok és példák azonban csak bemutató jellegűek, és nem jelentik az oltalmi kör korlátozását.Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms are used in the usual manner known to those skilled in the art. However, methods and materials similar to and known in the art can be used to carry out or test the present invention. Preferred methods and materials are described herein. However, the methods, materials, and examples described are illustrative only and are not intended to limit the scope of protection.
A találmány szerinti megoldás megértését segítik elő a következő ábrák:The following figures will help to understand the present invention:
Az 1. ábra csontvelő-strómasejtek szaporodását mutatja aFGF és heparin jelenlétében és távollétében tenyészetve.Figure 1 shows proliferation of bone marrow stromal cells cultured in the presence and absence of FGF and heparin.
• · • » · · · · • · »· «·* • · · ·• · • »· · · · ·» · «· * • · · ·
- 10 A szaporodást a sejtek számának százalékos változásában fejezzük ki mindenegyes átvitelre (Po-Pe).Growth is expressed as the percentage change in cell number for each transfer (Po-Pe).
A 2. ábra az aFGF és heparin jelenlétében és távollétében tenyészetett csontvelő-strómasejtek össz számát mutatja.Figure 2 shows the total number of bone marrow stromal cells cultured in the presence and absence of aFGF and heparin.
A 3. ábra humán növekedési hormon (hGH) in vitro kifejeződését és kiválását mutatja transzfektált kutya csontvelő-strómasejtek esetében. A hGH mennyiségét μρ-όβη adjuk meg 10s sejtre és 24 órára vonatkoztatva. A P2-Ps oszlop a 3. számú kísérleti kutyából nyert sejtek, mig a P6-Pg a 9. számú kísérleti kutyából nyert sejtek adatait mutatja.Figure 3 shows in vitro expression and secretion of human growth hormone (hGH) in transfected canine bone marrow stromal cells. The amount of hGH is expressed as μρ-όβη per 10 s per 24 hours. The P 2 -Ps column represents the data obtained from experimental dog # 3, while P 6 -Pg represents the data obtained from experimental dog # 9.
A transzplantációhoz alkalmazható csontvelő-strómasejttenyészet kifejlesztéséhez csontvelőt nyerünk emberektől vagy kutyáktól, és speciálisan kialakított szövettenyésztő edényekben növesztjük. Emellett, a közeget savas fibroblaszt növekedési faktorral (aFGF) és heparinnal egészítjük ki, és egy adott előírás szerint frissítjük. A találmány szerinti eljárással nagyszámú csontvelő-strómasejt állítható elő a tenyészetben, és így olyan mennyiségű sejtet kapunk, ami strómasejtekkel végzett hatékony génterápiához alkalmazható.To develop a bone marrow-stromal cell culture for transplantation, bone marrow is obtained from humans or dogs and grown in specially designed tissue culture vessels. In addition, the medium is supplemented with acidic fibroblast growth factor (aFGF) and heparin and updated according to a specific protocol. The method of the present invention can produce a large number of bone marrow stromal cells in culture to obtain an amount of cells that can be used for effective gene therapy with stromal cells.
A csontvelő-strómasejtek tenyésztésének eljárását, valamint humán növekedési hormon (hGH) transzfektált kutya csontvelő-strómasejtekben történő in vitro kiválasztásának részletes ismertetését az alábbiakban adjuk meg:The method for culturing bone marrow stromal cells and the in vitro secretion of human growth hormone (hGH) in transfected canine bone marrow stromal cells are described below:
Kutya csontvelő-strómasejtek tenyésztéséhez kutyákat elaltatunk, és a teljes csontvelőt aszeptikus körülmények között megcsapoljuk a csípőtaréjból. A megcsapoláshoz használt fecskendő heparint tartalmaz az aggregálódás megaka• · • · <* ··» *** • · · · · · ·· · · »· ··*For the cultivation of canine bone marrow stromal cells, dogs are anesthetized and whole bone marrow is aseptically drained from the hips. The tap for syringe contains heparin contains mega-aggregation mega-aggregate.
-11dályozása érdekében. A csontvelőt a fecskendőből egy 50 ml-es kónikus csőbe juttatjuk, amely 15 ml lehűtött szövettenyésztő közeget, így RPMI vagy DMEM közeget tartalmaz, amely fungicidszerrel és antibiotikummal (50 pg/ml Fungizon (amphotericin B), 50 pg/ml gentamicin, 100 egység/ml penicillin és 100 pg/ml sztreptomicin-szulfát) van kiegészítve. Minden csőhöz mintegy 10-15 ml megcsapolt csontvelőt adunk, és az elegyet jégen tartjuk.-11. The bone marrow is injected from the syringe into a 50 mL conical tube containing 15 mL of cooled tissue culture medium such as RPMI or DMEM containing fungicide and antibiotic (50 pg / mL Fungizone (amphotericin B), 50 pg / mL gentamicin, 100 units / ml penicillin and 100 pg / ml streptomycin sulfate). About 10-15 ml of dripped bone marrow is added to each tube and the mixture is kept on ice.
A csontvelőmintákból sejtmagot tartalmazó sejteket állítunk elő a szokásos FICOLL technikával. Röviden, 15 ml FICOLL-PAQUE-t (Pharmacia Biotech) helyezünk egy 50 mles kónikus csőbe, és a FICOLL felületére óvatosan rárétegezzük az egyes csontvelő-közeg minták felét. A mintákat 30 percen keresztül és 18 °C hőmérsékleten 400 g értéken centrifugáljuk úgy, hogy az eltelt idő után a centrifuga fejet lassan fékezzük le. A kapott preparátum felső rétegét, amely sejtmentes közeget tartalmaz, eltávolítjuk, és eldobjuk. A középső réteget, amely a sejtmagvas sejteket tartalmazza, óvatosan összegyűjtjük, és friss 20 ml fenti szövettenyésztő közeget tartalmazó 50 ml-es csövekbe töltjük. A mintákat ezután további közeggel 50 ml végső térfogatra feltöltjük.Bone marrow specimens are prepared from nucleated cells using standard FICOLL techniques. Briefly, 15 mL of FICOLL-PAQUE (Pharmacia Biotech) is placed in a 50 mL conical tube and half of each bone marrow media sample is carefully overlaid on the surface of FICOLL. The samples were centrifuged at 400 g for 30 minutes at 18 ° C with slow deceleration of the centrifuge head. The upper layer of the resulting preparation containing the cell-free medium is removed and discarded. The middle layer containing the nucleated cells is carefully collected and filled into fresh 20 ml tubes containing the above tissue culture medium. The samples were then filled with additional medium to a final volume of 50 ml.
A sejtmagvas sejtek tartalmazzák a csontvelő-strómasejteket. A strómasejtek azonban csak kis frakciót képeznek, vagyis a sejtmagvas csontvelósejtek közül közel minden ezredik strómasejt.Nuclear cells contain bone marrow stromal cells. However, stromal cells form only a small fraction, that is to say nearly one thousandth of the nuclear bone marrow cells.
A sejtmagvas sejteket 10 percen keresztül 100 g értéken centrifugálva pelletáljuk. A sejtpelletet szövettenyésztő közeggel (25 pg/ml Fungizon-nal (amphotericin B), 25 pg/ml gentamicinnel, 100 egység/mi penicillinnel és 100 pg/mlNuclear cells are pelleted by centrifugation at 100 g for 10 minutes. Cell pellets with tissue culture medium (25 pg / ml Fungizon (amphotericin B), 25 pg / ml gentamicin, 100 units / ml penicillin and 100 pg / ml
- 12 • a*···*»··*· ·'* 99·· • · » · ' » • · · ·«· ··· • · · · · · «« · · ·” sztreptomicin-szulfáttal kiegészített RPMI vagy DMEM) mossuk, és 5-10 ml teljes csontvelő-strómasejt közegben (teljes közeg) szuszpendáljuk. A szuszpendálás után a sejteket megszámoljuk.- 12 • a * ··· * »·· * · ·’ * 99 ··· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · “" "Streptomycin Sulphate supplemented RPMI or DMEM) and resuspended in 5-10 ml of complete bone marrow stromal cell medium (whole medium). After suspension, the cells are counted.
A teljes csontvelő-strómasejtközeg általában a következő komponenseket tartalmazza a megadott mennyiségekben vagy koncentrációkban. DMEM és 1-50 térfogat%, előnyösen legalább 12,5 térfogat% magzati borjúszérum (FBS), 0,01100 ng/ml aFGF polipeptid, például rekombináns aFGF, 0,05-100 egység/ml heparin, például nátrium-heparin, 0,25250 pg/ml Fungizon (amphotericin B), 0,25-250 pg/ml gentamicin, 1-1000 egység/ml penicillin és 1-1000 pg/ml sztreptomicin-szulfát. A teljes közeg előnyös összetétele 16 térfogat% hővel inaktivált FBS-sel, 1 ng/ml aFGF-fel, 5 egység/ml heparinnal, 25 pg/ml Fungizonnal, 25 pg/ml gentamicinnel, 100 egység/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztreptomicin-szulfáttal kiegészített DMEM.The total bone marrow stromal cell medium generally contains the following components in the amounts or concentrations indicated. DMEM and 1-50% v / v, preferably at least 12.5% v / v fetal calf serum (FBS), 0.01100 ng / ml aFGF polypeptide, e.g. recombinant aFGF, 0.05-100 units / ml heparin, e.g. sodium heparin, , 25,250 pg / ml Fungizon (amphotericin B), 0.25-250 pg / ml gentamicin, 1-1000 units / ml penicillin and 1-1000 pg / ml streptomycin sulfate. The preferred composition of the total medium is 16% by volume heat-inactivated FBS, 1 ng / ml aFGF, 5 units / ml heparin, 25 pg / ml Fungizone, 25 pg / ml gentamicin, 100 units / ml penicillin and 100 pg / ml DMEM supplemented with streptomycin sulfate.
A szövettenyésztő edényeket (T150 cm2) belső felületükön előnyösen zselatinnal és FBS-sel vonjuk be. Előnyösen 1 tömeg% zselatint tartalmazó vizes elegyet (Sigma) adunk minden edényhez az edény aljának befedéséig. A felesleget eltávolítjuk, és az edényt az aljára helyezve szobahőmérsékleten legalább 30 percen keresztül állni hagyjuk. Az edényeket ezután a további felhasználásig fagyasztjuk. A zselatinnal bevont edényekhez hővel inaktivált FBS-t adunk. A korábbi lépéshez hasonló módon, az oldat feleslegét eltávolítjuk, és az edényt aljára helyezve szobahőmérsékleten legalább 30 percen keresztül állni hagyjuk. Az edényeket ezután felhasználjuk vagy újból fagyasztjuk.Tissue culture vessels (T150 cm 2 ) are preferably coated on their inner surface with gelatin and FBS. Preferably, an aqueous mixture (Sigma) containing 1% by weight of gelatin is added to each vessel until the bottom of the vessel is covered. The excess is removed and the vessel is placed on its bottom and allowed to stand at room temperature for at least 30 minutes. The dishes are then frozen until further use. Heat-inactivated FBS is added to the gelatin-coated dishes. As in the previous step, the excess solution was removed and the vessel was placed at the bottom for 30 minutes at room temperature. The dishes are then used or re-frozen.
·«· ·<· • · • » < » ·»· «· · <· • · •» <»·»
- 13 A csontvelőből a fent leírt módon előállított sejtmagvas sejteket hozzáadjuk az edényekhez, egyenként mintegy 1x10® sejtmennyiségben. A sejteket ezután 15 ml teljes csontvelő közegben 33 °C hőmérsékleten és 5 % CO2 jelenlétében inkubáljuk. 3-4 nap elteltével, vagy a strómasejteknek a tenyészedény belső felületére való rátapadásakor 15 ml friss teljes közeget adunk a tenyészetekhez. A közeg adagolását csepegtetve, a sejtek felzavarása nélkül végezzük. Egy héttel később, a vitális komponensek használata előtt, az úgynevezett kondicionált közeg-ef vagyis az össze nem tapadt sejteket tartalmazó közeget eltávolítjuk, és 15 ml friss teljes közeget adunk az edényhez. Az össze nem tapadt sejteket 500 g értéken 5 percen keresztül centrifugálva pellettáljuk, majd 15 ml kondicionált közegben szuszpendáljuk, és az eredeti edénybe visszatöltjük. Igy az össze nem tapadt sejteket visszajuttatjuk az edénybe, és a közeget úgy változtatjuk, hogy egy rész friss közeget és egy rész kondicionált közeget tartalmazzon.- 13 Nuclear cells prepared from bone marrow as described above are added to the dishes at a volume of about 1x10 cells each. The cells are then incubated in 15 ml of complete bone marrow medium at 33 ° C and 5% CO 2 . After 3-4 days or when the stromal cells adhere to the inner surface of the culture vessel, 15 ml of fresh complete medium is added to the cultures. The medium is added dropwise without disturbing the cells. One week later, before using the vital components, the so-called conditioned medium, i.e. the medium containing the non-adherent cells, is removed and 15 ml of fresh complete medium is added. Non-adherent cells were pelleted by centrifugation at 500 g for 5 minutes, resuspended in 15 ml conditioned medium and returned to the original flask. Thus, non-adherent cells are returned to the vessel and the medium is changed to include a portion of fresh medium and a portion of conditioned medium.
A sejttenyésztés menete általában a következő:The cell culture procedure is generally as follows:
(1) A szövettenyésztő edények belső felületét zselatin eleggyel vonjuk be; (2) az össze nem tapadt sejteket a közeg cseréjekor visszajuttatjuk a tenyészetbe; (3) megfelelő tápanyagokat tartalmazó közeget adunk a tenyészethez a növekedés elősegítése érdekében a csontvelősejtek által kiválasztott anyagok teljes eltávolítása nélkül, ami fokozza a növekedést; (4) a szövettenyésztő közeget aFGF-fel egészítjük ki; és (5) a szövettenyésztő közeget heparinnal egészítjük ki.(1) Coating the inner surface of tissue culture vessels with a gelatin mixture; (2) returning the non-adherent cells to the culture when the medium is changed; (3) adding medium containing appropriate nutrients to the culture to promote growth without complete removal of bone marrow-derived material, which enhances growth; (4) supplementing the tissue culture medium with aFGF; and (5) supplementing the tissue culture medium with heparin.
• · • »· ··· « » »· *»·• · • »· ···« »» · * »·
- 14 Ezt az eljárást, amelynek során az össze nem tapadt sejteket eltávolítjuk, pelletáljuk, és azonos mennyiségű friss és kondicionált közegből álló tenyészethez visszajuttatjuk, hetenként egyszer ismételjük 2-3 héten keresztül, vagy az összetapadt sejtekből álló réteg kialakulásáig. A csontvelőstrómasejtekből álló réteg kialakulása után a sejteket 1:2 vagy 1:3 arányban osztva friss edényekbe átvisszük. Ennél a lépésnél, és innentől kezdve minden lépésnél az átvitelhez használt edényeket zselatinnal bevonjuk, de FBS-sel nem vonjuk be. Ezenkívül, a továbbiakban nincs szükség arra, hogy a megállapodott strómasejteket kondicionált közeggel tápláljuk, vagy az össze nem tapadt sejteket visszajuttassuk a tenyészetbe. A sejtek ílymódon legalább nyolcszor átvihetők.This procedure of removing non-adherent cells is pelleted and returned to a culture of equal volume of fresh and conditioned medium, repeated once a week for 2 to 3 weeks, or until a layer of adherent cells is formed. After forming a layer of bone marrow stromal cells, the cells are transferred to fresh vessels in a ratio of 1: 2 or 1: 3. At this step, and henceforth each step, the transfer vessels are coated with gelatin but not coated with FBS. In addition, it is no longer necessary to feed the agreed stromal cells with a conditioned medium or return non-adherent cells to the culture. The cells can thus be transferred at least eight times.
Ez az eljárás alkalmas kutya vagy humán (vagy más gerinces) csontvelő-strómasejtek szelektálására és expandálására, összesen legalább 108, előnyösen legalább 3x109 sejtszám in vitro kifejlesztésére az egyedtől lecsapolt csontvelőből kiindulva. A csontvelő kinyerésére más eljárások is használhatók. A kutyákból nyert és fenti eljárással sokszorosított csontvelő-strómasejtek a fibroblaszt-szerű csontvelő-strómasejtek jellemző megjelenési formáját mutatják. Mivel a génterápiás eljárások hatékonysága a transzgenikus termék megfelelő celluláris szinten történő termelésétől függ, ami viszonylag alacsony lehet, a strómasejtek tenyészetben történő 1 08-1 09 szintig végzett expandálása lényeges előnyt jelent.This method is suitable for starting a dog or a human (or other vertebrate) expanding the bone marrow stromal cells and selection, a total of at least 10 8 and preferably at least 3x10 9 cells in vitro to develop drained on the individual bone marrow. Other methods can be used to obtain bone marrow. Bone marrow stromal cells obtained from dogs and amplified by the above method exhibit a typical appearance of fibroblast-like bone marrow stromal cells. Because the efficacy of gene therapy procedures depends on the production of the transgenic product at the appropriate cellular level, which may be relatively low, expanding stromal cells to a level of 1 0 8 -1 0 9 in culture is a major advantage.
Annak ellenére, hogy a kutyákból primer módon lecsapolt csontvelőből származó strómasejtek önmagukban a Po ·· « · ·Despite the fact that stromal cells derived from primary bone marrow drainage from dogs are themselves P o ·· «· ·
- 15 (0 átvitel) tenyészetben az aFGF és heparin alkalmazásától függetlenül életképesek, a sejtek növekedése az első vagy második átvitel után csak a fenti két faktor jelenlétében folyamatos. Emellett az aFGF-fel és heparinnal növekedett sejtek hosszabb ideig megtartják a fibroblaszt-szerű strómasejt morfológiát, mint a fenti faktorok nélkül növesztett strómasejtek.In 15 (0 transfer) cultures, viable irrespective of the use of aFGF and heparin, cell growth is sustained after the first or second transfer only in the presence of the above two factors. In addition, cells grown with aFGF and heparin retain fibroblast-like stromal cell morphology longer than stromal cells grown without the above factors.
A találmány szerinti megoldást közelebbről alábbi példával mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példára korlátozódna.The present invention will be further illustrated by the following example, without limiting the scope thereof.
Csípő csontvelő pungálást végzünk a fenti leírt módon az ALG-5 jelű kutyánál, és a kapott csontvelőt két részre osztva a sejtek egyik felét aFGF és heparin jelenlétében, a másik felét ezek nélkül tenyésztjük. Szövettenyésztő edényeket 2,75x107 primer csontvelősejtekkel ojtunk be, és a sejteket a fent leírt módon tenyésztjük. Ennek során a strómasejttel kondicionált közeget és az össze nem tapadt sejteket az edényekbe az első átvitelnél visszatöltjük. Amikor minden edény összefolyó strómasejt réteget tartalmaz, a sejteket tripszinezzük, és T75 edényeket (P1 átvitel) 2,5x106 sejtmennyiségben Po edényekből származó sejtekkel ojtunk be. Ezeket a sejteket egy héttel később összegyűjtjük, és minden edényből 2x106 sejtet átviszünk (P2 átvitel), amit továbbra is aFGF és heparin jelenlétében és távollétében végzünk.Hip bone marrow puncture was performed as described above on the dog ALG-5 and the resulting bone marrow was split into one half of the cells in the presence of FGF and heparin and the other half cultured without them. Tissue culture dishes were inoculated with 2.75x10 7 primary bone marrow cells and cultured as described above. During this, the stromal cell-conditioned medium and the non-adherent cells are returned to the vessels at the first transfer. When each vessel contained a confluent stromal cell layer, the cells were trypsinized and T75 dishes (P1 transfer) were inoculated with 2.5x10 6 cells from cells derived from Po dishes. These cells were harvested one week later and 2x10 6 cells were transferred from each well (P2 transfer), which was continued in the presence and absence of FGF and heparin.
Hasonló módon, a P2 sejteket a beojtástól számított 8 nap elteltével összegyűjtjük, és 1x106 sejtet viszünk minden P3 edénybe. Ennél az átvitelnél lecsökkentettük a sejtek számát, mivel az aFGF és heparin nélkül tenyészthető sejtek • · ' · ·Similarly, P 2 cells were harvested 8 days after inoculation and 1x10 6 cells were added to each P 3 vessel. We reduced the number of cells in this transfer since cells that can be grown without aFGF and heparin • · '· ·
• · · · · · ·• · · · · · ·
- 16 száma korlátozott, csak 1x10® sejt használható újraojtáshoz. Valamennyi edényt ezzel a sejtszámmal ojtunk be, és így minden edény összehasonlítható méretű populációt tartalmaz.- 16 is limited, only 1x10® cells can be used for grafting. All vessels are inoculated with this cell number and thus each vessel contains a population of comparable size.
A P3 sejteket a beojtástól számított 8 nap elteltével összegyűjtjük, és a P4 edényeket 1x106 sejtszámmal beojtjuk. A sejtek átvitelét folytatjuk, és mindenegyes összegyűjtés és újraojtás után óvatosan meghatározzuk a sejtszámot. Négy átvitel után a sejteket aFGF és heparin jelenlétében tenyésztve az összefolyás sokkal gyorsabban (7 nap alatt) elérhető, mint a fenti faktorok nélkül végzett tenyésztéssel (1 4 nap).AP 3 cells were harvested after 8 days from the beojtástól, and P 4 dishes seeded with 1x10 6 cells number. Cell transfer is continued and after each collection and grafting, the cell number is carefully determined. After four passages, the cells are cultured in the presence of FGF and heparin, and fusion is achieved much faster (7 days) than when cultured without the above factors (14 days).
Az egyes átvitelek összegyűjtésekor kapott sejtszámot az átvitel beojtásához használt sejtszámhoz viszonyítva meghatározzuk a sejtszám százalékos változását. A pozitív szám a sejtszám növekedésére, a negatív szám a sejtszám csökkenésére és 0 érték a sejtszám változatlan szinten maradására utal. Az összetapadt strómasejtek a primer tenyészet (Po) minden edényében megfogannak. A Po tenyészet végén nagyobb sejtszámot kapunk az aFGF és heparin nélküli edényekben (1. ábra). A P-ι átvitelben mindkét sejtcsoport expandálódik, de az aFGF és heparin jelenlétében tenyésztett sejtek növekedése 2,5-ször nagyobb, mint az aFGF és heparin nélkül tenyésztett sejtek növekedése. Talán ennél is fontosabb, hogy az aFGF és heparin jelenlétében tenyésztett sejtek növekedése folyamatos a 2, 3, 4 és 5 átvitel folyamán, míg az aFGF és heparin nélkül tenyésztett sejtek ezeknél az átviteleknél már csak alig, vagy egyáltalán nem növekednek.The number of cells obtained at the time of collection of each transfer is calculated as a percentage change in the number of cells used to inoculate the transfer. A positive number indicates an increase in cell number, a negative number indicates a decrease in the number of cells, and a value of 0 indicates that the cell number remains unchanged. The adherent stromal cells are trapped in all vessels of the primary culture (Po). At the end of P o culture, higher numbers of cells were obtained in dishes without aFGF and heparin (Fig. 1). In P-ι transmission, both cell groups expand, but the growth of cells cultured in the presence of aFGF and heparin is 2.5-fold greater than that of cells cultured in the absence of aFGF and heparin. Perhaps more importantly, cells cultured in the presence of aFGF and heparin continue to grow during transfer 2, 3, 4, and 5, whereas cells cultured in the absence of aFGF and heparin show little or no growth in these transmissions.
- 17 Az 1. ábrán a Po átvitelnél valamennyi edényre mutatott negatív szám arra utal, hogy a csontvelő-strómasejtek csak kis frakciót képeznek a csontvelő primer megcsapolásával nyert sejtmagvas sejtek ossz populációjában, és ezenkívül igazolják, hogy az aFGF és a heparin szignifikáns pozitív hatást gyakorol a kutya csontvelő-strómasejtek in vitro növekedésére.- 17 Figure 1 is the P o transmissions all showed a vessel negative number indicates that the bone marrow stromal cells constitute only a small fraction of nucleated cells from the bone marrow primary tapping share population of, and in addition, demonstrate that aFGF and heparin significant positive effect has been implicated in the in vitro growth of canine bone marrow stromal cells.
Az ALG-5 jelű kutyától nyert csontvelő-strómasejteknél kiszámoltuk az összes növekedést is aFGF és heparin jelenlétében és távollétében. Az így kijött, az egyes edényekben mért ossz strómasejt-számot (+/- aFGF és heparin) a beágyazódás! periódus végén megszorozzuk az első átvitelre érvényes sejtszám változás átlagával. Az ossz növekedést hasonlóan számoljuk minden egyes átvitelhez (2. ábra). A 2. ábráról látható, hogy az aFGF és heparin nélkül végzett tenyésztés gyakorlatilag nem mutat növekedést. Másrészről, az aFGF és heparin jelenlétében végzett tenyésztés jelentős növekedést mutat 60x107 sejt értékig a P6 átvitelben.Bone marrow stromal cells obtained from dog ALG-5 were also calculated for total growth in the presence and absence of aFGF and heparin. This is how the total number of stromal cells (+/- aFGF and heparin) in each vessel is measured for implantation! at the end of the period multiplied by the average change in cell number for the first transfer. Total growth is calculated similarly to each transmission (Figure 2). Figure 2 shows that cultivation without aFGF and heparin shows virtually no growth. On the other hand, culturing in the presence of aFGF and heparin shows a significant increase to 60 x 10 7 cells in P 6 transfer.
Az ALG-5 jelű kutyából származó sejteket vizuálisan is ellenőrizzük minden átvitel végén közvetlenül a tripszines kezelés és begyűjtés előtt. Az aFGF és heparin jelenlétében növesztett sejtek több átvitelen keresztül megőrzik a fibroblaszt-szerű morfológiát, míg az aFGF és heparin nélkül tenyésztett sejtek lapos morfológiát vesznek fel az első vagy második átvitel után.Cells from dog ALG-5 are also visually inspected at the end of each transfer immediately prior to trypsin treatment and collection. Cells grown in the presence of aFGF and heparin retain fibroblast-like morphology through multiple transmissions, whereas cells cultured in the absence of aFGF and heparin adopt flat morphology after the first or second transfer.
Összefoglalva megállapítható, hogy az eredmények egyértelműen igazolják, hogy az aFGF és a heparin fokozza a kutya csontvelő-strómasejtek növekedését, és a tenyészet·· · · ·· ···In summary, the results clearly show that aFGF and heparin enhance the growth of canine bone marrow stromal cells and the culture ··· · ···················································································
- 18 ben fenntartja a sejtek jellemző fibroblaszt-szerű morfológiáját.18 maintains the characteristic fibroblast-like morphology of cells.
Humán csontvelő-strómasejtek tenyésztéséhez humán csontvelőt távolítunk el a combcsont fejrészéből, amit eldobnak a csípőtranszplantációs műtétnél. A csontvelő más módszerekkel is kinyerhető. A csontvelőt szövettenyésztő közeget, így 50 μg/ml Fungizonnal és 50 pg/ml gentamicinnel kiegészített RPMI vagy DMEM közeget tartalmazó csövekbe töltjük. A közegben szuszpendált csontot és szövetet steril ollóval finoman felaprítjuk, 10 percen keresztül 500 g értéken centrifugáljuk, majd 16 %, hővel inaktivált FBS-t tartalmazó szövettenyésztő közegben szuszpendáljuk a cső óvatos forgatásával. A nagyméretű csont- és szövettöredékeket hagyjuk a cső aljára ülepedni, amihez mintegy 1 perc szükséges. A szuszpendált sejteket tartalmazó felülúszót óvatosan eltávolítjuk, és 10 percen keresztül 500 g értéken centrifugáljuk. A sejtpelletet egyszer teljes csontvelő-strómasejt-közeggel centrifugálva mossuk, friss teljes közegben szuszpendáljuk, és a sejteket megszámoljuk. Ezeket a primer csontvelősejteket először zselatinnal és FBS-sel kezelt edényekben tenyésztjük a kutya csontvelő-strómasejt tenyészet ismertetésénél megadott módon, és 1x108 sejt/T150 edény mennyiségben.For the cultivation of human bone marrow stromal cells, human bone marrow is removed from the femoral head and discarded at hip transplant surgery. Bone marrow can also be obtained by other methods. The bone marrow is filled into tubes containing tissue culture medium such as RPMI or DMEM medium supplemented with 50 μg / ml Fungizone and 50 pg / ml gentamicin. Bone and tissue suspended in the medium are finely chopped with sterile scissors, centrifuged at 500 g for 10 minutes, and resuspended in 16% tissue culture medium containing heat-inactivated FBS by gentle rotation of the tube. The large bone and tissue fragments are allowed to settle on the bottom of the tube, which takes about 1 minute. The supernatant containing the suspended cells was carefully removed and centrifuged at 500 g for 10 minutes. The cell pellet was washed once by centrifugation with complete bone marrow-stromal cell medium, resuspended in fresh whole medium, and counted. These primary cultured bone marrow cells are first treated with gelatin and FBS vessels entered the dog bone marrow stromal cell culture is the description of the way and 1x10 8 cells / T150 container quantities.
A humán csontvelő-strómasejteket a fent ismertetett eljárással és teljes közeggel szelektáljuk és in vitro expandáljuk. Amellett, kisméretű humán combcsont-töredékeket adunk a teljes közeget tartalmazó szövettenyésztő edényekhez. A kifejlődő csontvelő-strómasejtek megtapadnak az edényen, és ezeket a többi csontvelő-strómasejtekkel azonos • · · · · « • · · ···«·· • · · « · •· · « ·· 4·*Human bone marrow stromal cells are selected and expanded in vitro using the method described above and in whole medium. In addition, small human femur fragments are added to the complete culture tissue culture vessels. The developing bone marrow stromal cells adhere to the vessel and are identical to the other bone marrow stromal cells.
- 19 módon kezeljük. A humán csontvelő-strómasejteket szelektáljuk és expandáljuk a különböző egyedektől származó primer csontvelőből, ahol a sejtek expandálását legalább 2x108 sejtszintig végezzük.- We handle it in 19 ways. Human bone marrow stromal cells are selected and expanded from primary bone marrow from different individuals, wherein the cells are expanded to at least 2x10 8 cellular levels.
A transzfektált kutya csontvelő-strómasejtek képesek humán növekedési hormon in vitro kifejezésére és kiválasztására. Annak igazolására, hogy a fent ismertetett eljárással kapott csontvelő-strómasejtek transzfektálhatók, pETKhGH expressziós vektort állítunk elő, és a szokásos módon kutya strómasejtekbe transzfektáljuk. A kutyamodell egy általánosan elfogadott állati modell a humán csontvelőrendszerre, így a kutyával kapott eredmények alapján megjósolható a humán betegnél elérhető hatékonyság.Transfected canine bone marrow stromal cells are capable of expressing and secreting human growth hormone in vitro. To confirm that the bone marrow stromal cells obtained by the method described above were transfected, a pETKhGH expression vector was prepared and transfected into canine stromal cells in the usual manner. The canine model is a generally accepted animal model for the human bone marrow system, so the results obtained with the dog can be used to predict the efficacy of the human patient.
A vektort pTKGH plazmidból (Selden és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 6, 3173-3179 (1986)) állítjuk elő, amely humán növekedési hormon (hGH) gént, valamint a HSV timidinkináz (TK) promoter szekvenciák (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA, USA) transzkripcionális szabályzása alá eső intronokat tartalmaz. Emellett, az SV40 fokozóból származó 179 bázispár méretű Fokl-Pvull restrikciós enzimfragmenst Hindlll hellyel egészítjük ki PCR technikával, amelynek során templátként pSV(E)-MLP plazmid származékát (Hurwitz és munkatársai: Nuc. Acids Rés., 15, 7137-7153 (1987)) alkalmazzuk, majd a TK promoter pTKGH származékának Hindlll helyébe klónozzuk. A pETKhGH plazmid nem tartalmaz eukarióta replikációs origót, és nem integrálódik a gazdasejt genomjába. Ennek megfelelően, a vektor átmenetileg fejezi ki a hGH-t.The vector was constructed from the plasmid pTKGH (Selden et al., Mol. Cell. San Juan Capistrano, CA, USA) contains introns that are transcriptionally regulated. In addition, a 179 bp Fokl-Pvull restriction enzyme fragment from the SV40 enhancer was complemented with a HindIII site by PCR using a plasmid derivative of pSV (E) -MLP as a template (Hurwitz et al., 1987, Nuc. Acids Res. 15, 7137-7153). )) and cloned into the HindIII site of the derivative of the TK promoter pTKGH. Plasmid pETKhGH does not contain a eukaryotic origin of replication and does not integrate into the host cell genome. Accordingly, the vector temporarily expresses hGH.
I ··« ··· ·· · ··I ·· «··· ··· ···
- 20 Kutya csontvelő-strómasejteket pETKhGH expressziós vektorral transzfektálunk CaPO4-DNS együttes kicsapásos módszerrel, amelyhez MBS emlős transzfekciós készletet (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) alkalmazunk, vagy kationos lipid-DNS komplex módszerrel, amelyhez LIPOFEKTAMIN reagenst és OPTI-MEM I redukált szérumközeget (Life Technologies) alkalmazunk a gyártó előírásai szerint. A CaPO4 módszert az ALG-3 jelű kutyától nyert sejtek transzfektálására, míg a lipofekciós módszert az ALG9 jelű kutyától nyert sejtek transzfektálására használjuk. A DNS-t a CaPO4 módszerrel 3,2x10® sejtbe transzfektáljuk egy nappal a T150 palackba a P2 átvitelhez történő beojtás után. A sejteket 150 pg pETKhGH plazmiddal transzfektáljuk 24 órán keresztül. Ezek a sejtek hatékonyan növekednek, és fibroblaszt-szerű morfológiát mutatnak.- 20 canine bone marrow stromal cells were transfected with the pETKhGH expression vector using the CaPO 4 DNA co-precipitation method using the MBS mammalian transfection kit (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) or the cationic lipid-DNA complex method using LIPOFEK. -MEM I reduced serum medium (Life Technologies) was used according to the manufacturer's instructions. The CaPO 4 method is used to transfect cells derived from dog ALG-3, while the lipofection method is used to transfect cells obtained from dog ALG9. The DNA was transfected into 3.2x10® cells by the CaPO 4 method one day after inoculation into the T150 flask for P 2 transfer. Cells were transfected with 150 pg of pETKhGH for 24 hours. These cells grow efficiently and exhibit fibroblast-like morphology.
A DNS-t Iipofekcióval 1,2x10® sejtbe transzfektáljuk a T150 edénybe a P6 átvitelhez történő beojtás után egy nappal. A kapott sejtek növekedése elmarad az előző átvitelnél mért növekedéstől, és a celluláris morfológia megváltozik, ezért a sejtek inkább laposak és szétterülök. Ezeket a sejteket 6 órán keresztül 40 pg pETKhGH plazmiddal transzfektáljuk összesen 4,28 ml OPTI-MEM és 0,24 ml LIPOFEKTAMIN reagens jelenlétében.The DNA was transfected Iipofekcióval 1,2x10® cell T150 flask the day after seeding of the P 6 in transmission. The growth of the resulting cells is less than that of the previous transfer, and the cellular morphology is altered, so that the cells are more flat and spread out. These cells were transfected with 40 pg of pETKhGH for 6 hours in the presence of a total of 4.28 ml OPTI-MEM and 0.24 ml LIPOFECTAMINE reagent.
A hGH kiválasztás mértékét radioimmunoassay (RIA) vizsgálattal határozzuk meg hGH-TGES készlet (Nichols Institute Diagnostics) segítségével. Az eredményeket két párhuzamos átlagában fejezzük ki. Mind a korai (P2), mind a késői (P6) átvitelben szereplő kutya-strómasejtek nagy menynyiségben fejeznek ki és választanak ki hGH transzgén tér• · · · ··· · · · • · · · ·· »··The degree of hGH secretion was determined by radioimmunoassay (RIA) assay using the hGH-TGES kit (Nichols Institute Diagnostics). The results are expressed as two parallel averages. Both early (P 2 ) and late (P 6 ) transmission canine stromal cells express and secrete large amounts of hGH transgenic space.
- 21 méket a pETKhGH expressziós vektorral történő transzfektálás után (3. ábra). A hGH kifejezés abszolút szintje változik a vizsgált egyedi állattól, a sejtek átvitelének számától és a transzfekció módszerétől függően.- 21 mice after transfection with pETKhGH expression vector (Figure 3). The absolute level of hGH expression varies depending on the individual animal tested, the cellular transfer rate and the method of transfection.
A 3. ábráról látható, hogy az ALG-3 jelű kutyából nyert sejtek által kifejezett hGH abszolút szintje 1-2,5 μg között változik 24 órára és 106 sejtre vonatkoztatva. Az ALG-9 jelű kutyából nyert sejtek által kifejezett hGH abszolút szintje mintegy 3-5 pg között változik 24 órára és 10s sejtre vonatkoztatva a Ps és P7 átvitel között, és ezután mintegy 0,5 pg és közel 0 értékre csökken a Ps és P9 átvitelben.Figure 3 shows that the absolute level of hGH expressed by cells derived from ALG-3 dog ranges from 1 to 2.5 µg per 24 hours and 10 6 cells. Absolute level expressed by the cells from dog ALG-9 hGH sign changes with respect to 24 to 10 hours and cell between P s and P 7 is transferred between about 3-5 pg, and then decreased to about 0.5 pg to nearly 0 Ps and P 9 transmission.
A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módja értelmében a csontvelő-strómasejtek fagyasztva tárolhatók a szövettenyészetben történő expandálás előtt vagy után.In one embodiment of the method of the invention, bone marrow stromal cells can be frozen before or after expansion in tissue culture.
A primer módon lecsapolt csontvelő fagyasztva tárolásához sejtmagvas sejteket állítunk elő a fent ismertetett FICOLL gradiens módszerrel, és 50 % közeg és 50 % FBS elegyben szuszpendáljuk például 2-5x1 07 sejt/ml mennyiségben. A szuszpenziót alikvot részletekben, például 900 μΙ, fiolákban, például 2 ml-es steril kriogén fiolákban (Corning, katalógusszám: 25704) töltjük, amely 100 μΙ dimetil-szulfoxidot tartalmaz. A fiolákat 24 órán keresztül -80 °C hőmérsékleten tároljuk, majd -150 °C hőmérsékletre hűtjük fagyasztóban vagy folyékony nitrogéntartályban, ahol hosszú időn át tarthatók.For frozen storage of the primary drained bone marrow, nucleated cells are prepared by the FICOLL gradient method described above and suspended in 50% medium and 50% FBS, for example at 2-5x10 7 cells / ml. The suspension is filled in aliquots, for example 900 μΙ, in vials such as 2 ml sterile cryogenic vials (Corning, Cat. No. 25704) containing 100 μΙ of dimethylsulfoxide. The vials are stored at -80 ° C for 24 hours and then cooled to -150 ° C in a freezer or liquid nitrogen container where they can be stored for extended periods.
A tenyészetben növesztett strómasejtek fagyasztásos tárolásához a közeget eltávolítjuk a szövettenyésztő edényből, és a sejteket Dulbecco foszfátpufferolt sóoldattal (Dibco 14190-144) egyszer átöblítjük. A sejteket ezután leválasztI ··· ··· ·» »·«For freezing storage of cultured stromal cells, the medium is removed from the tissue culture vessel and the cells are rinsed once with Dulbecco's phosphate buffered saline (Dibco 14190-144). The cells are then detached · · · · · »
- 22 juk az edény vagy lemez felületéről, amit tripszin/EDTA oldattal (0,05 % tripszin és 0,53 mmól/l EDTA; Gibco 25300062) végzünk. A tripszinezést azonos térfogatú közeg hozzáadásával megállítjuk, és a sejtszuszpenziót 500 g értéken centrifugálva a sejteket pelletáljuk. A pelletált sejteket közegben (például 3 ml közegben) szuszpendáljuk, és megszámoljuk. A sejtsürüséget 1x106 sejt/ml értékre állítjuk 10 tömeg% dimetil-szulfoxidot tartalmazó közeggel (Sigma D8779). A sejteket alikvot részletekben (például 1 ml térfogatban) steril kriogén fiolákba (Corning 25704) töltjük, és azonnal -80 °C hőmérsékletre hűtjük. 24 óra elteltével a fiolákat folyékony nitrogéntartályba vagy -150 °C hőmérsékletű fagyasztóba visszük, ahol hosszú időn keresztül tárolhatók.- 22 from the surface of the vessel or plate with trypsin / EDTA solution (0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA; Gibco 25300062). The trypsinization was stopped by adding an equal volume of medium and the cells were pelleted by centrifugation of the cell suspension at 500 g. The pelleted cells were resuspended in medium (e. G. 3 ml) and counted. Cell density was adjusted to 1 x 10 6 cells / ml with 10% w / w dimethylsulfoxide (Sigma D8779). Cells were aliquoted into sterile cryogenic vials (Corning 25704) in aliquots (e.g., 1 ml) and immediately cooled to -80 ° C. After 24 hours, the vials are transferred to a liquid nitrogen container or freezer at -150 ° C where they can be stored for long periods.
A megoldás alkalmas nagyszámú tenyésztett strómasejt fagyasztva tárolására is. Ennek során például úgy járunk el, hogy a fent leírt módon begyűjtött sejteket szuszpendáljuk, és 200 ml sejtszuszpenziót 250 ml centrifugacsőbe helyezünk, és 500 g értéken centrifugálva a sejteket pelletáljuk. A pelletált sejteket 10-20 ml közegben szuszpendáljuk, és megszámoljuk. A szuszpenziót ezután közeggel 45 ml térfogatra töltjük, és 18 gauge méretű tűvel ellátott steril fecskendővel szállítótartályokba (Baxter Fenwal, 4R2001) töltjük. A sejtekhez 5 ml dimetil-szulfoxidot adunk, majd az edényeket egy éjszakán keresztül -80 °C hőmérsékleten tároljuk. 24 óra elteltével az edényeket folyékony nitrogéntartályba vagy -150 °C hőmérsékletű fagyasztóba helyezzük, ahol hosszú időn keresztül tárolhatók.The solution is also suitable for frozen storage of a large number of cultured stromal cells. For example, cells harvested as described above are suspended and 200 ml of cell suspension is placed in a 250 ml centrifuge tube and pelleted by centrifugation at 500 g. The pelleted cells were resuspended in 10-20 ml media and counted. The suspension is then filled with medium to a volume of 45 ml and filled into sterile syringes (Baxter Fenwal, 4R2001) with a 18 gauge needle sterile syringe. To the cells is added 5 ml of dimethyl sulfoxide and the dishes are stored overnight at -80 ° C. After 24 hours, the dishes are placed in a liquid nitrogen container or freezer at -150 ° C where they can be stored for long periods.
A találmány szerinti megoldást a fenti részletes leírással ismertettük, de nyilvánvaló, hogy a megadott leírás csak • · · · · · • · · ······ • · · * · · ·· · · ·· ···The present invention has been described with reference to the foregoing detailed description, but it is to be understood that the description given is only that of the present invention.
- 23 bemutató jellegű, és nem jelenti az oltalmi kör korlátozását. Ettől eltérő megvalósítások, előnyök és módosítások is az igénypontokban meghatározott oltalmi kör alá tartoznak.- 23 are for display purposes only and do not constitute a limitation of the scope of protection. Other embodiments, advantages and modifications are within the scope of the claims.
Claims (22)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9900825A HUT78047A (en) | 1995-12-29 | 1995-12-29 | Expansion of bone marrow stromal cells |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9900825A HUT78047A (en) | 1995-12-29 | 1995-12-29 | Expansion of bone marrow stromal cells |
| CN95198024A CN1209836A (en) | 1995-12-29 | 1995-12-29 | Expansion of bone marrow stromal cells |
| PCT/US1995/017073 WO1997024434A1 (en) | 1995-12-29 | 1995-12-29 | Expansion of bone marrow stromal cells |
| CA002240790A CA2240790C (en) | 1995-12-29 | 1995-12-29 | Expansion of bone marrow stromal cells |
| US08/581,059 US5766950A (en) | 1995-12-29 | 1995-12-29 | Expansion of bone marrow stromal cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT78047A true HUT78047A (en) | 1999-07-28 |
Family
ID=27508653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9900825A HUT78047A (en) | 1995-12-29 | 1995-12-29 | Expansion of bone marrow stromal cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HUT78047A (en) |
-
1995
- 1995-12-29 HU HU9900825A patent/HUT78047A/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4526186B2 (en) | Methods and compositions for maintaining hematopoietic stem cells in vitro | |
| CA2629405C (en) | Tissue engineering methods and compositions | |
| Zhuo et al. | Cumulus oophorus extracellular matrix: its construction and regulation | |
| US5824547A (en) | Method for production of transfected cells | |
| Goldman | The use of heavy meromyosin binding as an ultrastructural cytochemical method for localizing and determining the possible functions of actin-like microfilaments in nonmuscle cells. | |
| EP1077254A2 (en) | Multiple mesodermal lineage differentiation potentials for adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof | |
| EP2179030B1 (en) | Human disc tissue | |
| CN106687581A (en) | Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use | |
| CN101735981B (en) | Process for producing cytotoxic lymphocyte | |
| WO2006078034A1 (en) | Cells capable of differentiating into cardiac muscle cells | |
| US20120100607A1 (en) | Compositions of adult disc stem cells and methods for the treatment of degenerative disc disease | |
| US5962323A (en) | Expansion of bone marrow stromal cells | |
| WO1998020907A1 (en) | TGFβ1-RESPONSIVE CELLS FROM BONE MARROW | |
| WO1997024144A1 (en) | Methods of preparing bone marrow stromal cells for use in gene therapy | |
| AU722569B2 (en) | Expansion of bone marrow stromal cells | |
| HUT78047A (en) | Expansion of bone marrow stromal cells | |
| CA2240790C (en) | Expansion of bone marrow stromal cells | |
| EP1120462A1 (en) | Expansion of bone marrow stromal cells | |
| AU774775B2 (en) | Expansion of bone marrow stromal cells | |
| US6991787B1 (en) | Methods of preparing bone marrow stromal cells for use in gene therapy | |
| US20100062038A1 (en) | Markers, Antibodies and Recombinant scFvs for Mesenchymal Stem Cell Sub-populations and Osteoclasts | |
| AU2013222002B2 (en) | Tissue engineering methods and compositions | |
| Emami et al. | Enhanced growth of canine bone marrow stromal cell cultures in the presence of acidic fibroblast growth factor and heparin | |
| JP2003116533A (en) | Cartilage cell strain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee |