HUT62652A - Process for producing humqnized cdr-inoculated anti-icam-1 antibodies - Google Patents

Description

Humanizált CDR-oltott

Λ

CL etjára^ előálitásfrifra anti-ICAM-1 antitestek fésf

CELLTECH LIMITED, Slough, Berkshire, NAGY-BRITANNIA

BOEHRINGER INGELHEIM PHARMACEUTICALS INC.,

Ridgefield,

Connecticut,

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Feltalálók:

ADAIR John Róbert,

High Wycombe, Buckinghamshire

ATHWAL Diljeet Singh,

London

NAGY-BRITANNIA

ROTHLEIN Róbert,

Danbury, Connecticut,

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A bejelentés napja: 1991. 04. 29.

Elsőbbsége: 1990. 04. 27. (90 09549.8)

NAGY-BRITANNIA

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US91/02942

A nemzetközi közzététel száma: WO 91/16927

76056-7177/SL

A találmány rekombináns antitest molekulára (RAM), elsősorban CDR-oltott humanizált antitest molekulára (HAM) vonatkozik, amely az egyes intercelluláris adhéziós molekula (ICAM-1) antigén determinánsára specifikus. A találmány kiterjed ennek rekombináns DNS technológiával történő előállítására, és terápiás felhasználására.

A találmány keretein belül a “rekombináns antitest molekula (továbbiakban RAM) kifejezés rekombináns DNS technológiával előállított antitestre vonatkozik, és felöleli a természetes immunoglobulinok analógjait és ezek fragmenseit. A CDR-oltott humanizált antitest molekula (továbbiakban HAM) kifejezés olyan molekulát jelent, amely egy nem-humán fajból származó immunoglobulinból levezetett antigénkötő helyet tartalmaz, a további, immunoglobulin eredetű részei humán immunoglobulinból származnak, ahol az antigén kötő hely olyan komplementaritást meghatározó szakaszokat tartalmaz, amelyek megfelelő humán változó dómén szerkezet szakaszokra ráoltott nem-humán immunoglobulinból származnak.

A jelen találmány kiterjed az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM és RAM felhasználására a granulocita vagy makrofág eredetű sejtek intercelluláris adhéziójának gátlására. Az ilyen molekulák felhasználása lehetővé teszi a specifikus és nem-specifikus gyulladások kezelését.

A találmány értelmében az ICAM-1 megkötésére alkalmas RAM és HAM felhasználható továbbá virusbetegségek, elsősorban rinovirus betegségek kezelésére.

A találmány kiterjed a leukociták HÍV fertőzésének, elsősorban HIV-1 fertőzésének terápiájára és megelőzésére, amelyhez a betegnek ICAM-1 megkötésére alkalmas RAM-t és HAM-t adagolunk. így lehetővé válik a HÍV vírus által okozott betegségek, igy az AIDS kezelése.

A találmány kiterjed továbbá egy olyan terápiás módszerre, amely megakadályozza a HIV-1 vírussal fertőzött sejteknek a keringési rendszerben történő migrálását, amelyhez ICAM-1 megkötésére alkalmas RAM-t és HAM-t adagolunk. így lehetővé válik a HIV-1 vírus által okozott betegségek, igy az AIDS kezelése.

A találmány értelmében az ICAM-1 megkötésére alkalmas RAM és HAM felhasználható az asztma kezelésére is.

A technika állása

A. Humanizált antitestek

A természetes immunoglobulinok régóta ismertek a belőlük enzimes hasítással előállítható különböző fragmensekkel, igy Fab, (Fab’)2 és Fc fragmensekkel együtt. A természetes immunoglobulinok általában Y-alaku molekulát képeznek, amely a két felső kar szabad végéhez közel antigén kötő hellyel rendelkezik. A fennmaradó szerkezet, közelebbről az Y szára közvetíti az immunoglobulin effektor funkcióját.

A természetes immunoglobulinok felhasználhatók a vizsgálatokban, a diagnózisban, és, korlátozott mértékben, a terápiában. Ezeket a felhasználási lehetőségeket, elsősorban a terápiás alkalmazást, gátolja a természetes immunoglobulinok poliklonális természete. Az immunoglobulinok terápiás szerként történő gyakorlati alkalmazhatóságát jelentős mértékben elősegítette a meghatározott specifitással rendelkező monoklonális antitestek előállításának felfedezése (Kohler és munkatársai: Natúré, 265, 295-497 (1975)). A legtöbb Mab előállításához azonban rágcsáló lépsejteket fuzionálnak rágcsáló mielóma sejtekkel. Ezek ezért lényegében rágcsáló fehérjék. Humán MAb előállításáról nagyon kevés ismerettel rendelkezünk.

A legtöbb ismert Mab rágcsáló eredetű, vagyis az emberrel szemben természetes antigén hatással rendelkeznek, ami nem-kivánt immunválaszt válthat ki. Ezt a választ HAMA válasznak (Humán Anti-Mouse Antibody; humán anti-egér antitest) nevezik. A rágcsáló MAb embernél történő terápiás felhasználását tehát jelentős mértékben korlátozza az a tény, hogy a humán beteg immunológiai választ ad az MAb-re, és vagy teljesen eltávolítja, vagy hatékonyságát jelentősen csökkenti. A gyakorlatban a rágcsáló eredetű MAb ugyanazon betegnél csak egy vagy legfeljebb néhány kezelésre alkalmazható, mivel a HAMA válasz rövid időn belül kifejlődik, és csökkenti az MAb hatékonyságát, és nemkívánatos mellékreakciókat okozhat.

Olyan megoldásokat dolgoztak ki, amelyek csökkentik a nem-humán MAb embernél kiváltott antigén hatását. Ezeket a megoldásokat általánosan humanizációs eljárásoknak nevezik.

Ennek során általában rekombináns DNS technológiát alkalmaznak az antitest molekula polipeptid láncait kódoló DNS szekvencia megváltoztatására.

Az MAb humanizálására szolgáló korai módszerek értelmében olyan kimér antitestet állítottak elő, amelyben egy antitest teljes változó doménjét tartalmazó antigénkötő hely kapcsolódik egy másik antitest állandó doménjeihez. Ilyen kimerizációs eljárást ismertet a 120 694 és 125 023 számú európai szabadalmi leírás, a 171 496 és 173 494 számú európai közrebocsátási irat és a WO 86/01533 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés. Ezek az irodalmak általában olyan antitest molekulák előállítását ismertetik, amelyek egy nem-humán MAb, igy egér MAb változó dóménjeit és egy humán immunoglobulin állandó dóménjeit tartalmazzák. Ezek a humanizált kimér antitestek azonban még mindig nagy mennyiségben tartalmaznak nem-humán aminosav szekvenciákat, igy a teljes nem-humán változó doméneket, és ezért HAMA választ válthatnak ki, elsősorban hosszabb időn keresztül történő adagolás esetén (Begent és munkatársai: Br. J. Cancer 62, 487 (1990)).

A 239 400 számú európai közrebocsátási irat szerint egy egér MAb komplementaritást meghatározó szakaszait (complementarity determining regions; továbbiakban CDR) humán immunoglobulin változó doménjeinek szerkezetébe oltják helyspecifikus mutációval, amelynek megvalósításához hosszú oligonukleotidokat alkalmaznak. A jelen találmány többek között humanizált antitest molekulákra, vagyis CDR-oltott humanizált antitest molekulákra vonatkozik, amiket a fenti eljárással állítunk elő. Az ilyen CDR-oltott humanizált antitestek kevésbé hajlamosak HAMA válasz kiváltására, mint a humanizált kimér antitestek, mivel kisebb a nem-humán aminosav szekvenciák aránya.

A CDR-oltásos MAb humanizálást eredetileg MAb-t felismerő szintetikus antigéneken, igy NP vagy NIP antigéneken végezték. Ismert azonban olyan példa is, amelyben egér MAb-t felismerő lizozimot és humán T-sejtre vonatkozó antigént felismerő patkány MAb-t humanizálnak CDR-oltással (Verhoeyen és munkatársai: Science, 239, 1534-1536 (1988); Riechmann és munkatársai: Natúré, 332. 323-324 (1988)). Humán T-sejtre vonatkozó antigénre specifikus CDR-oltott antitest előállítását ismerteti a WO 89/07454 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés.

A Riechmann-féle irodalom és a WO 89/07454 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint a CDR szakaszok önmagában történő átvitele (mint ezt korábban javasolták, lásd Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Humán Services, NIH, USA (1987); valamint Wu és munkatársai: J. Exp. Med. 132, 211-250 (1970)) nem biztosit kielégítő antigénkötő aktivitást a CDR-oltott termékbe. A Riechmann-féle irodalom szerint a humán szekvencia 27. pozíciójában található szerin-maradékot a patkányban található megfelelő fenil-alanin maradékká kell alakítani ahhoz, hogy megfelelő antigénkötő aktivitással rendelkező CDR-oltott terméket kapjunk. A nehéz láncegység fenti 27. pozíciója a CDR1 szomszédságában található szerkezeti hurokban van. Egy másik szerkezet, amely további módosításként humán szerin helyett patkány tirozint tartalmaz a nehéz láncegység 30. pozíciójában, nem eredményez lényeges kötőaktivitás változást a 27. pozícióban szerin helyett fenil-alanint tartalmazó humanizált antitesthez viszonyítva. Ez arra utal, hogy több komplex antigén felismerésére alkalmas hatékony antigénkötő aktivitással rendelkező CDR-oltott antitestek előállításához a CDR szakaszon kívül, elsősorban a CDR1 szomszédságában lévő hurokban kell megváltoztatni a humán szekvencia egyes maradékait. Még ebben az esetben is elmarad a legjobb CDR-oltott antitestek kötési aktivitása az eredeti MAb-hez képest.

Queen és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86. 10029-10033 (1989) és WO 90/07861 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés) olyan humanizált antitest előállítását ismertetik, amely interleukin-2 receptort blokkol. Ehhez egy egér MAb (anti-Tac) CDR szakaszát humán immunoglobulin szerkezettel és állandó szakaszokkal kombinálnak. Az alkalmazott humán szerkezeti szakaszok maximális homológiát mutatnak az anti-Tac MAb szekvenciával. Emellett, komputeres modellezéssel azonosították azokat a szerkezeti aminosav maradékokat, amelyekről feltehető, hogy kölcsönhatásba lépnek a CDR-rel vagy az antigénnel, és a humanizált antitest igy azonosított pozícióiban egér aminosavakat alkalmaztak.

* ·

- 8 A WO 90/07861 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés négy kritériumot javasol humanizált immunoglobulinok előállításához. Az első kritérium szerint humán akceptorként egy adott humán immunoglobulin szerkezetét használjuk, amely szokatlan mértékben homológ a humanizálandó nem-humán donor immunoglobulinnal, vagy több humán antitest közös szerkezetét használjuk fel. A második kritérium szerint az akceptor helyett inkább a donornak megfelelő aminosavat használjuk, ha a humán akceptornak megfelelő maradék nem szokásos aminosav, mig a donor maradék a szerkezet egy adott maradékánál a humán szekvenciában szokásos aminosav. A harmadik kritérium értelmében az akceptor helyett donor szerkezeti aminosav maradékot alkalmazunk a CDR közvetlen szomszédságában található pozíciókban. A negyedik kritérium szerint donor aminosav maradékot kell használni a szerkezet azon pozícióiban, ahol olyan aminosav szükséges, amely a háromdimenziós immunoglobulin modellben a CDR 3 A-ös környezetébe benyúló oldallánccal rendelkezik, és kölcsönhatásba lép az antigénnel vagy a humanizált immunoglobulinban lévő CDR-rel.

A javaslat szerint a második, harmadik vagy negyedik kritérium alkalmazható az első kritériummal együtt vagy ahelyett, illetve önmagában vagy bármely kombinációban.

A WO 90/07861 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés részletesen ismerteti egy CDR-oltott humanizált antitest, az IL-2 receptor p55 Tac fehérjéjére specifikus humanizált antitest előállítását. Ennek során » · • « β · » • · « · * · · • «· * · · · ♦ ·»» « ·· · ·

- 9 mind a négy említett kritériumot figyelembe vették, és akceptorként az Eu humán antitest (Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Humán Services, NIH (1987)) változó szerkezetét használták. A kapott humanizált antitestben a donor CDR-ek megfelelnek Kábát és munkatársai definíciójának (Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Humán Services, NIH (1987); valamint Wu és munkatársai: J. Exp. Med. 132. 211-250 (1970)), és emellett egér donor maradékokat tartalmaz a humán akceptor maradékok helyett a nehéz láncegység 27., 30., 48., 66., 67., 89., 91., 94., 103.,

104., 105. és 107. pozíciójában, és a könnyű láncegység 48., 60. és 63. pozíciójában a változó szerkezetben. Az igy előállított humanizált anti-Tac antitest affinitása a p55 vonatkozásában 3 x 10⁹ M¹, ami mintegy egyharmada az egér MAb affinitásának.

Továbbfejlesztették a CDR-oltott humanizált antitest molekulák előállítására szolgáló módszereket, és a változó területek szerkezetében (vagyis a változó területeken található CDR-n és szerkezeti hurkon kívül) azonosították az egyes pozíciók hierarchiáját, amelyen belül azonos aminosav maradékokat kell használni ahhoz, hogy megfelelő kötőaffinitással rendelkező CDR-oltott terméket kapjunk. Ez lehetővé tette a megfelelő CDR-oltott termékek előállítására szolgáló előírás összeállítását, amely a donor immunoglobulin és az akceptor szerkezet közötti homológiától függetlenül széles körben használható.

Tempest és munkatársai (Biotechnology, 9, 266-271 (1991)) olyan átformált humán monoklonális antitest előállítását ismertetik, amely gátolja a humán respirációs szincitiál vírus (RSV) in vivő fertőzését. Az átformált antitest előállításához az RSV fertőzést semlegesítő egér MAb-ből származó CDR-t kódoló szintetikus oligonukleotidokat helyspecifikus mutációval humán IgGl monoklonális antitest szerkezetét kódoló DNS-be oltották. Az egyszerű, átformált antitest, amelyben csak a CDR-eket transzformálták az egér és a humán antitest között, csak csekély RSV kötést biztosit, amely alig haladja meg a háttér értéket. A kötőképesség részleges megőrzése érdekében a nehéz láncegység CDR3-jával szomszédos szerkezet humán csoportjait egér csoportokra kell cserélni.

A fenti irodalom szerint a funkcionális HAM előállítása során kritikai fontossággal bíró szerkezeti szakaszban található maradékok nincsenek összhangban a Queen és munkatársai által azonosított maradékokkal (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989) és WO 90/07861 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés). Ez a receptura a kritikus maradékok azonosításával együtt részletesen megtalálható a PCT/GB90/02017 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben, amely többek között leírja az egér anti-ICAM-1 monoklonális antitest CDR oltását is.

·* ···

- 11 B. Leukocita megkötése és funkciói

A leukocitáknak és a granulocitáknak celluláris szubsztrátumhoz kell tapadni ahhoz, hogy gyulladásos választ adjanak, és igy megfelelő mértékben megvédjék a gazdaszervezetet a behatolóktól, igy vírusoktól, baktériumoktól és allergénektől. Ezt a tényt két, egymástól független kutatási feladat alátámasztja.

Az első feladatban leukocita membrán fehérjéket vizsgáltak (Wallis W.J. és munkatársai: J. Immunoi. 135, 2323-2330 (1985) ; Mentzer S. J. és munkatársai: J. Cell. Physiol. 126. 285-290 (1986); Haskard D.O. és munkatársai: J. Immunoi. 137, 2901-2906 (1986); Harlan J.M. és munkatársai: Blood, 66, 167-178 (1985)). A celluláris adhézió folyamatában fontos szerepet töltenek be a leukocita membrán fehérjék, elsősorban ezek CD18 jelű csoportja. Ez a csoport három heterodimerből áll (Mac-1, LFA-1 és P150,90), ezek mindegyike egy közös alegységből (β-alegység) és egy egyedi alegységből (α-alegység) áll (Springer T.A. és munkatársai: Immunoi. Rév. 68, 111-135 (1982); Springer T. és munkatársai: Fed. Proc. 44. 2660-2663 (1985); Keizer G. és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 15, 1142-1147 (1985); Sanchez-Madrid F. és munkatársai: J. Exper. Med. 158. 1785-1803 (1983)).

A leukocita membrán fehérjék CD18 csoportjával szembeni monoklonális antitestek, amelyek a fehérjéket antagonizálják, in vitro gátolják a különböző, leukocita adhéziótól • · ·<> ♦ <»·· *» * · ·* · • · · «· • ♦*·· » 9 ··«· · ·· «· függő folyamatokat. Ezekre példaként említhető a granulociták megfelelő stimulálásra bekövetkező aggregációja, a granulociták fehérjével bevont műanyaghoz történő hozzátapadása, a granulociták kétdimenziós agaróz vizsgálatban történő vándorlása, és a granulociták endotéliális sejtekhez történő hozzátapadása.

A másik esetben olyan betegeket vizsgáltak, akik a leukocita adhéziós molekulák CD18 csoportjában található közös alegységet kódoló gén örökletes hibája miatt képtelenek az ilyen adhéziós molekuláknak a sejtek felületén történő kifejezésére. Ezt a betegséget leukocita tapadás hiány betegségnek (Leukocyte adherence deficiency disease, LAD) nevezik (Anderson D.C. és munkatársai: Fed. Proc. 44. 2671-2677 (1985); Anderson D.C. és munkatársai: J. infect. Dis. 152, 668-689 (1985)). A LAD betegség jellemzői a lágy szövetek elhalásos sérülései, a legyengült gennyképződés és sebgyógyulás, valamint az abnormális in vitro adhéziófüggő leukocita funkciók, és a krónikus és gyógyulás utáni bakteriális fertőzésre vonatkozó érzékenység. Az ilyen LAD betegektől vett granulociták in vitro ugyanolyan kóros módon viselkednek, mint a normál minták anti-CD18 monoklonális antitest jelenlétében. Ez azt jelenti, hogy képtelenek az adhézióval összefüggő funkciók betöltésére, vagyis az aggregációra, vagy az endotéliális sejtekhez történő hozzákötődésre. Sokkal fontosabb azonban az a megfigyelés, hogy ezek a betegek képtelenek normál gyulladásos válasz kiváltására, mivel a granulociták nem tapadnak meg a celluláris szubsztrátumon. Még figyelemreméltóbb az a megfigyelés, hogy az LAD betegekből vett granulociták nem képesek eljutni a gyulladás, igy bőrfertőzés helyére, mivel nem tapadnak meg a vérben a gyulladásos sérülés közelében megtalálható endotéliás sejteken. Ez utóbbi fontos lépése a vérkilépésnek.

Összefoglalva tehát a limfocitáknak és a granulocitáknak az állat egészsége és életképessége megtartásához más sejtekhez (például endotéliális sejtekhez) kell kapcsolódniuk. A granulocita-endotéliális sejt összekapcsolódáshoz a két sejtnek érintkeznie kell egymáshoz, amelyhez specifikus receptor molekulák szükségesek a granulocita sejt felületén. Ezek a receptorok lehetővé teszik, hogy a leukocita más leukocitákhoz, endotéliális sejtekhez vagy más nem-vaszkuláris sejtekhez tapadjon.

A leukociták sejtfelületi receptor molekulái közeli rokonságban állnak egymással. Embernél a leukocita sejtfelületi receptor molekulák hiánya krónikus, és visszatérő fertőzéseket, valamint más klinikai szimptómákat okoz. A gyulladásos reakciók lecsökkennek, ha a leukociták nem képesek normális módon megtapadni a CD18 komplex funkcionális adhéziós molekulák hiánya miatt. Mivel a leukociták adhéziója részt vesz abban a folyamatban, amelynek következtében szöveti gyulladás lép fel, a leukocita adhéziók közelebbi megismerése különleges fontossággal bir a specifikus és nem-specifikus gyulladás kezelésének kidolgozásában.

Emellett, mivel a limfocita adhézió részt vesz abban a folyamatban, amelyben az idegen testet vagy szövetet fel14 ismerik és kilökik, a folyamat megismerése nagyon fontos a szervátültetések, szövetátültetések, az allergia és az onkológia területén.

C. Az ICAM-l intercelluláris adhéziós molekula és a celluláris adhézió

Az ICAM-l intercelluláris adhéziós molekulát először Rothlein R. és munkatársai módszerével (J. Immunoi. 137. 1270-1274 (1986)) azonosították, és részlegesen jellemezték. Az ICAM-l molekulát, ennek előállítását, tisztítását és jellemzőit részletesen a WO 90/03400 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti.

Az ICAM-l molekuláról eredetileg feltételezték, hogy részt vesz az endotéliális sejtek és a leukociták közötti celluláris adhézió folyamatában. A celluláris adhézió az a folyamat, amelynek során a leukociták a celluláris szubsztrátumhoz, igy az endotéliális sejtekhez kapcsolódnak, annak érdekében, hogy a keringéssel a kezdődő gyulladás helyére vándoroljanak, és a gazdaszervezetet megvédjék a behatolókkal, igy baktériumokkal vagy vírusokkal szemben. A védekező rendszer részletes leírása megtalálható az Eisen H.W.: Microbiology, 3. kiadás, Harper and Row, Philadelphia, PA, USA 290-295. és 381-418 (1980) irodalomban.

Az endotéliális sejtek felületén megtalálható egyik molekula, amely részt vesz az adhéziós folyamatban, az ICAM-1. Ez a molekula elősegíti az adhéziót úgy, hogy megköti a

CD-18 molekulát, amely a leukociták felületén található glikoproteinek CD-11/18 csoportjába tartozik (Sanchez-Madrid

F. és munkatársai: J. Exper. Med. 158. 1785-1803 (1983) ; Keizer G.D. és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 15, 1142-1147 (1985)).

Az intercelluláris adhéziós molekula (ICAM-1) egy indukálható sejtfelületi glikoprotein, amit különböző sejttípusok, igy vaszkuláris endotéliális sejtek fejeznek ki, elsősorban a fertőzés helyén. Mivel az ICAM-1 az LFA-1 természetes kötőligandumja, az ICAM-1 és az LFA-1 közötti kölcsönhatás központi szerepet játszik a celluláris adhézióban, a limfocitáknak a gyulladás helyére történő vándorlásában és a limfocita funkciók kiváltásában, amely érinti a specifikus és a nem-specifikus gyulladást egyaránt.

D. A humán rinovirus celluláris receptora

Abraham és munkatársai (J. Virol. 51, 340-345 (1984)) felfedezték, hogy a legtöbb véletlenszerűen kiválasztott humán rinovirus (HRV) szerotipus képes ugyanahhoz a celluláris receptorhoz kötődni. Egy monoklonális antitestet fejlesztettek ki ezután Colonno és munkatársai (Colonno és munkatársai: J. Cell. Biochem. 10. kiegészítő kötet (D rész) 266 (1986); Colonno és munkatársai: J. Virol. 57, 7-12 (1986); 169 146 számú európai közrebocsátási irat), amely blokkolta a HRV fő szerotipusának az endotéliális sejtek felületén történő megkötését. Az antitest által felismert endotéliális sejt receptor fehérjét izolálták, mérete a meghatározások szerint 90 kd (Tomassini és munkatársai: J. Virol. 58, 290-295 (1986)), és később kimutatták, hogy azonos az ICAM-1 molekulával (Staunton és munkatársai: Cell 56, 849-854 (1989)).

A rinovirus fertőzés, elsősorban a humán rinovirus fő típusa által okozott fertőzés kezeléséhez javasolták az ICAM-1 virusreceptor elleni egér monoklonális antitest alkalmazását (391 088 számú európai szabadalmi leírás).

E. Hív fertőzés

A HÍV fertőzés okozza az AIDS betegséget. A HÍV két fő típusban fordul elő: HIV-1 és HIV-2. A HIV-1 Észak-Amerikában és Európában, mig a HIV-2 csak Afrikában terjedt el. A vírusok hasonló szerkezetet mutatnak, és azonos funkcióval rendelkező fehérjéket kódolnak. A két változatban megtalálható nukleotidok, génszekvenciák és géntermékek mintegy 40 %-os homológiát mutatnak.

A feltételezések szerint a HÍV fertőzés úgy alakul ki, hogy egy virusfehérje (jelölése gpl20) kötődik egy receptormolekulához (jelölése CD4), amely a T4 (T kisegítő) limfocita felületén található (Schnitman S.M. és munkatársai: J. Immunoi. 141, 4181-4186 (1988)). A vírus ezután belép a sejtbe, és elkezd szaporodni, amelynek végeredményeként a T sejt elhal. Az egyed T4 populációjának elpusztulása a HÍV fertőzés közvetlen eredménye. A HÍV feltárható a perifériás vér mononukleáris sejtekből és a humán plazmából (J. Clin. Microbiol. 26, 2371-2376 (1988); N. Engl. J. Med. 321, 1621-1625 (1989)). Ennek eredményeként súlyosabb virusvérüség keletkezik, mint korábban feltételezték, és a T sejt fertőzés gyakorisága 1 %.

A T sejtek elroncsolása azt eredményezi, hogy gyengül a fertőzött betegnek az a képessége, hogy legyőzze az alkalmazkodó fertőzéseket. Bár az AIDS-szel fertőzött betegeknél gyakran alakul ki rák, az ilyen rák és a Hív fertőzés közötti összefüggés a legtöbb esetben bizonytalan.

Bár a HÍV vírus egyszerű elszaporodása is halálos a fertőzött sejtekre, az ilyen replikáció általában csak a fertőzött egyedből származó T4 sejtek kis frakcióján mutatható ki. Széles körben kutatják azokat a mechanizmusokat, amelyekkel a HÍV vírus közvetíti a T4 populáció elroncsolását.

A HÍV elszaporodásától eltekintve a HÍV fertőzött sejtek citotoxikus killer sejtekkel elroncsolhatók. A killer sejtek az emberi szervezetben általában jelen vannak, és a gazda azonosítására és az idegen sejtek (például téves vértranszfuzió vagy szervátültetés) elpusztítására szolgálnak. HÍV fertőzés esetében a T4 sejtek gpl20 molekulát választanak ki a sejt felületén, a killer sejtek idegen sejtként azonosítják az ilyen T4 sejteket, és ennek megfelelően elősegítik annak elpusztulását.

A HÍV fertőzés a nem-fertőzött, egészséges sejtek pusztulásához is vezethet. A fertőzött sejt a gpl20 fehérjét a véráramba közvetítheti. A szabad gpl20 molekula ezután az egészséges, nem fertőzött sejtek CD4 receptorán kötődik. A megkötődés hatására a sejt látszólagosan fertőzött sejtként viselkedik. A citotoxikus killer sejtek felismerik azokat a nem-fertőzött T4 sejteket, amelyek gpl20 molekulát kötöttek meg, a sejtet idegen sejtnek minősitik, és elősegítik annak elpusztulását.

Egy másik, és a találmány szempontjából különösen érdekes mechanizmus szerint a HÍV szincicia kialakulásán keresztül éri el a T4 sejtek elpusztulását. A szincicium egy többmagvu óriás sejt, amely több száz T4 sejt fúziójával alakul ki. A HÍV fertőzés hatására a fertőzött sejt képessé válik arra, hogy más T4 sejtekkel egyesüljön. Fúziós partnerként szolgálhatnak a HÍV fertőzött sejtek, valamint a nem-fertőzött, egészséges sejtek is. A szincicium nem képes funkcionálni és hamarosan elpusztul. Ez a folyamat tehát a fertőzött és a nem-fertőzött T4 sejtek egyidejű elpusztulását eredményezi. Ez a folyamat különösen érdekes a találmány szempontjából, mivel feltételezi a T4 sejtek közvetlen érintkezését. A HÍV fertőzött sejtek szincicia kialakulásához vezető képessége feltételezi, hogy a sejt az egészséges sejtekkel végrehajtott fúzióhoz szükséges eszközökkel rendelkezik. Ennek következtében a sejtek érintkezése alapvető fontosságú abban a folyamatban, amelynek során a HÍV fertőzés egyik sejtről a másikra terjed.

A HÍV fertőzés, és különösen a HIV-1 fertőzés befolyásolja a leukocita integrin sejtfelületi kifejezését, és a heterodimer által közvetített celluláris adhéziós reakciót (Petit A.J. és munkatársai: J. Clin. Invest. 79, 188 (1987) ; Hildreth J.E.K. és munkatársai: Science 244, 1075 (1989) ; Valentin A. és munkatársai: J. Immunology 144, 934-937 (1990); Rossen R.D. és munkatársai: Trans. Assoc. American Physicians 102, 117-130 (1989)). A HIV-1 fertőzést követően megnövekszik az U937 sejtek homotipikus aggregációja a CD18, CDllb sejtfelületi kifejeződése miatt (Petit A.J. és munkatársai: J. Clin. Invest. 79, 188 (1987)). A HIV-1 fertőzött U937 sejtek gyakrabban megtapadnak az IL-1 által stimulált endotéliumon, mint a nem-fertőzött U937 sejtek. Ez a folyamat megakadályozható, ha a fertőzött sejteket anti-CD18 vagy anti-CDlla monoklonális antitesttel kezelik, vagy az endotéliális szubsztrátumot anti-ICAM-l-gyel kezelik (Rossen R.D. és munkatársai: Trans. Assoc. American Physicians, 102. 117-130 (1989)). A CD18 vagy CDlla monoklonális antitestje szintén képes arra, hogy megakadályozza a szincicia kialakulását, ami kiterjed a fitohemagglutininnal (PHA) stimulált limfoblasztoid sejtekre és a fertőzött, CD4-negativ T sejtekre (Hildreth J.E.K. és munkatársai: Science 244. 1075 (1989)). Ha csak a vírussal fertőzött sejteket kezeljük anti-CD18 vagy anti-CDlla monoklonális antitestekkel, akkor csak kismértékben befolyásoljuk a szincicium képződést, ami arra utal, hogy ezek az antitestek lényegében a nem-fertőzött célsejteket védik a fertőzéstől (Hildreth J.E.K. és munkatársai: Science 244. 1075 (1989); Valentin A. és munkatársai: J. Immunology 144, 934-937 (1990)). Valentin és munkatársai idézett müvükben ezt a megfigyelést azzal erősitik meg, hogy a CD18-ra specifikus monoklonális antitestek gátolják a szincicia képződést, ha folyamatos T sejtvonalakat HIV-1 fertőzött U937 sejtekkel együtt tenyésztünk.

Még nem ismert, és a találmány szerinti megoldás vonatkozásában nem is lényeges az a mechanizmus, amellyel a CD18-ra vagy CDlla-ra specifikus monoklonális antitestek megvédik az érzékeny sejteket a HÍV fertőzött sejtekkel történő fúziótól. A rádió jelölésű gtl20 molekulával végzett vizsgálatok azonban arra utalnak, hogy a CD18-at tartalmazó heterodimer már nem jelent kötési helyet a vírus számára (Valentin A. és munkatársai: J. Immunology 144. 934-937 (1990)). A HÍV fertőzés tehát sejt-sejt kölcsönhatást és/vagy olyan virus-sejt kölcsönhatást vált ki, amely utánozza a sejt-sejt kölcsönhatást. A sejt-sent kölcsönhatás eredményezheti a sejtmentes vírus transzportját, vagy a fertőzött mononukleáris sejt citoplazmáján belül a vírus transzportját az endotéliális gáton keresztül. A sejt-sejt kölcsönhatást utánzó virus-sejt kölcsönhatás elősegíti, hogy a szabad vírus az egészséges sejtekhez kötődjön, és/vagy azokat megfertőzze.

A találmány szerinti megoldás tehát részben abból a megfigyelésből származik, hogy a HÍV fertőzés, és ezen belül elsősorban a HIV-1 fertőzés fokozza a CDlla/CD18 heterodimer és ezek kötőiigandumját jelentő ICAM-1 kifejeződését. A fokozott kifejeződés szignifikáns abból a szempontból, hogy elősegíti a HÍV fertőzött T sejtek egymással történő össze21 kapcsolódását és aggregálódását (homotipusos aggregáció) . Mivel az ilyen homotipusos aggregáció nem figyelhető meg a tétlen normál leukociták között, feltételezhető, hogy az aggregáció feltétele a CD11/CD18 receptorok és/vagy az ICAM-1 kifejeződése. Az adhézió következtében a HIV-1 a fertőzött sejtből átkerül az egészséges sejtekbe, illetve a szabad virus megfertőzi az egészséges sejteket.

Mivel az ICAM-1 központi szerepet játszik a sejt-sejt kölcsönhatásokban, az ICAM-1 megkötésére alkalmas egér monoklonális antitestek felhasználhatók a HÍV fertőzés megelőzésére (WO 90/13281 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés).

F. A HÍV fertőzött sejtek migrációja

A leukociták migrációja és szétszóródása fontos momentum a fertőzés elleni védelemben. Ugyanezek a folyamatok felelősek azonban a virusfertőzött leukociták migrációjáért és szétszóródásáért. Ebből a szempontból elsősorban a HÍV fertőzött leukociták migrációja és szétszóródása bir jelentőséggel. Az ilyen sejtek migrációja extravaszkuláris gócok kialakulásához vezet, ami tumort és más abnormalitásokat okozhat.

A megtámadott szervek hisztológiai vizsgálata helyi extravaszkuláris, mononukleáris sejtbeszürődéseket mutat ki. A központi idegrendszer beszürődéseiben található fertőzött sejtekben HIV-1 fertőzött sejtek jelenléte mutatható ki. A vizsgálatok szerint a HIV-1 elsősorban monocitákban és makrofágokban, valamint más hasonló sejtekben fordul elő (R.T. Johnson és munkatársai: FASEB J. 2, 2970 (1988); M.H. Stoler és munkatársai: J. Amer. Med. Assn. 256. 2360 (1986); S. Gartner és munkatársai: J. Amer. Med. Assn. 256, 2365 (1986); S. Gartner és munkatársai: Science, 233, 215 (1986)).

Teljes egészében még nem ismert az a mechanizmus, amely stimulálja a HIV-1 fertőzött monocitoid sejtekből az extravaszkuláris beszürődés kialakulását. A mechanizmus egyik lépése feltehetően a sejtmentes vírus transzportja vagy a vírus transzportja az endotéliális határvonalon keresztül a fertőzött mononukleáris sejtek citoplazmájába.

Mivel a HIV-1 fertőzés stimulálja az olyan molekulák sejtfelületi kifejeződését, amelyek elősegítik a leukocitáknak a vaszkuláris endotéliális sejtekhez történő tapadását, és a leukociták transzlokációját a vérből az extravaszkuláris szövetekre (C.W. Smith és munkatársai: J. Clin. Invest. 82., 1746 (1988)), olyan antitestek alkalmazását javasolták, amelyek a celluláris migráció gátlásával megakadályozza a HÍV fertőzött sejtek szétszóródását (WO 90/13316 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés).

G. Asztma, klinikai jellemzők

Az asztma a heterogén tipusu betegségek közé tartozik. A légcső és a hörgők túlérzékenysége jellemzi (McFadden E.R. és munkatársai: Harrison’s Principles of Internál Medicine,

10. kiadás, Petersdorf R.G. és munkatársai kiadásában, McGraw-Hill, New York, USA, 1512-1519 (1983); Kay A.B.: Allergy and Inflammation, Academic Press, New York (1987)). Klinikailag az asztmát a beszűkült légcső és hörgő, sürü, tapadó váladék, fokozottan nehéz légzés, köhögés és zihálás jellemzi. Bár az egyes kondíciók relatív hozzájárulása ismeretlen, az együttes végeredmény a légutak fokozott ellenállása, a tüdőben és a mellkasban jelentkező hiperinfláció, a légzés abnormális eloszlása és a pulmonáris vérzés. A betegség akut szimptómái periodikusan jelentkeznek, amelyeket szimptómamentes szakaszok szakítanak meg. Az akut periódusok hatására lecsökken az oxigéntartalom, ami halálos lehet. A Föld ossz népességének mintegy 3 %-a szenved ettől a betegségtől.

Az asztma két típusa ismeretes, az allergiás asztma és az idioszinkráziás asztma. Az allergiás asztma általában örökölt allergiás betegséghez, igy náthához, csalánkiütéshez vagy ekcémához társul. A betegség jellemzője, hogy a levegő által szállított antigének (igy virágpor, környezeti vagy munkahelyi szennyeződések) intradermális injekciója hatására a bőr hólyagossá és pirossá válik, és megnő a szérum IgE szintje. Az allergiás asztma kifejlődése a legtöbb betegben öszefüggésben van az IgE antitestek jelenlétével. Azok az asztmás betegek, akik nem mutatják ezeket a jellemzőket, idioszinkráziás asztmában szenvednek.

* · 4« ·»·* • · · » · • « · ««· · • · V · · · ·

Az allergiás asztma tehát a feltételezések szerint az IgE választól függ, amit a T és B limfociták szabályoznak, és a levegő által szállított antigén és a hízósejtekhez kötött IgE molekulák közötti kölcsönhatás aktivál. Az első esetben az antigén csak megfelelő koncentrációban vált ki olyan hosszú idejű IgE termelést, amely érzékennyé teszi a szervezetet. Ezután az asztmás betegnél a szimptómák már különösen alacsony antigén koncentrációnál is jelentkeznek.

Az asztma szimptómái súlyosbodnak a káros antigén jelenléte miatt, környezeti faktorok, munkahelyi faktorok, fizikai megerőltetés és lelki stressz hatására.

Az asztma kezelhető metil-xantin-származékokkal, igy teofilinne, β-adrenerg agonistákkal, igy katechol-aminnal, rezorcinollal, szaligeninnel és efedrinnel, glükokortikoidokkal, igy hidrokortizonnal, a hízósejtek degranulálódását gátló anyagokkal, igy kromonokkal, például kromolin-nátriuiranal, valamint antikolinerg hatású anyagokkal, igy atropinnal .

Az asztmás megbetegedés részeként eozinofil sejtek kerülnek a tüdő szöveteibe (eozinofilia) (Frigas E. és munkatársai: J. Allergy Clin. Immunoi. 77., 527-537 (1986)).

Az asztma immunológiai alapjának felderítése bronchoalveoláris mosási vizsgálatokból (Godard P. és munkatársai: J. Allergy Clin. Immunoi. 70 88, (1982)), és hámrétegétől megfosztott légző simaizom tanulmányozásából (Flavahan N.A. és munkatársai: J. Appl. Physiol. 58. 834 (1985); Barnes P. J. és munkatársai: Br. J. Pharmacol. 86, 685 (1985)) indult ♦ · ·· ··«· • » « · « i · * ··· · • ·♦·· V · ··»· · ·« ««

- 25 ki. Bár a vizsgálatok nem eredményezték az asztma immunológiai mechanizmusának teljes megértését, lehetővé tették egy általánosan elfogadott hipotézis kialakítását a betegség immunológiai etiológiájárói (Frigas E. és munkatársai: J. Allergy Clin. Immunoi. 77, 527-537 (1986)).

Az asztma patológiájának fő részei az eozinofil sejtek beszürődése a tüdő parenchimába, és a mukociliáris kapacitás csökkenése. Az eozinofil hipotézis szerint a bronchus magához vonza az eozinofil sejteket, és igy semlegesíti a tüdő hízósejtjei által felszabadított káros közvetítőket. Az elmélet szerint a bronchushoz vonzott eozinofil sejtek degranulációval citotoxikus molekulákat szabadítanak fel. Az eozinofil sejtek által felszabadított enzimek, igy hisztamináz, aril-szulfatáz és foszfolipáz D enzimatikusan semlegesítik a hízósejtek káros közvetítőit. Ezek a molekulák elősegítik a mukociliáris berendezés elroncsolását, és igy megakadályozzák a hörgő váladék kiürülését, és elősegítik az asztma által okozott tüdősérülést.

Mivel az asztmás folyamatokban sejtmigráció is szerepet játszik, javasolták olyan antitestek alkalmazását, amelyek gátolják a migrációt, és csökkentik az allergének hatását (WO 90/10453 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés).

H. Következtetések

Ismert volt tehát a leukociták által közvetített gyűl• ·

4· ···· • · · · · • · « ··· · • »··· · · ·«·· · ·· - 26 ladások kezelése anti-ICAM-1 antitesttel (0 289 949 és

314 863 számú európai szabadalmi leírás), vírusfertőzések kezelése anti-ICAM-1 antitesttel (0 391 088 számú európai szabadalmi leírás), HÍV fertőzés megakadályozása anti-ICAM-1 antitest alkalmazásával (WO 90/13281 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés), HÍV fertőzött sejtek szétszóródásának megakadályozása anti-ICAM-1 antitest alkalmazásával (WO 90/13316 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés), valamint allergének hatásának csökkentése anti-ICAM-1 antitest adagolásával (WO 90/10453 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés).

A 0 289 949 számú európai szabadalmi leírás egér monoklonális R6-5-D6 előállítását ismerteti, amely az ICAM-l-re specifikus, és előnyösen alkalmazható antitestként a fent említett terápiákban. Az R6-5-D6 mintáit az ATCC HB9580 számon deponálták 1987. október 30-án.

Az említett kezelési eljárásokban alkalmazott anti-ICAM-1 MAb-ként általánosan hozzáférhetők az egér MAb-k, amelyek humán betegeknek ismételt dózisban adagolva jelentős HAMA választ váltanak ki. Szükség van tehát arra, hogy ezt a nemkívánatos HAMA választ az egyébként igen hatékony antitestek megfelelő humanizálásával vagy más rekombináns DNS manipulálásával csökkentsük, és igy kiterjesszük azok alkalmazhatóságát. Szükség van továbbá arra, hogy ezekből az antitestekből rekombináns DNS technológiával anti-ICAM-1 RAM származékokat állítsunk elő.

Egér MAb-ből kiindulva anti-ICAM-1 RAM származékokat és

CDR-oltott humanizált antitest molekulákat állítottunk elő.

A találmány lényegének ismertetése

A találmány rekombináns antitest molekulák (RAM) előállítására vonatkozik. A találmány szerinti RAM egy anti-ICAM-1 antitest nehéz és/vagy könnyű láncegységeinek változó területeiről származó antigénkötő helyeket tartalmazza.

A találmány tárgya továbbá eljárás CDR-oltott humanizált antitest molekulák (HAM) előállítására. A találmány szerinti HAM ICAM-l-re specifikus, és antigénkötő helyet tartalmaz, ahol a változó területekhez tartozó legalább egy komplementaritást meghatározó szakasz (CDR) nem humán anti-ICAM-1 antitestből származik.

A találmány kiterjed a detektálható jelöléssel ellátott HAM és RAM származékokra.

A találmány részét képezi továbbá a találmány szerinti RAM vagy HAM kifejezésére alkalmas rekombináns DNS molekula.

A találmány kiterjed az olyan gazdasejtekre, amelyek a fenti rekombináns DNS molekulával transzformálva találmány szerinti HAM-t vagy RAM-t termelnek.

A találmány értelmében a találmány szerinti HAM és RAM diagnosztikai és terápiás célból alkalmazható.

A találmány tárgya továbbá eljárás emlősök specifikus védekezőrendszerének válaszából származó gyulladások kezelésére, amelynek során a betegnek a szükséges mennyiségben gyulladásgátló szert adagolunk, ahol gyulladásgátló szerként

ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM monoklonális antitestet alkalmazunk.

A találmány kiterjed továbbá emberek és emlős állatok nem-specifikus gyulladásainak kezelésére. Közelebbről, a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi emlősök specifikus és nem-specifikus védekezőrendszerének válaszaként kialakuló gyulladás kezelését, amelyhez a betegnek a szükséges mennyiségben gyulladásgátló szert adagolunk, ahol gyulladásgátló szerként ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárással kezelhető gyulladásokra példaként említhetők az alábbi betegségekhez társuló gyulladás: felnőttkori légzési nehézség szindróma, baktériumvérüséghez társult többszörös szervsérülés szindróma, traumához társult többszörös szervsérülés szindróma, miokardiális és más szövetek reperfúziós sérülése, akut glomerulónefritisz, reaktív izületi gyulladás, akut gyulladásos bőrbetegség, akut gennyes agyhártyagyulladás és a központi idegrendszer más gyulladásos betegségei, termális sérülés, vérdializis, leukaferezisz, fekélyes vastagbélgyulladás, Crohn betegség, elhalásos vékonybél-vastagbél gyulladás, granulocita transzfuzióhoz kapcsolódó szindróma és citokinnal indukált toxicitás.

A találmány tárgya továbbá eljárás a migrációhoz az LFA-1 csoport egyik funkcionális tagját igénylő vérképző tumorsejt áttételének megakadályozására, amelyhez a beteget az áttétel megakadályozásához szükséges mennyiségben gyulla29 dásgátló szerrel kezeljük, ahol gyulladásgátló szerként ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t alkalmazunk.

A találmány tárgya továbbá eljárás ICAM-1 kifejezésére alkalmas tumorsejt növekedésének megakadályozására, amelynek során a betegnek a növekedés megakadályozásához szükséges mennyiségben toxint adagolunk, ahol toxinként valamely találmány szerinti HAM vagy RAM származékot alkalmazunk.

A tallmány tárgya továbbá eljárás emlősök specifikus védekezőrendszerének válaszából kialakuló gyulladás diagnosztizálására és lokalizálására, amelynek során

a) a betegnek ICAM-l-t kifejezősejt azonosítására alkalmas, és kimutatható jelöléssel ellátott HAM-t vagy RAM-t tartalmazó készítményt adagolunk;

és

b) a megkötött ligandumot detektáljuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás emlősök specifikus védekezőrendszerének válaszából kialakuló gyulladás diagnosztizálására és lokalizálására, amelynek során

a) a betegből vett szövetmintát ICAM-l-t kifejező sejt azonosítására alkalmas és kimutatható jelöléssel ellátott HAM-t vagy RAM-t tartalmazó készítménnyel inkubáljuk; és

b) a kötött ligandumot detektáljuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás ICAM-l-t kifejező tumorsejt diagnosztizálására és lokalizálására, amelynek során

a) a betegnek ICAM-1 megkötésére alkalmas és kimutatható jelöléssel ellátott HAM-t vagy RAM-t tartalmazó készítményt adagolunk; és

b) a kötött ligandumot detektáljuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás ICAM-l-t kifejező tumorsejt diagnosztizálására és lokalizálására, amelynek során

a) a betegből vett szövetmintát ICAM-1 megkötésére alkalmas és kimutatható jelöléssel ellátott HAM-t vaga RAM-t tartalmazó készítménnyel inkubáljuk; és

b) a kötött ligandumot detektáljuk.

A találmány tárgya továbbá gyógyszerkészítmény, amely

a) ICAM-1 megkötésére alkalms RAM-ből vagy HAM-ből álló gyulladásgátló szert; és

b) legalább egy immunoszupressziv anyagként dexametaszont, azatioprint és/vagy ciklosporin A-t tartalmaz.

A találmány kitérje az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM és RAM vírus elleni terápiában történő alkalmazására.

Ennek értelmében az ICAM-1 megkötésére alkalmas vírus által okozott fertőzés kezelésére a betegnek a vírusfertőzés megszüntetéséhez szükséges mennyiségben ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t adagolunk.

A találmány tárgya továbbá eljárás leukociták HÍV fertőzésének megszüntetésére, amelynek során a HÍV fertőzött betegnek a szükséges mennyiségben ICAM-1 megkötésére alkalmas RAM-t vagy HAM-t adagolunk.

Ez utóbbi eljárás előnyösen alkalmazható HIV-1 által okozott fertőzések megszüntetésére.

A találmány tárgya továbbá eljárás virusfertőzött leukociták extravaszkuláris migrációjának megszüntetésére, amelynek során a betegnek a leukocita és az ICAM-1 között kialakuló kötés gyengítésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t adagolunk.

Ez utóbbi eljárás előnyösen alkalmazható a HÍV fertőzött leukociták migrációjának megakadályozására.

Ez utóbbi eljárásban előnyösen alkalmazható az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM.

A találmány tárgya továbbá eljárás asztma kezelésére, amelynek során a betegnek a szükséges mennyiségben ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t adagolunk.

A fenti eljárásban előnyösen alkalmazható az R6-5-6D egér monoklonális antitestből származó, és ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM.

Az ábrák rövid ismertetése

A találmány szerinti megoldás közelebbi ismertetését ismertetik az 1-17. ábrák, amelyek tartalma a következő:

Az 1. ábra az R6-5-D6 egér MAb könnyű láncegység cDNS szekvenciáját mutatja az 5' le nem fordított szakaszra, a szingál szekvenciára, a változó területre és részben az állandó területre kiterjedően, a megfelelő aminosav szekvenciával együtt.

A 2. ábra az R6-5-D6 egér MAb nehéz láncegység azonos cDNS és aminosav szekvenciáját mutatja.

A 3. ábra a PEE6 hCMV expressziós vektor plazmid diagrammját mutatja.

A 4. ábra a könnyű láncegységet kifejező pAL5 plazmid előállítását mutatja.

Az 5. ábra a nehéz láncegységet kifejező pAL6 plazmid előállítását mutatja.

A 6. ábra a rekombináns és egér R6-5-D6, valamint kontrollként az MAb UPC10 kötődésének kompetitiv vizsgálata grafikonját mutatja.

A 7. ábra a könnyű láncegység változó területére vonatkozó oltott gL221 és gL221A gén aminosav szekvenciáját mutatja az egybetüs kód alkalmazásával, ahol az aláhúzás az egér szekvenciából származó aminosavakat jelöli.

A 8. ábra a változó területre vonatkozó gL221 gén előállításához alkalmazott oligonukleotid párokat mutatja.

A 9. ábra a pBJl plazmid előállítását mutatja, amely megfelelő eukarióta gazdasejtben irányítja a gL221 könnyű láncegység kifejezését és kiválasztását. A 408 bp BstBI-Spii fragmenst pE1081 plazmidba klónoztuk az egyetlen BstBl és SplI helyre, amellyel teljes hosszúságú könnyű láncegység gént kaptunk, amelyben a humanizált változó területnek megfelelő gén közvetlenül a humán kappa konstans területnek megfelelő génhez kapcsolódik. A kapott könnyű láncegység fehérje a korrekt V-C kapcsolódási szekvenciával rendelkezik.

A 10. ábra a gL221A génszerkezet előállításához alkalmazott oligonukleotid párokat mutatja.

A 11. ábra az egybetüs kódok alkalmazásával mutatja az egér anti-ICAM-1 antitest nehéz láncegységének változó szakasza, a humanizált gH341, gH341A, gH341B és gH341D láncegységek és összehasonlításként az EU nehéz láncegység változó szakasza aminosav szekvenciáját.

A gH341, gH341A, ghH341B és gH341D szekvenciában az egér szekvencia benne van a géntermékben, amit aláhúzással jelölünk.

A 12. ábra a gH341 génszerkezet előállításához alkalmazott oligonukleotid párokat mutatja.

A 13. ábra a gH341B génszerkezet előállítását mutatja a polimeráz láncreakció (PCR) eljárással, ami lehetővé teszi az egyes aminosavak lecserélését.

A 14. ábra az Xhol-Aapal génfragmens előállításához alkalmazott oligonukleotidokat mutatja, amely génfragmenst a gH341D gén előállításához alkalmazzuk.

A 15. és 16. ábra a COS sejtkifejeződés eredményét mutatja, amelynek során különböző génkombinációkat alkalmaztunk uj antitestek előállításához. Az antitest kitermelését ELISA vizsgálat alapján számoltuk, és felhasználtuk az antitest és az ICAM-1 antigén közötti kötődés JY sejteken mért értékének táblázatos megadásához.

A 17. ábra a kimér és CDR-oltott antitestek közötti kompetitiv kötődési vizsgálat eredményét mutatja.

A találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módiának rövid ismertetése

A. Humanizált antitestek

A találmány szerinti megoldás egyik megvalósítási módja során egy RAM-t állítunk elő, amely egy anti-ICAM-1 antitest nehéz és/vagy könnyű láncegységének változó területeiről származó antigénkötő helyeket tartalmaz.

Anti-ICAM-1 antitestként előnyösen rágcsáló MAb-t alkalmazunk.

A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja során CDR-oltott, humanizált antitest molekulát (HAM) állítunk elő, amely specifikus az ICAM-1 antigénre, és olyan antigénkötő helyet tartalmaz, ahol legalább a változó domének komplementaritást meghatározó szakaszai (CDR) egy nem-humán (például rágcsáló) anti-ICAM-1 antitestből származnak. A HAM-t általában rekombináns DNS technológiával állítjuk elő.

A találmány értelmében az anti-ICAM-1 kötőszakasz általában legalább egy CDR-t tartalmaz az anti-ICAM-1 antitestből. Az anti-ICAM-1 antigénkötő szakasz általában legalább kettő, előnyösen három CDR-t tartalmaz a nehéz láncegység és/vagy a könnyű láncegység változó területeinek mindegyikéből. A CDR tartalmazhatja a Kábát CDR-t, a szerkezeti hurok CDR-t és ezek tetszőleges kombinációját.

A találmány szerinti HAM jellemző módon nem tartalmaz humanizált kimér antitest molekulákat, amelyekben az antigénkötő hely tartalmazza a kívánt antigénkötő specifitással rendelkező antitestből származó teljes könnyű és/vagy nehéz láncegység változó doméneket. A találmány szerinti HAM általában egy CDR-oltott antitest.

A találmány szerinti HAM előnyösen a PCT/GB90/02017 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerinti CDR-oltott antitestet tartalmazza.

A könnyű láncegységben található CDR-ek előnyösen a Rabat CDR-nek felelnek meg a CDR1 (24-34 pozíció) és CDR2 (50-56 pozíció) helyeken, és a szerkezeti hurok maradékot tartalmazzák (91-96 pozíció) vagy a Rabat CDR-maradékot tartalmazzák (89-97 pozíció) a CDR3 helyen. Emellett, a könnyű láncegység egy vagy több egér maradékot tartalmazhat az 1, 2 és/vagy 3, 46, 47, 49, 60, 70, 84, 85 és 87 pozíciókban, és előnyösen nem-humán maradékot tartalmaz legalább a 46 és 47 pozícióban.

A HAM nehéz láncegység előnyösen nem-humán (például egér) maradékot tartalmaz a 23 és/vagy 24 és 71 és/vagy 73 pozícióban. Emellett, a nehéz láncegység egy vagy több nem-humán maradékot tartalmazhat a 48 és/vagy 49, 69, 76 és/vagy 78, 80, 88 és/vagy 91 és 6 pozícióban. A nehéz láncegységben található CDR-ek előnyösen a Rabat CDR-nek felelnek meg a CDR2 (50-65 pozíció) helyen, a szerkezeti hurok maradékokat tartalmazzák a CDR3 (95-100 pozíció) helyen, és a Rabat és szerkezeti hurok maradékok kombinációját tartalmazzák a CDR1 (24-35 pozíció) helyen, például, ha az alkal36 mázott humán változó terület szerkezet a KOL. Alternatív módon, a nehéz láncegységben található CDR-ek nem-humán (például egér) maradékokat tartalmazhatnak a 26-35 pozícióban a CDR1 helyen, az 50-56 pozícióban a CDR2 helyen, és a 94-100 pozícióban a CDR3 helyen; például, ha az alkalmazott humán változó terület szerkezet az EU. Emellett, az EU egy különösen idioszinkratikus J szakaszt tartalmaz a 103-113 maradékok között, amely tartalmazhat egér aminosavakat is. Lehetséges továbbá az is, hogy ugyanitt egy együttműködő humán J szakasz vagy ezek megfelelő kombinációja található a 103-108 maradékoknál.

A csoportok megjelölésére a fentiekben és a leírás egyéb részein a Kábát féle számozást alkalmazzuk (Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Humán Services, NIH (1987); és Wu és munkatársai: J. Exp. Med. 132, 211-250 (1970)). Ezért a maradékok számozása nem felel meg minden esetben az aminosav maradékok lineáris számozásának. Az aktuális lineáris aminosav szekvencia több vagy kevesebb aminosavat tartalmazhat, mint a kötött Kabat-féle számozás, amelynek oka lehet egy szerkezeti komponens, például szerkezet vagy CDR kiiktatása vagy beépítése az alap változó dómén szerkezetbe. így például a Queen és munkatársai által leirt anti-Tac antitest nehéz láncegységének változó területe (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989) és WO 90/07861 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés) egy aminosavból álló inszertet (52a maradék) tartalmaz a CDR2 52.

maradéka után és három aminosavból álló inszertet (82a, 82b és 82c maradék) tartalmaz a 82. szerkezeti maradék után a Kábát féle számozás szerint. Egy adott antitest esetében a maradékok pontos Kábát féle számozása meghatározható, ha az antitest szekvencia homológ szakaszainak sorrendjét egy standard Kábát számozású szekvenciához viszonyítjuk.

A találmány szerinti RAM vagy HAM általában a következő elemekből áll: egy teljes antitest molekula, amely tartalmazza a teljes hosszúságú nehéz és könnyű láncegységeket, ennek fragmense, igy a Fab vagy (Fab’)2 fragmens, egy könnyű láncegység vagy nehéz láncegység monomer vagy dimer vagy egy egyláncu antitest, például egy egyláncu FV, amelyben a könnyű és nehéz láncegység változó területei egy peptid linkerrel vannak összekapcsolva, valamint az eredeti donor antitesttel azonos specifitásu bármely más rekombináns vagy CDR-oltott molekula. Ennek megfelelően a CDR-oltott nehéz és könnyű láncegység változó területei más megfelelő antitest doménekkel kombinálhatok.

Az RAM vagy HAM további, immunoglobulin eredetű részei bármely megfelelő humán immunoglobulinból származhatnak. A megfelelő változó területű szerkezeti szekvenciákat a donor antitest típusa alapján választjuk ki, amelyből az antigénkötő szakaszok származnak. Előnyösen a donor antitesttel azonos vagy hasonló típusba tartozó humán szerkezetet használunk. Előnyösen olyan szerkezetet választunk, amely maximalizálja vagy optimalizálja a donor antitest szekvenciával mutatott homológiát, elsősorban a CDR-ekkel szomszédos vagy ahhoz közeli pozíciókban. A CDR-oltott HAM előállításához alkalmazható humán szerkezetekre példaként említhető a KOL, NEWM, REIEU, LAY és POM (Kábát és munkatársai : Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Humán Services, NIH (1987); Wu és munkatársai: J. Exp. Med. 132. 211-250 (1970)), ezen belül például a KOL és a NEWM, a nehéz láncegység és a REI a könnyű láncegység esetében, mig az EU, LAY és POM a nehéz és a könnyű láncegység bármelyike esetében.

A HAM humán állandó szakasz doménjeit is az antitest kívánt funkciója, elsősorban effektor funkciója alapján választjuk ki. így például, az állandó szakasz doménjeként alkalmazható humán IgA, IgE, IgG vagy IgM dómén. Közelebbről, Az IgG humán állandó szakasz doménjei, elsősorban az IgGl és IgG3 izotopok előnyösen alkalmazhatók akkor, ha a kapott HAM-t terápiás célokból kívánjuk felhasználni, és antitest effektor funkcióra van szükség. Alternatív módon, az IgG2 és lgG4 izotopok alkalmazhatók akkor, ha a kapott HAM-t terápiás célból kívánjuk használni, de antitest effektor funkcióra nincs szükség. Ilyen például az ICAM-1/LFA-l kölcsönhatás egyszerű blokkolása. Humanizált anti-ICAM-1 antitestekkel az IgGl izotipus mutatja a legnagyobb kötő affinitást.

A HAM fennmaradó része nemcsak humán immunoglobulinból származó fehérje szekvenciákat tartalmazhat. így például előállítható olyan gén, amelyben egy humán immunoglobulin lánc egy részét kódoló DNS szekvenciához egy polipeptid effektornak vagy riporter molekulának megfelelő aminosav szekvenciát kódoló DNS csatlakozik.

Alternatív módon, a találmány szerinti RAM vagy HAM lehet valamely RAM vagy HAM kémiai származéka. Ebben az értelemben egy molekulát akkor tekintünk egy másik molekula kémiai származékának, ha olyan további kémiai csoportokat tartalmaz, amelyek általában nem fordulnak elő az adott molekulában. Az ilyen csoport javíthatja például a molekula oldékonyságát, abszorpcióját, vagy biológiai felezési idejét. Lehetséges továbbá az is, hogy ezek a csoportok csökkentik a molekula toxicitását, megszüntetik vagy csökkentik a nem-kivánatos mellékhatásokat. Az ilyen célból alkalmazható csoportok felsorolása megtalálható a Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) cimü irodalomban. Az toxin származék molekulák a kémiai származékok speciális csoportját képezik. A toxin származék molekula olyan molekula (például ICAM-1 vagy antitest), amely toxinrészt tartalmaz. Ha egy ilyen molekula egy sejthez kötődik, akkor a toxinrész közeli érintkezésbe kerül a sejttel és ezzel elősegíti a sejt elpusztulását. Ebben a vonatkozásban bármely megfelelő toxinrész felhasználható, amelyekre példaként említhető a ricintoxin, diftériatoxin, radioizotóp toxinok, membrán csatornát képző toxinok és hasonlók. Az ilyen részeknek az adott molekulához történő hozzákapcsolását az ismert módon végezzük. Lehetséges továbbá az is, hogy a RAM vagy HAM egy makrociklusos molekulához kapcsolódik, amely valamely nehéz fématommal kelátot képez.

• ·

- 40 A RAM vagy HAM kémiai származékainak előállításához felhasználható a rekombináns DNS technológia is, amelynek során a teljes antitest molekula FC fragmensét vagy CH3 doménjét valamely funkcionális nem-immunoglobulin fehérjével, igy enzimmel vagy toxin molekulával helyettesítjük, vagy peptid kapcsolással ilyenhez kapcsoljuk.

A találmány kiterjed a fenti HAM molekulák rekombináns DNS eljárással történő előállítására.

A találmány harmadik megvalósítási módja eljárás anti-ICAM-1 humanizált antitest molekula előállítására, amelynek során

a) olyan expressziós vektort állítunk elő, amelynek operon egysége olyan antitest nehéz vagy könnyű láncegységet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, ahol a változó doménben legalább egy CDR nem-humán (rágcsáló) anti-ICAM-1 antitestből származik, és az antitest láncegység további, immunoglobulin eredetű részei humán immunoglobulinból származnak;

b) olyan expressziós vektort állítunk elő, amelynek operon egysége olyan komplementer antitest könnyű vagy nehéz láncegységet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, ahol a változó doménben legalább egy CDR rágcsáló (nem-humám) anti-ICAM-1 antitestből származik, és az antitest láncegység további, immunoglobulin eredetű részei humán immunoglobu-

1inból származnak;

c) egy gazdasejtet a kapott vektorral vagy vektorokkal transzfektáljuk; és • · ·« *· · * » ♦ · » • · · ·· · « • »«·» · ·

d) a transzfektált sejtvonalat tenyésztve HAM-t termelünk.

A CDR-specifikus változó területek mellett a szerkezeti maradékok nem-humán (például egér) maradékokat is tartalmazhatnak, mint ezt a találmány szerinti megoldás második megvalósítási módjánál ismertettük. Megjegyezzük azonban, hogy ebben az esetben sem alkalmazható az eljárás kimér antitestek előállítására, vagyis olyan antitestek előállítására, amelyekben lényegében a teljes nehéz és/vagy könnyű láncegység változó terület egy nem-humán (rágcsáló) anti-ICAM-1 antitestből származik.

A sejtvonal két vektorral transzfektálható, ahol az első vektor egy könnyű láncegységből származó polipeptidet kódoló operont, a második vektor egy nehéz láncegységből származó polipeptidet kódoló operont tartalmaz. Előnyösen alkalmazhatók azok a vektorok, amelyek egymással azonosak, és csak a kódoló szekvenciában és a szelektálható markerben térnek el, és igy biztosítjuk a két polipeptid lánc egyenlő kifejezését.

Eljárhatunk úgy is, hogy egyetlen vektort alkalmazunk, amely tartalmazza a könnyű láncegységből és a nehéz láncegységből származó polipeptidet kódoló DNS szekvenciákat.

A könnyű és nehéz láncegységeket kódoló DNS szekvencia tartalmazhat cDNS-t vagy genom DNS-t vagy mindkettőt. Előnyös azonban, ha a nehéz vagy a könnyű láncegységet kódoló DNS szekvencia legalább részben genom DNS-ből áll. Még előnyösebb, ha a nehéz vagy könnyű láncegységet kódoló * · «·*♦ * · « · · • · · <Μ « • ·*♦· · « ···· * ·· ··

- 42 szekvencia a cDNS és a genom DNS fúzióját tartalmazza.

A találmány kiterjed a klónozó és expressziós vektorokra, valamint a transzfektált sejtvonalakra, amelyeket a találmány szerinti eljárásban alkalmazunk.

A vektorok előállításához, a transzfekcióhoz és a sejttenyésztéshez önmagában ismert eljárásokat alkalmazunk (például Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York (1982); Primrose and Old: Principles of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford (1980)).

A találmány szerinti anti-ICAM-1 antitestek felölelik az anti-ICAM-1 összes jellemzőit. így például ezek az antitestek specifikusak az ICAM-1 antigén epitópjaira, amelyek az antitesthez kötődve blokkolják, gátolják, vagy más módon módosítják az ICAM-l/LFA-1 és/vagy ICAM-I/Mac-I kölcsönhatást. Előnyösek azok az antitestek, amelyek ugyanazokra vagy hasonló ICAM-1 antigén epitopokra specifikusak, mint az R6-5-D6 antitestek. Különösen előnyösek az R6-5-D6 antitestből származó antitestek.

B. Terápia és diagnózis

A találmány szerinti megoldás kiterjed az olyan terápiás diagnosztikai készítményekre, amelyek találmány szerinti RAM-t vagy HAM-t tartalmaznak, valamint ezek alkalmazására.

A találmány szerinti anti-ICAM-1 termékek terápiás célból minden olyan esetben felhasználhatók, amelyben részt vesznek az anti-ICAM-1 antitestek, amelyekre példaként em» · ·· ···» * ν « «»·* · ♦ »··»· » Λ ·««· * ·· ·♦

- 43 lithetők a Ο 289 949 és Ο 314 863 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett esetek.

1· Gyulladásgátló szerek

A. Specifikus gyulladás

A CD18 vagy CD11/18 komplex tagjaira vonatkozó monoklonális antitestek gátolják a leukociták adhéziótól függő funkcióit, igy az endotéliumhoz történő kötődést (Haskard D. és munkatársai: J. Immunoi. 137, 2901-2906 (1986)), a homotipusos adhéziót (Rothlein R. és munkatársai: J. Exp. Med. 163. 1132-1149 (1986)), a limfociták antigénnel vagy mitogénnel indukált elszaporodását (Davignon D. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4535-4539 (1981)), az antitest képződést (Fischer A. és munkatársai: J. Immunoi. 136. 3198-3203 (1986)), valamint a leukociták effektor funkcióit, igy a citotoxikus T sejtek roncsoló hatását (Krensky A.M. és munkatársai: J. Immunoi. 132. 2180-2182 (1984)), a makrofágok roncsoló hatását (Strassman G. és munkatársai: J. Immunoi. 136, 4328-4333 (1986)), valamint az antitesttől függő celluláris citotoxikus reakciókban résztvevő valamennyi sejt hatását (Kohl S. és munkatársai: J. Immunoi. 133, 2972-1978 (1984)). Az említett esetekben az antitestek akadályozzák a leukociták azon képességét, hogy megtapadjanak a megfelelő celluláris szubsztrátumon, és ez végső soron gátolja a megfelelő működést. Bár a fenti • « ·· ·«·· • · 4 4 · * · · ··· • »4w· « « »·4· « 44 ·*

- 44 funkciók gátlására poliklonális és monoklonális antitestek is alkalmazhatók, a találmány szerinti megoldás anti-ICAM-1 monoklonális antitestből származó HAM vagy RAM felhasználására vonatkozik.

Mint fent említettük, az ICAM-1 molekula valamely LFA-1 csoportba tartozó molekulákhoz történő hozzákötődése központi szerepet játszik a celluláris adhézióban. Az adhéziós folyamat hatására a limfociták folyamatosan ellenőrzik az idegen antigének jelenlétét. Bár ez a folyamat normális esetben hasznos, ugyanez okozza a szervátültetések kilökődését, a szövetátültetések kilökődését, és egy sor autoimmun betegséget. Ennek megfelelően, szervátültetés (például veseátültetés), szövetátültetés vagy autoimmun betegség esetében bármely olyan eszköz hasznos lehet, amely gyengíti vagy gátolja a celluláris adhéziót.

Az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM emlősökben előnyösen alkalmazható gyulladásgátló szerként. Ezek a szerek különböznek az általános gyulladásgátló szerektől és nem humanizált antitestektől, mivel szelektív módon gátolják az adhéziót, nem okoznak mellékhatásokat, igy a szokásos szereknél fellépü nefrotoxicitást, és korlátozzák az egér MAb alkalmazása esetén fellépő HAMA-t. Az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM ezért felhasználható szerv (például vese) vagy szövet kilökődésének megelőzésére, vagy autoimmun válaszok módosítására anélkül, hogy valamely fent említett mellékhatást váltanának ki.

Az ICAM-1 felismerésére alkalmas HAM vagy RAM alkalma45 zásával lehetővé válik a szervátültetés olyan egyedek között is, akik HLA hibahelyeket mutatnak.

A találmány szerinti megoldás negyedik megvalósítási módja eljárás gyulladás csökkentésére, amelynek során a betegnek a gyulladás csökkentéséhez szükséges mennyiségben találmány szerinti HAM-t vagy RAM-t adagolunk. Az alkalmazott mennyiség akkor elegendő a gyulladás csökkentéséhez, ha a szer az alkalmazott dózisban és adagolási módszerrel csökkenti vagy megelőzi a gyulladást.

A HAM vagy RAM adagolható önmagában vagy egy vagy több további immunoszupressziv anyaggal kombinálva (elsősorban szerv- vagy szövettranszplantált betegnél) . Az ilyen készítmény alkalmazható megelőzési és terápiás célokból. Megelőzési célból az immunoszupressziv készítményt akkor alkalmazzuk, ha a szerv- vagy szövetátültetés előtt, során vagy után gyulladások szimptómák vagy kilökődési szimptómák jelentkeznek. A készítmény profilaktikus adagolásának célja, hogy megelőzzünk vagy legyengítsünk minden esetleges gyulladásos választ (például az átültetett szerv vagy szövet kilökődését) . Terápiás célból az immunoszupressziv készítményt a valóságos gyulladási szimptómák (például szerv- vagy szövetkilökődés) kialakulásakor vagy röviddel azután alkalmazzuk. A készítmény terápiás adagolásának célja, hogy legyengítsük a kialakult gyulladást (például az átültetett szerv vagy szövet kilökődését).

A találmány szerinti gyulladásgátló szer alkalmazható tehát a gyulladás kialakulása előtt (például a feltételezett gyulladás csökkentésére) vagy a gyulladás jelentkezése után.

Mivel az ICAM-1 molekulák főként a gyulladás helyén, vagyis a késleltetett tipusu hiperszenzitiv reakciót mutató helyeken fejeződnek ki, az ICAM-1 molekulák megkötésére alkalmas antitestek (elsősorban az anti-ICAM-1 monoklonális antitestekből származó HAM és RAM) terápiás potenciállal rendelkeznek az ilyen reakciók gyengítésében és megszüntetésében. Ez a terápia kétféle módon valósítható meg. Az első esetben az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t tartalmazó készítményt adagolunk a késleltetett tipusu hiperszenzitiv reakciót mutató betegnek. így például, az ilyen készítmény adagolható annak a betegnek, aki antigénekkel, igy mérges szömörcével került érintkezésbe.

A hatodik megvalósítás értelmében a találmány szerinti HAM vagy RAM olyan betegnek adagolható, aki antigénnel került érintkezésbe, egy esetleges gyulladási reakció megelőzése érdekében. így ha az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-mel vagy RAM-mel együtt egy antigént adagolunk, akkor elérhetjük, hogy a kezelt beteg a későbbiekben elviselje az adott ant igént.

Mivel azoknál az LAD betegeknél, akiknél hiányzik az LFA-1, nem jelentkezik gyulladásos válasz, feltételezhető, hogy az LAF-1 természetes ligandumját, az ICAM-l-et antagonizáló anyagok szintén gátolják a gyulladásos választ. Az ICAM-l-gyel szembeni antitestek gyulladást gátló tulajdonságai teszik lehetővé, hogy ezeket krónikus gyulladásos betegségek és autoimmun betegségek kezelésére alkalmazzuk.

Ezekre példaként említhető a lupus erythematosus, az autoimmun pajzsmirigy gyulladás, a kísérleti allergiás agy-gerincvelő gyulladás (EAE), a sclerosis multiplex, a diabetikus Reynaud szindróma néhány fajtája és a reumás izületi gyulladás. Ezek az antitestek felhasználhatók továbbá a psoriasis kezelésére. Az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM általában felhasználható azon betegségek kezelésére, amelyek szteroid terápiával kezelhetők.

B. Nem-specifikus gyulladás

A találmány szerinti megoldás abból a felismerésből indul ki, hogy az ICAM-1 az endotéliális sejteken a granulocita-endotéliális sejt adhézió közvetítésért felelős granulociták CD18 csoportjának tagjaihoz kötődik, és hogy az ICAM-1 antagonistái gátolják ezt az adhéziót. Ez a gátlás lehetővé teszi az általános, nem-specifikus szövetgyulladás kezelését.

Mivel a celluláris adhézió szükséges ahhoz, hogy a leukociták a nem-specifikus gyulladás helyére migráljanak, és/vagy a gyulladással szemben különböuző effektor funkciókat váltsanak ki, a celluláris adhéziót gátló szerek gyengítik vagy megelőzik az ilyen gyulladást. A nem-specifikus védekezőrendszer reakciója egy olyan válasz, amit immunológiai memóriára képtelen leukociták közvetítenek. Az ilyen sejtek granulocitákat és makrofágokat tartalmaznak. Ebben az értelemben a gyulladás akkor származik a nem-spe48 cifikus védekezőrendszer válaszából, ha a gyulladást a nem-specifikus védekezőrendszer reakciója okozza, közvetíti vagy ehhez társul. Az olyan gyulladásra, amely legalább részben a nem-specifikus védekezőrendszer reakciójából származik, példaként említhetők az olyan gyulladások, amelyek az alábbi kondíciókkal társulnak: felnőtt légzési nehézség szindróma (ARDS), baktériumvérüséghez társuló többszörös szervsérülés szindróma, traumához társuló többszörös szervsérülés szindróma, miokardiális vagy más szövetek reperfuziós sérülése, akut glomerulónefritisz, reaktív izületi gyulladás, akut gyulladással járó bőrfertőzés, akut gennyes agyhártyagyulladás vagy a központi idegrendszer más gyulladásos betegségei (például gutaütés), termális sérülés, vérdializis, leukaferezisz, fekélyes vastagbél gyulladás, Crohn betegség, elhalásos vékonybél-vastagbél hurut, granulocita transzfuzióval összefüggő szindróma, és citokinnal kiváltott toxicitás.

A találmány ötödik megvalósítási módja eljárás nem-specifikus gyulladás kezelésére, amelynek során a betegnek a szükséges mennyiségben találmány szerinti HAM-t vagy RAM-t adagolunk.

2. Diagnosztikai és prognosztikai alkalmazás

Mivel az ICAM-1 általában a gyulladás helyén fejeződik ki, az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t felhasználhatjuk a fertőzés és gyulladás helyének láthatóvá tételéhez is.

A találmány szerinti megoldás nyolcadik megvalósítása értelmében kimutatható jelöléssel, igy radioizotóppal, affinitásjellel (igy biotinnal vagy avidinnel), fluoreszcens jellel vagy paramágneses atomokkal megjelölt HAM-t vagy RAM-t adagolunk a betegnek, és igy lokalizáljuk a fertőzés vagy gyulladás helyét. A jelöléshez alkalmazott módszer általánosan ismert. Antitestek diagnosztikai leképezéshez történő klinikai alkalmazását ismerteti Grossman H.B.: Urol. Clin. North Amer. .13, 465-474 (1986); Unger E.C. és munkatársai: Invest. Rádiói. 20. 693-700 (1985); Khaw B.A. és munkatársai: Science 209. 295-297 (1980).

Az ilyen kimutatható jelöléssel ellátott antitestek felhalmozódási helyének detektálása kezdődő gyulladás vagy tumor helyét indikálja. A vizsgálat megvalósítható úgy, hogy szövetmintát, előnyösen vérsejteket tartalmazó szövetmintát veszünk, és ezt a kimutatható jelöléssel ellátott antitest jelenlétében inkubáljuk. Az eljárást előnyösen nem-behatoló módon, mágneses leképezés vagy fluorográfia alkalmazásával végezzük. Az ilyen diagnosztikai teszt alkalmazásával szervátültetéses betegnél kimutathatók a potenciális szövetkilökődés korai jelei. Ez a fajta vizsgálat felhasználható továbbá a reumás izületi gyulladásra vagy más, krónikus gyulladásos betegségre való hajlam kimutatására.

3. Kiegészítés antigén anyagok terápiás vagy diagnosztikai célból történő adagolásához

A terápiás vagy diagnosztikai szerekre, igy a borjú inzulinra, interferonra, szövet tipusu plazminogén aktivátorra, vagy egér monoklonális antitestekre adott immun válasz lényegesen gyengíti az ilyen szerek terápiás vagy diagnosztikai értékét, és a gyakorlatban betegséget, igy szérum érzékenységet okozhat. Az ilyen esetek elkerülhetők a találmány szerinti HAM és RAM alkalmazásával. Ebben az esetben ezeket az antitesteket terápiás vagy diagnosztikai szerekkel kombinálva adagoljuk.

A találmány szerinti megoldás kilencedik megvalósítása értelmében hatékony mennyiségben ICAM-l-re specifikus HAM-t vagy RAM-t adagolunk a betegnek, és ezzel megelőzzük a terápiás vagy diagnosztikai szer felismerését, és az ellene irányuló immunválasz kialakulását. Az immunválasz elmaradása következtében a terápiás vagy diagnosztikai szer ismételten adagolható.

4. HAM és RAM vírus elleni alkalmazása

A találmány szerinti megoldás egy másik vonatkozásban azon a felismerésen alapszik, hogy az ICAM-1 bizonyos vírusok celluláris receptora, és ezért a vírusnak szüksége van erre az anyagra ahhoz, hogy a humánsejteken megtapadjon, és azokat megfertőzze (Greve J.M. és munkatársai: Cell, 56,

839-847 (1989); Staunton D.E. és munkatársai: Cell, 56, 849-853 (1989)). Elsősorban a rinovirusokra, ezen belül a rinovirus fő szerotipusára jellemző, hogy a fertőzési folyamat során megköti a sejt felületén található ICAM-1 molekulákat.

A találmány szerinti megoldás tizedik megvalósítása az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM és RAM vírusfertőzés kezelésére történő alkalmazását jelenti. Mivel ezek az antitestek blokkolják az endotéliális sejtek ICAM-1 molekuláját, ezek alkalmazása a szervezetben csökkenti a receptorok virusmegkötő képességét és ezáltal a sejt fertőzésére alkalmas vírusok százalékos arányát.

Az ICAM-1 képes arra, hogy kölcsönhatásba lépjen a vírussal és azt megkösse, ahol vírusként előnyösen alkalmazható a rinovirus fő szerotipusa, ezen belül a Picornaviridae nembe tartozó vírusok, valamint az A csoportbeli koxszakkie vírusok (Colonno R.J. és munkatársai: J. virol., 57, 7-12 (1986)) és a Mengo vírusok (Rossmann M.G. és munkatársai: Virol. 164, 373-382 (1988)). A kölcsönhatást az ICAM-1 aminosav maradékai közül azok közvetítik, amelyek az ICAM-1 molekula 1. számú doménjeiben vannak jelen. A kölcsönhatásban részt vesznek azonban az ICAM-1 2. és 3. számú doménjeiben jelenlévő aminosavak is. Ennek megfelelően előnyösek azok a találmány szerinti RAM és HAM antitestek, amelyek az ICAM-1 molekula 1., 2. és 3. számú doménjét kötik meg. Különösen előnyösek azok a HAM és RAM antitestek, amelyek az ICAM-1 molekula 1. és 2. számú doménjét, ezen belül elsősorban az ICAM-1 molekula 1. számú doménjét kötik meg«

A találmány szerinti virus elleni szerek alkalmazhatók megelőzés vagy terápia céljából. A megelőzéshez a virus elleni szert a vírusfertőzés bármely szimptómájának megjelenésekor (például a fertőzés időpontja előtt, alatt vagy röviddel utána, előnyösen a fertőzés bármely szimptómájának bekövetkeztekor) adagoljuk. A profilaktikus adagolás célja egy esetleges vírusfertőzés megelőzése vagy gyengítése vagy annak a veszélynek a csökkentése, hogy az ilyen fertőzés átterjedjen másokra.

Terápia esetében a virus elleni szert a valóságos vírusfertőzés szimptómáinak (például nazális fertőzés vagy láz) kitörésekor (vagy röviddel utána) adagoljuk. A terápiás adagolás célja a bekövetkezett vírusfertőzés gyengítése.

A találmány szerinti virus elleni szerek tehát adagolhatok a vírusfertőzés kitörése előtt (a feltételezett fertőzés gyengítése érdekében) vagy egy ilyen fertőzés kitörése után.

5. HÍV fertőzés gyengítése és a HÍV fertőzött sejtek szétszóródásának megakadályozása

A találmány szerinti megoldás tizenegyedik megvalósítása eljárás HÍV fertőzés megszüntetésére, amelynek során a betegnek hatékony mennyiségben HÍV fertőzés elleni szert adagolunk. Bár a találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható a HIV-1 fertőzés esetében, az eljárás alkalmazhatósága kiterjed bármely HIV-1 változatra (például a HIV-2.

vírusra), amely a sejteket olyan folyamatokkal fertőzi, amely a találmány szerinti szerekkel leküzdhető. Ezek a változatok a találmány értelmében a HIV-1 ekvivalenseinek tekinthetők .

A találmány szerinti megoldás ebben a vonatkozásban azon a felismerésen alapszik, hogy az LFA-1 és bizonyos esetekben az ICAM-1 HÍV fertőzéssel stimulált kifejeződése elősegíti a sejtek közötti adhéziós reakciót, ami növeli a fertőzött és nem-fertőzött sejtek érintkezési idejét, és elősegíti a vírusnak fertőzött sejtből a nem-fertőzött sejtbe történő átjutását. Ennek megfelelően az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM és RAM képes csökkenteni a HÍV, és elsősorban a HIV-1 fertőzést.

Az egyik folyamat, amelyen keresztül az ICAM-1 megkötésére alkalmas molekulák csökkentik a HÍV fertőzést, abban áll, hogy gyengítik a HÍV fertőzött sejtek által kifejezett ICAM-1 azon képességét, hogy egy egészséges T sejt CD11/CD18 receptorához kötődjön. Annak érdekében, hogy egy sejtnél gyengítsük a CDlla/CD18 receptorhoz vagy az ICAM-1 ligandum molekulához történő kötődést, ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t adagolunk.

A találmány szerinti szert a HÍV fertőzés megszüntetéséhez szükséges mennyiségben kell adagolni a betegnek. Egy adott mennyiség akkor elegendő a HÍV fertőzés megszüntetéséhez, ha a szer az alkalmazott dózisban és adagolási módon gyengíti vagy megelőzi a HÍV fertőzést. A szert olyan betegeknek adagoljuk, akik HÍV fertőzésben szenvednek, vagy ilyennek vannak kitéve.

A találmány szerinti HAM és RAM a HÍV fertőzés kezelésében alkalmazható megelőzés vagy terápiás célból. Megelőzés esetén az antitestet a vírusfertőzés bármely szimptómájának megjelenésekor (például a fertőzés megjelenése előtt, alatt vagy röviddel utána, de előnyösen bármely szimptóma megjelenésekor) adagoljuk. A profilaktikus adagolás célja egy esetleges HÍV fertőzés megelőzése vagy gyengítése. Terápiás cél esetén az antitestet a virusfertőzött sejtek detektálásakor (vagy röviddel utána) adagoljuk. A terápiás adagolás célja a további HÍV fertőzések gyengítése.

A találmány szerinti szerek tehát adagolhatok a vírusfertőzés kitörése előtt (a feltételezett vírusfertőzés gyengítése érdekében) vagy virusfertőzött sejtek gyakorlati detektálása után (a további fertőzés gyengítése érdekében).

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható az AIDS terápiájában és a HÍV fertőzés, elsősorban a HIV-1 fertőzés megszüntetésére, amelynek során együttesen adagoljuk az alábbi komponenseket:

(I) ICAM-1, oldható ICAM-1 származék, CD11 (ami lehet CDlla, CDllb vagy CDllc), oldható CD11 származék, CD18, oldható CD18 származék, CD11/CD18 heterodimer vagy a CD11/CD18 heterodimer oldható származéka, és/vagy (II) ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM; és (III) a CD4-hez vagy a CD4 oldható származékához kapcsolódó sejt vagy ennek része, és/vagy (IV) a CD4 megkötésére alkalmas molekula (előnyösen antitest vagy antitest fragmens).

A találmány szerinti megoldás tizenkettedik megvalósítása eljárás a HIV-fertőzött sejtek migrációjának megakadályozására, amelynek során a HIV-fertőzött betegnek hatékony mennyiségben migrációgátló szert adagolunk.

A találmány értelmében migrációgátló szerként bármely olyan HAM vagy RAM alkalmazható, amely csökkenti a HIV-fertőzött T sejtek azon képességét, hogy ICAM-1 molekulához kötődjenek. Az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM és RAM olymódon gátolja a migrációt, hogy csökkenti a HIV-fertőzött T sejtek által kifejezett ICAM-1 azon képességét, hogy CD11/CD18 receptort kifejező sejtekhez kötődjön. Egy sejt CDlla/CD18 receptorhoz történő kötődésének megakadályozására alkalmazható az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM.

A találmány szerinti szereket a HÍV (vagy más vírussal) fertőzött T sejtek migrációjának megakadályozásához szükséges mennyiségben alkalmazzuk. Egy adott mennyiség akkor elegendő a T sejtek migrációjának megakadályozásához, ha a szer az alkalmazott dózisban és adagolási módon gyengíti vagy megelőzi a migrációt.

Az ilyen vegyületek adagolhatok megelőzés vagy terápia céljából. Megelőzés esetén a HAM-t vagy RAM-t a vírusfertőzés bármely szimptómájának megjelenésekor (a szimptóma megjelenése előtt, alatt vagy röviddel utána, előnyösen a fertőzésre utaló bármely szimptóma megjelenésekor) adagoljuk. A HAM vagy RAM profilaktikus adagolásának célja a virusfertőzött T sejtek feltételezett migrációjának megelőzése vagy legyengitése. Terápia esetén a HAM-t vagy RAM-t a vírussal fertőzött T sejtek detektálásakor (vagy röviddel utána) adagoljuk. A terápiás adagolás célja az ilyen T sejtek további migrációjának legyengitése.

A találmány szerinti HAM és RAM tehát a vírusos fertőzés kitörése előtt (a fertőzött T sejtek feltételezett migrációjának megakadályozására) vagy a virusfertőzött sejtek gyakorlati detektálása után alkalmazható.

6. Asztma kezelése

A találmány szerinti megoldás tizenharmadik megvalósítása értelmében az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t és RAM-t asztma kezelésére használjuk.

A találmány szerinti asztma elleni szer terápiás célból a betegnek bármely szokásos módon (például intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután, enterálisan vagy parenterálisan) adagolható. A találmány szerinti szert előnyösen intranazálisan (például nazális spray vagy tampon formájában) alkalmazzuk. Különösen előnyös az orális inhalálás, például orális spray vagy aeroszol segítségével. Injekciós utón történő alkalmazás megvalósításához választható a folyamatos infúzió vagy az egyszeri vagy többszörös injekció.

A találmány szerinti asztma ellenes szert az asztma szimptómák súlyosságának, kiterjedésének vagy időtartamának legyengitésére elegendő mennyiségben használjuk.

A találmány szerinti HAM és RAM adagolható önmagában vagy egy vagy több további asztma ellenes szerrel kombinálva. Az ilyenekre példaként említhetők a metil-xantin származékok (például teofillin), β-adrenerg agonisták (például katecholamin, rezorcinol, szaligenin és efedrin), a glükokortikoidok (például hidrokortizon), a kromonok (például kromolin-nátrium), és az antikolinerg anyagok (igy atropin). Kombináció alkalmazása esetén a találmány szerinti HAM és RAM lehetővé teszi az ismert asztma ellenes szer mennyiségének csökkentését.

A találmány szerinti HAM vagy RAM adagolható megelőzés vagy terápia céljából. Megelőzés esetén a HAM-t vagy RAM-t az asztma bármely szimptómájának megjelenésekor adagoljuk. A profilaktikus adagolás célja egy bekövetkező asztmatikus válasz megelőzése vagy legyengitése. Terápia esetén a HAM-t vagy RAM-t az asztma szimptómáinak kitörésekor (vagy röviddel utána) adagoljuk. A terápiás adagolás célja egy bekövetkezett asztmatikus periódus gyengítése. A találmány szerinti antitestek tehát adagolhatok egy feltételezett asztmatikus periódus kitörése előtt (a feltételezett periódus súlyosságának, időtartamának és kiterjedésének gyengítése érdekében) vagy a periódus beindulása után.

C. A találmány szerinti készítmények adagolása

Az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM terápiás hatásának kihasználásához a betegnek hatékony mennyiségben »»♦

- 58 HAM-t vagy RAM-t adagolunk, amely természetes szennyeződésektől mentes.

A találmány szerinti HAM és RAM a természetes szennyeződésektől mentesnek minősül akkor, ha az ezeket tartalmazó készítmények mentesek azoktól az anyagoktól, amelyek az ilyen termékek természetes kísérői.

A találmány kiterjed az olyan HAM és RAM termékekre, amelyek előállításához valamely állatot, szövettenyészetet vagy rekombináns DNS technológiát alkalmazunk.

A HAM vagy RAM adagolt mennyisége különböző faktoroktól, igy a kezelt beteg korától, tömegétől, magasságától, nemétől, általános egészségügyi állapotától és előzetes kortörténetétől függ. Az antitest dózisa általában mintegy ¹ P9/^k(J ~ ¹⁰ mg/kg testtömeg, bár alkalmazható ennél alacsonyabb vagy nagyobb dózisban is.

Az ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM adagolható intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután, enterálisan, helyileg inhalálva, intranazálisan vagy parenterálisan. Az adagolás végezhető folyamatosan vagy egyetlen vagy többszörös dózisban.

A készítmény farmakológiailag alkalmazhatónak minősül akkor, ha a kezelt beteg számára elviselhető. A szert terápiásán hatékony mennyiségben adagoljuk akkor, ha az adagolt mennyiség fiziológiailag szignifikáns. Egy szer fiziológiailag szignifikánsnak minősül akkor, ha jelenléte kimutatható változást okoz a kezelt beteg fiziológiájában.

A találmány szerinti HAM és RAM a szokásos módon gyógy* «

-59szerkészitménnyé alakítható. Ehhez az antitestet gyógyszerészeti hordozóanyaggal és adott esetben egyéb, gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük. Hordozóanyagként alkalmazható például más humán fehérje, például humán szérum albumin (Remingston's Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, Osol, A, Mack, Easton, Pennsylvania, USA (1980)). A hatékony kezelésre alkalmas, farmakológiailag alkalmazható készítmény hatékony mennyiségű HAM-t vagy RAM-t tartalmaz megfelelő mennyiségű hordozóanyaggal együtt.

A hatás időtartamának szabályozásához további farmakológiái módszerek alkalmazhatók. Szabályozott hatóanyagleadásu készítmény állítható elő, ha a HAM vagy RAM molekulát polimerrel komplex-szé alakítjuk, vagy polimeren megkötjük. A hatóanyag felszabadulásának a helye szabályozható megfelelő makromolekulák (például poliészterek, poliaminosavak, polivinil-pirrolidon, etilénvinil-acetát, metil-cellulóz, karboxi-metil-cellulóz vagy protamin-szulfát) alkalmazásával, amikoris a makromolekula koncentrációjának és a készítmény előállítási technika megválasztásával szabályozott hatóanyagleadás is elérhető. A hatás időtartamát szabályozó nyújtott hatóanyagleadásu készítmény előállítható úgy is, hogy a HAM vagy RAM molekulát polimer anyag (igy poliészter, poliaminosav, hidrogél, polilaktolsav vagy etilén-vinil-acetát kopolimer) szemcséibe építjük be. Emellett lehetőség van arra is, hogy a HAM vagy RAM molekulát mikrokapszulázzuk, például koacerváló technikával vagy felületi polimerizálással, amellyel alkalmazható például hidroxi-metil-cel* · *· *·«· • · ♦ ♦ · • · · ··« · • ···Ο · · lulóz vagy zselatin mikrokapszula és polimetil-metakrilát mikrokapszula. Előállíthatok kolloid állapotban lévő készítmények is, például liposzómák, albumin mikroszemcsék, mikroemulzió, nanoszemcsék és nanokapszulák, vagy makróemulziók alkalmazásával. A szükséges technikák megtalálhatók az idézett Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) cimü irodalomban.

Alkalmazott eljárások

1. Alkalmazott sejtek

Az R6-5-D6 hibridoma sejtvonal beszerezhető a Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. cégtől (száma: R6-5-D6-E9-B2 0-29-86). A sejtvonalat glutaminnal és 5 % magzati borjuszérummal kiegészített antibiotikum-mentes Dulbecco-féle módosított Eagles közegen (DMEM) tenyésztjük, és két részre osztva tulnövekedett felüluszót állítunk elő a kifejlesztéshez, és sejteket állítunk elő az RNS extrahálásához. A tulnövekedett felüluszó egér IgG2a/kappa antitestet tartalmaz. A sejttenyészet felüluszója a vizsgálatok szerint R6-5-D6 antitestet tartalmaz.

2. Molekulár-biolőgiai eljárások

Az alkalmazott alapvető molekulár-biolőgiai eljárásokat ismertetik Maniatis és munkatársai (Maniatis és munkatársai:

♦ · *« ···· • · · · » • · · ··* · • · · * · · · » · t* · * ·· ··

- 61 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, USA (1982)), amelyen egyes esetekben kismértékű módosításokat végeztünk. A DNS szekvenálást Sanger és munkatársai módszerével (Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)) és az Amersham International Plc szekvenáló kézikönyv előírásai szerint végeztük. Az alkalmazott COS sejt kifejezés és metabolit jelölési vizsgálatokat Whittle és munkatársai: Prot. Eng. 1, 6, 499-505 (1987) ismerteti. Az aranyhörcsög petefészek (Chinese Hamster Ovary, CHO) transzfekciót és a sejttenyésztést Gorman C.: DNA Cloning 2, 143-190 (1988), valamint Bebbington és Hentschel: DNA Cloning 3, 163-188 (1988) ismerteti.

³· Vizsgálati eljárások

3.1 A kiválasztott antitest könnyű láncegység vizsgálata

A CHO sejtvonal felüluszóját könnyű láncegység kiválasztásra vizsgáljuk a könnyű láncegységet kifejező vektorral történő transzfektálás után, ami a teljes kimér antitest termelésére alkalmas stabil sejtvonal kifejlesztésének első lépése. Az alkalmazott eljárás a következő:

mérőhelyes mikrotitráló lemezt F(ab')2 kecske antihumán kappa könnyű láncegységgel vonjuk be. A lemezet vízzel mossuk, hozzáadjuk a mintát, és egy órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A lemezeket mossuk, majd F(ab')2 kecske antihumán F(ab')₂ torma-peroxidáz (HRPO) konjugátumot * · · 9 9 · · ··· · * · · · · · <* ··»* · 99 ♦ »

- 62 adunk hozzá, és további egy órán keresztül inkubáljuk. A reakció beindításához enzim szubsztrátumot adagolunk.

3.2 Mennyiségi vizsgálat

A transzfektált COS sejtek és a transzfektált CHO sejtek felüluszójában meghatározzuk az ép IgG mennyiségét.

3.2.1. Egér génnel transzfektált COS és CHO sejtek

A sejt felüluszóban az ép egér IgG-t ELISA vizsgálattal határozzuk meg az alábbiak szerint:

Egy 96 mérőhelyes mikrotitráló lemezre F(ab')2 kecske antiegér IgG Fc-t viszünk fel. A lemezeket vízzel mossuk, hozzáadjuk a mintát és egy órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A lemezeket mossuk, és F(ab')2 kecske antiegér IgG F(ab’)2 (HRPO konjugált) adunk hozzá. A reakció megindításához enzim szubsztrátumot adagolunk. Standardként UPCIO-t, egy egér IgG2a mielomát alkalmazunk.

3.2.2 Kimér génnel transzfektált COS és CHO sejtek

A COS sejtek felüluszójában az ép humanizált anti-ICAM-l-t ELISA módszerrel vizsgáljuk az alábbiak szerint:

Egy 96 mérőhelyes mikrotitráló lemezre F(ab')2 kecske antihumán IgG Fc-t viszünk fel. A lemezt mossuk, hozzáadjuk a mintát, és egy órán keresztül szobahőmérsékleten inku9 ♦ ·*> ·«#· • « ú é • · 4 ··· · * * · · 4 · · ·«·» · ·* ·- 63 báljuk. A lemezt mossuk, és monoklonális egér antihumán kappa láncegységet adunk hozzá, majd egy órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A lemezt mossuk, és F(ab*)₂ kecske antiegér IgG Fc (HRPO) konjugált adunk hozzá. A reakció megindításához enzim szubsztrátumot adagolunk. Standardként kimér B72.3-t (WO 89/01783 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés) (IgG4), majd tisztított anti-ICAM-1 (IgG4, IgG2 és igGl) alkalmazunk. A monoklonális antikappa láncegység alkalmazása lehetővé teszi a CDR-oltott antitestek mennyiségének meghatározását.

3.3 Az antigénkötő aktivitás vizsgálata

3.3.1 Közvetlen kötés

A COS és CHO sejt felüluszóban található anyagokat és tisztított kimér antitesteket vizsgálunk az anti-ICAM-1 antigént megkötő képességükre közvetlen vizsgálat formájában ICAM-1 pozitív sejteken. Az alkalmazott eljárás a következő:

JY sejteket (a sejt felületén ICAM-1 kifejezésére alkalmas humán B limfoblasztoid sejtvonal) tenyésztünk. A JY sejtek monorétegét 96 mérőhelyes ELISA lemezen fixáljuk poli-L-lizin és paraformaldehid segítségével. A mintát hozzáadjuk a monoréteghez és egy órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A lemezeket óvatosan PBS-sel mossuk, majd a humanizált vagy egér mintához F(ab')2 kecske antihumán IgG Fc (HPO konjugált) vagy F(ab')2 kecske antiegér

IgG Fc (HRPO konjugált) adunk. A reakció megindításához enzim szubsztrátumot adagolunk. A sejten alapuló vizsgálatban negatív kontrollként kimér B72.3 (IgG4) vagy összgyüjtött tisztított humán IgG2 és IgG4 (Chemicon) használható. A pozitív kontroll egér R6-5-D6 MAb vagy kimér anti-ICAM-1 antitest.

3.3.2 Kompetitiv kötés

JY sejtekből monoréteget állítunk elő a 3.3.1 pontban leirt módon. Hozzáadjuk az antitest mintát és egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután biotinilezett anti-ICAM-1 molekulákat adunk a lemezhez, a keveréket 2 órán keresztül szobahőmérsékleten hagyjuk, majd mossuk, és streptavidin-HRPO-t adunk hozzá. További inkubálás után a reakciót enzim-szubsztrátum adagolásával indítjuk.

Eredmények

4. cDNS tár előállítása

4.1. mRNS előállítása és cDNS szintézis

Sejteket növesztünk az 1. pontban leirt módon, majd

1,4 x 10⁹ sejtet begyüjtünk, és az mRNS-t guanidinium/LiCl extrakciós eljárással extraháljuk. cDNS-t állítunk elő oligo-dT-ből kiindulva, amelynek során teljes hosszúságú cDNS-t kapunk. A cDNS-t metilezzük, és a klónozáshoz EcoRI linkért adunk hozzá.

4.2. A tár előállítása

A cDNS tárat pSP64 vektor DNS-hez ligáljuk, amit előzetesen EcoRI-gyel hasítunk, és az 5' foszfátcsoportokat borjubél-foszfatázzal eltávolítjuk (EcoRI/CIP). A ligáit terméket könnyen transzforrnáIható Escherichia coli HB101 (24

E. coli HB101, Bethesda Research Lbs, BRL) törzsbe visszük a könnyű láncegység esetében, és elektroporációval előállított (Dower és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 16, 6127 (1988)) E. coli LM1035 törzsbe visszük a nehéz láncegység esetében. így cDNS tárakat állítunk elő. 11600 telepet vizsgálunk a könnyű láncegység és 25000 vizsgálunk a nehéz láncegység vonatkozásában.

5. Vizsgálat

A nehéz vagy könnyű láncegység próbára pozitig E. coli telepeket megvizsgáljuk. Ez megvalósítható például oligonukleotid vizsgálattal, amelyhez az alábbi oligonukleotid szekvenciát használjuk:

5’TCCAGATGTTAACTGCTCAC a könnyű láncegység vonatkozásában, amely komplementer az egér kappa állandó területben található szekvenciával. A vizsgálat megvalósítható továbbá egy 980 bp BamHI/EcoRI restrikciós fragmens alkalmazásával, amit a korábban izolált egér IgG2a állandó területű klónból állítunk elő. Hat könnyű láncegység és tiz nehéz láncegység klón azonosítható és ezt használjuk a vizsgálatok második körében. A vizsgálatok második körében talált pozitív kiónokat növesztjük, és ebből DNS-t állítunk elő. A gén inszert méretét gélelektroforézissel becsüljük meg, és szekvenáljuk azt a DNS inszertet, amelyről feltételezhető, hogy tartalmazza a teljes hosszúságú cDNS-t.

6. DNS szekvenálás

Az 5' le-nem-forditott szakasz, a szignálszekvencia, a változó és állandó területen és a 3' le-nem-forditott szakasz DNS szekvenciáját a teljes hosszúságú cDNS-ben meghatározzuk, és az 1. ábrán adjuk meg a könnyű láncegység, illetve a 2. ábrán adjuk meg a nehéz láncegység vonatkozásában.

7. cDNS expressziós vektor előállítása

A Celltech expressziós vektorok a pEE6 hCMV plazmidon alapulnak, amint ez a 3. ábrán látható (WO 89/01036 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés). A humán citomegalovirus (hCMV) fő középső korai promoter/dúsító egysége után egy polilinkert építünk be a kifejezendő gén inszertálása érdekében. Az eukarióta sejtbe transzfektált plazmid szelektálását lehetővé tevő marker gének BamHI kazetta formában a pEE6 hCMV plazmid egyetlen BamHI helyére építhetők be. Az általános gyakorlat szerint a neo és gpt markereket a kívánt gén beépítése előtt visszük be, mig a GS markert utolsónak inszertáljuk, a kazettában lévő belső EcoRI hely jelenléte miatt.

A szelektálható markereket SV40 késői promoterből fejezzük ki, amely szintén tartalmaz replikációs origót, igy a vektor a COS sejten alapuló átmeneti expressziós rendszerben kifejezhető.

Az egér szekvenciákat EcoRI fragmensek formájában kivágjuk, és a könnyű láncegység vonatkozásában EE6-hCMV-neo egységbe (4. ábra) és a nehéz láncegység vonatkozásában EE6-hCMV-gpt egységbe (5. ábra) klónozzuk.

8. cDNS kifejezése COS sejtekben

A pAL6 plazmidot (4. ábra) és a pAL6 plazmidot (5. ábra) együtt COS sejtekbe transzfektáÍjuk, ahol az átmeneti expressziós kísérlet felüluszója JY sejteket megkötő összegyűjtött antitesteket tartalmaz (6. ábra). A metabolit jelölés kísérletben ³⁵S metionin alkalmazásával kimutatható a nehéz és könnyű láncegységek kifejezése és összegyűjtése.

9· CDR-oltott gének előállítása

A receptor szerkezetként alkalmazható humán antitest » > * I · « · « · w * «. « *

- 68 szekvenciák analízise szerint előnyösen alkalmazható az EU antitest (lásd Kábát és munkatársai idézett müve (1987)).

9.1. Könnyű láncegység szekvencia

A 7. ábra két változó terület aminosav szekvenciáját mutatja, amelyekben az egér szerkezeti területeket az EU könnyű láncegység analóg szekvenciájával helyettesítettük. A gL221 szerkezetben egér szekvenciát csak a 24-34, 50-56 és 89-97 maradékoknál alkalmazunk. A gL221A szerkezetben több szerkezeti maradékként egér szekvenciát alkalmazunk. Ezt az a felismerés indokolja, hogy a fenti maradékok feltehetően résztvesznek a dómén hajtogatásában, és az antigénkötő szakasz konformációjának stabilizálásában. A 2, 3, 49, 60, 70, 84, 85 és 87 maradékok az ábrán aláhúzással vannak jelölve.

A 8. ábra a gL221 szerkezet változó területének megfelelő gén összeállításához alkalmazott oligonukleotid párokat mutatja. Az oligonukleotidokat a szintézis során kémiailag foszforiláltuk. 20 pmól komplementer oligonukleotidot párosítottunk, majd 65 ’C hőmérsékletre melegítettük, és szobahőmérsékletre hülve hagytuk anellálódni. A párokat ezután összekevertük, és T4 DNS ligázzal egy éjszakán keresztül ligáltuk. A terminális restrikciós helyeket a ligáit termék BstBl és SplI enzimmel végzett hasításával kivágtuk. A szükséges 408 bp fragmenst preparativ agaróz gél elektroforézissel izoláltuk, és a fent említett pEE6 hCMV vektorral azonos pE1081 vektorba ligáltuk, amely hCMV promotert és humán kappa állandó területet tartalmaz olyan konfigurációban, hogy a változó területnek megfelelő szekvencia BstBI-StlI fragmensen keresztül történő inszertálása lehetővé teszi a teljes hosszúságú könnyű láncegység szekvencia hatékony kifejezését és kiválasztását megfelelő eukarióta sejtben, például COS-1 sejtben.

A megfelelő kiónokat DNS szekvenálással ellenőriztük. Az expressziós vizsgálatokhoz a pBJ2 kiónt használtuk. A 9. ábra az előállítási folyamatot mutatja. A gL221A gént azonos módon feldolgozva pBJl plazmidot kapunk.

A 10. ábra a gL221A szerkezet változó területeknek megfelelő génje előállításához alkalmazott oligonukleotid párokat mutatja.

9.2. Nehéz láncegység szekvencia

A 11. ábra a nehéz láncegység változó területeinek aminosav szekvenciáját mutatja, amelyben az egér szerkezeti területeket analóg Eü nehéz láncegység szekvenciákkal helyettesítettük. Az EU nehéz láncegység részlegesen különleges J szakaszt tartalmaz, és az anti-ICAM antitestnek minősülő R6-5-D6-ból származó egér szekvenciák a gyakorlatban közelebb állnak a normál humán szekvencia részleteihez, mint az EU. Ezért a 103-108 maradékok közé (a számozást az EU index alapján adjuk meg; Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest US ···

- 70 Department of Health and Humán Services, NIH, USA (1987)) egér szekvenciát viszünk be a kívánt génszerkezetbe.

A gH341 szerkezet tartalmazza a 26-35, 50-56 és 94-100B maradékoknak megfelelő egér szekvenciákat, a korábban említettek mellett. A gH341A szerkezetben a 24 és 73 maradékoknál egér maradékot alkalmazunk. A gH341B szerkezetben a 24, 48 és 73 maradékoknál alkalmazunk egér maradékot. A gH341D szerkezetben a 24, 48, 69, 71, 73, 80, 88 és 91 maradékoknál alkalmazunk egér maradékot. Az extra egér maradékok célja, hogy elősegítse ezen maradékok részvételét a dómén integritásában, és az antigénkötő szakasz megfelelő elhelyezkedésében.

A 12. ábra a gH341 szerkezet változó területnek megfelelő génje előállításához alkalmazott oligonukleotid párokat mutatja. A gént a gL221 vonatkozásában a 9.1. pontban megadott előírás szerint állítjuk elő. A kívánt gén fragmens izolálásához a Hindin és Apai restrikciós enzimeket használjuk. A 440 bp gén fragmenst a pE1004 vektor (a fent ismertetett pEE6 hCMV szerkezettel azonos vektor) HindlII és Apai helyére klónozzuk, ahol a vektor hCMV promotert és humán IgG4 állandó területet tartalmaz olyan konfigurációban, hogy a változó terület szekvenciájának bevezetése lehetővé teszi a teljes hosszúságú nehéz láncegység szekvenciájának hatékony kifejezését és elválasztását, ha a megfelelő könnyű láncegység termelésére alkalmas vektorral együtt eukarióta sejtben, például COS-1 sejtben kifejezzük. A vektor a hipoxantin-guanin-foszforibozil transz71 feráz gént (gpt gén) is kódolja, ami lehetővé teszi stabil sejtvonalak, például aranyhörcsög petefészek sejtvonal (CHO) kialakítását. A megfelelő kiónokat DNS szekvenálással ellenőrizzük. Az expressziós vizsgálatokhoz a pJA192 kiónt használjuk. A gH341A gént azonos módon feldolgozva pJA195 plazmidot kapunk.

A JA192 szerkezetben található gH341A génbe bevezetett és 73 maradékokat szétválasztva két további gént, gH341Al és gH341A2 gént kapunk, amelyhez az Xhol restrikciós helyet használjuk fel, amely a gH341A génben található két kodon között helyezkedik el. A pJA192 (gH341 vektor) és pJA195 (gH341A vektor) HindlII-XhoI fragmensének izolálásával és a génfragmensek felcserélésével a gH341Al és gH341A2 géneket tartalmazó vektorszármazékot kapjuk. Ez lehetővé teszi a fenti aminosavak relativ hatásának vizsgálatát anélkül, hogy a kapott antitest savassá válna.

A gH341B gént a pJA195 plazmidban található gH341A génből állítjuk elő polimeráz láncreakciós (PCR) mutációs eljárással, ahol a 48 aminosav kodonját úgy változtatjuk meg, hogy a kapott aminosav humán maradékként szolgáló metioninről egér aminosavként szolgáló izoleucinra változzon. A gH341B gén előállítását a 13. ábra mutatja. A pAL19 nevű kiónt DNS szekvenálással ellenőrizzük, és az expreszsziós vizsgálatokhoz használjuk.

A gH341D gént a változó terület 3' felének oligonukleotid kezelésével állítjuk elő, és 294 bp Xhol Apai fragmensként pJA195 (gH341A) szerkezetbe klónozzuk. A 13. ábra mutatja a génfragmens előállításához alkalmazott oligonukleotidokat. A kapott vektor a pAL20 jelet kapja.

Nehéz láncegység akceptorként az EU helyett más akceptor szerkezetek is alkalmazhatók, például a KOL antitest.

Az olyan szerkezetek szekvenciájának vizsgálatával, amelyek részt vesznek a dómén integritásában, és az antigénkötő szakasz megfelelő elhelyezkedésében, megtervezhető a változó terület aminosav szekvenciája. A gH341A (KOL) gén egér szekvenciát tartalmaz a 36-35, 50-62, 64-65 és 95-100b szakaszokban (a számozás Kábát és munkatársai idézett müve szerint), valamint a 24, 71 és 73 pozíciójú aminosavaknál. A gén előállításához alkalmazott oligonukleotidokat a 14. ábra mutatja. Az oligonukleotidokból egyenként 10 pmól mennyiséget összekeverünk 100 μΐ végső térfogatú pufferben. A keveréket 30 ciklusban 95 °C hőmérsékleten melegítjük 1 percen keresztül, 55 °C hőmérsékleten melegítjük 1 percen keresztül, és 72 °C hőmérsékleten melegítjük 1 percen keresztül 0,5 egység Taq polimeráz jelenlétében. A kívánt fragmens Hindui és Apai emésztéssel feltárható a reakciótermékekből, és az expressziós vizsgálatokhoz a pE1004 szerkezetbe klónozható.

10. CDR-oltott antitestek kifejezése

A CDR-oltott könnyű és nehéz láncegység géneket tartalmazó expressziós vektorokat együtt COS sejtekbe transzfektáljuk az ismertetett módon. A könnyű és nehéz lánc73 egységeket egyesitjük, és kontroll láncként kimér könnyű láncegységet (cL) és kimér IgG4 nehéz láncegységet (cH) alkalmazunk.

A 15. ábra a gL221 és gL221A gének cH génnel együtt végzett transzfektálását, valamint a gH341, gH341A, gH341B és gh341D gének cL génnel együtt végzett transzfektálását mutatja. Az összehasonlítást a cL/cH kombinációval végezzük.

A gL221/cH és gL221A/cH kombináció esetében látható, hogy olyan antitestet eredményez, amelynek kötő aktivitása ekvivalens a kimér antitest aktivitásával. Az oltott nehéz láncegység/kimér könnyű láncegység kombinációk esetében a CDR-en kívüli egér szekvenciák növelésével javul a kapott a antitest kötési jellemzője.

A 16. ábrán a gL221 génnel vagy gL221A génnel együtt kifejezett gH341D gén összehasonlítását adjuk meg. Látható, hogy az antitestek kötőaktivitása a kimér antitest aktivitásához viszonyítva mintegy 75 % és 50 %, a gL221A/gH341D és gL221/gH341D kombinációk esetében.

Szignifikáns kötőaktivitás érhető el tehát egér szerkezeti maradékoknak a gH341 génbe történő bevitelével.

A 17. ábra a kompetitiv vizsgálat eredményét mutatja, amelyben az IgG4 gL221A gH341D antitest eredményesen verseng a JY sejten található ICAM-1 megkötésében a szülőként alkalmazott R6.5 egér antitesttel. A kompetitiv képesség mintegy 10 % a kimér IgG4 antitestre vonatkoztatva.

Claims (55)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Rekombináns antitest molekula, azzal jellemezve, hogy egy anti-ICAM-1 antitest nehéz és/vagy könnyű láncegységének változó területeiről származó antigénkötő szakaszokat tartalmaz .
2. 2. CDR-oltott humanizált antitest molekula, azzal jellemezve, hogy ICAM-1 specifikus és olyan antigénkötő helyet tartalmaz, ahol a változó domének komplementaritást meghatározó szakaszai közül legalább egy valamely nem-humán anti-ICAM-1 antitestből származik.
3. 3. A 2. igénypont szerinti CDR-oltott antitest könnyű láncegysége, azzal jellemezve, hogy a 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) és 91-96 (CDR3) pozíciókban nem humán CDR-t tartalmaz.
4. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti CDR-oltott antitest könnyű láncegysége, azzal jellemezve, hogy az 1, 2 és/vagy 3, 46, 47, 49, 60, 70, 84, 85 és 87 pozíciókban egy vagy több nem-humán maradékot tartalmaz.
5. 5. A 4. igénypont szerinti CDR-oltott antitest könnyű láncegysége, azzal jellemezve, hogy legalább a 46 és 47 pozíciókban nem-humán maradékot tartalmaz.
6. 6. A 2. igénypont szerinti CDR-oltott antitest nehéz láncegysége, azzal jellemezve, hogy a 24-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) és 95-100 (CDR3) pozíciókban nem-humán CDR-t tartalmaz .
7. 7. A 2. igénypont szerinti CDR-oltott antitest nehéz láncegysége, azzal jellemezve, hogy a 26-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) és 94-100 (CDR3) pozíciókban nem-humán CDR-t tartalmaz .
8. 8. A 2., 6. vagy 7. igénypontok szerinti CDR-oltott antitest nehéz láncegysége, azzal jellemezve, hogy a 23 és/vagy 24 és 71 és/vagy 73 pozíciókban nem-humán maradékot tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti CDR-oltott antitest nehéz láncegysége, azzal jellemezve, hogy a 6, 48 és/vagy 49, 69, 76 és/vagy 78, 80, 88 és/vagy 91 pozíciókban egy vagy több további nem-humán maradékot tartalmaz.
10. 10. Rekombináns antitest molekula vagy CDR-oltott humanizált antitest molekula, azzal jellemezve, hogy legalább egy 1-5. igénypont bármelyike szerinti könnyű láncegységet és legalább egy, 1., 2. vagy 6-9. igénypont bármelyike szerinti nehéz láncegységet tartalmaz.
11. 11. Rekombináns antitest molekula vagy CDR-oltott humanizált antitest molekula, azzal jellemezve, hogy az antitest R6-5-D6 egér monoklonális antitestből származik.
12. 12. DNS, azzal jellemezve, hogy 1-11. igénypont bármelyike szerinti antitest nehéz láncegységet vagy könnyű láncegységet kódol.
13. 13. Vektor, azzal jellemezve, hogy 10. vagy 11. igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.
14. 14. Kifejező vektor, azzal jellemezve, hogy 1-5. igénypont bármelyike szerinti antitest könnyű láncegységet kódoló DNS-t és ezzel operatív kombinációban 1., 2. vagy • » · ·

    6-9. igénypont bármelyike szerinti antitest nehéz láncegységet kódoló DNS-t tartalmaz.
15. 15. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy 12. vagy 13. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.
16. 16. Eljárás anti-ICAM-1 HAM előállítására, azzal jellemezve, hogy

    a) olyan expressziós vektort állítunk elő, amelynek operon egysége olyan antitest nehéz vagy könnyű láncegységet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, ahol a változó doménben legalább egy CDR nem-humán (rágcsáló) anti-ICAM-1 antitestből származik, és az antitest láncegység további, immunoglobulin eredetű részei humán immunoglobulinból származnak;

    b) olyan expressziós vektort állítunk elő, amelynek operon egysége olyan komplementer antitest könnyű vagy nehéz láncegységet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, ahol a változó doménben legalább egy CDR rágcsáló (nem-humám) anti-ICAM-1 antitestből származik, és az antitest láncegység további, immunoglobulin eredetű részei humán immunoglobulinból származnak;

    c) egy gazdasejtet mindkét vektorral transzfektálunk; és

    d) a transzfektált sejtvonalat tenyésztve HAM-t állítunk elő.
17. 17. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely 1-10. igénypont szerinti antitest molekulát vagy annak fragmensét tartalmazza gyógyszerészeti hordozóanyagok és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyagok mellett.
18. 18. Diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy • · * · ·

    - 77 valamely 1-11. igénypont szerinti antitest molekulát vagy annak fragmensét tartalmazza a detektálást biztosító jelölt formában.
19. 19. Kezelési eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán vagy állati beteget valamely 1-11. igénypont szerinti antitest termék hatékony mennyiségével kezeljük.
20. 20. Eljárás emlősök specifikus védekező rendszerének válaszaként kialakuló gyulladás kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek a gyulladás megszüntetéséhez szükséges mennyiségben gyulladásgátló szert adagolunk, ahol gyulladásgátló szerként ICAM-l megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t alkalmazunk.
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HAM-ként vagy RAM-ként egy vagy több 1-11. igénypont szerinti antitestet alkalmazunk.
22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy késleltetett tipusu hiperszenzitiv reakcióból származó gyulladás kezelésére alkalmazzuk.
23. 23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a psoriasis szimptómáit mutató gyulladás kezelésére alkalmazzuk.
24. 24. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy autoimmun betegség szimptómáit mutató gyulladás kezelésére alkalmazzuk.
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy autoimmun betegségként Reynaud-szindróma, autoimmun pajzsmirigy gyulladás, EAE, sclerosis multiplex, reumás *·«·

    - 78 izületi gyulladás és lipus erythematosus kezelésére alkalmazzuk.
26. 26. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyulladásként szerv transzplantációs kilökődés! válasz kezelésére alkalmazzuk.
27. 27. A 26 igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy veseátültetés kezelésére alkalmazzuk.
28. 28. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szövetátültetés kilökődésének kezelésére alkalmazzuk.
29. 29. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiegészítő kezelésként LFA-1 megkötésére alkalmas antitestet, ennek funkcióképes származékát, valamint az LFA-1 nem-immunoglobulin antagonistáját adagoljuk.
30. 30. Eljárás emlősök nem-specifikus védekezőrendszerének válaszából kialakuló gyulladások kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek a gyulladás csökkentéséhez szükséges mennyiségben gyulladásgátló szert adagolunk, ahol gyulladásgátló szerként ICAM-1 megkötésére alkalma HAM-t vagy RAM-t alkalmazunk.
31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felnőtt légzési nehézség szindrómával, baktériumvérüséggel összefüggő összetett szervsérülés szindrómával, traumával összefüggő összetett szervsérülés szindrómával, szövetek reperfuziós sérülésével, akut glomerulonefritiszszel, reaktív izületi gyulladással, bőrbetegséggel összefüggő akut gyulladásos komponenssel, a központi idegrendszer gyulladásos betegségével, például gutaütéssel, termális sérüléssel, vérdializissel, leukaferézissei, fekélyes vastagbél gyulladással, Crohn-betegséggel, elhalásos vékonybél-vastagbél huruttal, granulocita transzfuzióval összefüggő szindrómával, és citokinnal kiváltott toxicitással kapcsolatos gyulladás kezelésére alkalmazzuk.
32. 32. A 30. vagy 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HAM-ként vagy RAM-ként egy vagy több 1-11. igénypont szerinti antitestet alkalmazunk.
33. 33. Eljárás vérképző tumorsejt áttételének megakadályozására, ahol a sejt a migrációhoz az LFA-1 család valamely funkcionális tagját használja, azzal jellemezve, hogy a betegnek az áttétel elnyomásához szükséges mennyiségben gyulladásgátló szert adagolunk, ahol gyulladásgátló szerként ICAM-1 megkötésére alkalmas kimér antitestet alkalmazunk.
34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-ként vagy RAM-ként valamely 1-11. igénypont szerinti antitestet alkalmazunk.
35. 35. Eljárás ICAM-l-t kifejező tumorsejt növekedésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a betegnek a növekedés elnyomására szükséges mennyiségben toxint adagolunk, ahol toxinként ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM vagy RAM toxin-származékot alkalmazunk.
36. 36. Eljárás vírusfertőzés kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek a vírusfertőzés elnyomására szükséges mennyiségben ICAM-l-t megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t adagolunk.

    * 4 » · · · · • · 4 ·*· « • ···· · · • · W · * · · · ·
37. 37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Picornaviridae fajba tartozó fő szerotipusnak megfelelő rinovirus, A csoport-beli coxsackie vírus vagy Mengo vírus fertőzés kezelésére alkalmazzuk.
38. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fő szerotipusba rinovirus fertőzés kezelésére alkalmazzuk.
39. 39. A 36-38. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HAM-ként vagy RAM-ként legalább egy, 1-11. igénypont szerinti antitestet alkalmazunk.
40. 40. Eljárás leukociták HÍV fertőzésének kezelésére, azzal jellemezve, hogy a HÍV fertőzött vagy ennek kitett beteget hatékony mennyiségben HIV-1 fertőzést csökkentő szerrel kezeljük, ahol a fertőzést csökkentő szerként ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t alkalmazunk.
41. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HÍV fertőzésként HIV-1 fertőzés kezelésére alkalmazzuk.
42. 42. A 40. vagy 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HAM-ként vagy RAM-ként legalább egy, 1-11. igénypont szerinti antitestet alkalmazunk.
43. 43. Eljárás virusfertőzött leukocita extravaszkuláris migrációjának csökkentésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek hatékony mennyiségben antimigrációs szert adagolunk, ahol antimigrációs szerként az adott leukocita ICAM-1 megkötőképességét csökkentő HAM-t vagy RAM-t alkalmazunk.
44. 44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HÍV fertőzött sejtek kezelésére alkalmazzuk.

    • φ ·«··*♦ *· · φ ·· • · ··*· * • ···· · · *·«* » ····
45. 45. A 43. vagy 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HAM-ként vagy RAM-ként legalább egy 1-11. igénypont szerinti antitestet alkalmazunk.
46. 46. Eljárás asztma kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek az asztma csökkentéséhez szükséges mennyiségben ICAM-1 megkötésére alkalmas HAM-t vagy RAM-t adagolunk.
47. 47. A 46. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HAM-ként vagy RAM-ként legalább egy, 1-11. igénypont szerinti antitestet alkalmazunk.
48. 48. A 19-47. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humanizált HAM-t vagy RAM-t enterálisan, parenterálisan, topikálisan, inhalációval vagy intranazálisan adagoljuk.
49. 49. A 48. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HAM-t vagy RAM-t megelőzésként alkalmazzuk.
50. 50. A 48. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humanizált HAM-t vagy RAM-t terápiásán alkalmazzuk.
51. 51. A 48., 49. vagy 50. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a parenterális adagolást intramuszkulárisan, intravénásán vagy szubkután végezzük.
52. 52. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely 1-11. igénypont szerinti gyulladásgátló szert tartalmaz gyógyszerészeti hordozóanyagok és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyagok mellett.
53. 53. 52. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy további hatóanyagként legalább egy, immunszupressziv anyagot tartalmaz.
54. 54. Eljárás ICAM-1 kifejezésére alkalmas tumorsejtek emlősökben történő diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy

    a) a betegnek ICAM-1 megkötésére alkalmas, és detektálható jelöléssel ellátott HAM-t vagy RAM-t adagolunk; és

    b) az ICAM-l-hez kötött HAM-t vagy RAM-t kimutatjuk.
55. 55. Eljárás gyulladás emlősökben történő diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy

    a) egy szövetmintát ICAM-1 kifejezésére alkalmas sejthez kötődő, és detektálható jellel ellátott kimér antitestet tartalmazó készítménnyel inkubálunk; és

    b) a sejthez kötött kimér antitestet detektáljuk.