HU231403B1 - Biopesticidal fungel strains and preparation thereof - Google Patents
Biopesticidal fungel strains and preparation thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HU231403B1 HU231403B1 HUP1800012A HUP1800012A HU231403B1 HU 231403 B1 HU231403 B1 HU 231403B1 HU P1800012 A HUP1800012 A HU P1800012A HU P1800012 A HUP1800012 A HU P1800012A HU 231403 B1 HU231403 B1 HU 231403B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- strain
- trichoderma
- ncaim
- strains
- day
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 24
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 title description 3
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 155
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 59
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 46
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 39
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 39
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 241001307140 Diplodia seriata Species 0.000 claims description 22
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims description 20
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 claims description 19
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 claims description 17
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 claims description 17
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 claims description 17
- 241001221840 Neofusicoccum parvum Species 0.000 claims description 16
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 16
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 16
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 claims description 14
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 claims description 13
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 claims description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 9
- 231100000517 death Toxicity 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000219095 Vitis Species 0.000 claims 7
- 241001638069 Rigidoporus microporus Species 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 44
- 101100207368 Curvularia clavata kkR gene Proteins 0.000 description 38
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 35
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 30
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 27
- 241000894007 species Species 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 25
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 12
- 241001557886 Trichoderma sp. Species 0.000 description 11
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 8
- 241000306527 Trichoderma orientale Species 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 6
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 6
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 6
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 6
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 6
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 5
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 5
- 101100207370 Curvularia clavata TR07 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100207372 Curvularia clavata TR09 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000894120 Trichoderma atroviride Species 0.000 description 4
- 241000303715 Trichoderma lixii Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241001149472 Clonostachys rosea Species 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 3
- 241000303716 Trichoderma simmonsii Species 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 3
- 229960001257 oxyquinoline sulfate Drugs 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004476 plant protection product Substances 0.000 description 3
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 2
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 2
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 2
- 101100313266 Mus musculus Tead1 gene Proteins 0.000 description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241001460073 Trichoderma asperellum Species 0.000 description 2
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000018842 conidium formation Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000001052 yellow pigment Substances 0.000 description 2
- ULYMTCOVLNBXIE-HEXJONDASA-N (2s)-2-[[(2s,4r)-1-[2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-acetamido-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]- Chemical class C([C@@H](C(=O)NC(C)(C)C(=O)NC(C)(C)C(=O)NC(C)(C)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(C)(C)C(=O)NC(C)(C)C(=O)N1C[C@H](O)C[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@](C)(CC)C(=O)N1[C@@H](C[C@@H](O)C1)C(=O)NCC(=O)NC(CO)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)NC(C)=O)C1=CC=CC=C1.O=C([C@@H]1CCCN1C(=O)C(C)(C)NC(=O)[C@@H]1C[C@@H](O)CN1C(=O)C(C)(C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1C[C@@H](O)CN1C(=O)C(C)(C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)C(C)(C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(C)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)NC(CO)CC1=CC=CC=C1 ULYMTCOVLNBXIE-HEXJONDASA-N 0.000 description 1
- 101150078635 18 gene Proteins 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000190146 Botryosphaeria Species 0.000 description 1
- 241000190148 Botryosphaeriaceae Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001133184 Colletotrichum agaves Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241001306390 Diaporthe ampelina Species 0.000 description 1
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 1
- 241000378864 Eutypa Species 0.000 description 1
- 241000378865 Eutypa lata Species 0.000 description 1
- 241001240951 Fomitiporia mediterranea Species 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 238000010629 Molecular evolutionary genetics analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108010061784 Peptaibols Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000263269 Phaeoacremonium minimum Species 0.000 description 1
- 241000088433 Phaeoacremonium sp. Species 0.000 description 1
- 241000047848 Phaeomoniella Species 0.000 description 1
- 241000047853 Phaeomoniella chlamydospora Species 0.000 description 1
- 241001480007 Phomopsis Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 101100213970 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ypt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000303774 Trichoderma atrobrunneum Species 0.000 description 1
- 241000944293 Trichoderma gamsii Species 0.000 description 1
- 239000005854 Trichoderma gamsii (formerly T. viride) strain ICC080 Substances 0.000 description 1
- 241000223262 Trichoderma longibrachiatum Species 0.000 description 1
- HNEGCRMUYSKRRR-UHFFFAOYSA-N Trichodermin Natural products CC(=O)OC1CC2OC3C=C(C)CCC3(C)C1(C)C21CO1 HNEGCRMUYSKRRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012681 biocontrol agent Substances 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000011438 cord wood Substances 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005078 fruit development Effects 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 231100000363 mycotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000357 mycotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000024241 parasitism Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- KDNCILYKSYKEFJ-UHFFFAOYSA-N sodium;benzenesulfonyl(chloro)azanide Chemical compound [Na+].Cl[N-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KDNCILYKSYKEFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- HNEGCRMUYSKRRR-IKIFYQGPSA-N trichodermin Chemical compound C([C@@]12[C@@]3(C)[C@@]4(C)CCC(C)=C[C@H]4O[C@@H]1C[C@H]3OC(=O)C)O2 HNEGCRMUYSKRRR-IKIFYQGPSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000009369 viticulture Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/38—Trichoderma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/885—Trichoderma
Description
BIOPESZTICID GOMBATÖRZSEK ÉS KÉSZÍTMÉNYEKBIOPESTICIDES OF MUSHROOMS AND PREPARATIONS
A TALÁLMÁNY TÁRGYKÖRESCOPE OF THE INVENTION
A találmány tárgya eljárás szőlő tőkebetegségének megelőzésére és/vagy kezelésére, valamint növényi növekedés serkentésére, amely magában foglalja a növény mikoparazita Trichoderma törzzsel vagy azt tartalmazó készítménnyel való kezelését. A találmány tárgya továbbá eljárás Fusarium oxysporum által okozott növényi betegségek kezelésére.The subject of the invention is a method for the prevention and/or treatment of grape root disease and the stimulation of plant growth, which includes the treatment of the plant with the mycoparasitic Trichoderma strain or with a preparation containing it. The subject of the invention is also a method for the treatment of plant diseases caused by Fusarium oxysporum.
A TECHNIKA ÁLLÁSASTATE OF THE ART
A szőlő tőkebetegsége (tökeelhalás, Grapevine Trunk Diseases -GTD) a tőke korai pusztulásához vezet. A megbetegedés komplex betegségként értelmezendő, hiszen kialakulásában számos növényi kórokozó gomba vehet részt, emellett a tünetek kialakulását és a betegség súlyosságát egyéb környezeti tényezők is nagymértékben befolyásolják. A betegség kapcsán az Ascomycota fajok közül leggyakrabban leírt fajok: Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydosrpoa és más Phaeoacremonium sp., Eutypa lata, Diplodia seriata, Phomopsis viticola. Basidiomycoták közül: Fomitiporia mediterranea. Az elhalást többféle gombafaj együttesen is okozhatja, a kórokozók faja, mintázata függ a növényfajtól, fajtától, az alany fajtájától, éghajlattól, stb. A szőlő leggyakoribb tőkebetegségei közé tartoznak az esca betegségkomplex, a Petri-betegség, az Eutypa, a Botryosphaeria és a Phomopsis fajok okozta elhalások, a fekete kordonkar-elhalás és a fekete láb betegség (Kovács 2017).Grapevine Trunk Diseases (GTD) lead to premature death of the stem. The disease is to be interpreted as a complex disease, since many plant pathogenic fungi can be involved in its development, and the development of symptoms and the severity of the disease are also greatly influenced by other environmental factors. Among the Ascomycota species, the most frequently described species are: Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydosrpoa and other Phaeoacremonium sp., Eutypa lata, Diplodia seriata, Phomopsis viticola. Among Basidiomycota: Fomitiporia mediterranea. The death can be caused by several species of fungi together, the species and pattern of pathogens depends on the plant species, variety, species of the subject, climate, etc. The most common capital diseases of grapes include the esca disease complex, Petri's disease, Eutypa, Botryosphaeria and Phomopsis species deaths, black cord rot and black leg disease (Kovács 2017).
A védekezést megnehezíti, hogy nem ismert a betegségnek ellenálló szőlőfajta vagy hatásosan alkalmazható növényvédöszer. A védekezés így jelenleg a megelőzésre (egészséges szaporítóanyag, metszési sebeken keresztüli fertőzés megakadályozása) korlátozódik.Control is made more difficult by the fact that there is no known grape variety resistant to the disease or an effective plant protection product. Protection is thus currently limited to prevention (healthy propagating material, prevention of infection through incision wounds).
A Trichodermák gyors növekedésű, légmicéliumot termelő fajok. Növekedésük optimális hőmérséklete általában 30°C. Konídiumtartói a hifákon képződnek; egysejtű konídiumai - melyek fehér színűek vagy zöldes ámyalatúak (Kövics, 2009) - a táptalajon elszórtan vagy koncentrikus körökbe rendeződve helyezkednek el. A konídiumok változatos alakúak és méretűek lehetnek. A Trichoderma fajok egyik mikroszkopikus jellemzője, hogy hifafonalaik rendkívül vékonyak. Erre utal a nemzetségnevük is (tricho (’thrix’) = hajszál görögül).Trichodermas are fast-growing, aerial mycelium-producing species. The optimum temperature for their growth is usually 30°C. Conidia are formed on hyphae; its single-celled conidia - which are white or greenish in color (Kövics, 2009) - are scattered on the culture medium or arranged in concentric circles. Conidia can be of various shapes and sizes. One of the microscopic characteristics of Trichoderma species is that their hyphal threads are extremely thin. This is also indicated by their genus name (tricho ('thrix') = strand of hair in Greek).
A Trichoderma fajok potenciális biopeszticideknek tekinthetőek, egyes törzseiket növényi kórokozók ellen is alkalmazzák (Weindling, 1932). A fajokat általában gyors növekedés jellemzi, melynek köszönhetően kiszorítják a patogén kórokozókat a növény környezetéből (térparazitizmus). Mikoparazitaként pedig más (pl. növényi kórokozó) gombák hifáit képesek elpusztítani. Térparazita és mikoparazita aktivitásuk mellett mikotoxikus vegyületek kiválasztásával (antibiózis) is hatékonyan képesek más mikrobák növekedését gátolni (Kubicek et al„ 2007).Trichoderma species can be considered as potential biopesticides, some of their strains are also used against plant pathogens (Weindling, 1932). The species are usually characterized by rapid growth, thanks to which they displace pathogenic agents from the plant's environment (space parasitism). As mycoparasites, they can destroy the hyphae of other fungi (e.g. plant pathogens). In addition to their parasitic and mycoparasitic activity, they are also able to effectively inhibit the growth of other microbes by excreting mycotoxic compounds (antibiosis) (Kubicek et al. 2007).
A WINETWORK projektben (www.winetwork.eu) a Trichoderma fajok alkalmazásának lehetőségeivel kapcsolatos eredményeket összegezték (http://www. winetwork-data.eu/íntranet/líbretti/O/libretto 16735-01 1 .pdf, közzétéve 2017. augusztus 30; idézve a 2017. 12. 11-i állapot), és megállapították, hogy a vizsgált számos Trichoderma faj és törzs közül a biológiai védekezésben biokontroll ágensként a szőlő tökebetegségek ellen leginkább használt törzsek: a Trichoderma atroviride, a Trichoderma asperellum, a Trichoderma gamsii és a Trichoderma harzianum fajok közé tartoznak. Hangsúlyozzák, hogy a Trichoderma fajok és törzsek hatás122825-1423/KOHThe WINETWORK project (www.winetwork.eu) summarized the results related to the possibilities of using Trichoderma species (http://www. winetwork-data.eu/íntranet/líbretti/O/libretto 16735-01 1 .pdf, published August 30, 2017 ; quoted as of 11/12/2017), and found that among the many Trichoderma species and strains tested, the strains most used as biocontrol agents against grape root diseases in biological control are: Trichoderma atroviride, Trichoderma asperellum, Trichoderma gamsii and they belong to the Trichoderma harzianum species. It is emphasized that Trichoderma species and strains effect122825-1423/KOH
SZTNH-100089099SZTNH-100089099
-2mechanizmusa többféle (faj- vagy akár törzs specifikus) és génszinten szabályozott. A Tríchoderma fajokat megelőző jelleggel alkalmazzák, a szőlő tökebetegségek esetén nincs kuratív képességük, de hatékonyak például a metszési sebek befertözödésének megakadályozásában. Az összefoglalóból egyértelmű, hogy a Trichodermát tartalmazó készítményeket a metszési sebeknél vagy a szaporítóanyagként használt oltványoknál kell alkalmazni a metszést követő kritikus időszakban (2-8 hét) - pontosabban a nyugalmi időszak és a könnyezés ideje között - ahhoz, hogy a kórokozókkal való fertőzést megelőzzék. A metszési sebek kezelésére irányuló eljárásokat a telepítést követően ajánlott megkezdeni, majd évenkénti kezelés szükséges. Megállapítják azt is, hogy a Tríchoderma fajok hatékonysága nem teljes mértékben alátámasztott szabadföldi alkalmazásban, szükség van ellenőrzött kísérletekre. A hatástalanság oka lehet, hogy az alkalmazott készítményekben lévő Tríchoderma fajok nem szőlőből származnak, illetve az is, hogy az alkalmazott Tríchoderma törzsek a metszési sebeket csak kis mélységben képesek kolonizálni, amennyiben egyáltalán képesek a kolonizációra. A Tríchoderma fajok hatékonysága az összefoglaló szerint részleges a szőlő tökebetegségei ellen.-2 its mechanism is diverse (species or even strain specific) and regulated at the gene level. Trichoderma species are used preventively, they do not have a curative effect in the case of vine stem diseases, but they are effective, for example, in preventing the infection of pruning wounds. It is clear from the summary that preparations containing Trichoderma must be used in incision wounds or in grafts used as propagating material during the critical period after pruning (2-8 weeks) - more precisely, between the resting period and the time of tearing - in order to prevent infection with pathogens. Procedures for the treatment of pruning wounds are recommended to be started after installation, and then annual treatment is required. They also state that the effectiveness of Trichoderma species is not fully supported in field use, and controlled experiments are needed. The reason for the ineffectiveness may be that the Trichoderma species in the used preparations do not come from grapes, or that the Trichoderma strains used can only colonize incision wounds at a small depth, if they are able to colonize at all. According to the summary, the effectiveness of Tríchoderma species is partial against grape root diseases.
Hasonló eredményekről számolnak be Di Marco és munkatársai, akik szerint az esca kórokozójának kiirtása jelenleg nem lehetséges. Az általuk a fertőzés előtt alkalmazott T. harzianum T39 törzzsel való kezelés a metszési sebeken megelőzte a fekete kordonkar-elhalást és csökkentette a Phaeomoniella chlamydospora fertőzést. A szerzők hangsúlyozzák, hogy a ZricAor/erma-kezelés hatékony prevenciót biztosít a még meg nem fertőződött szőlő esetén. Di Marco és munkatársai vizsgálták azt is, hogy a Tríchoderma alkalmazható-e növényi növekedést elősegítő szerként a kalluszképzödést megelőzően, azonban eredményeik ezt az alkalmazást nem támasztották alá (Di Marco et al. Experiments on the control of esca by Tríchoderma. Phytopathol. Mediterr. 2004. 43, 108-115).Similar results are reported by Di Marco et al., according to whom eradication of the causative agent of esca is currently not possible. Pre-infection treatment with T. harzianum T39 strain on incision wounds prevented black cordwood death and reduced Phaeomoniella chlamydospora infection. The authors emphasize that the ZricAor/erma treatment provides effective prevention for uninfected grapes. Di Marco et al. also investigated whether Tríchoderma can be used as a plant growth promoter before callus formation, but their results did not support this use (Di Marco et al. Experiments on the control of esca by Tríchoderma. Phytopathol. Mediterr. 2004 43, 108-115).
Chaverri és munkatársai felhívják a figyelmet a Tríchoderma fajok és törzsek pontos - genetikai alapú azonosításának szükségességére, amennyiben azokat növényvédöszerekben kívánják alkalmazni. Vizsgálataik során azt találták, hogy a Tríchoderma genuson belül a fajok morfológiailag ugyan akár azonosak is lehetnek, biológiai sajátosságaik azonban nagyon is különböznek. A harzianum fajkomplex tagjai is nagy morfológiai hasonlóságot mutatnak, azonban geográfiai eloszlásuk és ennek megfelelően ökológiai szerepük, életmódjuk (például talajban élő vagy endofita) különböző. Megállapították például, hogy a leggyakrabban vizsgált T22 T. harzianum törzs (amelyet növényvédöszerekben és növényi növekedést elősegítő készítményekben is alkalmaznak) valójában Tríchoderma afroharzianum. Részletes genetikai elemzéssel sikerült megállapítaniuk azt is, hogy a gombaellenes ágensként leírt CGMCC 1780 T. harzianum törzs valójában két különböző fajhoz tartozó keverék, amelyek közül az egyik trichodermin mikotoxint termel, vagyis alkalmazása növényvédöszerként nem lehetséges.Chaverri and his colleagues draw attention to the need for accurate genetic identification of Trichoderma species and strains if they are to be used in plant protection products. During their investigations, they found that the species within the Trichoderma genus may be morphologically identical, but their biological characteristics are very different. The members of the harzianum species complex also show great morphological similarity, but their geographical distribution and, accordingly, their ecological role and lifestyle (e.g. soil-dwelling or endophytic) are different. For example, it was found that the most commonly studied strain T22 T. harzianum (which is also used in plant protection products and plant growth promoters) is actually Tríchoderma afroharzianum. With a detailed genetic analysis, they also managed to establish that the CGMCC 1780 T. harzianum strain described as an antifungal agent is actually a mixture of two different species, one of which produces trichodermin mycotoxin, meaning that it cannot be used as a plant protection agent.
Nyilvánvaló tehát, hogy szükség van olyan készítményekre, melyek genetikailag azonosított, az emberre ártalmatlan, a szőlő tökebetegségeit hatékonyan megelőzni és/vagy kezelni képes Tríchoderma törzset tartalmaznak.It is therefore clear that there is a need for products that contain a genetically identified Trichoderma strain that is harmless to humans and can effectively prevent and/or treat grape root diseases.
A TALÁLMÁNY RÖVID ISMERTETÉSEBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
A találmány megalkotói felismerték, hogy az általuk izolált egyes Tríchoderma törzsek széles hőmérsékleti tartományban képesek növekedésre, a tökebetegséget okozó kórokozókat in vitro teljes mértékben képesek gátolni (elpusztítani). Szabadföldi kísérletekben igazolták, hogy a találmány szerinti Tríchoderma törzsek alThe inventors of the invention realized that some of the Trichoderma strains they isolated are able to grow in a wide temperature range, and are able to completely inhibit (destroy) the pathogens that cause mite disease in vitro. It was verified in field experiments that the Trichoderma strains according to the invention al
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-3kalmasak a tökebetegségek megelőzésére és a betegség kezelésére, akár a növény telepítése előtt és szaporítóanyagon alkalmazva is. A találmány szerinti törzsek kiterjedten és tartósan kolonizálták a vizsgált növényeket. A találmány szerinti törzsek hatékonyan serkentették a növények növekedését és pozitívan befolyásolták a termés minőségét is.-3 are suitable for the prevention of root diseases and the treatment of the disease, even before planting the plant and when applied to propagating material. The strains according to the invention extensively and permanently colonized the tested plants. The strains according to the invention effectively stimulated plant growth and positively influenced the quality of the crop.
1. Eljárás szőlő tőkebetegségének megelőzésére és/vagy kezelésére, amely tartalmazza legalább egy Trichoderma törzs vagy legalább egy Trichoderma törzset tartalmazó készítmény érintkeztetését szölőnövénynyel vagy szölőnövény-szaporítóanyaggal, ahol a legalább egy Trichoderma törzs1. Process for the prevention and/or treatment of grape root disease, which includes contacting at least one Trichoderma strain or a preparation containing at least one Trichoderma strain with a grape plant or grape plant propagating material, where the at least one Trichoderma strain
- a következő csoportba tartozó fajokba tartozó törzsek közül választott: Trichoderma harzianum fajcsoport és Trichoderma viride,- chosen from strains belonging to species belonging to the following group: Trichoderma harzianum species group and Trichoderma viride,
- képes a szőlő fás szövetét tartósan kolonizálni, úgy, hogy a Trichoderma törzs a fás szövetből a kezelés után több mint hat hónappal később, előnyösen több mint egy évvel később, különösen előnyösen több mint két évvel később izolálható,- is able to permanently colonize the woody tissue of the grape, so that the Trichoderma strain can be isolated from the woody tissue more than six months later, preferably more than one year later, especially preferably more than two years later,
- Diplodia seriata és Neofusicoccum parvum ellen appresszóriumot képez és Biokontroll-Index (BCI) értéke legalább 90%, előnyösen 95%, különösen előnyösen 100%.- Forms an appressorium against Diplodia seriata and Neofusicoccum parvum and has a Biocontrol Index (BCI) value of at least 90%, preferably 95%, especially preferably 100%.
2. Egy megvalósítási mód szerint a Trichoderma törzs a kezelés után kevesebb, mint 12 hónappal később, előnyösen kevesebb, mint nyolc hónappal később, különösen előnyösen kevesebb, mint hat hónappal később a kezelés helyétől számított legalább 5 centiméterre, előnyösen legalább 10 centiméterre kimutatható a szőlőnövény fás szövetéből, különösen előnyösen a szőlönövény bármely fás részéből kimutatható.2. According to one embodiment, the Trichoderma strain can be detected less than 12 months after the treatment, preferably less than eight months later, especially preferably less than six months later, at least 5 centimeters, preferably at least 10 centimeters from the place of treatment, on the grape plant it can be detected from its woody tissue, particularly preferably from any woody part of the grape plant.
3. Az eljárásban alkalmazott Trichoderma törzs burgonya-dextróz agar táptalajon tenyésztve elszórtan vagy koncentrikus körökbe rendeződve képez konídiumokat, melyek enyhén megnyúlt gömb alakúak.3. The Trichoderma strain used in the procedure forms conidia scattered or arranged in concentric circles when cultured on potato-dextrose agar medium, which are slightly elongated spherical.
4. A Trichoderma törzs burgonya-dextróz agar táptalajon képes mintegy 5°C-on növekedni úgy, hogy átlagos micéliális növekedése legalább 0,5 mm/nap, előnyösen legalább 0,75 mm/nap, különösen előnyösen legalább 1,25 mm/nap.4. The Trichoderma strain can grow on potato-dextrose agar medium at about 5°C, with an average mycelial growth of at least 0.5 mm/day, preferably at least 0.75 mm/day, particularly preferably at least 1.25 mm/day .
5. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a Trichoderma törzs Trichoderma harzianum fajcsoportba tartozó törzs.5. According to a preferred embodiment, the Trichoderma strain is a strain belonging to the Trichoderma harzianum species group.
6. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a Trichoderma törzs Fusarium oxysporum ellen appresszóriumot képez és BCI-értéke legalább 50%, előnyösen legalább 75%, különösen előnyösen 100%6. According to a preferred embodiment, the Trichoderma strain forms an appressorium against Fusarium oxysporum and has a BCI value of at least 50%, preferably at least 75%, particularly preferably 100%
7. Különösen előnyös megvalósítási mód szerint a Trichoderma törzs a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél 2017. december 12-én NCAIM (P) F 001456 azonosítószámon letétbe helyezett DETR04 törzs vagy annak származéka, NCAIM (P) F 001457 azonosítószámon letétbe helyezett DE_TR05 vagy annak származéka.7. According to a particularly advantageous embodiment, the Trichoderma strain is DETR04 deposited at the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms on December 12, 2017 under identification number NCAIM (P) F 001456 or its derivative, DE_TR05 deposited under identification number NCAIM (P) F 001457 or its derivative.
8. Különösen előnyös megvalósítási mód szerint Trichoderma törzs a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél (1118 Budapest, Somlói út 14-16, Magyarország) 2017. december 12-én NCAIM (P) F 001458 azonosítószámon letétbe helyezett DE TR08 vagy annak származéka.8. According to a particularly advantageous embodiment, Trichoderma strain DE TR08 deposited at the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (1118 Budapest, Somlói út 14-16, Hungary) on December 12, 2017 under identification number NCAIM (P) F 001458 or its derivative.
9. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint az eljárás tartalmazza legalább két Trichoderma törzs vagy legalább két Trichoderma törzset tartalmazó készítmény érintkeztetését szőlőnövénnyel vagy szőlőnövény-szaporítóanyaggal, ahol a legalább két Trichoderma törzs a következők közül választott: DE_TR04 vagy származéka és DE TR05 vagy származéka. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a legalább két9. According to a particularly preferred embodiment, the method includes contacting at least two Trichoderma strains or a preparation containing at least two Trichoderma strains with a grape plant or grape plant propagating material, where the at least two Trichoderma strains are chosen from the following: DE_TR04 or its derivative and DE TR05 or its derivative. According to a particularly advantageous embodiment, the at least two
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-4Trichoderma törzs a DE TR04 és a DE TR05. Egy másik megvalósítási mód szerint az eljárás tartalmazza legalább három Trichoderma törzs vagy legalább három Trichoderma törzset tartalmazó készítmény érintkeztetését szölönövénnyel vagy szölönövény-szaporítóanyaggal, ahol a legalább három Trichoderma törzs a következők közül választott: DE TR04 vagy származéka, DE TR05 vagy származéka és DETR08 vagy származéka.-4Trichoderma strain DE TR04 and DE TR05. According to another embodiment, the method comprises contacting at least three Trichoderma strains or a composition containing at least three Trichoderma strains with a grape plant or grape plant propagation material, where the at least three Trichoderma strains are selected from DE TR04 or its derivative, DE TR05 or its derivative, and DETR08 or its derivative .
Egy előnyős megvalósítási mód szerint a Trichoderma törzset vagy származékát, vagy a Trichoderma törzset vagy származékát tartalmazó készítményt tőkebetegség tünetét mutató szölönövénnyel vagy szölönövényszaporítóanyaggal érintkeztetjük.According to an advantageous embodiment, the Trichoderma strain or its derivative, or the preparation containing the Trichoderma strain or its derivative, is brought into contact with a grape plant showing symptoms of capital disease or with grape plant propagating material.
Előnyösen a tökebetegség fekete kordonkar-elhalás.Preferably, the root disease is black cordon dieback.
Előnyösen a tökebetegség Diplodia seriata és/vagy Neofusicoccum parvum okozta fertőzéssel összefüggő betegség.Preferably, the powdery mildew is a disease associated with infection by Diplodia seriata and/or Neofusicoccum parvum.
Eljárás növény növekedésének elősegítésére, amely tartalmazza az 1-9. számozott bekezdések bármelyikében meghatározott Trichoderma törzs vagy származéka, vagy az 1-9. számozott bekezdések bármelyikében meghatározott Trichoderma törzset vagy származékát tartalmazó készítmény érintkeztetését a növénnyel vagy szaporítóanyagával.Process for promoting plant growth, which includes 1-9. Trichoderma strain or derivative specified in any of the numbered paragraphs, or 1-9. the contact of a preparation containing a Trichoderma strain or derivative specified in any of the numbered paragraphs with the plant or its propagating material.
Előnyösen a Trichoderma törzset a növény telepítése előtt érintkeztetjük a növénnyel vagy a szaporítóanyaggal.The Trichoderma strain is preferably brought into contact with the plant or the propagating material before the plant is planted.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a szaporítóanyag hajtás, oltvány, gyökeres oltvány, alanyvesszö vagy oltócsap.According to a preferred embodiment, the propagating material is a scion, scion, rooted scion, rootstock or rootstock.
Egy megvalósítási mód szerint kezelendő növény a következők közül választott: Kékfrankos, Cabemet Sauvignon, Cabemet Franc, Hárslevelű, Tárcái 26 és Furmint fajtájú szőlő.According to one embodiment, a plant to be treated is selected from the following: Kékfrankos, Cabemet Sauvignon, Cabemet Franc, Hárslevelű, Tárcái 26 and Furmint grape varieties.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a növényt vagy szaporítóanyagát kétévente, előnyösen háromévente, különösen előnyösen a növény élete során egy alkalommal érintkeztetjük a Trichoderma törzzsel vagy származékával.According to a preferred embodiment, the plant or its propagation material is brought into contact with the Trichoderma strain or its derivative every two years, preferably every three years, particularly preferably once during the life of the plant.
Eljárás növényben Fusarium oxysporum okozta fertőzés megelőzésére és/vagy kezelésére, amely tartalmazza az 1-9. igénypontok bármelyikében meghatározott Trichoderma törzs vagy származéka, vagy az 1-9. számozott bekezdések bármelyikében meghatározott Trichoderma törzset vagy származékát tartalmazó készítmény érintkeztetését a növénnyel vagy szaporítóanyagával.Process for preventing and/or treating infection caused by Fusarium oxysporum in plants, which includes 1-9. Trichoderma strain or derivative defined in any of the claims, or 1-9. the contact of a preparation containing a Trichoderma strain or derivative specified in any of the numbered paragraphs with the plant or its propagating material.
Trichoderma törzs vagy származéka, amely az 1-9. számozott bekezdések bármelyikében meghatározott Trichoderma törzs vagy származéka.A strain or derivative of Trichoderma that is classified as 1-9. strain or derivative of Trichoderma defined in any of the numbered paragraphs.
Készítmény, amely az 1-9. számozott bekezdések bármelyikében meghatározott Trichoderma törzset vagy származékát és mezőgazdaságilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmaz. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a készítmény tartalmaz DE TR04 törzset vagy származékát és DE TR05 törzset vagy származékát. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a készítmény DE_TR04 törzset és DE TR05 törzset tartalmaz. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a készítmény DE TR04 törzset, DETR05 törzset és DE TR08 törzset tartalmaz.Preparation, which is 1-9. contains a Trichoderma strain or derivative specified in any of the numbered paragraphs and an agriculturally acceptable carrier or auxiliary material. According to a preferred embodiment, the composition contains strain DE TR04 or its derivative and strain DE TR05 or its derivative. According to a particularly preferred embodiment, the preparation contains strain DE_TR04 and strain DE TR05. According to a preferred embodiment, the preparation contains strain DE TR04, strain DETR05 and strain DE TR08.
AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSEBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
1. ábra Maláta kivonatos agar táptalajra helyezett töke mintákFigure 1. Pumpkin samples placed on malt extract agar medium
2. ábra Trichoderma harzianum törzsek (TR04 bal, TR05 jobb) makromorfológiája burgonya-dextróz agarFigure 2. Macromorphology of Trichoderma harzianum strains (TR04 left, TR05 right) on potato-dextrose agar
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-5táptalajon.-5 on nutrient medium.
3. ábra Trichoderma viride TR08 törzs makromorfológiája burgonya-dextróz agar táptalajon.Figure 3. Macromorphology of Trichoderma viride TR08 strain on potato-dextrose agar medium.
4. ábra Trichoderma törzsek ITS szekvencia alapján szerkesztett filogenetikai törzsfájaFigure 4. Phylogenetic tree of Trichoderma strains based on ITS sequence
A dendogramon látható elágazások hossza arányos a nukleotid eltérések számával, a skála alul, középen található. Az elágazásoknál látható kék szám a bootstrap analízis (1000 ismétlés) eredményét jelöli, míg faj nevek előtt az NCBI adatbázisban található deponált törzsek nyilvántartási számait (Accession Number) láthatjuk, melyekkel a saját törzseinket összehasonlítottuk. Az 50%-nál nagyobb értékeket jelöltük a törzsfán. A TR01-10 saját törzseinket jelöli.The length of the branches shown on the dendogram is proportional to the number of nucleotide differences, the scale is located at the bottom, in the middle. The blue number visible at the branches indicates the result of the bootstrap analysis (1000 repetitions), while in front of the species names we can see the registration numbers (Accession Number) of the strains deposited in the NCBI database, with which we compared our own strains. Values greater than 50% were marked on the family tree. TR01-10 represents our own strains.
5. ábra Trichoderma törzsek tefl szekvencia alapján szerkesztett filogenetikai törzsfájaFigure 5. Phylogenetic tree of Trichoderma strains based on tefl sequence
Az elágazások hossza arányos a nukleotid eltérések számával, a skála alul, középen található. Az elágazások melletti látható kék szám a bootstrap analízis (1000 ismétlés) eredményét jelöli, míg fajnevek előtt az NCBI adatbázisban található deponált törzsek nyilvántartási számait (Accession Number) láthatjuk, melyekkel a saját törzseinket összehasonlítottuk. Az 50%-nál nagyobb értékeket jelöltük a törzsfán. A TR01-10 saját törzseinket jelöli.The length of the branches is proportional to the number of nucleotide differences, the scale is located at the bottom, in the middle. The visible blue number next to the branches indicates the result of the bootstrap analysis (1000 repetitions), while before the species names we can see the accession numbers of the strains deposited in the NCBI database, with which we compared our own strains. Values greater than 50% were marked on the family tree. TR01-10 represents our own strains.
6. ábra Trichoderma harzianum törzsek tefl (A) és chil8-5 (B) gének alapján készített törzsfáiFigure 6. Phylogenetic trees of Trichoderma harzianum strains based on tefl (A) and chil8-5 (B) genes
Az elágazások hossza arányos a nukleotid eltérések számával, a skála alul, középen található. Az elágazások melletti látható kék szám a bootstrap analízis (1000 ismétlés) eredményét jelöli, míg fajnevek előtt az NCBI adatbázisban található deponált törzsek nyilvántartási számait (Accession Number) láthatjuk, melyekkel a saját törzseinket összehasonlítottuk. Az 50%-nál nagyobb értékeket jelöltük a törzsfán. A TR01-10 saját törzseinket jelöli.The length of the branches is proportional to the number of nucleotide differences, the scale is located at the bottom, in the middle. The visible blue number next to the branches indicates the result of the bootstrap analysis (1000 repetitions), while before the species names we can see the accession numbers of the strains deposited in the NCBI database, with which we compared our own strains. Values greater than 50% were marked on the family tree. TR01-10 represents our own strains.
7. ábra TR01-TR05 T harzianum törzsek növekedése 18,5-37°C közöttFigure 7 Growth of TR01-TR05 T harzianum strains between 18.5-37°C
8. ábra TR07-TR10 Trichoderma törzsek micéliális növekedéseFigure 8. Mycelial growth of Trichoderma strains TR07-TR10
9. ábra T. harzianum (TR01, TR05, TR09), Trichoderma viride (TR08) törzsek micéliális növekedésének összehasonlítása a Trichoderma orientate (TR06) törzs növekedésévelFigure 9. Comparison of the mycelial growth of T. harzianum (TR01, TR05, TR09), Trichoderma viride (TR08) strains with the growth of Trichoderma orientate (TR06) strain
10. ábra Trichoderma törzsek micéliális növekedése 5°C hőmérsékletenFigure 10. Mycelial growth of Trichoderma strains at 5°C
11. ábra Trichoderma harzianum (TR04, TR05) és Trichoderma orientate (TR06) micéliális növekedése 12°C hőmérsékletenFigure 11 Mycelial growth of Trichoderma harzianum (TR04, TR05) and Trichoderma orientate (TR06) at 12°C
12. ábra TR04, TR05 T. harzianum és TR06 T orientate törzsek mikoparazita képessége D. seriata patogénnel szembenFigure 12. Mycoparasitic ability of TR04, TR05 T. harzianum and TR06 T orientate strains against the pathogen D. seriata
13. ábra TR04, TR05 T. harzianum és TR06 T. orientate törzsek mikoparazita képessége N. pamim patogénnel szembenFigure 13. Mycoparasitic ability of TR04, TR05 T. harzianum and TR06 T. orientate strains against N. pamim pathogen
14. ábra A TR07 - F. oxysporum interakciójaFigure 14. TR07 - F. oxysporum interaction
15. ábra A D. seriata köré tekeredő T. harzianum TR04Figure 15. T. harzianum TR04 wrapped around D. seriata
16. ábra T. harzianum TR04 rátekeredése aF. oxysporum patogén hifafonaláraFigure 16. Wrapping of T. harzianum TR04 aF. oxysporum pathogenic hyphae
17. ábra 8 napos TR05 (T. harzianum), TR06 (T orientate) /felső sor/, TR08 (T viride) és a MIX törzsek PDA agar táptalajonFigure 17. 8-day-old TR05 (T. harzianum), TR06 (T orientate) /top row/, TR08 (T viride) and the MIX strains on PDA agar medium
18. ábra 8 napos Saját MIX és az ESQUIVE Trichoderma törzs PDA agar táptalajonFigure 18. 8-day-old Saját MIX and the ESQUIVE Trichoderma strain on PDA agar medium
19. ábra SpóraszuszpenzióFigure 19. Spore suspension
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
20. ábra Tárcái 26 fajta a Trichoderma kezelés nélkül és Trichoderma kezelést követő 10 hónappalFigure 20. Portfolios of 26 varieties without Trichoderma treatment and 10 months after Trichoderma treatment
21. ábra Tárcái 26 fajta fürtök kezelt/kezeletlen tökénFigure 21. Folders of 26 types of clusters on treated/untreated pumpkins
22. ábra Trichoderma spóra szuszpenzió (balról-jobbra: TR06, TR08, TR05)Figure 22 Trichoderma spore suspension (from left to right: TR06, TR08, TR05)
23. ábra Oltványok áztatásaFigure 23. Soaking grafts
24. ábra OltványtelepítésFigure 24. Graft installation
25. ábra Nemes és alanyvesszö áztatása Trichoderma spóra szuszpenzóbanFigure 25. Soaking noble and root canes in Trichoderma spore suspension
26. ábra Oltványok a ládábanFigure 26. Grafts in the crate
27. ábra Oltványok telepítéseFig. 27 Installation of grafts
28. ábra Trichoderma és fungicides kezelés hatékonyságának eredménye oltványoknálFigure 28. Results of the effectiveness of Trichoderma and fungicide treatment for grafts
29. ábra Visszaizolált Trichoderma sp. Tárcái 26 fajtárólFigure 29 Re-isolated Trichoderma sp. Portfolios of 26 varieties
30. ábra Trichoderma izolátumok (TRI01-04) és referencia szekvenciák összehasonlítása tef 1 szekvenciája alapján szerkesztett filogenetikai törzsfa a Tokaji Borvidékről. A dendogramon látható elágazások hossza arányos a nukleotid eltérések számával, a skála alul található. Az elágazásoknál látható szám a bootstrap analízis (1000 ismétlés) eredményét jelöli. A fajnevek előtt az NCBI adatbázis nyilvántartási számai, a TR05, TR06 a saját, kijuttatott törzseket, a TRIÓI, TRI03, TRI04 pedig a visszaizolált Trichoderma fajokat jelöliFigure 30. Comparison of Trichoderma isolates (TRI01-04) and reference sequences, phylogenetic tree based on the tef 1 sequence from the Tokaj Wine Region. The length of the branches shown on the dendogram is proportional to the number of nucleotide differences, the scale is at the bottom. The number shown at the branches indicates the result of the bootstrap analysis (1000 repetitions). In front of the species names, the registration numbers of the NCBI database, TR05, TR06, indicate the own, released strains, and TRIÓI, TRI03, TRI04, the re-isolated Trichoderma species
31. ábra Trichoderma spóra szuszpenzióval kezelt (balra) és a kezeletlen (jobbra) sorFigure 31. The row treated with Trichoderma spore suspension (left) and the untreated (right)
32. ábra Kijuttatott, típustörzs és visszaizolált Trichoderma izolátumok tefl génjének szekvencia rendezés részlete a Tokaji BorvidékrőlFigure 32. Detail of sequence alignment of the tefl gene of applied, type strain and re-isolated Trichoderma isolates from the Tokaj Wine Region
33. ábra Kijuttatott, típustörzs és visszaizolált Trichoderma izolátumok tefl génjének szekvencia rendezés részlete Villányi BorvidékrőlFigure 33. Detail of sequence alignment of the tefl gene of applied, type strain and re-isolated Trichoderma isolates from Villányi Borvidék
34. ábra Trichoderma izolátumok, a kijuttatott törzsek és néhány deponált tef 1 (B) szekvencia alapján szerkesztett filogenetikai törzsfa a Villányi Borvidékről. A dendogramon látható elágazások hossza arányos a nukleotid eltérések számával, a skála alul található. Az elágazásoknál látható szám a bootstrap analízis (1000 ismétlés) eredményét jelöli. A fajnevek előtt az NCBI adatbázis nyilvántartási számai, a TR05, TR06 a saját, kijuttatott törzseket, az SZ 01-03, SZ 05-08 pedig a visszaizolált Trichoderma mintákat jelöli.Figure 34. Trichoderma isolates, the applied strains and some deposited tef 1 (B) sequences based on the phylogenetic family tree from the Villányi Wine Region. The length of the branches shown on the dendogram is proportional to the number of nucleotide differences, the scale is at the bottom. The number shown at the branches indicates the result of the bootstrap analysis (1000 repetitions). Before the species names, the registry numbers of the NCBI database, TR05, TR06, denote the own, released strains, and SZ 01-03, SZ 05-08 the re-isolated Trichoderma samples.
35. ábra Szálka telepítés. A telepítést követően ősszel 4 Trichoderma-oXáathan áztatott töke került begyűjtésre a Trichodermák visszaizolálásának céljából (A). Trichoderma törzsek izolálási helyei. A feliratok közül a T4 a 4-es tökemintát jelöli, a /1 - /5 az izolálás helyét (B).Figure 35. Thread installation. After planting, 4 Trichoderma-oXáathan-soaked pumpkins were collected in autumn for the purpose of re-isolating the Trichodermas (A). Isolation sites of Trichoderma strains. Among the inscriptions, T4 denotes capital pattern 4, /1 - /5 the place of isolation (B).
36. ábra A különböző tőkékből és mintavételi helyekről kitenyésztett Trichodema törzsek képe.Figure 36. Image of Trichodema strains cultured from different capitals and sampling locations.
37. ábra A telepítést követő egy évben kipusztult tőkék aránya a különböző alkalmazott kezelések esetében a telepített fajták eredményeinek átlagában (Villányi Borvidék, 2015-ös telepítés).Figure 37. The ratio of the capitals that died one year after the planting in the case of the different applied treatments in the average of the results of the planted varieties (Villányi Borvidék, 2015 planting).
38. ábra Az egyes kezelések hatása a növény növekedési intenzitására 12-24 órás áztatásokat követően egy évvel a telepítés után. Az eredmények a különböző telepített fajták átlagát ábrázolják (Villányi Borvidék, 2015ös telepítés).Figure 38. The effect of each treatment on the growth intensity of the plant after 12-24 hour soakings one year after planting. The results represent the average of the different planted varieties (Villányi Borvidék, 2015 planting).
39. ábra A Trichoderma harzianum fajcsoportba tartozó törzsek (TR01_10), visszaizolált törzsek (TRI0104) és deponált tefl szekvenciák alapján, „Maximum Likelihood” módszerrel szerkesztett törzsfa. Az elágazások hossza arányos a nukleotid eltérések számával, a skála alul található. Az elágazások melletti kék szám a bootstrap analízis (1000 ismétlés) eredményét jelöli, míg fajnevek mögött az NCBI adatbázisban található deFigure 39. Strains belonging to the Trichoderma harzianum species group (TR01_10), re-isolated strains (TRI0104) and based on deposited tefl sequences, edited using the "Maximum Likelihood" method. The length of the branches is proportional to the number of nucleotide differences, the scale is at the bottom. The blue number next to the branches indicates the result of the bootstrap analysis (1000 repetitions), while behind the species names it is found in the NCBI database
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-7 ponált törzsek nyilvántartási számait (Accession Number) tüntettük fel. Az 50%-nál nagyobb értékeket jelöltük a törzsfán.- The registration numbers (Accession Number) of 7 identified strains have been indicated. Values greater than 50% were marked on the family tree.
40. ábra A Trichoderma harzianum fajcsoportba tartozó törzsek (TR01-10), és néhány visszaizolált törzs (TRIO 1-04), valamint deponált tefl szekvenciák összerendezést képe.Figure 40. Strains belonging to the Trichoderma harzianum species group (TR01-10), and some re-isolated strains (TRIO 1-04), as well as a picture of the arrangement of deposited tefl sequences.
41. ábra A Trichoderma harzianum fajcsoportba tartozó TR04 törzs (valamint TR01-02, 07, 10) és Trichoderma harzianumi, valamint Trichoderma simmonsii fajok törzseinek deponált tefl szekvenciák összerendezést képe. Az oszlopok fölötti számok a szekvenciák számát, az oszlopok alatti nagy betűk a konszenzus szekvenciákat jelölik.Figure 41. Image of the deposited tefl sequences of strains TR04 belonging to the Trichoderma harzianum species group (as well as TR01-02, 07, 10) and strains of Trichoderma harzianumi and Trichoderma simmonsii species. The numbers above the columns indicate the number of sequences, the capital letters below the columns indicate the consensus sequences.
A TALÁLMÁNY RÉSZLETES ISMERTETÉSEDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A találmány szerinti eljárás alkalmas szőlő tőkebetegségének megelőzésére és/vagy kezelésére.The method according to the invention is suitable for the prevention and/or treatment of grape root disease.
Az eljárásban alkalmazott Trichoderma törzseket GTD-levéltüneteit nem mutató, magyarországi termőhelyen élő, Furmint fajtájú szőlő belső, fás szöveteiből izoláltuk és 2017. december 12-én a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében a Budapesti Szerződés szerint letétbe helyeztük. A DE—TR04 törzs (amelyet ebben a leírásban TR04-ként is jelölünk) letéti száma NCAIM (P) F 001456, a DETR05 törzs (amelyet ebben a leírásban TR05-ként is jelölünk) letéti száma NCAIM (P) F 001457, a DE TR08 törzs (amelyet ebben a leírásban TR08-ként is jelölünk) letéti száma NCAIM (P) F 001458. In vitro kísérletekben igazoltuk, hogy a törzsek igen magas (100%) Biokontroll Indexszel (BCI) rendelkeztek ismert GTD-patogének (Diplodia seriata, Neofusicoccum parvum) ellen, vagyis elpusztították a GTD-patogéneket, illetve a mikroszkópi felvételek alapján az appresszórium-képzés is megfigyelhető volt. A BCI laboratóriumi körülmények között jól alkalmazható mutató, amely megmutatja, hogy Petri-csészében, konfrontációs kísérletben mekkora területet tud elfoglalni a vizsgált biokontroll (BC) törzs, vagyis a mikoparazita (esetünkben Trichoderma). A BC által elfoglalt terület nagyságának, valamint a BC és a parazitáit gomba által együttesen elfoglalt terület nagyságának hányadosa (%-ban számolva) (Szekeres et al. 2006). A törzseket tehát hiperparazitizmus jellemzi.The Trichoderma strains used in the procedure were isolated from the inner, woody tissues of Furmint grapevines, which do not show GTD leaf symptoms, and live in Hungary, and were deposited in the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms in accordance with the Budapest Treaty on December 12, 2017. Strain DE—TR04 (also referred to as TR04 in this description) has the deposit number NCAIM (P) F 001456, strain DETR05 (also referred to as TR05 in this description) has the deposit number NCAIM (P) F 001457, the DE The deposit number of strain TR08 (also referred to as TR08 in this description) is NCAIM (P) F 001458. In vitro experiments proved that the strains had a very high (100%) Biocontrol Index (BCI) against known GTD pathogens (Diplodia seriata, Neofusicoccum parvum), i.e. GTD pathogens were destroyed, and appressorium formation was also observed based on the microscopic images. The BCI is a well-applied indicator in laboratory conditions, which shows how much area the tested biocontrol (BC) strain, i.e. the mycoparasite (in our case Trichoderma) can occupy in a Petri dish in a confrontation experiment. The ratio of the size of the area occupied by BC and the size of the area jointly occupied by BC and its parasitic fungi (calculated in %) (Szekeres et al. 2006). The strains are therefore characterized by hyperparasitism.
A találmány szerinti Trichoderma törzsek burgonya-dextróz agar (PDA) táptalajon, széles hőmérséklettartományban tenyészthetők. Hőmérsékleti optimumuk 30°C körüli, de képesek növekedni 5°C-on, 12°C-on és 37°C-on is. Morfológiájukra az enyhén megnyúlt gömb alakú konídiumok és az elszórt vagy koncentrikus körökbe való konídiumképzés jellemző. A törzsek ferde agaron 4°C-on és -80°C-on, 20%-os glicerinoldatban fenntarthatok, liofdizálhatóak. Összehasonlító vizsgálatban kimutattuk, hogy ugyanolyan körülmények között a törzsek keveréke gyorsabban növekszik és korábban spórázik, mint az ESQUIVE védjegy alatt forgalmazott biofangicidben található Trichoderma atroviridae (1-1237 törzs).The Trichoderma strains according to the invention can be cultured on potato dextrose agar (PDA) medium in a wide temperature range. Their temperature optimum is around 30°C, but they can grow at 5°C, 12°C and 37°C. Their morphology is characterized by slightly elongated spherical conidia and conidia formation in scattered or concentric circles. The strains can be maintained on slanted agar at 4°C and -80°C, in 20% glycerol solution, and can be lyophilized. In a comparative study, we showed that under the same conditions, the mixture of strains grows faster and sporulates earlier than Trichoderma atroviridae (strain 1-1237) found in the biofungicide marketed under the ESQUIVE trademark.
A DE TR04 burgonya dextróz agar táptalajon növesztve a táptalajba diffundálódó sárga pigmentet termel.DE TR04 potatoes, when grown on dextrose agar medium, produce a yellow pigment that diffuses into the medium.
A leírásban a DE_TR04 törzs származéka alatt olyan Trichoderma harzianum fajcsoportba, ezen belül „lixii” szubkládba (subclade) tartozó gombát értünk, amelyIn the description, the derivative of strain DE_TR04 is a fungus belonging to the Trichoderma harzianum species group, including the "lixii" subclade, which
Diplodia seriata és Neofusicoccum parvum ellen appresszóriumot képez és Biokontroll-Index (BCI) értéke legalább 90%, előnyösen 95%, különösen előnyösen 100%, képes a szőlő fás szövetét tartósan kolonizálni, úgy, hogy a fás szövetből a kezelés után több mint hat hóIt forms an appressorium against Diplodia seriata and Neofusicoccum parvum and has a Biocontrol Index (BCI) value of at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, it is able to permanently colonize the woody tissue of the grape, so that more than six months after the treatment, the woody tissue
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-8nappal később, előnyösen több mint egy évvel később, különösen előnyösen több mint két évvel később izolálható, és adott esetben burgonya-dextróz agar táptalajon képes mintegy 5°C-on növekedni úgy, hogy átlagos micéliális növekedése legalább 1 mm/nap, előnyösen legalább 1,5 mm/nap, különösen előnyösen legalább 2 mm/nap, és adott esetben a kezelés után kevesebb, mint 12 hónappal később, előnyösen kevesebb, mint nyolc hónappal később, különösen előnyösen kevesebb mint hat hónappal később a kezelés helyétől számított legalább 5 centiméterre, előnyösen legalább 10 centiméterre kimutatható a szölönövény fás szövetéből, különösen előnyösen a szölönövény bármely fás részéből kimutatható, és adott esetben Fusarium oxysporum ellen appresszóriumot képez és BCI-értéke legalább 50%, előnyösen legalább 75%, különösen előnyösen 100% és adott esetben tefl génje a SEQ ID No: 1 szerinti szekvenciával legalább 95%-ban, előnyösen legalább 98%-ban, előnyösebben legalább 99%-ban, különösen előnyösen 100%-ban azonos szekvenciát tartalmaz, ahol a SEQ ID No: 1 szerinti szekvencia 138. pozíciójának megfelelő pozícióban T, a SEQ ID SEQ ID No: 1 szerinti szekvencia 156. pozíciójának megfelelő pozícióban A áll; és/vagy chil8-5 génje a SEQ ID No 2 szerinti szekvenciával legalább 95%-ban, előnyösen legalább 98%-ban, előnyösebben legalább 99%-ban, különösen előnyösen 100%-ban azonos szekvenciát tartalmaz.It can be isolated 8 days later, preferably more than a year later, especially preferably more than two years later, and can optionally grow on potato-dextrose agar medium at about 5°C with an average mycelial growth of at least 1 mm/day, preferably at least 1.5 mm/day, particularly preferably at least 2 mm/day, and optionally less than 12 months later, preferably less than eight months later, particularly preferably less than six months later at least 5 centimeters from the treatment site , preferably detectable at least 10 centimeters from the woody tissue of the grape plant, particularly preferably detectable from any woody part of the grape plant, and optionally forms an appressorium against Fusarium oxysporum and has a BCI value of at least 50%, preferably at least 75%, particularly preferably 100% and optionally its tefl gene contains a sequence that is at least 95%, preferably at least 98%, more preferably at least 99%, particularly preferably 100% identical to the sequence according to SEQ ID No: 1, where position 138 of the sequence according to SEQ ID No: 1 T is in the corresponding position, A is in the position corresponding to position 156 of the sequence according to SEQ ID SEQ ID No: 1; and/or chil8-5 gene contains at least 95%, preferably at least 98%, more preferably at least 99%, particularly preferably 100% identical sequence to the sequence according to SEQ ID No. 2.
A leírásban a DETR05 törzs származéka alatt olyan Trichoderma harzianum fajcsoportba, ezen belül II szubkládba (subclade) tartozó gombát értünk, amelyIn the description, the derivative of strain DETR05 is a fungus belonging to the Trichoderma harzianum species group, including subclade II, which
Diplodia seriata és Neofusicoccum parvum ellen appresszóriumot képez és Biokontroll-Index (BCI) értéke legalább 90%, előnyösen 95%, különösen előnyösen 100%, képes a szőlő fás szövetét tartósan kolonizálni, úgy, hogy a fás szövetből a kezelés után több mint hat hónappal később, előnyösen több mint egy évvel később, különösen előnyösen több mint két évvel később izolálható, és adott esetben burgonya-dextróz agar táptalajon képes mintegy 5°C-on növekedni úgy, hogy átlagos micéliális növekedése legalább 0,5 mm/nap, előnyösen legalább 1 mm/nap, különösen előnyösen legalább 1,5 mm/nap, és adott esetben a kezelés után kevesebb, mint 12 hónappal később, előnyösen kevesebb, mint nyolc hónappal később, különösen előnyösen kevesebb, mint hat hónappal később a kezelés helyétől számított legalább 5 centiméterre, előnyösen legalább 10 centiméterre kimutatható a szölönövény fás szövetéből, különösen előnyösen a szölönövény bármely fás részéből kimutatható, és adott esetben Fusarium oxysporum ellen appresszóriumot képez és BCI-értéke legalább 50%, előnyösen legalább 75%, különösen előnyösen 100%, és adott esetben tefl génje a SEQ ID No: 3 szerinti szekvenciával legalább 95%-ban, előnyösen legalább 98%-ban, előnyösebben legalább 99%-ban, különösen előnyösen 100%-ban azonos szekvenciát tartalmaz és/vagy chil8-5 génje a SEQ ID No 4 szerinti szekvenciával legalább 95%-ban, előnyösen legalább 98%-ban, előnyösebben legalább 99%-ban, különösen előnyösen 100%-ban azonos szekvenciát tartalmaz.It forms an appressorium against Diplodia seriata and Neofusicoccum parvum and has a Biocontrol Index (BCI) value of at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, it is able to permanently colonize the woody tissue of the grape, so that it is removed from the woody tissue more than six months after the treatment it can be isolated later, preferably more than one year later, especially preferably more than two years later, and optionally it can grow on potato-dextrose agar medium at about 5°C with an average mycelial growth of at least 0.5 mm/day, preferably at least 1 mm/day, particularly preferably at least 1.5 mm/day, and optionally less than 12 months after the treatment, preferably less than eight months later, especially preferably less than six months later at least 5 centimeter, preferably at least 10 centimeters from the woody tissue of the grape plant, particularly preferably it can be detected from any woody part of the grape plant, and optionally forms an appressorium against Fusarium oxysporum and has a BCI value of at least 50%, preferably at least 75%, particularly preferably 100%, and optionally tefl gene contains at least 95%, preferably at least 98%, more preferably at least 99%, particularly preferably 100% identical sequence to the sequence according to SEQ ID No: 3 and/or chil8-5 gene of SEQ ID No It contains at least 95%, preferably at least 98%, more preferably at least 99%, especially preferably 100% identical sequence to the sequence according to 4.
A leírásban a DE TR08 törzs származéka alatt olyan Trichoderma viridae fajba tartozó gombát értünk,In the description, the derivative of strain DE TR08 means a fungus belonging to the species Trichoderma viridae,
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-9amely-9which
Diplodia seriata és Neofusicoccum parvum ellen appresszóriumot képez és Biokontroll-Index (BCI) értéke legalább 90%, előnyösen 95%, különösen előnyösen 100%, és adott esetben burgonya-dextróz agar táptalajon képes mintegy 5°C-on növekedni úgy, hogy átlagos micéliális növekedése legalább 0,5 mm/nap, előnyösen legalább 1 mm/nap és adott esetben Fusarium oxysporum ellen appresszóriumot képez és BCI-értéke legalább 50%, előnyösen legalább 75%, különösen előnyösen 100%.It forms an appressorium against Diplodia seriata and Neofusicoccum parvum and has a Biocontrol Index (BCI) value of at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, and can grow on potato-dextrose agar medium at about 5°C as an average mycelial its growth is at least 0.5 mm/day, preferably at least 1 mm/day and optionally forms an appressorium against Fusarium oxysporum and its BCI value is at least 50%, preferably at least 75%, particularly preferably 100%.
A találmány szerinti Trichoderma törzsek a kezelt növényt igen gyorsan kolonizálják: telepítést megelőző gyökérkezelést követően 5 hónappal a kezelést követően a gyökérszinttől a hajtáscsúcsig ki tudtuk mutatni a törzseket. Szaporítóanyag felületi kezelését követően 3 nappal később a belső, fás szövetből mutattuk ki a kezelésre alkalmazott törzset.The Trichoderma strains according to the invention colonize the treated plant very quickly: after the root treatment before planting, we were able to detect the strains from the root level to the shoot tip 5 months after the treatment. 3 days after the surface treatment of propagating material, the strain used for the treatment was identified from the inner woody tissue.
A törzseket szőlő kordonkarjának fás szövetéből izoláltuk. A mintavétel során 10-15 cm-es rész került levágásra úgy, hogy az a tőke vitalitását, és termőképességét ne változtassa meg jelentősen.The strains were isolated from the woody tissue of the grapevine cord arm. During the sampling, a 10-15 cm section was cut so that it does not significantly change the vitality and productivity of the capital.
Eredményeink alapján a törzseink képesek voltak kolonizálni:Based on our results, our tribes were able to colonize:
i. az idősebb növények kordonkarját (tokaji vizsgálat) ii. az oltványokat (alany és nemes részt egyaránt (legyesbényei vizsgálat) iii. a gyökereket (villányi vizsgálat, szekszárdi vizsgálat) iv. a gyökérkezelést követően a teljes fás növényi szöveteket (szekszárdi telepítés).i. cordon arm of older plants (Tokaji test) ii. the grafts (both rootstock and noble part (Flyesbénye test) iii. the roots (Villány test, Szekszárd test) iv. the whole woody plant tissues after the root treatment (Szekszárd planting).
Szabadföldi kísérletekben igazoltuk, hogy a törzsek képesek a szőlő (a Furminton kívül egyéb fajták, például Tárcái 26, Hárslevelű, Cabemet Franc, Kékfrankos) fás szöveteinek tartós kolonizálására, a törzsekkel kezelt szőlőtőkékből a törzsek a kezelést követően legalább egy évvel, de akár két évvel később is visszaizolálhatók voltak (a kezelt növények a kezelés előtt természetesen nem tartalmazták a Trichoderma törzseket). A tartós kolonizálás vizsgálata folyamatos, így várhatóan még hosszabb együttélés mutatható ki a gombatörzsek és a szőlönövény között.In free-field experiments, we proved that the strains are able to permanently colonize the woody tissues of grapes (varieties other than Furmint, e.g. Tárcái 26, Hárslevelű, Cabemet Franc, Kékfrankos). they could also be re-isolated later (the treated plants naturally did not contain Trichoderma strains before the treatment). The study of long-term colonization is ongoing, so it is expected that an even longer coexistence between the fungal strains and the vine can be demonstrated.
Kimutattuk, hogy a találmány szerinti törzsekkel kezelt, tőkebetegség tüneteit mutató szölőnövényeken a kezelés hatására a vegetatív szerveken a betegség jellegzetes tünetei csökkentek, vagyis a kezelés hatása kuratív. A kuratív hatást támasztja alá az a vizsgálatunk is, amelyben a kezelt, eltérő fajtájú szőlőnövényekböl a nekrotikus fás szövetből is kimutattuk a kezelés során alkalmazott törzseket. A találmány szerinti Trichoderma törzsek nem csupán a felszínen, a metszési sebek felületén képesek kiszorítani a kórokozó gombákat, hanem a fás szövet belsejében is. Az egyszeri alkalommal a növényre juttatott Trichoderma a kezelés után igen hosszú ideig (még két évvel később is) visszaizolálható volt, vagyis a találmány szerinti megoldás alkalmazása hosszútávon képes biztosítani a tőkebetegség tüneteinek kezelését, a kórokozó fajok pusztítását, kontrollját. A találmány szerinti megoldással ezért kevesebb kezelésre van szükség, szükségtelenné válhat a Trichoderma évenként történő alkalmazása.We have shown that the characteristic symptoms of the disease on the vegetative organs of the vine plants treated with the strains according to the invention and showing symptoms of capital disease decreased as a result of the treatment, i.e. the effect of the treatment is curative. The curative effect is also supported by our study, in which we also detected the strains used during the treatment from the necrotic wood tissue of the treated vines of different varieties. The Trichoderma strains according to the invention are able to displace pathogenic fungi not only on the surface, on the surface of cut wounds, but also inside the woody tissue. The Trichoderma applied to the plant once could be re-isolated for a very long time after the treatment (even two years later), that is, the application of the solution according to the invention can ensure the treatment of the symptoms of the capital disease, the destruction and control of the pathogenic species in the long term. With the solution according to the invention, less treatment is therefore necessary, and the annual application of Trichoderma may become unnecessary.
A találmány szerinti megoldással a szőlő tőkebetegségének kialakulása megelőzhető. Kísérleteink eredménye szerint a Trichodermáv^A kezelt oltványok később sem mutatták a GTD tüneteit. Az egyszeri alkalmazás után a növényekből a találmány szerinti Trichoderma törzs - ellentétben más vizsgált TrichodermávsA - még két évvel később is visszaizolálható volt, vagyis a találmány szerinti megoldás alkalmazása hosszútávon képesWith the solution according to the invention, the development of capital disease of grapes can be prevented. According to the results of our experiments, the grafts treated with Trichodermav^A did not show the symptoms of GTD later either. After the single application, the Trichoderma strain according to the invention could be re-isolated from the plants - unlike other investigated TrichodermavsA - even two years later, that is, the application of the solution according to the invention is capable of long-term
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
- 10megakadályozni a tökebetegség kialakulását. A találmány szerinti megoldással ezért kevesebb kezelésre van szükség, szükségtelenné válhat a Trichoderma évenként történő alkalmazása. Az Európában jelenleg forgalomba hozatali engedéllyel rendelkező, a találmány szerinti Trichoderma törzsektől eltérő törzseket tartalmazó készítményekkel (például Esquive WP — Trichoderma atroviridae 1-1237; Vintec — Trichoderma atroviridae SCI,; Tellus WP - Trichoderma asperellum ICC0122 és Trichoderma gamsii ICC 080) többszöri, jellemzően évenkénti kezelést javasolnak, megelőzés céljára, a fertőzés előtt.- 10 to prevent the development of capital disease. With the solution according to the invention, less treatment is therefore necessary, and the annual application of Trichoderma may become unnecessary. With preparations currently licensed in Europe and containing strains different from the Trichoderma strains according to the invention (for example Esquive WP - Trichoderma atroviridae 1-1237; Vintec - Trichoderma atroviridae SCI,; Tellus WP - Trichoderma asperellum ICC0122 and Trichoderma gamsii ICC 080) several times, typically annual treatment is recommended, for the purpose of prevention, before infection.
A találmány szerinti megoldás alkalmazható a szőlőtermesztés különböző fázisaiban. Eredményesen kezelhető a szaporítóanyag (pl. hajtás, oltvány, alany, oltócsap) a növény telepítése előtt, oltványkészítés előtt az alany és/vagy az oltócsap, kezelhető a növény seb keletkezésekor (pl. metszés, sérülés, törés).The solution according to the invention can be used in different phases of grape growing. Propagation material (e.g. shoot, scion, rootstock, rootstock) can be successfully treated before planting the plant, the rootstock and/or the rootstock before grafting, can be treated when the plant is wounded (e.g. pruning, injury, fracture).
A találmány szerinti megoldás előnye, hogy széles hőmérséklettartományban alkalmazható, vagyis a kezelés eredményes tél végi, kora tavaszi metszés és tavaszi telepítés idején is. A találmány szerinti Trichoderma törzsek jól növekednek magasabb hőmérsékleten is, vagyis magyarországi körülmények között különösen jól alkalmazhatók. Hatékonyságukat a fajták és termesztési helyek széles körén igazoltuk.The advantage of the solution according to the invention is that it can be used in a wide temperature range, i.e. the treatment is effective even during late winter, early spring pruning and spring planting. The Trichoderma strains according to the invention grow well even at higher temperatures, that is, they can be used particularly well in Hungarian conditions. We have proven their effectiveness across a wide range of varieties and cultivation locations.
A találmány szerinti Trichoderma törzseket szőlő belső, fás szöveteiből izoláltuk, így képesek a kezelt szőlőnövény fás szöveteinek kolonizálására, hatékonyabb védelmet biztosítva a kórokozók ellen.The Trichoderma strains according to the invention were isolated from the internal, woody tissues of grapes, so they are able to colonize the woody tissues of the treated grape plant, providing more effective protection against pathogens.
A Trichoderma törzsek hatékonyan segítették elő a kezelt szölőnövények növekedését és a termés fejlődését, így alkalmazhatók növényi növekedést serkentő szerként.The Trichoderma strains effectively promoted the growth and fruit development of the treated grape plants, so they can be used as plant growth stimulants.
A Trichoderma törzsek hatékonyan parazitálták a F. oxysporum gombát, melynek patotípusai különböző lágyszárú növények betegségeit okozzák (pl. borsó, uborka, dinnye stb. fuzáriumos hervadása). In vitro eredményeink alapján a találmány szerinti megoldás alkalmazható ezen betegségek kezelésére és/vagy megelőzésére is.Trichoderma strains effectively parasitized the fungus F. oxysporum, whose pathotypes cause diseases of various herbaceous plants (e.g. fusarium wilt of peas, cucumbers, melons, etc.). Based on our in vitro results, the solution according to the invention can also be used to treat and/or prevent these diseases.
A Trichoderma törzseket alkalmazhatjuk a növényen a (metszési) sebeken vagy a növény egyéb felületén (pl. ecseteléssel vagy permetezéssel), a szaporítóanyagon pl. áztatással, permetezéssel vagy a növénytermesztési technológiának leginkább megfelelő módon. A törzseket kiszerelhetjük mezőgazdaságilag elfogadható, a spórák életképességét biztosító hordozóval és/vagy segédanyaggal. A spórakészítmények a szakember számára ismert módon előállíthatok, például a Példák című részben ismertetett módon. A sejtek koncentrációja az alkalmazott technológiától függően pl. l-9xl07 sejt/ml, l-9x!06 sejt/ml vagy ΙΟ9 - 105 sejt/ml lehet.Trichoderma strains can be applied to the plant on (pruning) wounds or on other surfaces of the plant (e.g. by brushing or spraying), on the propagating material, e.g. by soaking, spraying or in the most suitable way for plant cultivation technology. The strains can be prepared with an agriculturally acceptable carrier and/or auxiliary material that ensures the viability of the spores. The spore preparations can be prepared in a manner known to the person skilled in the art, for example as described in the Examples section. The concentration of the cells depends on the technology used, e.g. l-9xl0 7 cells/ml, l-9x!0 6 cells/ml or ΙΟ 9 - 10 can be 5 cells/ml.
PÉLDÁKEXAMPLES
Trichoderma sp. izolálása szőlő fás szöveteibőlTrichoderma sp. isolation from the woody tissues of grapes
A Trichoderma törzseink a Tokaji Borvidékről származnak, melyeket a Bakonyi dűlőn Furmint fajtájú szőlők fás szövetéből izoláltuk. A törzsek olyan tőkék kordonkarából származnak, melyek egészségesek, és a területen gyakran előforduló, a fás szövetekben növekedő gombák okozta fertőző tökeelhalás levéltüneteit nem mutatták (Kovács et al„ 2017).Our Trichoderma strains come from the Tokaj Wine Region, which we isolated from the woody tissue of Furmint grapes in the Bakony vineyard. The strains come from the cordon branches of trees that are healthy and did not show the symptoms of leaf death caused by fungi growing in woody tissues, which often occurs in the area (Kovács et al„ 2017).
A minták előkészítését és a mikrobiológiai vizsgálatokat Kovács et al. (2014c) leírása alapján végeztük el. A fás szövetet 10%-os Neomagnol (klorogén-szeszkvihidrát) oldatban 10 percig fertőtlenítettük, majd kétszer steril desztillált vízzel mostuk át. A mosások után a mintákat malátás agar táptalajra (MEA, Scharlau, Spanyolország) helyeztük (Crous et al., 2006) (1. ábra). 3-5 napos, 25°C hőmérsékleten történő inkubálás után a fejlődő micéliumokból tiszta tenyészeteket készítettünk. A törzseink fenntartása ferde agaron 4°C-on és -80°C-on, 20%os glicerinoldatban történt (Kovács et al., 2014c).Sample preparation and microbiological tests were performed by Kovács et al. (2014c) description. The woody tissue was disinfected in a 10% Neomagnol (chlorogenic sesquihydrate) solution for 10 minutes, then washed twice with sterile distilled water. After washing, the samples were placed on malt agar medium (MEA, Scharlau, Spain) (Crous et al., 2006) (Figure 1). After 3-5 days of incubation at 25°C, pure cultures were prepared from the developing mycelia. Our strains were maintained on agar slants at 4°C and -80°C in a 20% glycerol solution (Kovács et al., 2014c).
122825- 1423/KOH122825- 1423/KOH
-11Morfológiai vizsgálatok-11 Morphological studies
A morfológiai azonosítás során a tenyészeteket családok és nemzetségek szintjén sikerült meghatározni. A jellemzésüknél a telepmorfológiát, a konídiumok, konídiumtartók, a termötest jelenlétét és hiányát, illetve ezek legfontosabb jellemzőit (konídiumok alakja, mérete) vizsgáltuk (Kovács et al., 2014b). Ezek alapján elkülönítet- tűk a Trichoderma törzseket más endofiton gombáktól.During the morphological identification, the cultures were defined at the level of families and genera. When characterizing them, we examined colony morphology, the presence and absence of conidia, conidia holders, the fruiting body, and their most important characteristics (conidia shape and size) (Kovács et al., 2014b). Based on these, Trichoderma strains were separated from other endophytic fungi.
Tríchoderma törzsek morfológiájaMorphology of Trichoderma strains
Táptalajon elszórtan vagy koncentrikus körökbe rendeződve helyezkednek el (2., 3. ábra). A törzseink konídiumai enyhén megnyúlt gömb alakúak voltak, átlagos átmérőjük 2,8 -3,3 pm volt (1. táblázat). A TR04 PDA táptalajon növesztve a táptalajba diffundálódó sárga pigmentet termelt.They are scattered on the nutrient medium or arranged in concentric circles (Figures 2, 3). The conidia of our strains were slightly elongated spherical, with an average diameter of 2.8-3.3 pm (Table 1). When grown on TR04 PDA medium, it produced a yellow pigment that diffused into the medium.
1. táblázat Trichoderma törzsek morfológiai jellemzőiTable 1. Morphological characteristics of Trichoderma strains
Trichoderma törzsek molekuláris azonosításaMolecular identification of Trichoderma strains
A molekuláris azonosítást első lépésben a gombáknál legelterjedtebben használt rDNS régióban található molekuláris markerek, az ITS1 (Internal Transcribed Spacer) és az ITS2 szekvenciák segítségével végeztük (Schoch et al., 2012), majd a tefl, illetve az ech42 gének szekvencia eredményei alapján pontosítottuk. A mar15 kerek felszaporításához használt primerek szekvenciái a 2. táblázatban találhatóak.In the first step, the molecular identification was carried out using the ITS1 (Internal Transcribed Spacer) and ITS2 sequences, the molecular markers found in the rDNA region most widely used in fungi (Schoch et al., 2012), and then it was refined based on the sequence results of the tefl and ech42 genes. The sequences of the primers used for the round amplification of mar15 can be found in Table 2.
2. táblázat: A Trichoderma törzsek azonosításához alkalmazott molekuláris markerekTable 2: Molecular markers used to identify Trichoderma strains
♦Anelláció hőmérséklet♦Annellation temperature
A DNS kinyeréséhez NucleoSpin® Plant II (Macherey-Nagel) kitet alkalmaztuk a gyártó leírása szerint. A PCR reakcióban GoTaq Green Master polimerázt (Promega) használtunk. A PCR reakciót 25 μΐ térfogatban 20 végeztük el, amely 12,5 μΐ GoTaq Green Master polimeráz enzimet (Promega), 0,4-0,4 nmol/μΐ ITS4 és ITS5 (IBA, Germany) primereket, valamint a 12-50 ng templát DNS-t tartalmazott. A szekvenáltatáshoz a PCR termékeket NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) segítségével tisztítottuk. A szekvenálást a Microsynth Austria végezte.For DNA extraction, the NucleoSpin® Plant II (Macherey-Nagel) kit was used according to the manufacturer's description. GoTaq Green Master polymerase (Promega) was used in the PCR reaction. The PCR reaction was carried out in a volume of 25 μΐ containing 12.5 μΐ GoTaq Green Master polymerase enzyme (Promega), 0.4-0.4 nmol/μΐ primers ITS4 and ITS5 (IBA, Germany), and 12-50 ng contained template DNA. For sequencing, the PCR products were purified using NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel). Sequencing was performed by Microsynth Austria.
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-12A szekvenáltatást követően elvégeztük a szekvenciák bioinformatikai analízisét. A törzsek taxonómiai besorolását a szekvenciák BLAST analízisével határoztuk meg (Altschul et al., 1990; Kovács et al., 2014a). A szekvenciák összerendezését Clustal-X programmal (Higgins és Sharp, 1988; Thompson et al., 1997; Larkin et al., 2007), majd a GeneDoc program segítségével manuálisan végeztük el a szekvenciák finomítását (Nicholas et al., 1997). A pontos összerendezés az alapja az egyes szekvenciák közötti filogenetikai kapcsolatok feltárásának. A filogenetikai törzsfa elkészítéséhez MEGA 6.0 programot használtunk (Tamura et al., 2013).-12 After the sequencing, we performed the bioinformatics analysis of the sequences. The taxonomic classification of the strains was determined by BLAST analysis of the sequences (Altschul et al., 1990; Kovács et al., 2014a). The sequences were aligned using the Clustal-X program (Higgins and Sharp, 1988; Thompson et al., 1997; Larkin et al., 2007), and the sequences were refined manually using the GeneDoc program (Nicholas et al., 1997). Accurate alignment is the basis for exploring the phylogenetic relationships between individual sequences. The MEGA 6.0 program was used to create the phylogenetic tree (Tamura et al., 2013).
A biológiai védekezés kialakításához felhasználható élő, tünetet nem mutató fás szövetből izolált Trichoderma törzsek identifikálása először ITS szekvencia alapján történt, típustörzsek szekvenciáinak (Druzhinina et al. 2005) felhasználásával (5. ábra). A törzsfa készítéséhez Maximum Likelihood (ML) analízist alkalmaztunk Az eredmény alapján a TR01-05, TR 07, TR09-10 törzsek a T. harzianum csoportba tartoznak, a TR06 a Trichoderma orientale - T. longigrachiatum csoportba, a TR08 pedig a Trichoderma viride csoportba. A SEQ ID No: 5, 6 és 7 szerinti szekvenciák rendre a TR04, TR05 és TR08 törzsek vizsgált ITS szekvenciáit mutatják be.The identification of Trichoderma strains isolated from living, symptom-free woody tissue that can be used for biological control was first done on the basis of ITS sequence, using the sequences of type strains (Druzhinina et al. 2005) (Figure 5). Maximum Likelihood (ML) analysis was used to create the family tree. Based on the results, strains TR01-05, TR 07, TR09-10 belong to the T. harzianum group, TR06 to the Trichoderma orientale - T. longigrachiatum group, and TR08 to the Trichoderma viride group . The sequences according to SEQ ID No: 5, 6 and 7 show the tested ITS sequences of strains TR04, TR05 and TR08, respectively.
A Trichoderma törzsek pontos taxonómiai besorolásához elengedhetetlen a tefl (transzlációs elongációs faktor alfa 1) génszekvencia ismerete is. Az ITS szekvenciához hasonlóan a tefl törzsfa készítése is Maximum Likelihood (ML) módszerrel történt. A filogenetikai törzsfa készítéséhez saját törzseink mellett a GenBank adatbázisból további típustörzseket (Druzhinina et al. 2005) vontunk be. A tefl szekvencia elemzés megerősítette az ITS1 és 2 szekvenciák eredményét (5. ábra). A T harzianum csoportba tartozik a TR01-05, TR 07, TR0910, a TR06 a csoporton belül a Trichoderma orientale-hez (teleomorf: Hypocrea orientalis) mutat nagyobb hasonlóságot. A szekvencia-eredmények alapján a TR05 törzs az eddig leírt fajoktól a tefl szekvencia részlete (SEQ ID No: 3) alapján jól elkülönül, a legközelebb álló Trichoderma atrobrunneum faj törzseitől 95%-os valószínűséggel elkülönülő csoportot alkot (39. ábra). A TR04 törzs tefl szekvenciája alapján a Trichoderma simmonsii fajjal mutat hasonlóságot (40. ábra). A 41. ábrán látható a TR04 törzs tefl szekvenciájának a SEQ ID NO 1 szerinti részletén a hozzá leginkább hasonló Trichoderma simmonsii deponált szekvenciák összehasonlítása. Az ábra alján a konszenzus szekvencia található. A vonalak a gap-et (hiány) jelölik. A TR04 törzsnél az ábrán, a 138. helyen levő „T” a konszenzus szekvenciában található „C”-től eltérő nukleotidot jelöli, míg a 156. pozícióban egy „A” található, ami a deponált szekvenciák esetében hiányzik, vagyis egyértelműen elkülöníti a hasonló szekvenciájú törzsektől.Knowledge of the tefl (translational elongation factor alpha 1) gene sequence is also essential for the exact taxonomic classification of Trichoderma strains. Similar to the ITS sequence, the tefl family tree was created using the Maximum Likelihood (ML) method. In addition to our own strains, we included additional type strains from the GenBank database (Druzhinina et al. 2005) to create the phylogenetic tree. The tefl sequence analysis confirmed the result of the ITS1 and 2 sequences (Figure 5). TR01-05, TR 07, TR0910 belong to the T harzianum group, TR06 shows greater similarity to Trichoderma orientale (teleomorph: Hypocrea orientalis) within the group. Based on the sequence results, the TR05 strain is clearly separated from the species described so far based on the tefl sequence detail (SEQ ID No: 3), and it forms a group with 95% probability from the strains of the closest Trichoderma atrobrunneum species (Figure 39). Based on the tefl sequence of strain TR04, it shows similarity with Trichoderma simmonsii species (Figure 40). Figure 41 shows the comparison of the most similar Trichoderma simmonsii deposited sequences on the part of the tefl sequence of strain TR04 according to SEQ ID NO 1. At the bottom of the figure is the consensus sequence. The lines mark the gap. In the TR04 strain, the "T" at position 138 in the figure indicates a different nucleotide from the "C" found in the consensus sequence, while at position 156 there is an "A", which is missing in the case of the deposited sequences, i.e. it clearly separates the similar from sequence strains.
A Trichoderma fajok közül a T. harzianum fajok pontos taxonómiai besorolásához szükséges a tefl gén (6. ábra) mellett a kitináz termelésért felelős GH18 (glikozid-hidroláz 18 gén) kitináz (chi) 18-5 gén (6. ábra) szekvenciái alapján történő elemzés is (Druzhinina et al. 2010). Ennek alapján törzseink a következő T. harzianum alcsoportokba (subclade) tartoznak: T. harzianum subclade (TR07, TR10), „H. lixii” subclade (TR01-04), Subclade II (TR05). A tefl génszakasz vizsgálata alapján a TR09 törzs a Subclade III-ba, a chil8-5 szekvencia vizsgálata alapján azonban a Subclade IV-be tartozott. A SEQ ID No: 2 szerinti szekvencia a TR04 törzs vizsgált chi 18-5 génszakaszát, a SEQ ID No: 4 szerinti szekvencia a TR05 törzs vizsgált chi 18-5 génszakaszát mutatja be.For the exact taxonomic classification of the T. harzianum species among the Trichoderma species, in addition to the tefl gene (Figure 6), the GH18 (glycoside hydrolase 18 gene) chitinase (chi) 18-5 gene (Figure 6) responsible for chitinase production is required based on the sequences analysis (Druzhinina et al. 2010). Based on this, our strains belong to the following T. harzianum subgroups (subclades): T. harzianum subclade (TR07, TR10), "H. lixii” subclade (TR01-04), Subclade II (TR05). Based on the analysis of the tefl gene segment, strain TR09 belonged to Subclade III, but based on the analysis of the chil8-5 sequence, it belonged to Subclade IV. The sequence according to SEQ ID No: 2 shows the examined chi 18-5 gene section of the TR04 strain, the sequence according to SEQ ID No: 4 shows the examined chi 18-5 gene section of the TR05 strain.
Trichoderma törzsek micéliális növekedéseMycelial growth of Trichoderma strains
A Trichoderma törzsek micéliális növekedési sebességét 9 cm átmérőjű Petri csészében, PDA táptalajon, söThe mycelial growth rate of Trichoderma strains in a 9 cm diameter Petri dish on PDA medium, s
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
- 13tétben, különböző hőmérsékleteken inkubálva vizsgáltuk. A statisztikai vizsgálathoz varianciaanalízist és Tukey-tesztet, illetve nem paraméteres Kruskal-Wallis próbát és Dunn-féle összehasonlító tesztet alkalmaztunk. 5%-os P-érték alatt tekintettük a próbákat szignifikánsnak. A T. harzianum törzsek közül a H. lixii subclade-be tartozó TR01-04, illetve a Subclade II-be tartozó TR05 (3. ábra) hasonló növekedési aktivitást mutattak 18,525°C közötti hőmérsékleten. Növekedési optimumuk 30°C-on volt, míg 37°C-on növekedésük sebessége csökkent (4. ábra).- We tested it in batches of 13, incubating at different temperatures. Analysis of variance and Tukey's test, non-parametric Kruskal-Wallis test and Dunn's comparison test were used for the statistical analysis. Tests below a P-value of 5% were considered significant. Among the T. harzianum strains, TR01-04 belonging to the H. lixii subclade and TR05 belonging to Subclade II (Figure 3) showed similar growth activity at temperatures between 18.525°C. Their growth optimum was at 30°C, while at 37°C their growth rate decreased (Figure 4).
A filogenetika elemzés alapján különböző csoportokba (Subclade, 6. ábra) sorolható T. harzianum törzseinket (TR01 - H. lixii subclade, TR05 - Subclade IL, TR07 — T. harzianum subclade, TR09 — Subclade III. tefl szekvencia vizsgálatánál (IV. chil8-5 génszakasz vizsgálatánál) és a T. viride (TR08) a legmagasabb vizsgált hőmérsékleten (37°C) lassabban nőttek, mint 18,5-30°C között. (7., 8. ábra).Based on the phylogenetic analysis, our T. harzianum strains can be classified into different groups (Subclade, Figure 6) (TR01 - H. lixii subclade, TR05 - Subclade IL, TR07 — T. harzianum subclade, TR09 — Subclade III. tefl sequence analysis (IV. chil8 -5 gene section) and T. viride (TR08) grew more slowly at the highest tested temperature (37°C) than between 18.5-30°C (Figures 7, 8).
A T. orientate (TR06) izolátum micéliális növekedése gyorsabb volt, mint a másik két fajba (T. harzianum, T viride) tartozó törzsé (6. ábra). A T. orientale minden vizsgált hőmérsékleten gyors növekedést mutatott.The mycelial growth of the isolate T. orientate (TR06) was faster than that of the strains belonging to the other two species (T. harzianum, T viride) (Figure 6). T. orientale showed rapid growth at all tested temperatures.
A TR01 és TR05 T. harzianum törzsekre 37°C-on alacsony növekedés volt jellemző (7. ábra). A TR08 T. viride és TR09 T harzianum törzsek is alacsonyabb növekedési aktivitással rendelkeztek a vizsgált törzsekhez képest a legmagasabb hőmérsékleten (6., 7. ábra).T. harzianum strains TR01 and TR05 showed low growth at 37°C (Figure 7). The TR08 T. viride and TR09 T harzianum strains also had a lower growth activity compared to the tested strains at the highest temperature (Figures 6, 7).
Az törzsek növekedése 5°C-on csak egy hét elteltével indult meg. A legintenzívebb növekedést a TR01 (Γ harzianum, H. lixii subclade) törzs mutatta. Alacsony növekedést a T. harzianum subclade-be tartozó TR07 és a TRIO T. harzianum törzsek mutattak (10. ábra).The growth of the strains started only after one week at 5°C. The most intensive growth was shown by strain TR01 (Γ harzianum, H. lixii subclade). Low growth was shown by the TR07 and TRIO T. harzianum strains belonging to the T. harzianum subclade (Figure 10).
12°C-os hőmérsékleten három törzs (TR04, TR05, TR06) növekedését vizsgáltuk, melyek 2014 májusában spóra szuszpenzió formájában kerültek kijuttatásra tünetes szőlőtőkék kezelésére. A TR04 elsősorban az alacsony hőmérsékleteken mutatott intenzív növekedést (7., 8., 9., 10. ábra). A TR06 (T. orientale) törzs 12°C-on alacsonyabb növekedést mutatott a TR04 (T harzianum) törzshöz képest (8. ábra).We tested the growth of three strains (TR04, TR05, TR06) at a temperature of 12°C, which were applied in the form of a spore suspension in May 2014 to treat symptomatic vines. TR04 showed intense growth mainly at low temperatures (Figures 7, 8, 9, 10). Strain TR06 (T. orientale) showed lower growth at 12°C compared to strain TR04 (T harzianum) (Figure 8).
Trichoderma törzsek mikoparazita képességének vizsgálataExamination of the mycoparasitic ability of Trichoderma strains
A Trichoderma törzsek kompetíciós képességét tőkeelhalást okozó kórokozó gombák (D. seriata, N. parvum), valamint egy eddig szőlőnél kórokozóként még nem leírt fajjal (F. oxysporum) szemben teszteltük.The competitive ability of the Trichoderma strains was tested against pathogenic fungi (D. seriata, N. parvum) that cause death of capital, as well as a species not yet described as a grape pathogen (F. oxysporum).
A mikoparazita képesség vizsgálatát Szekeres et al. (2006) által leírt módszer alapján végeztük el. (A módszer rövid ismertetése: Szekeres és munkatársai 9 cm-es Petri-csészére fitopatogént oltottak, majd 24 órával később ugyanazzal a módszerrel Trichodermái oltottak a Petri-csészére, a fitopatogéntöl 3 cm távolságra. Az oltások helyét a Petri-csésze alján megjelölték, a Petri-csésze közepétől ellentétes irányban 1,5 cm-es távolságra. A Trichoderma oltásakor különösen ügyelni kell arra, hogy a két gomba számára azonos tér álljon rendelkezésre. Az antagonista folyamatot rögzített Kodak DX 3900 digitális fényképezőgéppel készített fényképekkel követték. A távolság (18 cm) minden esetben azonos volt. Az eredeti 1800X1200 pixel felbontású képeket Lanczos filter (Duchon, 1979) eljárással, Irfan View v3.95 szoftver alkalmazásával fele akkora méretűre újraméretezték. A digitális felvételeken a Trichoderma törzsek telepei és a Trichoderma és a növényi patogén telepei által elfoglalt teljes területet Scion Image v4.02 szoftverrel, szabad kéz eszköz alkalmazásával körberajzolták és megmérték. Az analízis során a skálát centiméterenként 28.346 pixelre állították, vagyis a számolt területek egysége cm2 volt. A vizsgált Trichoderma törzsek antagonista képességét a következő képlet szerint számított BioControl Index-szel jellemezték:The mycoparasitic ability was investigated by Szekeres et al. (2006) based on the method described. (Brief description of the method: Szekeres et al. inoculated a phytopathogen into a 9 cm Petri dish, and 24 hours later Trichodermai inoculated the Petri dish with the same method, at a distance of 3 cm from the phytopathogen. The location of the inoculations was marked at the bottom of the Petri dish, the at a distance of 1.5 cm in the opposite direction from the center of the petri dish. When inoculating Trichoderma, special care should be taken to ensure that the two fungi have equal space. The antagonistic process was followed by recorded photographs taken with a Kodak DX 3900 digital camera. The distance (18 cm ) was the same in all cases. The original 1800X1200 pixel resolution images were resized to half the size using the Lanczos filter (Duchon, 1979) process and Irfan View v3.95 software. the entire area was outlined and measured using Scion Image v4.02 software, using a freehand tool.During the analysis, the scale was set to 28,346 pixels per centimeter, that is, the unit of the calculated areas was cm 2 . The antagonistic capacity of the examined Trichoderma strains was characterized by the BioControl Index calculated according to the following formula:
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-14BCI=(a Trichoderma telep területe/a Trichoderma és patogén gomba telepei által elfoglalt teljes terület)X100.)-14BCI=(area of Trichoderma colony/total area occupied by colonies of Trichoderma and pathogenic fungi)X100.)
A Trichoderma sp. és rendre a Diplodia seriata/N. parvum/F. oxysporum fajokat burgonya-dextróz (PDA) táptalajon növesztettük. A kísérletekhez két napos Trichoderma és három napos Diplodia seriata/N. parvum/F. oxysporum izolátumokat használtunk. Először a Diplodia seriata/N. parvum/F. oxysporum leoltását végeztük el malátás agarra, a Petri-csésze közepétől 1,5 cm-re, majd 24 óra után pedig a Trichoderma micéliumot oltottuk le a patogéntöl 3 cm-re. 10 nappal később készítettünk fotót a tenyészetről. 10 nap után meghatároztuk a Biokontroll Indexet (BCI).Trichoderma sp. and, respectively, Diplodia seriata/N. parvum/F. oxysporum species were grown on potato dextrose (PDA) medium. For the experiments, two-day-old Trichoderma and three-day-old Diplodia seriata/N. parvum/F. oxysporum isolates were used. First, Diplodia seriata/N. parvum/F. oxysporum was inoculated on malt agar, 1.5 cm from the center of the Petri dish, and after 24 hours the Trichoderma mycelium was inoculated 3 cm from the pathogen. 10 days later we took a photo of the culture. After 10 days, we determined the Biocontrol Index (BCI).
A statisztikai vizsgálathoz varianciaanalízist és Tukey-tesztet, illetve nem paraméteres Kruskal-Wallis próbát és Durm-féle összehasonlító tesztet alkalmaztunk. 5%-os P-érték alatt tekintettük a próbákat szignifikánsnak.Analysis of variance and Tukey's test, non-parametric Kruskal-Wallis test and Durm's comparison test were used for the statistical analysis. Tests below a P-value of 5% were considered significant.
Az eredmények kiértékeléséhez GraphPad Prism 3.02 (Motulsky, 1999) statisztikai programokat használtunk. Minden vizsgált törzs Biokontroll-Index (BCI) értéke 100% volt, vagyis a Trichoderma törzsek ránöttek a kórokozókra. Minden vizsgált törzs esetén megfigyelhető volt a mikoparazita pusztító hatása (4., 5., 6. kép).GraphPad Prism 3.02 (Motulsky, 1999) statistical programs were used to evaluate the results. The Biocontrol Index (BCI) value of all tested strains was 100%, which means that the Trichoderma strains prevailed over the pathogens. The destructive effect of the mycoparasite was observed for all tested strains (pictures 4, 5, 6).
A mikroszkópos képen látható, hogy a T. harzianum rátekeredik a parazitáit gomba (D. seriata, F. oxysporum) hifájára, majd appresszóriumot fejleszt és sejtfalbontó enzimeket termelve elpusztítja a patogén gombát (Kotze et al., 2011) (15., 16. ábra).The microscopic image shows that T. harzianum wraps itself around the hypha of the parasitic fungus (D. seriata, F. oxysporum), then develops an appressorium and destroys the pathogenic fungus by producing cell wall-degrading enzymes (Kotze et al., 2011) (15, 16). figure).
Trichoderma spórakészítmény alkalmazása szabadföldi kísérletbenApplication of Trichoderma spore preparation in field experiment
Trichoderma spórakészítmény készítésePreparation of Trichoderma spore preparation
A szabadföldi kísérletben alkalmazott spórakoncentrátum elkészítéséhez (John et al., 2005) módszerét alkalmaztunk, amihez három kiválasztott törzs, 7 napos tenyészetét használtunk fel (17. ábra). Az egyes kijuttatásra kerülő törzseket Petri-csészében szaporítottuk fel. Minden Petri-csészébe 2-2 ml steril desztillált vizet pipettáztunk, majd oltókacs segítségével a spórákat a vízbe szuszpendáltuk. A készítmény koncentrációjának ellenőrzéséhez Thoma-kamrát alkalmaztunk.We used the method of (John et al., 2005) to prepare the spore concentrate used in the field experiment, for which we used the 7-day cultures of three selected strains (Figure 17). The individual strains to be applied were propagated in Petri dishes. 2 ml of sterile distilled water was pipetted into each Petri dish, and then the spores were suspended in the water using an inoculum. A Thoma chamber was used to check the concentration of the preparation.
I. szabadföldi kísérlet: hajtáskezelés Bakonyi dűlő (2014) (Tárcái)Field experiment I: shoot treatment Bakonyi dűlő (2014) (Tárcái)
Az első kísérletet 2014.05.06.-án a Tokaji Borvidék Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet kísérleti ültetvényében állítottuk be. A kijuttatott spóra szuszpenzió 107 sejt/ml koncentrációjú volt (11. kép). A spóra szuszpenzió összeállítása esetén figyelembe vettük az alkalmazásra került törzsek (TR04, TR05 (T. harzianum fajcsoport) és TR06 T. orientale) eltérő hőmérsékleten történő növekedését, valamint tőkeelhalást okozó patogének elleni mikoparazita képességét.The first experiment was set up on 05/06/2014 in the experimental plantation of the Tokaj Wine Region Viticulture and Wine Research Institute. The applied spore suspension had a concentration of 10 7 cells/ml (picture 11). When compiling the spore suspension, we took into account the growth of the strains used (TR04, TR05 (T. harzianum species group) and TR06 T. orientale) at different temperatures, as well as their mycoparasitic ability against pathogens that cause death of capital.
A készítményből a metszési sebek felületére a felület nagyságától függően egyszer, vagy kétszer fújtunk. A kezelt tőkékből előzőleg nem tudtunk Trichoderma fajokat kimutatni. A tőkék a korábbi évben GTD tünetet mutattak, és a kordonkarból D. seriata GTD kórokozót is izoláltunk.Depending on the size of the surface, the preparation was blown once or twice on the surface of the incision wounds. Previously, we could not detect any Trichoderma species from the treated stocks. The capitals showed GTD symptoms in the previous year, and we also isolated the D. seriata GTD pathogen from the cordon arm.
A kísérletbe bevont tőkéket havonta ellenőriztük (fotóztuk és a betegség jelenlétét vizsgáltuk). Három hónap egy és két év után a kezelt tőkékből újra mintákat gyűjtöttünk be. A 20. ábrán 2014-ben Trichoderma spóra szuszpenzióval kezelt/kezeletlen Tárcái 26-os fajta egy-egy tőkéje látható.The capitals included in the experiment were checked monthly (photographed and examined for the presence of the disease). After three months, one and two years, samples were collected again from the treated funds. Figure 20 shows one stem of Tárcái variety 26 treated/untreated with Trichoderma spore suspension in 2014.
Az idősebb ültetvények kezelése 2014 májusában történt TR04, TR05, TR06 törzsekkel, (29. ábra). Három hónappal és egy, illetve két évvel később is a kezelést követően sikerült visszaizolálni a Trichoderma törzseket. 2015-ben a kezelt töke intenzívebb hajtásnövekedést mutatott a kezeletlen tökével szemben, emellett a fürtökThe older plantations were treated in May 2014 with strains TR04, TR05, TR06 (Figure 29). Trichoderma strains were re-isolated three months and one and two years after the treatment. In 2015, the treated pumpkin showed more intense shoot growth compared to the untreated pumpkin, in addition, the clusters
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-15méretében is eltérést tapasztaltunk (21. ábra). A kijuttatott, több fajt is tartalmazó készítményből a TR04 és a TR05 (T. harzianum fajcsoport) törzseket sikerült visszaizolálni. A visszaizolált Trichoderma törzsek TRIÓI, TRI03 és TRI04 jelölést kaptak. A TRIÓI izolátum a kijuttatott TR05 törzsekkel 96%-os homológiát mutatott. A TRI03 és TRI04 izolátumok a típustörzzsel 98%-os homológiát mutattak (30. ábra).-15 we also noticed a difference in size (Figure 21). The TR04 and TR05 (T. harzianum species group) strains were re-isolated from the multi-species product applied. The re-isolated Trichoderma strains were designated TRIÓI, TRI03 and TRI04. The TRIOI isolate showed 96% homology with the released TR05 strains. Isolates TRI03 and TRI04 showed 98% homology with the type strain (Figure 30).
A 3. táblázat mutatja a 2014-ben beállított szabadföldi kísérletünk első eredményeit.Table 3 shows the first results of our field experiment set up in 2014.
3. táblázat: Trichoderma szabadföldi kísérlet eredményei (1-3 hónap)Table 3: Trichoderma field experiment results (1-3 months)
Négy vizsgált töke esetén nemcsak a látható tünetek csökkentek, hanem vissza is tudtuk izolálni a Trichoderma törzseket (20. ábra) 3 hónappal később. A többi vizsgált tőke esetén három hónap után, csak a tünetek csökkenését tapasztaltuk. A 111. sor 1. töke nem hozta a várt eredményt. Utólagos vizsgálattal megállapítottuk, hogy a töke már elpusztult korábban, a kezelés előtt.In the case of four investigated pumpkins, not only did the visible symptoms decrease, but we were also able to isolate the Trichoderma strains again (Figure 20) 3 months later. In the case of the other examined capitals, after three months, we only experienced a reduction in symptoms. Capital 1 of line 111 did not produce the expected result. With a subsequent examination, we found that the root had already died earlier, before the treatment.
II. szabadföldi kísérlet: Telepítés előtti oltvány áztatásos kezelése a Zuhánya dűlőben (2015)II. field experiment: Pre-planting graft soaking treatment in the Zuhánya vineyard (2015)
A kísérlethez a taxonómiai eredmények figyelembe vételével egy a T. harzianum fajcsoportba tartozó, korábbi szabadföldi kísérletben is felhasznált törzsét (TR05), illetve két endofita nem T. harzianum, T. orientale (TR06) és T. viride (TR08) alkalmaztuk. A 2015.04.30.-i kísérlethez 2015.04.01. és 04.02. napokon 600 mm átmérőjű Petri-csészébe történt a Trichoderma leoltása (TR06, TR05 és TR08). 2014.04.13. és 14.-én kezdtük el lemosni steril desztillált vízzel a Trichoderma spórákat. Összesen 21 liter szuszpenziót sikerült összegyűjtenünk, melynek koncentrációja hígítás nélkül 1 θ’ sejt/ml volt (22. ábra). Hígításhoz steril desztillált vizet alkalmaztunk. A spóraszuszpenzió hígítást követő koncentrációja 106-on volt.Taking into account the taxonomic results, a strain belonging to the T. harzianum species group and used in a previous field experiment (TR05) and two endophytic non-T. harzianum, T. orientale (TR06) and T. viride (TR08) were used for the experiment. For the experiment on 04.30.2015, 04.01.2015. and 04.02. Trichoderma was inoculated into Petri dishes with a diameter of 600 mm (TR06, TR05 and TR08). 13/04/2014 and on the 14th we started to wash the Trichoderma spores with sterile distilled water. We managed to collect a total of 21 liters of suspension, the concentration of which was 1 θ' cells/ml without dilution (Figure 22). Sterile distilled water was used for dilution. The concentration of the spore suspension after dilution was 10 6 .
A kísérlet beállítása a Villányi borvidéken, a Zuhánya dűlőben, Nagy Attila Őstermelőnél történt közel 12.000 oltvánnyal. Az oltványok 300 db-os kötegekben voltak áztatva egy éjszakán át (23. ábra). Laboratóriumi vizsgálatok több oltvány esetén igazolták a GTD kórokozók jelenlétét (a kezelést megelőzően), az összes oltványt - nagy számuk miatt - nem vizsgáltuk.The experiment was set up in the Villány wine region, in the Zuhánya vineyard, at Attila Nagy Őstermelő with nearly 12,000 grafts. The grafts were soaked overnight in batches of 300 (Figure 23). Laboratory tests confirmed the presence of GTD pathogens in the case of several grafts (before the treatment), we did not examine all the grafts - due to their large number.
Előnevelt, 1 éves gyökeres oltványok áztatása történt. A nemes rész parafinos viasszal fedve volt, így csak azPre-grown, 1-year-old rooted grafts were soaked. The noble part was covered with paraffin wax, that's all
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-16alanyvessző tudta felvenni a Trichodermát és az üzemi kontrolihoz alkalmazott fungicidet (8-oxi-kinolin szulfát).- 16 rootstocks were able to absorb Trichoderma and the fungicide used for plant control (8-oxyquinoline sulfate).
Az üzemi kontrolihoz alkalmazott fungicid 0,5%-os koncentrációban (1 liter esővízhez 5 ml-t) került kijuttatásra. Az oltványokat fél órán át áztattuk.The fungicide used for plant control was applied at a concentration of 0.5% (5 ml for 1 liter of rainwater). The grafts were soaked for half an hour.
Telepített oltványok jellemzése:Characterization of installed grafts:
Alany:Subject:
• 5C • 5BB• 5C • 5BB
Oltóvessző (nemes):Comma (noble):
• Kékfrankos Kt. 1.• Kékfrankos Kt. 1.
• Kékfrankos A4-1 • Cabernet Franc E11 • Cabernet Franc I-SV-FV5 • Cabernet Sauvignon 337• Kékfrankos A4-1 • Cabernet Franc E11 • Cabernet Franc I-SV-FV5 • Cabernet Sauvignon 337
A Trichoderma spóra szuszpenziós kezelés esetében 12- 24 órás áztatások voltak beállítva a Kékfrankos KT1 kivételével, ahol a telepítés elhúzódása miatt 24-36 órás áztatás történt. Az esővíz mennyisége 800 liter volt. Egyszerre 3.000 oltvány áztatása történt. 1.500 db Trichoderma szuszpenzióval kezelt 1.500 db pedig kontroll volt, melyből 750 db standard (üzemi) kontroll (fungicid): 8-oxi-kinolin-szulfát (1 literhez 5 ml), másik 750 db pedig a csak vizes, áztatásos kontroll volt. Az áztatások fajtánként elkülönültek.In the case of the Trichoderma spore suspension treatment, 12-24-hour soakings were set, with the exception of Kékfrankos KT1, where 24-36-hour soakings were performed due to the delay in installation. The amount of rainwater was 800 liters. 3,000 grafts were soaked at the same time. 1,500 were treated with Trichoderma suspension and 1,500 were controls, of which 750 were standard (factory) control (fungicide): 8-oxyquinoline sulfate (5 ml for 1 liter), and the other 750 were the water-only, soaking control. The soaks were separated by variety.
A hidrofurós telepítés az áztatásokat követően másnap történt (24. ábra).Hydro-drilling installation took place the day after soaking (Figure 24).
111. szabadföldi kísérlet: Trichoderma spóra szuszpenzió alkalmazása oltvány előállításához (2015)Field experiment 111: Application of Trichoderma spore suspension to produce a graft (2015)
2015. március 25.-én 425 ml 108 sejt/ml koncentrációjú Trichoderma spóra szuszpenzió készítmény készült el TR05; TR06; TR08 törzsekből, amelyet 2015. március 26.-ig hűtőben tároltunk.On March 25, 2015, 425 ml of Trichoderma spore suspension with a concentration of 108 cells/ml was prepared TR05; TR06; from TR08 strains, which was stored in a refrigerator until March 26, 2015.
Próbaáztatást végeztünk standard körülmények között, hogy modellezzük a 14 darab alany vessző, nemes oltócsap és a 7-7 darabos alany-nemes áztató folyadék igényét.We carried out a test soak under standard conditions to model the needs of the 14 rootstock canes, noble rootstocks and the 7-7 rootstock-noble soaking liquid.
A folyadék mennyiségét ráhagyással állapítottuk meg, hogy a vesszők és csapok mindig teljes fedésbe legyenek a nedves közeggel.The amount of liquid was determined by allowing the canes and pins to always be completely covered with the wet medium.
Ez alapján a következők szerint állítottuk be a kísérletet:Based on this, we set up the experiment as follows:
• 14 darab alany vessző folyadék igénye 2000 ml • 14 darab nemes oltócsap folyadék igénye 600 ml • 7 darab alany vessző folyadék igénye 1000 ml • 7 darab nemes oltócsap folyadék igénye 300 ml• 2000 ml of liquid required for 14 root cuttings • 600 ml for 14 noble cutting taps • 1000 ml for 7 root cuttings • 300 ml for 7 noble cutting pins
Ez alapján a Trichoderma szuszpenzió mennyisége, amelyet a vesszők és csapok kezeléséhez felhasználunk 15.600 ml.Based on this, the amount of Trichoderma suspension used for the treatment of canes and taps is 15,600 ml.
Az oldat elkészítését megelőzően a felhasználásra kerülő alanyvesszők noduszairól a rügyeket, kacsokat fertőtlenített késsel eltávolítottuk.Before preparing the solution, the buds and buds were removed from the nodes of the rootstocks to be used with a disinfected knife.
Ezt követően osztottuk az alanyokat (28-28 db) felhasználási csoportonként (12 órás, 24 órás, 36 órás és 48 órás kezelések).After that, we divided the subjects (28 each) into usage groups (12-hour, 24-hour, 36-hour and 48-hour treatments).
122825- 1423/KOH122825- 1423/KOH
-17A felhasználásra kerülő alany vessző (mind bevizsgált 125AA) csoportokat áztatási idejük szerint dolgoztuk fel. Először a 48 órás áztatási idejű alanyokat osztottuk tovább 14 darab kezelt, 7 darab kezelt kontroll és 7 darab standard kontroll csoportra.-17 The subject comma groups to be used (all tested 125AA) were processed according to their soaking time. First, the subjects with a soaking time of 48 hours were further divided into 14 treated groups, 7 treated control groups and 7 standard control groups.
Ezt követően a lemetszett oltócsapokból válogattuk össze a megfelelő vastagságú, átmérőjű leoltásra kerülő nemes vesszőket (bevizsgált Hl 104). A pontos párosításokat feljegyeztük, amelyek az oltáskor a párosító személy döntése alapján lett végleges. A nemes vesszők tökebetegség tüneteit mutatták, az alanyból GTD kórokozót nem mutattunk ki (a kezelést megelőzően).After that, noble canes with the appropriate thickness and diameter to be grafted were selected from the pruned grafts (tested Hl 104). We recorded the exact pairings, which became final at the time of vaccination based on the decision of the pairing person. The noble canes showed symptoms of root disease, no GTD pathogen was detected in the subject (before the treatment).
A párosítandó alany vesszők és nemes oltócsapok áztatás előtti tömegét lemértük. A 15.600 ml felhasználandó oldatot 15.180 ml desztillált víz és 420 ml Trichoderma szuszpenzió elegyéböl állítottuk össze egy erre alkalmas nagyméretű üvegedényben. Az összeöntést alapos rázás, keverés mellett végeztük. Ezt követően az első 48 órás áztatáshoz szükséges oldat mennyiségét mértük ki: 14 darab alanyvesszőhöz 2000 ml-t, 14 darab oltócsaphoz 600 ml-t, 7 darab alanyvesszöhöz (standard kontroll) 1000 ml-t és a 7 db nemes oltócsaphoz 300 ml-t, majd a megfelelő jelöléssel ellátott edényekbe helyeztük az oltásra kerülő anyagokat és felöntöttük a megfelelő oldatmennyiséggel. A standard kezeletlen kontrolinál ugyanekkora mennyiségű desztillált vizet használtunk a felöntésekre. Az így kiadott mennyiség teljesen ellepte az oltásra kerülő anyagokat (25. ábra).The weight of the canes and noble grafts of the subject to be mated before soaking was weighed. The 15,600 ml solution to be used was prepared from a mixture of 15,180 ml distilled water and 420 ml Trichoderma suspension in a suitable large glass container. The amalgamation was carried out with thorough shaking and mixing. After that, the amount of solution needed for the first 48-hour soaking was measured: 2000 ml for 14 rootstocks, 600ml for 14 rootstocks, 1000ml for 7 rootstocks (standard control) and 300ml for 7 noble rootstocks. , then we placed the materials to be inoculated into the containers marked with the appropriate markings and poured the appropriate amount of solution. For the standard untreated control, the same amount of distilled water was used for pouring. The amount released in this way completely covered the materials to be inoculated (Figure 25).
A felöntési folyamatot 12 óránként (36 órás áztatás, 24 órás áztatás, 12 órás áztatás) ismételtük, így minimális időeltolódással azonos időben álltak rendelkezésre az anyagok.The pouring process was repeated every 12 hours (36-hour soaking, 24-hour soaking, 12-hour soaking), so the materials were available at the same time with minimal time lag.
A standard kezelés alatt álló alanyokat, illetve oltócsapokat az áztatási periódus vége előtt két órával fungicides kezelésben részesítettük. Ehhez 8-oxi-kinolin szulfátot (1 literhez 5 ml szer=0,5% koncentráció) használtunk. Az áztatás előtt és után lemértük az oltványok tömegét és készítettünk egy százalékos hidratáltságot bemutató táblázatot. Emellett pedig a gyökérhosszakat is lemértük.The subjects under the standard treatment and the grafts were treated with fungicides two hours before the end of the soaking period. For this we used 8-oxyquinoline sulfate (5 ml agent=0.5% concentration for 1 liter). Before and after soaking, we weighed the weight of the grafts and prepared a table showing the percent hydration. We also measured the root lengths.
Összességében megállapítható a kezdeti és az áztatást követően mért tömegek alapján, hogy a vízfelvételt sem a Trichoderma spóra szuszpenzió, sem a fungicid, sem pedig a vizes áztatás jelentősen nem befolyásolta. Elmondható tehát, hogy a Trichoderma a vízfelvétel növeléséhez jelentősen nem járult hozzá.Overall, it can be established based on the weights measured at the beginning and after the soaking that neither the Trichoderma spore suspension, nor the fungicide, nor the soaking in water significantly affected the water absorption. It can therefore be said that Trichoderma did not significantly contribute to the increase in water absorption.
Az áztatott csapokat és alanyokat ezt követően kezelésenként elcsomagoltuk és feliratoztuk, majd az oltás helyére szállítottuk Értékes István, Legyesbényei oltvány előállítóhoz.The soaked plugs and rootstocks were then packaged and labeled for each treatment, and then transported to the grafting site to István Ertékes, the graft producer in Legyesbénye.
Az oltás után az oltványokat 70°C-os parafinba helyeztük a kallusz képződés helyének lezárása érdekében. Ezt követően az oltványok „talpát” gyökeresedést serkentő béta-indol-ecetsav porba mártottuk. Ezt követően pedig az oltványokat fűrészporral és műanyaglappal elkülönítve tárolásra előkészítettük (26. ábra).After inoculation, the grafts were placed in 70°C paraffin in order to seal the site of callus formation. After that, the "sole" of the grafts was dipped in root-stimulating beta-indole-acetic acid powder. After that, the grafts were prepared for storage by separating them with sawdust and plastic sheets (Figure 26).
A telepítés 2015. május 12. és 15. között történt (27. ábra).The installation took place between May 12 and 15, 2015 (Figure 27).
A telepítést követően 3 hónappal később a főhajtáshossz és a hajtásátmérő (rügyemelet átmérő) mérése történt a nódusz alatt a 10. intemódiumnál (21. ábra).3 months after the installation, the main shoot length and the shoot diameter (bud height diameter) were measured under the node at the 10th intemode (Figure 21).
IV. szabadföldi kísérlet: Szálka Trichoderma kezelés (2017)ARC. field experiment: Szálka Trichoderma treatment (2017)
A kísérlet beállítása 2017.05.02.-05.04. között Szálkán a Lajvér Borház ültetvényében történt. A kezeléseket ebben az estben csak két T harzianum fajcsoprtból származó törzseket használtunk. A TR06 37°C-on mutatott magas növekedési erélye, illetve a T. longibrachiatum csoport tagjainak gyakori humán patogénként való izolálása (Sandoval-Denis et al., 2014) miatt a további szabadföldi kísérletekből kizártuk. TR04 (~2χ107 sejt/ml) és TR05 (~7χ 107 sejt/ml) törzseket juttattunk ki meghatározott teraszokra. 1.510 kezelt oltvány telepítése történt.The setting of the experiment is 05.02.-05.04.2017. It took place in Szálká in the Lajvér Borház plantation. The treatments in this evening only used strains from two T harzianum species groups. Due to the high growth rate of TR06 at 37°C and the frequent isolation of members of the T. longibrachiatum group as human pathogens (Sandoval-Denis et al., 2014), we excluded it from further field experiments. TR04 (~2 χ 10 7 cells/ml) and TR05 (~7 χ 10 7 cells/ml) strains were distributed on specific terraces. 1,510 treated grafts were installed.
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-18A spóra szuszpenzió koncentrációja 9χ 107 sejt/ml volt. Ládánként 300 oltvány áztatása történt. Az oltványokból laboratóriumi vizsgálatokkal sikeresen izoláltuk a D. seriata GTD kórokozót (a kezelést megelőzően).-18 The concentration of the spore suspension was 9χ 10 7 cells/ml. 300 grafts were soaked per box. The pathogen D. seriata GTD was successfully isolated from the grafts by laboratory tests (before the treatment).
Szabadföldi kísérletek eredményeiResults of field experiments
IV. szabadföldi kísérlet: Szálka Trichoderma kezelés (2017): Trichoderma fajok visszaizolálása a Szekszárdi borvidékről, telepítés előtti áztatást követőenARC. field experiment: Szálka Trichoderma treatment (2017): Re-isolation of Trichoderma species from the Szekszárd wine region, after soaking before planting
A telepítést követően ősszel 4, Trichoderma oldatban áztatott tőke került begyűjtésre a Trichodermák viszszaizolálásának céljából (35. ábra). A beérkezett mintákból körülbelül 5 cm-enként végeztünk izolálást. Öszszességében elmondható, hogy a tőkékből sikerült a tenyészetek képe alapján mindkét, a kezelésben használt Trichoderma törzset visszaizolálni. A Trichoderma nem csak a gyökérszintböl, hanem a fiatal tőke valamennyi részéből kimutatható volt (36. ábra).After the installation, in autumn, 4 capitals soaked in Trichoderma solution were collected for the purpose of re-isolation of Trichodermas (Figure 35). Isolation was performed approximately every 5 cm from the received samples. In general, it can be said that both Trichoderma strains used in the treatment were re-isolated from the capitals based on the image of the cultures. Trichoderma was detectable not only from the root level, but from all parts of the young capital (Figure 36).
A 2017-es Szekszárdi telepítésnél felhasznált törzsek közül több oltványból vissza tudtunk izolálni Trichoderma fajokat, melyek telepmorfológia alapján az alkalmazott TR04 és TR05 törzsekkel azonosak. Az izolátumok molekuláris jellemzése folyamatban van.Among the strains used in the Szekszárd planting in 2017, we were able to isolate Trichoderma species from several grafts, which, based on colony morphology, are identical to the TR04 and TR05 strains used. Molecular characterization of the isolates is in progress.
II. szabadföldi kísérlet: Kijuttatott Trichoderma fajok visszaizolálása a Kékfrankos, Cabernet Sauvignon és Cabemet Franc fajtákról a Villányi BorvidékrőlII. field experiment: Re-isolation of applied Trichoderma species from the Kékfrankos, Cabernet Sauvignon and Cabemet Franc varieties from the Villány Wine Region
Az oltványok telepítése 2015-ben a Villányi Borvidéken egy kb. 2 hektár területen történt Kékfrankos (A41, Ktl), Cabemet Sauvignon (337 klón), Cabemet Franc (N101,1-SV-FV5, Eli) fajtákkal. A telepítést követően a kijuttatott Trichoderma szuszpenzió hatékonyságát vizsgáltuk. A telepítést követő évben a kontroll, és a Trichoderma kezelésben részesült növények között 1% alatti pusztulás volt tapasztalható (37. ábra).The planting of grafts in the Villány Wine Region in 2015 took an approx. It took place on an area of 2 hectares with Kékfrankos (A41, Ktl), Cabemet Sauvignon (337 clones), Cabemet Franc (N101.1-SV-FV5, Eli) varieties. After installation, the effectiveness of the applied Trichoderma suspension was examined. In the year following planting, there was less than 1% death between the control and Trichoderma-treated plants (Figure 37).
A fiatal ültetvényben GTD tüneteket nem tapasztaltunk. A Trichoderma szuszpenzióval kezelt növények intenzívebb növekedést mutattak a kontroll növényekhez képest (31. ábra), amit a kezelést követő évben mértünk fel (38. ábra).No GTD symptoms were observed in the young plantation. The plants treated with Trichoderma suspension showed more intense growth compared to the control plants (Figure 31), which was measured the year after the treatment (Figure 38).
2016-ban néhány Trichoderma szuszpenzióval kezelt fiatal növényből sikerült a kijuttatott fajokat visszaizolálni. A kezelt Kékfrankos, Cabemet Sauvignon, Cabemet Franc fajtáknál nekrotikus és nem nekrotikus fás szövetből kontroll és kezelt növények esetén is sikerült visszaizolálni a TrichodermákaL melyeket Trichoderma harzianum és Trichoderma orientale fajokként azonosítottunk. A szekvencia összerendezés az 32. és 33. ábrákon látható.In 2016, it was possible to isolate the applied species from some young plants treated with Trichoderma suspension. In the case of the treated varieties Kékfrankos, Cabemet Sauvignon, Cabemet Franc, it was possible to re-isolate Trichoderma L from necrotic and non-necrotic woody tissue in both control and treated plants, which were identified as Trichoderma harzianum and Trichoderma orientale species. The sequence arrangement is shown in Figures 32 and 33.
A kijuttatást és az adatbázisban deponált típustörzsekkel történő összehasonlítást tekintve a visszaizolált izolátumok esetén az SZ03, SZ 07, SZ_06 izolátumok 99%-os homológiát mutattak a saját, kijuttatott TR06 törzseinkkel, valamint a típustörzzsel.Regarding the spread and the comparison with the type strains deposited in the database, in the case of the re-isolated isolates, the SZ03, SZ 07, SZ_06 isolates showed 99% homology with our own, spread TR06 strains, as well as with the type strain.
Az SZ_01, SZ 02, SZ_05, SZ_08 izolátumok a kijuttatott TR05 törzzsel 98%-os hasonlóságot, a deponált törzzsel pedig 95 és 98% a homológiát mutattak (32. ábra).The isolates SZ_01, SZ 02, SZ_05, SZ_08 showed 98% similarity with the released TR05 strain, and 95 and 98% homology with the deposited strain (Figure 32).
I. és III. szabadföldi kísérlet: Oltványok és idősebb ültetvények monitorozása a Trichoderma szuszpenzióval történt kezelést követően.I. and III. field trial: Monitoring of grafts and older plantations after treatment with Trichoderma suspension.
A kijuttatott Trichoderma fajok visszaizolálása évente történik a Tokaji és a Villányi borvidékről egyaránt.The re-isolation of the applied Trichoderma species is done annually from both the Tokaj and Villány wine regions.
A Tokaji Borvidéken a Bakonyi dűlőben idősebb Hárslevelű ültetvényt kezeltünk, míg a Villányi Borvidéken oltványok kezelése történt a telepítés előtt.In the Tokaj Wine Region, we managed an older Hárslevelű plantation in the Bakony vineyard, while in the Villányi Wine Region, grafts were treated before planting.
Ezekben az in vivo kísérletekben megállapítható volt, hogy a kijuttatott Trichoderma fajok csökkentették aIn these in vivo experiments, it was established that the applied Trichoderma species reduced the
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-19vegetatív szerveken a betegség jellegzetes tüneteit, az oltványok esetében nagyobb lombtömeggel rendelkeztek a növények.-19 plants had the characteristic symptoms of the disease on vegetative organs, and in the case of grafts, the plants had a higher foliage mass.
A szőlő fás szöveteiből izolált törzseink hatékonyan tudták kolonizálni a növényi szöveteket.Our strains isolated from the woody tissues of the grape were able to effectively colonize the plant tissues.
Trichoderma szuszpenzióval történő kezelésekTreatments with Trichoderma suspension
A 4. táblázatban foglaltuk össze a Trichoderma törzsekkel végzett in vivo kísérletek időpontjait, a kijuttatott törzseket, valamint a spóra szuszpenziók koncentrációit.Table 4 summarizes the dates of the in vivo experiments with Trichoderma strains, the applied strains, and the concentrations of the spore suspensions.
4. táblázat: Trichoderma törzsekkel végzett szabadföldi kísérletekTable 4: Field experiments with Trichoderma strains
SZEKVENCIALISTA < 110> Debreceni Egyetem < 120> Biopeszticid gombatörzsek és készítmények < 130> 122825-1423/KOH < 160> 7 <170> Patentln version 3.5 < 210> 1 <211> 156 < 212> DNA < 213> Trichoderma sp. DE_TR04 strain <400>1 ggggtttctt gtgcacccca ctagctcgtt ttttctgctt cgctctcact tcccagccat60 cattcaacgt attctgtgtc tcgtcacttt cagcgatgct aaccactttt ccatcaatag120 gaagccgccg aactcggtaa gggttccttc aagtaa156 < 210> 2 <211> 770SEQUENTIALIST < 110> University of Debrecen < 120> Biopesticide fungal strains and preparations < 130> 122825-1423/KOH < 160> 7 <170> Patentln version 3.5 < 210> 1 <211> 156 < 212> DNA < 213> Trichoderma sp. DE_TR04 strain <400>1 ggggtttctt gtgcacccca ctagctcgtt ttttctgctt cgctctcact tcccagccat60 cattcaacgt attctgtgtc tcgtcacttt cagcgatgct aaccactttt ccatcaatag120 gaagccgccg aactcggtaa gggttcctt aagtaa156 <210> 2 <211> 770
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-20<212> DNA-20<212> DNA
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
-21ttggccagac ttacaacgga gttggaggtg gcggtggtgg ctcaactgga agctgggagg ccggtatctg ggattacaag gctcttccca aggccggcgc caccatccag tacgattctg tcgcaaaggg ttactacagc tacaacgccg gtaccaagga gctcatctct ttcgataccc ctgacatgat caacaccaag gttgcctacc tcaagtctct tggcctggga ggtagcatgt tctgggaggc ctcagccgac aagaagggat ctgactcgct gattg <210> 5 <211> 596 < 212> DNA < 213> Trichoderma sp. DE_TR04 strain < 400> 5 cgtaacaagg tctccgttgg tgaaccagcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aacccaatgt gaacgttacc aaactgttgc ctcggcggga tctctgcccc gggtgcgtcg cagccccgga ccaaggcgcc cgccggagga ccaaccaaaa ctcttattgt ataccccctc gcgggttttt ttataatctg agccttctcg gcgcctctcg taggcgtttc gaaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg agcgtcattt caaccctcga acccctccgg ggggtcggcg ttggggatcg gccctccctt agcggggtgg ccgtctccga aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc ctgcgcagta gtttgcacac tcgcatcggg agcgcggcgc gtccacagcc gttaaacacc caacttctga aatgttgacc tcggatcagg taggaa <210> 6 <211> 593 < 212> DNA < 213> Trichoderma sp. DE_TR05 strain < 400> 6 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt accgagttta caactcccaa acccaatgtg aacgttacca aactgttgcc tcggcgggat ctctgccccg ggtgcgtcgc agccccggac caaggcgccc gccggaggac caaccaaaac tcttattgta taccccctcg cgggtttttt tataatctga gccttctcgg cgcctctcgt aggcgtttcg aaaatgaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc aaccctcgaa cccctccggg gggtcggcgt tggggatcgg ccctgccttg gcggtggccg tctccgaaat acagtggcgg tctcgccgca gcctctcctg cgcagtagtt tgcacactcg catcgggagc gcggcgcgtc cacagccgtt aaacacccaa cttctgaaat gttgacctcg gatcaggtag gaa < 210> 7 < 211> 580 < 212> DNA-21ttggccagac ttacaacgga gttggaggtg gcggtggtgg ctcaactgga agctgggagg ccggtatctg ggattacaag gctcttccca aggccggcgc caccatccag tacgattctg tcgcaaaggg ttactacagc tacaacgccg gtaccaagga gctcatctct ttcgataccc ctgacatgat caacaccaag gttgcctacc tcaagtctct tggcctggga ggtagcatgt tctgggaggc ctcagccgac a agaagggat ctgactcgct gattg <210> 5 <211> 596 < 212> DNA < 213> Trichoderma sp. DE_TR04 strain < 400> 5 cgtaacaagg tctccgttgg tgaaccagcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aacccaatgt gaacgttacc aaactgttgc ctcggcggga tctctgcccc gggtgcgtcg cagccccgga ccaaggcgcc cgccggagga ccaaccaaaa ctcttattgt ataccccctc gcgggttttt ttataatctg agccttctcg gctctcg taggcgtttc gaaaatga at caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg agcgtcattt caaccctcga acccctccgg ggggtcggcg ttgggatcg gccctccctt agcggggtgg ccgtctccga aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc ctgcgcagta gtttgcacac tcgcatcggg agcgcggcgc gtccacagcc gttaaacacc caacttctga aatgttgacc tcggatcagg taggaa <210> 6 <211> 593 < 212> DNA < 213> Trichoderma sp. DE_TR05 strain < 400> 6 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt accgagttta caactcccaa acccaatgtg aacgttacca aactgttgcc tcggcgggat ctctgccccg ggtgcgtcgc agccccggac caaggcgccc gccggagac caaccaaaac tcttattgta taccccctcg cgggttttt tataatctga gccttctcgg cgcctctcgt aggcgtttcg aaaat gaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcctcatttc aaccctcgaa cccctccggg gggtcggcgt tggggatcgg ccctgccttg gcggtggccg tctccgaaat acagtggcgg tctcgccgca gcctctcctg cgcagtagtt tgcacactcg catcgggagc gcggcgcgtc cacagccgtt aaacacccaa cttctgaaat gttgacctcg gatcaggtag gaa < 210> 7 < 211> 580 < 212> DNA.
540540
600600
660660
720720
765765
120120
180180
240240
300300
360360
420420
480480
540540
596596
120120
180180
240240
300300
360360
420420
480480
540540
593593
122825-1423/KOH122825-1423/KOH
HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKELIST OF REFERENCES
Altschul, S. F. - Gish, W. - Miller, W. - Myers, E. W. - Lipman, D. J.: 1990. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215. 403-410.Altschul, S.F. - Gish, W. - Miller, W. - Myers, E.W. - Lipman, D.J.: 1990. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215. 403-410.
Carbone I. - Kohn L. M.: 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia. 91.3: 553-556.Carbone I. - Kohn L.M.: 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia. 91.3: 553-556.
Crous, P. W. — Slippers, B. - Wingfield, M. J. — Rheeder, J. - Marasas, W. F. O. - Philips, A. J. L. — Alves, A. — Burgess T. - Barber, P. - Groenewald, J. Z.: 2006. Phylogenetic lineages in the Botryosphaeriaceae. Studies in Mycology. 55. 235-253.Crous, P.W. - Slippers, B. - Wingfield, M.J. - Rheeder, J. - Marasas, W.F.O. - Philips, A.J.L. - Alves, A. - Burgess T. - Barber, P. - Groenewald, J.Z.: 2006. Phylogenetic lineages in the Botryosphaeriaceae. Studies in Mycology. 55. 235-253.
Duchon, C. E.: 1979. Lanczos Filtering in One and Two Dimensions. Journal of Applied Meteorology. 18. 1016-1022.Duchon, C.E.: 1979. Lanczos Filtering in One and Two Dimensions. Journal of Applied Meteorology. 18. 1016-1022.
Druzhinina, I.S. — Kopchinskiy A.G. — Komon, M. — Bissett, J. — Szakács, G - Kubicek, C.P. 2005: An oligonucleotide barcode for species identification in Tríchoderma and Hypocrea. Fungal Genet. Biol. 42. 813828 (2005)Druzhinina, I.S. — Kopchinskiy A.G. — Komon, M. — Bissett, J. — Szakács, G - Kubicek, C.P. 2005: An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea. Fungal Gene. Biol. 42. 813828 (2005)
Druzhinina, LS. - Kubicek, C.P. - Komon-Zelazowska, M. - Mulaw, T.B. - Bissett, J. 2010: The Tríchoderma harzianum demon: complex speciation history resulting in coexistence of hypothetical biological species, recent agamospecies and numerous relict lineages. BMC Evol Biol. 10. 94-107.Druzhinina, LS. - Kubicek, C.P. - Komon-Zelazowska, M. - Mulaw, T.B. - Bissett, J. 2010: The Tríchoderma harzianum demon: complex speciation history resulting in coexistence of hypothetical biological species, recent agamospecies and numerous relict lineages. BMC Evol Biol. 10. 94-107.
Higgins, D. G. - Sharp, P. M.: 1988. CLUSTAL: A package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 73. 1. 237-244.Higgins, D. G. - Sharp, P. M.: 1988. CLUSTAL: A package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 73. 1. 237-244.
John, S. - Wicks, T. J. - Hunt, J. S. - Lorimer, M. F. - Oakey H. - Scott, E. S.: 2005. Protection of grapevine pruning wounds from infection by Eutypa lata using Tríchoderma harzianum and Fusarium lateritium. Australas Plant Pathology. 34. 569-575.John, S. - Wicks, T. J. - Hunt, J. S. - Lorimer, M. F. - Oakey H. - Scott, E. S.: 2005. Protection of grapevine pruning wounds from infection by Eutypa lata using Tríchoderma harzianum and Fusarium lateritium. Australas Plant Pathology. 34. 569-575.
Kovács Cs. -Balling P. - Bihari Z. - Nagy A. - Sándor E.: 2017. Incidence of grapevine trunk diseases is influenced by soil, topology and vineyard age, but not by Diplodia seriata infection rate in the Tokaj Wine Region, Hungary. Phytoparasitica 45: 21-32.Kovács Cs. - Balling P. - Bihari Z. - Nagy A. - Sándor E.: 2017. Incidence of grapevine trunk diseases is influenced by soil, topology and vineyard age, but not by Diplodia seriata infection rate in the Tokaj Wine Region, Hungary. Phytoparasitica 45: 21-32.
Kovács Cs. - Peles F. - Balling P. - Bihari Z. - Sándor E.: 2014a. Szőlőtőkékből izolált Tríchoderma fajokKovács Cs. - Peles F. - Balling P. - Bihari Z. - Sándor E.: 2014a. Trichoderma species isolated from grapevines
122825- 1423/KOH122825- 1423/KOH
-23vizsgálata laboratóriumi és szabadföldi kísérletben. XXXI. Integrált termesztés a kertészeti és szántóföldi kultúrákban konferencia kiadványa. 5-11.-23 in laboratory and field experiments. XXXI Integrated cultivation in horticultural and arable crops is a conference publication. 5-11.
Kovács Cs. - Peles F. - Bihari Z. - Sándor E.: 2014b. A szőlő tőkebetegségeiben szerepet játszó gombák a Tokaj-Hegyaljai borvidéken. Növényvédelem. 50. 4: 153-159.Kovács Cs. - Peles F. - Bihari Z. - Sándor E.: 2014b. Fungi that play a role in grape root diseases in the Tokaj-Hegyalja wine region. Plant protection. 50. 4: 153-159.
Kovács Cs. - Peles F. — Xie, H. — Szojka A. - Hajdú G. - Bihari Z. - Sándor E.: 2014c. A fertőző tőkeelhalásban szerepet játszó gombák izolálása és azonosítása hagyományos és molekuláris biológiai módszerekkel a Tokaj-hegyaljai borvidéken. Agrártudományi Közlemények. 56. 61-66.Kovács Cs. - Peles F. — Xie, H. — Szojka A. - Hajdú G. - Bihari Z. - Sándor E.: 2014c. Isolation and identification of fungi involved in infectious cod die-off using traditional and molecular biological methods in the Tokaj Mountains wine region. Agricultural Science Bulletins. 56. 61-66.
Kovács Cs. A szőlő tökeelhalásában szerepet játszó gombafajok és a betegség elleni potenciális biológiai védekezési lehetőségek vizsgálata a tokaji borvidéken. Doktori értekezés. Debreceni Egyetem Kerpely Kálmán Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok Doktori Iskolája. 2017Kovács Cs. Examination of the fungal species involved in grape rot and potential biological control options against the disease in the Tokaj wine region. Doctoral thesis. University of Debrecen Kálmán Kerpely Doctoral School of Plant Breeding and Horticultural Sciences. 2017
Kövics Gy.: 2009. Növénykórtani vademecum. Magyar-angol angol-magyar szakkifejezés szótár. 107. NOFKA, Debrecen. 470.Gy. Kövics: 2009. Vademecum of plant pathology. Hungarian-English English-Hungarian term dictionary. 107. NOFKA, Debrecen. 470.
Kubicek, C. P. - Komon-Zelazowska, M. - Sándor E. - Druzhinina, L: 2007. Facts and challenges in the understanding of the biosynthesis of peptaibols in Trichoderma. Chemistry and Biodiversity. 4. 1068-1082.Kubicek, C. P. - Komon-Zelazowska, M. - Sándor E. - Druzhinina, L: 2007. Facts and challenges in the understanding of the biosynthesis of peptaibols in Trichoderma. Chemistry and Biodiversity. 4. 1068-1082.
Kullnig-Gradinger, C. M. - Szakács G. - Kubicek, C. P.: 2002. Philogeny and evolution of the genes Trichoderma·. a multigene approach. Mycology Research. 106. 7: 757-767.Kullnig-Gradinger, C. M. - Szakács G. - Kubicek, C. P.: 2002. Phylogeny and evolution of the genes Trichoderma·. the multigene approach. Mycology Research. 106. 7: 757-767.
Larkin, M. A. - Blackshields, G. - Brown, N. P. - Chenna, R. - McGettigan, P. A. - Me William, H. - Valentin, F. - Wallace, I. M. - Wilm, A. - Lopez, R. - Thompson, J. D. - Gibson T. J. - Higgins, D. G.: 2007. ClustalW and ClustalX version 2.0. Bioinformatics Advance Access. 2.Larkin, M.A. - Blackshields, G. - Brown, N.P. - Chenna, R. - McGettigan, P.A. - Me William, H. - Valentin, F. - Wallace, I.M. - Wilm, A. - Lopez, R. - Thompson, J.D. - Gibson T.J. - Higgins, D.G.: 2007. ClustalW and ClustalX version 2.0. Bioinformatics Advance Access. 2.
Nicholas, K. B. - Nicholas, Η. B. - Deerfield, D. W.: 1997. GeneDoc: Analysis and visualization of genetic variation. Embnet.News 4. 14.Nicholas, K.B. - Nicholas, Η. B. - Deerfield, D.W.: 1997. GeneDoc: Analysis and visualization of genetic variation. Embnet.News 4. 14.
Schoch, C. L. - Seifert, K. A. - Huhndorf, S. - Robert, V. - Spouge, J. L. — Levesque, C. A. - Chen, W. Fungal Barcoding Consortium.: 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as an universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109. 6241-6246.Schoch, C. L. - Seifert, K. A. - Huhndorf, S. - Robert, V. - Spouge, J. L. - Levesque, C. A. - Chen, W. Fungal Barcoding Consortium.: 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as an universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109. 6241-6246.
Sandoval-Denis, M. - Sutton, D. A. - Cano-Lira, J. F. -Géné, J. - Fothergill, A. W - Wiederhold, N. P. Guarro, J. 2014, Susceptibilities Trichoderma and their antifungal species of the emerging fungus. P J. Clin. Microbiol. 52. 2112-2115.Sandoval-Denis, M. - Sutton, D. A. - Cano-Lira, J. F. - Géné, J. - Fothergill, A. W - Wiederhold, N. P. Guarro, J. 2014, Susceptibilities Trichoderma and their antifungal species of the emerging fungus. P J. Clin. Microbiol. 52. 2112-2115.
Szekeres A. - Leitgeb B. - Kredics L. - Manezinger L. - Vágvölgyi Cs.: 2006. A novel, image analysis-based method for the evaluation of in vitro antagonism. Journal of Microbiological Methods. 65. 619-622.Szekeres A. - Leitgeb B. - Kredics L. - Manezinger L. - Vágvölgyi Cs.: 2006. A novel, image analysis-based method for the evaluation of in vitro antagonism. Journal of Microbiological Methods. 65. 619-622.
Tamura, K. - Stecher, G. - Peterson, D. - Filipski, A. - Kumar, S.: 2013. MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0.Tamura, K. - Stecher, G. - Peterson, D. - Filipski, A. - Kumar, S.: 2013. MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0.
Thompson, J. D. - Gibson, T. J. - Plewniak, F. v Jeanmougin, F. — Higgins, D. G.: 1997. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided . -quality analysis tools, Nucleic Acids Research. 25. 4876-4882.Thompson, J.D. - Gibson, T.J. - Plewniak, F. v Jeanmougin, F. — Higgins, D.G.: 1997. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided. -quality analysis tools, Nucleic Acids Research. 25. 4876-4882.
Weindling, R.: 1932. Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi. Phytopathology. 22. 837-845.Weindling, R.: 1932. Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi. Phytopathology. 22. 837-845.
White, T. J. - Bruns, T. D. - Lee, S. B. - Taylor, J. W.: 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. [In: Innis, M. A. - Gelfand, D. H. - Sninsky, J. J. - White, T. J. (szerk.) PCR Protocols: a guide to methods and applications.] Academic Press. New York. 315-322.White, T.J. - Bruns, T.D. - Lee, S.B. - Taylor, J.W.: 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. [In: Innis, M.A. - Gelfand, D.H. - Sninsky, J.J. - White, T.J. (ed.) PCR Protocols: a guide to methods and applications.] Academic Press. New York. 315-322.
Claims (13)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP1800012A HU231403B1 (en) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Biopesticidal fungel strains and preparation thereof |
| PCT/HU2019/050002 WO2019142009A1 (en) | 2018-01-16 | 2019-01-16 | Method for the treatment of grapevine diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP1800012A HU231403B1 (en) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Biopesticidal fungel strains and preparation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP1800012A2 HUP1800012A2 (en) | 2019-07-29 |
| HU231403B1 true HU231403B1 (en) | 2023-06-28 |
Family
ID=89992611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HUP1800012A HU231403B1 (en) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Biopesticidal fungel strains and preparation thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU231403B1 (en) |
| WO (1) | WO2019142009A1 (en) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2363991A2 (en) * | 1976-09-13 | 1978-04-07 | Ricard Jacques | Mycofungicide contg. propagules or spores of immunising commensals - such as Scytalidium lignicola and Trichoderma polysporum which are incubated on cereal grains |
| US4678669A (en) * | 1969-04-29 | 1987-07-07 | Suoma Ricard | Method of using immunizing commensals |
| FR2864832B1 (en) * | 2004-01-07 | 2006-02-24 | Olivier Besnard | CLICHES OF TRICHODERMA HERZIANUM, METHODS OF ISOLATION AND CULTURE AND APPLICATION AS PHYTOSANITARY PRODUCT |
| CA2751694C (en) * | 2009-02-06 | 2018-04-17 | Cornell University | Trichoderma strains that induce resistance to plant diseases and/or increase plant growth |
-
2018
- 2018-01-16 HU HUP1800012A patent/HU231403B1/en unknown
-
2019
- 2019-01-16 WO PCT/HU2019/050002 patent/WO2019142009A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP1800012A2 (en) | 2019-07-29 |
| WO2019142009A1 (en) | 2019-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bailey et al. | Antibiosis, mycoparasitism, and colonization success for endophytic Trichoderma isolates with biological control potential in Theobroma cacao | |
| Talgø et al. | Sydowia polyspora associated with current season needle necrosis (CSNN) on true fir (Abies spp.) | |
| Isikhuemhen et al. | Mating compatibility and phylogeography in Pleurotus tuberregium | |
| CN104818216B (en) | One plant is used to prevent and treat tomato and the Paecilomyces lilacinus of grape root knot nematode disease evil | |
| Sandoval-Denis et al. | New Fusarium species from the Kruger national park, south Africa | |
| Seo et al. | Potential reasons for prevalence of Fusarium wilt in Oriental Melon in Korea | |
| Nielsen et al. | Putative source of the invasive Sirex noctilio fungal symbiont, Amylostereum areolatum, in the eastern United States and its association with native siricid woodwasps | |
| CN102586120B (en) | Endophytic fungi CEF08111 of cotton and application thereof in prevention and treatment of cotton verticillium wilt | |
| CN105462858B (en) | Short and dense trichoderma brevicompactum and application thereof in cucumber fusarium wilt prevention and control | |
| Jian et al. | Identification of Colletotrichum species associated with anthracnose disease of strawberry in Sichuan Province, China | |
| Hassan et al. | Morphological and molecular characteristics of fungal species associated with crown rot of strawberry in South Korea | |
| Lawrence et al. | Pleurostoma decline of olive trees caused by Pleurostoma richardsiae in California | |
| Baki et al. | Indigenous entomopathogenic fungi as potential biological control agents of rose sawfly, Arge rosae L.(Hymenoptera: Argidae) | |
| CN108441443B (en) | Strain for preventing and treating plant nematodes and application thereof | |
| CN106282029B (en) | The trichoderma harzianum strain Th-N5 of one plant of resisting carbendazim and its application | |
| Brand et al. | First report on Pythium myriotylum as pathogen on duckweed (Lemna minor L.) in hydroponic systems in Germany | |
| CN107325973B (en) | Beauveria bassiana strain with strong pathogenicity on corylus avenae sinensis and application thereof | |
| HU231403B1 (en) | Biopesticidal fungel strains and preparation thereof | |
| CN111187724B (en) | Endophytic fungus with dark blueberry root and application thereof | |
| Li et al. | First report of Neofusicoccum parvum causing leaf spot disease on Macadamia integrifolia in China | |
| CN114480143B (en) | Trichoderma harzianum M6 for preventing and treating sclerotinia sclerotiorum of sunflower and application thereof | |
| Yangui et al. | Identification and occurrence of Trichoderma harzianum associated with cork oak in Tunisia. | |
| KR102612464B1 (en) | Acremonium tubakii NNIBRFG2982 strain isolated from freshwater having antifungal activity and plant growth promotion and uses thereof | |
| Ndobe | Fungi associated with roots of healthy-looking Scots pines and Norway spruce seedlings grown in nine Swedish forest nurseries | |
| CN110713936B (en) | Cladosporium virens and single spore separation method and identification method thereof |