HU211253A9 - Process for the preparation of water soluble primycin and its components and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents
Process for the preparation of water soluble primycin and its components and pharmaceutical compositions containing them Download PDFInfo
- Publication number
- HU211253A9 HU211253A9 HU9500219P HU9500219P HU211253A9 HU 211253 A9 HU211253 A9 HU 211253A9 HU 9500219 P HU9500219 P HU 9500219P HU 9500219 P HU9500219 P HU 9500219P HU 211253 A9 HU211253 A9 HU 211253A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- water
- soluble
- primicin
- components
- component
- Prior art date
Links
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 13
- NYWSLZMTZNODJM-MCGDBQAWSA-N 2-[5-[(4e,20e)-35-butyl-19-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-10,12,14,16,18,22,26,30,34-nonahydroxy-3,5,21,33-tetramethyl-36-oxo-1-oxacyclohexatriaconta-4,20-dien-2-yl]-4-hydroxyhexyl]guanidine Chemical compound OC1CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)CCCC\C(C)=C\C(C)C(C(C)C(O)CCCN=C(N)N)OC(=O)C(CCCC)C(O)C(C)CCC(O)CCCC(O)CCCC(O)\C(C)=C\C1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NYWSLZMTZNODJM-MCGDBQAWSA-N 0.000 title description 24
- 229950010664 primycin Drugs 0.000 title description 23
- NYWSLZMTZNODJM-SDUQVVOESA-N primycin Natural products CCCC[C@H]1[C@H](O)[C@H](C)CC[C@@H](O)CCC[C@@H](O)CCC[C@@H](O)C(=C[C@H](O[C@H]2O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]2O)[C@@H](O)C[C@H](O)C[C@@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CCCCC(=C[C@@H](C)[C@@H](OC1=O)[C@H](C)[C@H](O)CCCNC(=N)N)C)C NYWSLZMTZNODJM-SDUQVVOESA-N 0.000 title description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 16
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 8
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 8
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 8
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 241000288049 Perdix perdix Species 0.000 claims description 5
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- ZIUSEGSNTOUIPT-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-cyanoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC#N ZIUSEGSNTOUIPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N potassium methoxide Chemical compound [K+].[O-]C BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 2
- HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N ethoxide Chemical compound CC[O-] HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940046892 lead acetate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N cyanoacetic acid Chemical compound OC(=O)CC#N MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 claims 2
- ZSVKMXZWWWANRI-UHFFFAOYSA-N propanedioic acid propan-2-one Chemical compound CC(=O)C.C(CC(=O)O)(=O)O ZSVKMXZWWWANRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 12
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 12
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 7
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 6
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZARQXGRENRAGM-YQALYVIGSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCC1C(O)C(C)CCC(O)CCCC(O)CCCC(O)\C(C)=C\C(OC2OC(CO)C(O)C2O)C(O)CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)CCCC\C(C)=C\C(C)C(OC1=O)C(C)C(O)CCCN=C(N)N.CCCCC1C(O)C(C)CCC(O)CCCC(O)CCCC(O)\C(C)=C\C(OC2OC(CO)C(O)C2O)C(O)CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)CCCC\C(C)=C\C(C)C(OC1=O)C(C)C(O)CCCN=C(N)N Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCC1C(O)C(C)CCC(O)CCCC(O)CCCC(O)\C(C)=C\C(OC2OC(CO)C(O)C2O)C(O)CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)CCCC\C(C)=C\C(C)C(OC1=O)C(C)C(O)CCCN=C(N)N.CCCCC1C(O)C(C)CCC(O)CCCC(O)CCCC(O)\C(C)=C\C(OC2OC(CO)C(O)C2O)C(O)CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)CCCC\C(C)=C\C(C)C(OC1=O)C(C)C(O)CCCN=C(N)N BZARQXGRENRAGM-YQALYVIGSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 125000000089 arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- SNVLJLYUUXKWOJ-UHFFFAOYSA-N methylidenecarbene Chemical compound C=[C] SNVLJLYUUXKWOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl n'-phenylcarbamimidothioate;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.CCN(CC)CCSC(N)=NC1=CC=CC=C1 XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000003747 Grignard reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 101100208721 Mus musculus Usp5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010936 aqueous wash Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003321 atomic absorption spectrophotometry Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 150000004291 polyenes Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HUAUNKAZQWMVFY-UHFFFAOYSA-M sodium;oxocalcium;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].[Ca]=O HUAUNKAZQWMVFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Eljárás vízoldékony primicin és komponensei előállítására és az azt/azokat tartalmazó készítményekProcess for the preparation of water soluble primicin and its components and compositions containing it
A találmány tárgya eljárás vízoldékony primicin előállítására, és a komponensei szétválasztására. A találmány tárgya még hatóanyagként vízoldható primicint, vagy komponenseit tartalmazó gyógyászati és állatgyógyászati készítmények.The present invention relates to a process for the preparation of a water-soluble primicin and to separation of its components. The present invention also relates to pharmaceutical and veterinary compositions containing water-soluble primicin or its components.
A primicin széles körben használt antibiotikum, amely erős antimikrobás hatással rendelkezik. Szerkezeti képletét J. Aberhart és mtsai ismertették [J. Am. Chem. Soc. 92, 5816 (1970)]; a szerzők megadták a feltételezett szerkezeti képletét is. További vizsgálatok kiderítették, hogy a primicin antibiotikum több komponens keveréke: három főkomponensből, és több, mint tíz ún. minor komponensből áll (J. Chromatogr. 295, 141-151,1984).Primicin is a widely used antibiotic with potent antimicrobial activity. Its structural formula is described by J. Aberhart et al. Chem. Soc. 92, 5816 (1970)]; the authors also provided the hypothesized structural formula. Further studies have shown that the primicin antibiotic is a mixture of several components: three main components, and more than ten so-called "primary" antibiotics. minor component (J. Chromatogr. 295, 141-151, 1984).
A leírásban és igénypontokban használt „primicin” kifejezés többkomponensű keverékre utal; az egyes önálló komponenseket megfelelő betűvel jelzik.The term "primicin" as used in the specification and claims refers to a multi-component mixture; each individual component is identified by an appropriate letter.
Számtalan irodalom leírja a primicin és komponensei előállítását a fent említetteken kívül pl. a 146 332, 153 593, 158 241, 177 299, 194 493 és 195 514 lsz. magyar szabadalmi leírások.Numerous literature describes the preparation of primicin and its components in addition to those mentioned above, e.g. Nos. 146,332, 153,593, 158,241, 177,299, 194,493, and 195,514. Hungarian patents.
Az ismert eljárások szerint előállított primicin és komponensei vízben nagyon rosszul oldódnak, ami gondot okoz a terápiás alkalmazásukkor, mivel csak meglehetősen alacsony hatóanyag-tartalmú gyógyszerformák előállítását teszi lehetővé (pl. EbrimycinR gél hatóanyagtartalma mindössze 0,2%). További hátrány, hogy a komponensek elválasztása bonyolult és hosszadalmas eljárást igényel.Primicin and its components prepared according to known methods are very poorly soluble in water, which causes problems in their therapeutic use, since it allows only the preparation of formulations with a relatively low content of active ingredient (eg Ebrimycin R Gel only 0.2% active ingredient). A further disadvantage is that the separation of the components is a complicated and lengthy process.
A cél az volt, hogy a pl. 146 332 sz. és 153 593 sz. magyar szab. leírás szerint előállított primicint egyszerű gazdaságos módszerrel vízoldhatóvá tegyük.The aim was to No. 146,332 and 153,593. Hungarian Standard The primicin prepared according to the present invention is water soluble by a simple economical method.
További célunk az volt, hogy egyszerű eljárással elválasszuk a primicin két fő komponensét vagy azok keverékét a következő módon:A further object was to separate the two main components of primicin, or a mixture thereof, by a simple method as follows:
(i) a vízoldhatatlan primicint 1-3 szénatomos alkoholos közegben előnyösen etanolban etil ciano acetáttal vagy dinitril malonsavval vagy acetil acetonnal (előnyösen etil ciano acetáttal) reagáltatjuk nátrium, vagy kálium metoxid vagy etoxid előnyösen nátrium metoxid jelenlétében, és a kapott 40-60 mg/ml vízoldékonyságú terméket elkülönítjük és kívánt esetben (ii) a kapott anyagot szilikagél oszlopkromatografáljuk 1% Partridge keverék vizes oldatát használva eluálószerként és Aj és A3 képletű 50 mg/ml vízoldékonyságú keveréket kapunk és kívánt esetben (iii) a kapott kétkomponensű keveréket, adszorbensként ammónium ciklusú karboximetil-cellulózt használva, ioncserélő kromatografálásnak vetjük alá, az elúciót vizes ammónium-hidrokarbonát-oldattal hajtjuk végre és így az 50 mg/ml vízoldékonyságú A3 képletű komponenst tisztán kinyerjük és kívánt esetben (iv) 10 mmól ecetsavat tartalmazó abszolút metanollal az elúciót folytatjuk és tiszta formában a 10 mg/ml vízoldékonyságú A, képletű komponenst kinyerjük. A százalékos értékek súly/térfogat mértékegységben vannak kifejezve. Az első lépésben kapott vízoldékony primicin mind a szerkezeti képlete mind a vékonyréteg-kromatogramja megegyezik a kiindulási anyagéval azzal a különbséggel, hogy a vegyértékek orientációja a vízoldékonyságot megváltoztatja.(i) reacting the water-insoluble primicin in a C 1 -C 3 alcoholic medium, preferably ethanol, with ethyl cyanoacetate or dinitrile malonic acid or acetylacetone (preferably ethyl cyanoacetate) in the presence of sodium or potassium methoxide or ethoxide, preferably 40-60 mg / ml of water soluble product is isolated and, if desired, (ii) silica gel column chromatography using a 1% Partridge aqueous solution as eluent to give A and A 3 50 mg / ml water soluble mixture and, if desired, (iii) ammonium cycle as adsorbent. using carboxymethyl cellulose, subjected to ion exchange chromatography, and elution is performed with aqueous ammonium hydrogen carbonate solution, and thus the water solubility of 50 mg / ml of component A of formula 3 is recovered pure in absolute methanol, if desired, (iv) containing 10 mM of acetic acid and Elution is continued and component A is dissolved in water at a solubility of 10 mg / ml. Percentages are expressed in units of weight / volume. The water-soluble primicin obtained in the first step has the same structural formula and thin-layer chromatogram as the starting material except that the orientation of the valences changes the water solubility.
Ennek a ténynek a magyarázata nem teljesen tisztázott, úgy hihető, hogy a kiindulási anyagban az OH csoport térbeli helyzete megváltozik a találmány szerinti reakció folytán, amely vízoldékonyság növekedést okoz.The explanation for this fact is not completely clear, it is believed that the spatial position of the OH group in the starting material is changed by the reaction according to the invention, which causes an increase in water solubility.
A primicin két fő komponense [(A,) és (A3)] amelyet a vízoldékony primicinből szétválasztottunk szintén vízoldékonyak és összegképletük megegyezik az irodalomban közöltekkel.The two main components of primicin [(A,) and (A 3 )], which are separated from water soluble primicin, are also water soluble and have the same general formula as described in the literature.
A találmány szerint előállított vízoldékony primicin és komponensei előnyösen használhatók terápiás célokra, mivel megtartják kitűnő antimikrobás hatékonyságukat és alkalmasak magasabb hatóanyag-tartalmú gyógyszerkészítmények előállítására pl. vizes oldat esetén akár 50-100 mg/ml hatóanyag-tartalmú oldat is készíthető. A találmány tárgya még gyógyászati vagy állatgyógyászati készítmény amely hatóanyagként vízoldható primicint vagy az (A,) és (A3) komponens keverékét vagy azokat egyenként tartalmazza más, a gyógyászatban használatos hígító- vagy más segédanyagokkal együtt.The water-soluble primicin and its components of the present invention are advantageously used for therapeutic purposes, as they retain excellent antimicrobial activity and are suitable for the preparation of higher active pharmaceutical compositions, e.g. in the case of an aqueous solution, a solution containing up to 50-100 mg / ml of active ingredient may be prepared. The invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition comprising as active ingredient water soluble primicin or a mixture of components (A,) and (A 3 ) together with other diluents or other excipients used in medicine.
A találmányt az alábbiakban részletezzükThe invention will be described in more detail below
A nem vízoldható primicint a 146 332 sz. és 153 593 sz. magyar szabadalmi leírás szerint állítjuk elő, amely a találmány kiindulási vegyületeként szolgál. Ez az anyag ionofor tulajdonságokkal rendelkezik.Non-water soluble primicin is disclosed in U.S. Patent No. 146,332. and 153,593. is a starting compound of the invention. This material has ionophoric properties.
Saját, korábbi kísérleteink szerint a fenti vízoldhatatlan primycin a koncentráció és az idő függvényébenAccording to our previous experiments, the above water-insoluble primycin is dependent on concentration and time
1-10 pmol/ml koncentrációban gátolja a vázizomrostok membránjának nyugalmi K+-csatomáit, és ennek következményeképpen csökken a membránpotenciái, mely maga után vonja a kontraktilis rendszer funkciójának módosulását is. A primycin antibiotikum egyedülálló abban a tekintetben, hogy a magas komplexicitással rendelkező molekulában együtt van jelen egy guanidin- és egy arabinóz-egység. így mind a biológiai hatásért, mind fizikokémiai sajátságaiért a nem polién típusú makrolid lakton, ill. az ehhez kapcsolódó guanidin- ill. arabinóz-csoport a felelős. Ezeket együttesen alakítják ki amfipatikus - azaz hidrofil-hidrofób - sajátságaik révén az antibiotikum membránon át történő orientációját és kötődését. Feltételezhető továbbá, hogy a primycin csatomaképző tulajdonsága dimerek, vagy nagyobb polimerek képződésével függ össze.At concentrations of 1-10 pmol / ml, it inhibits resting K + channels in the membrane of skeletal muscle fibers and, as a consequence, decreases membrane potentials, which also results in alteration of contractile system function. The primycin antibiotic is unique in the presence of a guanidine and an arabinose moiety in a molecule with high complexity. Thus, for both its biological activity and its physicochemical properties, the non-polyene type macrolide lactone and / or macrolide. associated guanidine and the arabinose group is responsible. Together, they are formed by their amphipathic - that is, hydrophilic - hydrophobic properties, for the orientation and binding of the antibiotic across the membrane. It is further believed that the channel-forming property of primycin is related to the formation of dimers or larger polymers.
A fenti kölcsönhatások részleges vagy teljes megbontása jelentősen befolyásolhatja a molekula polaritását, és egyben oldékonysági viszonyait is. A molekula guanidin csoportjának részleges vagy teljes protonáltsága jelentősen befolyásolhatja a felületi töltéselosztást (bruttó polaritás), amely direkt vagy indirekt módon csökkenti, vagy éppen elősegíti az intermolekuláris kölcsönhatások kialakulását.Partial or complete breakdown of the above interactions can significantly affect the polarity of the molecule and also its solubility conditions. Partial or total protonation of the guanidine group in the molecule can significantly affect surface charge distribution (gross polarity), which directly or indirectly reduces or even promotes intermolecular interactions.
A pirimidinvázas vegyületek szintézisére széles körben alkalmazott kondenzációs reakciók megfelelőCondensation reactions widely used in the synthesis of pyrimidine backbone compounds are suitable
HU 211 253 A9 alkalmazásával közel 150 kísérletet végeztünk. Ezen reakciók általános jellemzője az N-C-N, ill. a C-C-C hidat tartalmazó vegyületek által kialakult heteroaromás gyűrű.Nearly 150 experiments were performed using A9. The general characteristic of these reactions is N-C-N, respectively. a heteroaromatic ring formed by compounds containing a C-C-C bridge.
Reakció közegként 1-3 C-atomos, vízmentes alkoholok alkalmazhatók, előnyösen abszolút etilalkoholban végeztük a reakciót, melyet a már vízmentes etilalkoholból Grignard-reakcióval készítettünk. Egyébként a kísérletek folyamán alkalmazott vízmentes oldószereket „molekulaszitával” (Sigma molecular sieve 3-4The reaction medium may be anhydrous alcohols having 1 to 3 carbon atoms, preferably in absolute ethyl alcohol prepared from the already anhydrous ethyl alcohol by the Grignard reaction. Otherwise, the anhydrous solvents used in the experiments were "molecular sieve" (Sigma molecular sieve 3-4
A) együtt tároltuk.A) stored together.
Katalizátorként nátrium/kálium metilát/etilát, előnyösen nátrium metilát alkalmazható: Az egyes reakciók az alkalmazott etilalkohol refluxhőmérsékletén 3-6 óráig tartottak. A reakciók befejeztével aktív szenes (Charcoal activ ,.Merck”) kezelést/derítést alkalmaztunk, mely után szűrés (glass microfibre paper GF/C „Whatman”) és részleges vákuumbepárlás (Rotavapor R 110 „Büchi”) következett.The catalyst used is sodium / potassium methylate / ethylate, preferably sodium methylate: Each reaction lasted for 3 to 6 hours at the reflux temperature of the ethyl alcohol used. At the end of the reactions, charcoal activ (.Merck) treatment / clarification was applied followed by filtration (glass microfiber paper GF / C "Whatman") and partial vacuum evaporation (Rotavapor R 110 "Büchi").
A bepárlás folyamán a reakcióközegként alkalmazott etilalkoholt folyamatosan vízmentes metilalkoholra cseréltük le, és a kis térfogatra történő bepárlást követően abszolút éterrel/acetonnal végeztük el a kicsapást. A kapott termék fehér színű, és a további azonosítási vizsgálatok céljára pulverizált formában vákuum-szárítópisztolyban (blaugél, kloroform/etanol, 65 °C) 24 órán keresztül tartottuk.During the evaporation, the ethyl alcohol used as the reaction medium was continuously replaced with anhydrous methyl alcohol and, after evaporation to a small volume, precipitated with absolute ether / acetone. The product was white and pulverized in a vacuum drying gun (blaze, chloroform / ethanol, 65 ° C) for 24 hours for further identification.
A vízoldékony primicin jellemző adatait - összehasonlítva a vízoldhatatlan kiindulási anyaggal - az alábbi 1. táblázat szemlélteti.Characteristic data for the water soluble primicin compared to the water insoluble starting material is shown in Table 1 below.
7. táblázatTable 7
Az empirikus formát tekintve úgy tűnik, hogy a vízoldékony primycin előállítása során valójában nem alakul ki a korábban vélt heteroaromás gyűrű, azaz a pirimidinvázas vegyületek szintézisét reprezentáló kondenzációs reakció nem eredményez semmiféle gyűrűzáródást. Valószínűnek tűnik, hogy a reakció során olyan „intermedier” keletkezik, mely alapvetően megváltoztatja a makrolid-gyűrű OH-csoportjának orientációját. Ez eredményezi végső fokon a vízoldékonyság igen kifejezett növekedését, és ez teszi lehetővé a fő komponensek viszonylag egyszerű elkülönítését. Ennek magyarázatára a későbbiek során visszatérünk.From an empirical point of view, it appears that the water-soluble primycin does not actually form the previously believed heteroaromatic ring, i.e., the condensation reaction representing the synthesis of pyrimidine backbone compounds does not result in any ring closure. It is likely that the reaction will result in an "intermediate" that will fundamentally change the orientation of the OH group on the macrolide ring. This ultimately results in a very pronounced increase in water solubility and allows relatively easy separation of the main components. We will return to this explanation later.
A fenti eljárás segítségével, jól reprodukálható módon, vízben jól oldódó primicint tudunk készíteni, amelyhez kiindulási anyagként bármely terméket, közvetlenül, mindennemű előzetes tisztítás nélkül alkalmazni tudjuk, előnyösen az ólomszennyezett primycint. Tapasztalataink szerint ugyanis az ólom előnyösen befolyásolja mind a vízoldékony primycin-komplex kitermelését - mely általában 80-85% - mind pedig az elérhető maximális vízoldhatóságot, amely 50100 mg/ml koncentrációt jelent.By the above process, a water-soluble primycin can be prepared in a highly reproducible manner, for which any product can be used as a starting material directly without any further purification, preferably lead-contaminated primycin. In our experience, lead has a beneficial effect on the yield of the water-soluble primycin complex, which is generally 80-85%, and on the maximum water solubility achievable, which is 50100 mg / ml.
Atomabszorpciós spektrofotometriás vizsgálataink szerint az „ólomszennyezett” gyári primicin-kompiex 6-10 ppm ólmot tartalmaz (Perkin-Elmer Mód. fo.). Ha a vízoldható primicint tisztított nem vízoldékony primicinből készítjük (EBRIMYCINR) a kitermelés csökken (50-60%), és a kapott termék maximálisan csak 5-10 mg/ml koncentrációban oldódik vízben.According to our atomic absorption spectrophotometry, the "lead-contaminated" factory primicin complex contains 6-10 ppm of lead (Perkin-Elmer Mod. Fo.). When water soluble primicin is prepared from purified non-water soluble primicin (EBRIMYCIN R ) the yield is reduced (50-60%) and the product obtained is only soluble in water at a maximum concentration of 5-10 mg / ml.
Ezért ha tisztított vízoldhatatlan primicint használunk kiindulási anyagként, akkor előnyös 15-20 ppm ólmot oldható vegyület formájában (előnyösen ólomacetát) a reakcióelegyhez adni.Therefore, when using purified water-insoluble primicin as a starting material, it is preferable to add 15-20 ppm of lead in the form of a soluble compound (preferably lead acetate) to the reaction mixture.
A vízoldható terméknek van még egy igen fontos és jellemző tulajdonsága. Azt tapasztaltuk, hogy vizes oldatban egy spontán gélesedési folyamat játszódik le, és ez a mindenkori hatóanyag koncentrációtól függ, hogy mennyi időt vesz igénybe. Az 1. ábrából látható, hogyThe water soluble product has another very important and characteristic property. It has been observed that an aqueous solution undergoes a spontaneous gelation process, and this depends on the concentration of the active ingredient at which time it takes. Figure 1 shows that
5-10 mg/ml koncentrációban 1-2 nap, 20-40 mg/ml anyagtartalom esetében kb. 6-12 óra, de 50 mg/ml-nél magasabb koncentrációnál már 1-2 óra is elegendő a teljes gélesedéshez. A hőmérséklet hatása a gélesedésre a 2. ábrán látható. Minden valószínűség szerint, a molekulában lévő OH-csoportok orientáció változásával van összefüggésben a vízoldékony termékek koncentráció-, hőmérséklet és időfüggő polimerizálhatósága.At 5-10 mg / ml for 1-2 days, at 20-40 mg / ml at ca. 6 to 12 hours, but at concentrations above 50 mg / ml, 1 to 2 hours are sufficient for complete gelling. The effect of temperature on gelation is shown in Figure 2. It is likely that concentration, temperature and time-dependent polymerization of water-soluble products are associated with a change in orientation of OH groups in the molecule.
A kialakult gél teljesen áttetsző, stabil és plusz oldószer hatására sem változik. E jellemző asszociációs tulajdonság lehetőséget nyújthat ún. polimerizált gélek vagy liofilezett hártyák alkalmazására olyan terápiás területeken, ahol igen nagy fontossággal bír a lokális magas hatóanyag koncentráció.The resulting gel does not change under the influence of completely translucent, stable and additional solvent. This characteristic association property may provide an opportunity for so-called. use of polymerized gels or lyophilized membranes in therapeutic areas where local high drug concentration is of great importance.
Felhasználva a vízoldható primicinnek ezt a gélképző tulajdonságát könnyen készíthetők magas hatóanyag-tartalmú kolloidális gyógyászati készítmények anélkül, hogy bármilyen ágenst alkalmaznánk. Elkerülhető a nem kívánt mellékhatású etilalkohol használata, amelyet a vízoldhatatlan primicin nagyobb hatóanyag koncentrációjának elérésére alkalmaznak.By utilizing this gel-forming property of water-soluble primicin, high-content colloidal pharmaceutical preparations can be readily prepared without the use of any agent. The use of ethyl alcohol, which is used to achieve higher concentrations of water-insoluble primicin, can be avoided.
Első közelítésben a találmány szerinti primicin a kiindulási anyagtól csupán a vízoldékonyságban különbözik. A megváltozott szolvatációs tulajdonságok révén viszont alapjaiban módosulhatnak az asszociációs viszonyok is, megváltozhatnak az ún. heterogenitási arányok, s ezáltal a primicin (amely egy többkomponens keverék) „hozzáférhetőbbé” válik. Nos, ez a „hozzáférhetőség”, a fenti jelenségek együttes hatása biztosította, hogy a viszonylag gyors és jól reprodukálható kromatografikus lépések alkalmazásával sikerült biológiailag aktív, kétkomponensű, ill. egykomponensű terméket izolálni.In the first approach, the primicin of the invention differs from the starting material only in its water solubility. However, due to the altered solvation properties, the association conditions can be fundamentally altered as well. heterogeneity ratios, thus making primicin (a multi-component mixture) more "accessible". Well, this "accessibility", the combined effect of the above phenomena, has ensured that the use of relatively fast and well reproducible chromatographic steps has resulted in a biologically active, two-component, or isolated one-component product.
A kétkomponensű vízoldékony primycin előállításánál kiindulási anyagként a már tárgyalt vízoldékony primicin komplex szerepelt. A primicin komplex komponenseinek elválasztására jelen esetben szilikagél oszlopkromatográfiát alkalmaztunk. A felhasznált szilikagél Kieselgel-60 (0,063-0,2 mm, ill. 0,2-0,5 mm). Ionmentes vízből történő többszöri dekantálás és mosás után az alkalmazott gélszuszpenziót vákuumbanThe starting material for the preparation of the two-component water-soluble primycin was the already discussed water-soluble primycin complex. In this case, silica gel column chromatography was used to separate the components of the primicin complex. The silica gel used was Kieselgel-60 (0.063-0.2 mm and 0.2-0.5 mm, respectively). After repeatedly decanting from the deionized water and washing, the gel suspension was applied under vacuum
HU 211 253 A9 buborékmentesítettük. Kromatográfiás oszlopként „flow adapter”-rel ellátott „Pharmacia” oszlopot (2,6x230 cm) alkalmaztunk. A folyamatos áramlást „Gilson” minipuls-2 négycsatornás perisztaltikus pumpával biztosítottuk. A kísérlet folyamatos ellenőrzését, frakciószedést, regisztrálást „Gilson” folyadék kromatográfiás berendezés (differenciál spektrofotométer Holochrome model HM, frakciószedő model 201, kétcsatornás szervopotenciometrikus rekorder model N2) szolgáltatta. A vízoldékony primicin felvitele vizes oldatból történt 5-10 mg/ml koncentrációban kromatogram (3. ábra).A9 was bubbled. The chromatography column was a "Pharmacia" column (2.6 x 230 cm) equipped with a flow adapter. Continuous flow was provided by a Gilson minipuls-2 four-channel peristaltic pump. Continuous monitoring of the experiment, fraction collection, and recording were performed by a Gilson liquid chromatography apparatus (Holochrome model HM differential spectrophotometer, Model 201 fractional, two-channel servopotentiometric recorder model N 2 ). The water-soluble primicin was plated from an aqueous solution at a concentration of 5-10 mg / ml (Figure 3).
Először vizes elúciót ill. mosást alkalmaztunk, melynek folyamán a primycin-komplex minor komponenseinek jelentős része eltávolítható (a 3. ábrán A-val jelzett). Az elúció folyamán az egyes csúcsfrakciókat vékonyréteg kromatográfia alkalmazásával ellenőriztük. (,Merck” DC-Alufolien vagy DC-Plastikfolien vagy DC-Plastikfolien Kieselgel 60 ^254 kész rétegeket alkalmaztunk.)First, aqueous elution or elution. washing, during which a significant amount of the minor components of the primycin complex can be removed (indicated by A in Figure 3). During the elution, each peak fraction was monitored by thin layer chromatography. ("Merck" DC-Alufolien or DC-Plastikfolien or DC-Plastikfolien Kieselgel 60 ^ 254 was applied.)
Szolvensként n-butilalkohol:etilalkohol:ecetsav:víz = 38:2:10:50 v/v elegyének felső fázisát (Partridge) használtuk, s a detektálásra az irodalomból ismert reagensek közül a vanilin-kénsavat (105 °C) alkalmaztuk. Az oszlopon kötődött anyagot, mely az (A3+A,) komponensek keverékét tartalmazta - a fenti Partridge elegy, vízzel készített 1 %-os oldatával eluáltuk. Ahogy az a 3. ábrából kitűnik először a még jelenlévő maradék minor komponensek eluálódnak, majd később az (A,) és (A3) komponensek, és végül az eluciogram leszálló tartományban a szennyezésként jelenlévő magasabb Rf értékkel jellemzett a korábbi szabadalmakban „B” komponensnek nevezett anyag eluálódik.The solvent used was the upper phase (Partridge) of n-butyl alcohol: ethyl alcohol: acetic acid: water = 38: 2: 10: 50 v / v, and vanillin sulfuric acid (105 ° C) was used for detection from reagents known in the art. The column-bound material containing the mixture of (A 3 + A,) components was eluted with a 1% solution of the above Partridge mixture in water. As shown in Figure 3, the remaining minor components, which are still present, elute, then components (A,) and (A 3 ), and finally the higher Rf in the descending range of the eluciogram, are characterized by component B in previous patents. said material elutes.
Az összegyűjtött csúcsfrakciókat bepároltuk, fokozatos dehidrálás (deszt. metanol, absz. metanol) után kis térfogatból absz. éterrel/acetonnal kicsaptuk. A kivált termék kétkomponensű, az (A3) és (At) komponensek keveréke amely vízoldható, biológiailag aktív termék. A termék kitermelése a kiindulási anyaghoz (vízoldható primicin) viszonyítva általában 50-60% aktív komponensű keverék olvadási pontja 165168 ’C.The collected peak fractions were evaporated and, after gradual dehydration (dist. Methanol, abs. Methanol), a small volume of abs. precipitated with ether / acetone. The precipitated product is a two-component mixture of (A 3 ) and (A t ) components which is a water soluble, biologically active product. The yield of the product, generally based on the starting material (water-soluble primicin), is generally 50-60%, m.p. 165168 ° C.
A fentiek után kísérletet tettünk a két főkomponens azaz (A3) és (Aj) szeparálására. Korábbi kísérleteink folyamán egyre inkább nyilvánvalóvá vált, hogy a két fő komponens közel azonos adszorptív tulajdonsággal jellemezhető, és így a teljes elválasztásuk hosszadalmas, nehezen kézben tartható folyamatot igényel, nem beszélve az igen nagymérvű anyagveszteségről.After the above, an attempt was made to separate the two main components, namely (A 3 ) and (Aj). In the course of our previous experiments, it became increasingly apparent that the two main components have nearly the same adsorptive property, and thus their complete separation requires a lengthy, difficult-to-handle process, not to mention very large amounts of material loss.
A primicin hatásmechanizmusának vizsgálatával kapcsolatos kutatásaink folyamán mindvégig nagy fontosságot tulajdonítottunk a primicin töltésszerkezetváltozásának. Hiszen a megváltozott töltésszerkezet alapvetően módosíthatja: 1. a primycin molekula membránorientáltságát (t. i. csakis egy diszkrét orientáció biztosíthatja pl. az antibakterális és toxikus hatások szétkapcsolását); 2. a molekula ill. az egyes komponensek adszorptív tulajdonságait.Throughout our research on the mechanism of action of primicin, we have attached great importance to the charge structure change of primicin. After all, the altered charge structure can fundamentally alter: 1. the membrane orientation of the primycin molecule (i.e., only a discrete orientation can provide, for example, a decoupling of antibacterial and toxic effects); 2. the adsorptive properties of each component.
A korábbi gélkromatográfiás [Sephadex (RTM) LH20] kísérletek eredményei arra engedtek következtetni, hogy a polaritási, s egyben az asszociációs viszonyok megváltozása jelentősen befolyásolhatja a primicin heterogenitását. Másszóval, az egyes csúcsfrakciók komponenseinek részaránya az alkalmazott oldószerrendszer dielektromos sajátságainak függvénye. Ezen kísérleti tapasztalatok és eredmények felhasználásával próbálkoztunk az ioncserés kromatográfia alkalmazásával, melynek egyik előnyösen alkalmazott változatát az alábbiakban közöljük.The results of previous gel chromatography (Sephadex (RTM) LH20) experiments suggested that a change in polarity as well as association could significantly influence primicin heterogeneity. In other words, the proportion of the components of each peak fraction depends on the dielectric properties of the solvent system used. Using these experimental experiences and results, we have tried to use ion exchange chromatography, a preferred version of which is given below.
Kiindulási anyagként az előzőekben tárgyalt kétkomponensű (A3)+(Aj) vízoldható primicin szolgált, melyet 4-5 mg/ml koncentrációjú vizes oldatban adagoltak az NH4-ciklusú karboxi-metil cellulóz oszlopra (CM-52 Cellulose, preswollen, „Whatman”; oszlopméret: 2,6x5 cm, „Pharmacia” Κ-26/flow adaptor). A kísérleti körülményeket és eluciogramot a 4. ábra szemlélteti.The starting material was the two-component (A 3 ) + (Aj) water-soluble primicin discussed above, which was added to an NH 4 -cyclo-carboxymethyl cellulose column (CM-52 Cellulose, preswollen, "Whatman") in an aqueous solution of 4-5 mg / ml. column size: 2.6 x 5 cm, Pharmacia Κ-26 / flow adapter). The experimental conditions and eluciogram are illustrated in Figure 4.
Vízzel történő kimosással először a „minor” („A”) komponenseket eluáltuk, 5-8 mM vizes ammóniumhidrokarbonáttal végeztük az elúciót, hogy megkapjuk a tiszta A3 komponenst.After washing with water, the "minor"("A") components were first eluted and eluted with 5-8 mM aqueous ammonium bicarbonate to give the pure A 3 component.
Az Aj komponens oszlopon marad. Az ammóniumhidrokarbonátos frakciókat összegyűjtöttük, és kevés n-butilalkohol hozzáadásával (habzásgátlás) közel szárazra pároltuk. Többszöri vizes mosás/bepárlás alkalmazása után (ammóniumhidrokarbonát eltávolítása) először deszt. metanollal, majd később absz. metanollal teljes dehidrálást végeztünk, s végül kis térfogatból absz. éterrel kicsaptuk az anyagot, melyet a szűrés folyamán kevés vízmentes acetonnal átmostunk.The Aj component remains on the column. The ammonium bicarbonate fractions were collected and evaporated to near dryness by the addition of a small amount of n-butyl alcohol (antifoam). After washing several times with water / evaporation (removal of ammonium bicarbonate), the product is first dried. methanol, followed by abs. complete dehydration with methanol and finally abs. ether precipitated and washed with a little anhydrous acetone during filtration.
A kiindulási kétkomponensű vízoldékony prmycinre számolt kitermelés általában 45-50%. Op. 159— 161 °C. A vízoldhatóság kb. 2-6 mg/ml.The yield of the starting two-component water-soluble prmycin is generally 45-50%. 159-161 ° C. Water solubility is approx. 2-6 mg / ml.
A csökkenést az olvadáspontban (a kiindulás keveréké (165-168 ’C) és a vízoldékonyságban (a kiindulási keverékben 40-60 mg/ml) a termékben maradt minimális mennyiségű kötött NH4 és NH4HCO3 okozhatja.The decrease can be caused by the minimal amount of bound NH 4 and NH 4 HCO 3 remaining in the product at the melting point (165-168 ° C of the starting mixture) and water solubility (40-60 mg / ml in the starting mixture).
A szennyezés eltávolítására az egykomponensű terméket vízben oldjuk és H+-ciklusú karboximetil-celulózra adagoljuk, s a teljes vizes elúció, ill. kimosás után a CM-cellulózt fokozatosan dehidráltuk deszt. metanol, ill. absz. metanol alkalmazásával.To remove the impurity, the one-component product is dissolved in water and added to H + -cyclo-carboxymethylcellulose, and the whole is eluted with water. after washing, CM cellulose was gradually dehydrated to distillate. methanol, respectively. abs. using methanol.
Végezetül a terméket 10 mM acetsav/absz. metanol eleggyel eluáltuk. Kis térfogatra történő bepárlás után absz. metanollal több ízben mostuk, és az ismételt bepárlás után, a terméket (A3) absz. acetonnal kicsaptuk. Üvegszűrőn (G-4) szűrtük és ismételt acetonos mosás után szárítottuk.Finally, the product was treated with 10 mM acetic acid / abs. eluted with methanol. After evaporation to a small volume, the abs. washed several times with methanol, and after repeated evaporation, the product (A 3 ) was abs. acetone precipitated. It was filtered through a glass filter (G-4) and dried after repeated washing with acetone.
Az így kapott A3 komponens tiszta, és az Op.: 164-166 ’C, vízoldékonysága kb. 50 mg/ml. Az ismételt ioncsere alkalmazása folytán az anyagveszteség maximum 10%.The resulting purity of the component 3, and the Mp .: 164-166 ° C, solubility in water of approx. 50 mg / ml. Repeated ion exchange results in up to 10% loss of material.
A másik vízoldható primycin komponenst, amely (A,) CM-52 cellulóz - NH4 oszlop ammóniumhidrokarbonátos eluálása után az oszlopon marad - a következőképpen választjuk el.The other water-soluble primycin component, which remains on the column after eluting the (A,) CM-52 cellulose with NH 4 column with ammonium bicarbonate, is as follows.
A szabad ammóniumhidrokarbonát teljes eltávolítása érdekében az oszlopot vízzel mossuk, majd fokozatosan dehidráljuk először deszt. metanollal, majd később absz. metanollal. Az anyag elúcióját absz. meta4To completely remove the free ammonium bicarbonate, the column is washed with water and then gradually dehydrated first on a distillate. methanol, followed by abs. methanol. Elution of the substance abs. meta4
HU 211 253 A9 nolban oldott 10 mM ecetsavval végezzük. Kis térfogatra történő bepárlás után, többszöri absz. metanolban történő újraoldást alkalmazunk, majd ismételt bepárlást a szabad ecetsav eltávolítása érdekében. Végezetül vízoldékony primicint kis térfogatból absz. acetonnal kicsapjuk. így a tiszta (Aj) primicin komponenst kapjuk meg, amely vízben jól oldódik, Op.-ja 167-168 ’C. E komponens esetében utólagos ioncsere nem szükséges, mert az ecetsavas elúció folyamán a maradék és „kötött” NH4, ill. NH4HCO3 ammóniumacetát formában eluálódik, és az acetonos kicsapás folyamán oldatban marad.This was done with 10 mM acetic acid in A9. After evaporation to a small volume, multiple abs. redissolution in methanol followed by repeated evaporation to remove the free acetic acid. Finally, water-soluble primicin is absent from a small volume. acetone is precipitated. This gives the pure (Aj) primicin component which is highly soluble in water, m.p. 167-168 ° C. No additional ion exchange is required for this component since residual and "bound" NH 4 and / or NH4 are removed during acetic acid elution. NH 4 HCO 3 elutes in the form of ammonium acetate and remains in solution during acetone precipitation.
A találmány szerint a nem vízoldékony primycin komplexből vízoldékony primycin komplexet állítottunk elő, melynek felhasználásával (A3 és A]) együttesen tartalmazó vízoldható primicint, majd a komponensek szétválasztásával egykomponensű vízoldható termékeket állítottunk elő. A találmány szerint előállított termék vízoldékony és biológiailag aktív. A biológiai értékmérés és a vékonyrétegkromatográfia összehasonlító eredményeit az 5. ábra tartalmazza.According to the present invention, a water-soluble primycin complex was prepared from the non-water-soluble primycin complex using water soluble primycin (A 3 and A 1) together, and then separating the components into one-component water-soluble products. The product of the present invention is water soluble and biologically active. The comparative results of the biological measurement and the thin layer chromatography are shown in Figure 5.
A vékonyrétegkromatografálást Kieselgel 60 DC Alufólia F254 lapon végezzük el, futtatást butanohetanohecetsav és víz 38:2:10:50 súly%-os oldatának felső fázisával végeztük, és az előhívást kénsavas vanilinnel 105 ’C-on hajtottuk végre. A biológiai értékmérést agardiffúziós technikával végeztük. Bacillus subtilis testorganizmust használtunk. A biológiai értékmérésnél mért MIC értékeket az alábbi Π. táblázatban foglaljuk össze:Thin layer chromatography was carried out on a Kieselgel 60 DC Aluminum Foil F 254 sheet, run on the upper phase of a 38: 2: 10: 50% w / w solution of butanohetanoic acetic acid and water and developed at 105 ° C with sulfuric vanillin. Biological values were measured by agar diffusion technique. Bacillus subtilis test organism was used. The MIC values for biological measurements are as follows Π. table:
II. táblázatII. spreadsheet
A biológiai értékmérés eredménye azt mutatja, hogy a komponensek aktivitása különböző. Ez a különbség arra utal, hogy az egyes komponensek antibakteriális hatásukat különböző módon fejtik ki, vagy lehetséges, hogy különböző támadásponton hatnak az élő szervezetre. Ez magyarázza azt a tényt, hogy az egyes komponensek szinergista hatással lehetnek egymásra. (Lásd pl. 196 309 sz. magyar szab. leírás). Az (AJ és (A3) komponensek és azok keveréke gélesedési tulajdonságát vizsgáltuk. Azt tapasztaltuk, hogy egy adott koncentráció esetén, időben csökken a gélesedés sebessége. Míg az egykomponensű termékek vizes közegben 5-10 mg/ml koncentrációban napokig eltarthatok (maximum egy hét) minden különösebb változás nélkül, addig pl. a kétkomponensű primicin esetében 1-2 nap, a vízoldható komplexnél pedig kevesebb, mint 24 órán belül bekövetkezik a gélesedés. Valószínűnek tartjuk, hogy a vízoldékony termékek időfüggő gélesedése konformációváltozással, ill. a hidroxil-csoportok orientációjával van összefüggésben.The result of the biological measurement shows that the activity of the components is different. This difference implies that each component exerts its antibacterial effects in different ways, or it is possible that they act on the living organism at different points of attack. This explains the fact that each component can interact synergistically. (See, e.g., Hungarian Patent Specification 196 309). The gelling properties of the (AJ and (A 3 ) components and their mixtures were tested. We found that at a given concentration, the rate of gelling decreases over time. While mono-component products in aqueous media may last for days (up to a week) ) without any significant change, for example, in the case of the two-component primicin, gelling occurs within 1-2 days, and in the water-soluble complex less than 24 hours, it is probable that the water-soluble products are time-dependent gelling with conformational change or orientation of hydroxyl groups is related.
Korábbi adatokból ismert a primicin nagyfokú elektrolit érzékenysége. Összhangban mind ezzel, mind a primicin ionofor tulajdonságával - saját kísérleteink szerint kationokkal reveltálható a hidroxil-csoportok orientációja, miközben nagymértékben, reverzibilisen csökken a primicin oldékonysága. Ugyanakkor megfelelő koncentrációban alkalmazott cukoroldatban (pl. izot. glukóz) mind a polimerizáció, mind az elektrolit (kation) érzékenység nagymértékben kivédhető.High sensitivity of primicin is known from previous data. Consistent with both this and the properties of primicin ionophore, our experiments have shown that cations can reverse the orientation of hydroxyl groups while greatly reducing the solubility of primicin. However, in a suitable concentration of a sugar solution (e.g., isot. Glucose), both polymerization and electrolyte (cation) sensitivity can be greatly prevented.
A 6. ábra a vízoldható primicin normál 13C-NMR spektrumát mutatja be (c = 500 mg/400 ml metanol-d4, Τ = 323K).Figure 6 shows a normal 13 C-NMR spectrum of water-soluble primicin (c = 500 mg / 400 mL methanol-d 4 , Τ = 323K).
A 7. ábra az (A,) és (A3) kétkomponensű elegy normál protonkioltó 13C-NMR spektrumát mutatja be. (c = 250 mg/1,5 ml metanol-d4, Τ = 323K, NS = 3000).Figure 7 shows a 13 C-NMR spectrum of a normal proton quencher of a (A,) and (A 3 ) binary mixture. (c = 250 mg / 1.5 mL methanol-d 4 , Τ = 323K, NS = 3000).
A 8. ábra az (AJ komponens normál protonkioltó i3C-NMR spektrumát mutatja be (c = =100 mg/400 ml metanol-d4, T-323K, NS = 5000).Figure 8 shows the (AJ component normal protonkioltó i3 C-NMR spectrum (c = 100 mg / 400 ml of methanol-d 4, T 323km, NS = 5000).
A 9. ábra az ammónium acetát tartalmú (A3) komponens 13C-NMR spektrumát mutatja be; a spektrum felvételnél EPT pulse frekvenciát használtak, (c = 50 mg/400 ml metanol-d4, Τ = 323K, NS-2000).Figure 9 shows the 13 C-NMR spectrum of the ammonium acetate-containing component (A 3 ); spectra were recorded using an EPT pulse frequency (c = 50 mg / 400 mL methanol-d 4 , Τ = 323K, NS-2000).
A 10. ábra az ammónium acetát tartalmú (A3) komponens normál protonkioltó l3C-NMR spektrumát mutatja be, (c = 50 mg/400 ml metanol-d4, Τ = 323K, NS = 2700).Figure 10 shows a 13 C-NMR spectrum of ammonium acetate-containing component (A 3 ) normal (c = 50 mg / 400 mL methanol-d 4 , Τ = 323K, NS = 2700).
All. ábra az (Aj) komponens protonkioltó 13CNMR spektrumát mutatja be. (c = 80 mg/400 ml metanol-d4, Τ = 323K, NS = 2700).All. This figure shows (Aj) component protonkioltó 13 C NMR spectra. (c = 80 mg / 400 mL methanol-d 4 , Τ = 323K, NS = 2700).
A spektrumok adataiból az alábbiakat állapíthatjuk meg. A vízoldékony primicin előállításánál alkalmazott reakció során semmiféle gyűrűzáródás nem jön létre. A 13C-NMR spektrum alapján egyértelműen megállapítható, hogy a vizsgált molekula négy kvatemer szénatomot tartalmaz. A karbonil-szén 176,7 ppm-nél található. A guanidin-csoport kvatemer szénatomja 158,8 ppm-nél, és a maradék két kvatemer szénatom pedig 145,7, ill. 135,8 ppm-nél jelentkezik (6. ábra).From the data of the spectra the following can be stated. The reaction used to prepare the water soluble primicin does not result in any ring closure. The 13 C-NMR spectrum clearly shows that the molecule under study contains four quaternary carbon atoms. Carbonyl carbon is found at 176.7 ppm. The guanidine group has a quatemeric carbon atom of 158.8 ppm and the remaining two quatemeric carbon atoms of 145.7 and 148.8 ppm, respectively. It occurs at 135.8 ppm (Figure 6).
A korábbiakban feltételezett gyűrűzáródás még további két kvatemer szénatom jelenlétét igényelné.The previously assumed ring closure would require the presence of two more quaternary carbon atoms.
Az alkalmazott „kondenzációs reakció” folyamán az NMR spektrumok szerint - nagy valószínűséggel egy intermedier keletkezik (6. ábra, 170,4 ppm-nél jelentkező kvatemer karbonil-jel). A jel csak abban az esetben jelentkezik, ha a primycint, abszolút oldószeres rendszerből preparáltuk. A továbbiakban vizes közegben kromatografáljuk, melynek során a feltételezett intermedier hidrolízise vagy szelektív adszorpciója révén már nem látható a fenti jel.During the "condensation reaction" used, NMR spectra most likely produce an intermediate (Figure 6, quaternary carbonyl signal at 170.4 ppm). The signal only appears if primycin was prepared from an absolute solvent system. Further, it is chromatographed in an aqueous medium in which the above signal is no longer visible by hydrolysis or selective adsorption of the putative intermediate.
A továbbiakban a 13C-NMR spektrum szerkesztés alapján (DEPT), valamint a J-modulált spin-echo technika alkalmazásával meghatároztuk a fő komponensekben jelenlévő különböző rendű (kvatemer-, CH-, CH2-, CH3-) szénatomok számát. így a vizsgált molekulában négy kvatemer szén található (a kémiai eltolódás értékét lásd fentebb), továbbá 22 metin-szén (105,6 ppm-nél az arabinóz anomer szene és 129,1, ill.Number of carbon atoms according to 13 C NMR spectrum editing (DEPT), and the use of J-modulated spin-echo technique Hereinafter, present in the major components of different orders (- -, CH3 kvatemer-, CH, CH 2) was determined. Thus, the molecule under study contains four quaternary carbons (see above for chemical shifts) and 22 methine carbons (at 105.6 ppm, the anomeric carbon of arabinose and 129.1, respectively).
124,9 ppm-nél a két telítetlen kötés CH-szene találha5At 124.9 ppm, CH is found in the two unsaturated bonds5
HU 211 253 A9 tó), 22-23 metilénszén (e bizonytalanságot a hasonló kémiai környezetben lévő metilén-szenek jeleinek véletlen egybeesése okozza), és végül 6 metilén-szén.A9), 22-23 methylene carbon (this uncertainty is caused by the coincidence of the signals of methylene carbons in a similar chemical environment), and finally 6 methylene carbon.
Ennek alapján megállapítható, hogy a vízoldékony primycin komplex fő komponenseinek összegképlete gyakorlatilag megfelel a már korábban közölt irodalmi adatokkal. A vízoldható primycin-komplex NMRspektrumában két epimer jelei különülnek el, amelyek az OH-, CH3- és butil-csoport szubsztituensek eltérő térállása miatt, kémiai eltolódás révén doublet (kettős jel) formájában tükröződnek.Based on this, it can be concluded that the sum of the main components of the water-soluble primycin complex is practically in accordance with previously published literature data. In the NMR spectrum of the water-soluble primycin complex, two epimeric signals are distinguished, which are reflected by a chemical shift in the form of doublets due to the different positions of the OH, CH 3 and butyl groups.
OH-csoportok a 4, 8, 12, 16, 28, 30, 32, 34, 36, valamint a 21' helyekenOH groups at positions 4, 8, 12, 16, 28, 30, 32, 34, 36 and 21 '
CH3-csoportok a 3, 15, 21, 23, és a 20' helyeken CH3 groups at 3, 15, 21, 23, and 20 'locations
-CH2-CH2-CH2-CH3 (butil)-csoport a 17. Csatomnál.-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 (butyl) at C 17.
Összehasonlítva a 6. és 7. ábrát megállapítottuk, hogy a főkomponensek súlyaránya változó; a vízoldható primicinben az (A3) komponens nagyobb mennyiségben található (lásd 6. ábra), míg az (Aj) komponens van túlsúlyban a kétkomponensű elegyben. A komponensek mennyiségi arányainak változása összhangban van a vékonyréteg kromatográfiás eredményekkel (5. ábra).Comparing Figures 6 and 7, it was found that the weight ratio of the main components is variable; water soluble primycin (A 3) component in large amounts (see figure 6), while (j) is the predominant component is a two-component mixture. The change in the quantitative proportions of the components is consistent with the results of TLC (Figure 5).
A 13C-NMR spektrumok alapján (10. ill. 11. ábrák) látható, hogy a két fő komponens az (A3 és A]) szénatomjainak számát tekintve gyakorlatilag azonosnak mondható azzal a megjegyzéssel, hogy a metilén-szenek - a már korábban említett bizonytalanságok miatt - egy szénatom számban differencia lehet.From the 13 C-NMR spectra (Figures 10 and 11) it can be seen that the two main components are practically identical in terms of the number of carbon atoms (A 3 and A 1), with the observation that the methylene carbons due to these uncertainties, one carbon atom may be different in number.
A két fő komponens megfelelő szénatomjainak kémiai eltolódásaiban észlelt minimális differenciák (melyek esetenként gyakorlatilag elhanyagolhatóak) arra utalhatnak, hogy a két fő komponens között lényeges különbség nincs, esetleg konformációbeli különbség, ill. monomer-dimér kölcsönhatás kialakulhat (8. ábra).Minimum differences (sometimes negligible) in the chemical shifts of the corresponding carbon atoms of the two major components may indicate that there is no significant difference, or perhaps conformation difference, between the two main components. monomer-dimer interaction may occur (Figure 8).
A találmányunk tárgyát képező eljárás részleteit (anyagok, módszerek, metodikai megoldások stb.) az alábbi példákban ismertetjük.Details of the process (materials, methods, methodological solutions, etc.) of the present invention are described in the following examples.
Anyagok és módszerekMaterials and Methods
Kísérleteink során alkalmazott oldószerek, vegyszerek mind analitikailag legtisztább készítmények voltak (Merck, Fluka, Reanal, Whatman, MachereyNagel Co., Sigma).The solvents and chemicals used in our experiments were all analytically pure (Merck, Fluka, Reanal, Whatman, MachereyNagel Co., Sigma).
Egyes oldószerek tisztítását, vagy további tisztítását (abszolutálás) magunk végeztük. A vízmentes oldószereket molekulaszitán (molecular siever 3-4 A) tároltuk.Some solvents were purified or further purified (absolute) by ourselves. The anhydrous solvents were stored on a molecular sieve (3-4 sieve).
Az oszlopkromatografikus elválasztások esetében az alábbi termékeket alkalmaztuk: Kieselgel-60 (0,062-0,2; ill. 0,2-0,5 mm).The following products were used for column chromatography separations: Kieselgel-60 (0.062-0.2 and 0.2-0.5 mm).
Karboximetilcellulóz MN 2100 CM „Macherey-Nagel” és CM-52, preswollen microgranuler „Whatman”.Carboxymethylcellulose MN 2100 CM Macherey-Nagel and CM-52 preswollen microgranuler Whatman.
A vékonyrétegkromatográfia alkalmazott rétegei a következők voltak:The layers used for TLC were as follows:
DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 20x20 cm/0,2 mm „Merck” No: 5554DC-Alufolien Kieselgel 60 F 254 20x20 cm / 0.2 mm Merck No: 5554
DC-Plastikfolien Kieselgel 60 F254 20x20 cm/0,2 mm .Merck” No: 5735DC-Plastic Film Kieselgel 60 F 254 20x20 cm / 0.2 mm .Merck ”No: 5735
Polygram Sil. G/UV254 20x20 cm/0,25 mm „Macherey-Nagel”Polygram Sil. G / UV 254 20x20cm / 0.25mm Macherey-Nagel
Folydékkromatográfiás berendezés: „Gilson” Medical Electronics, differenciál spektrofométer (UVmonitor, Holochrome HM, frakciókollektor, model 201, regisztráló, model N2, Minipuls-2 perisztaltikus pumpa).Liquid chromatography equipment: "Gilson" Medical Electronics, differential spectrophotometer (UV monitor, Holochrome HM, fraction collector, model 201, recorder, model N 2 , Minipuls-2 peristaltic pump).
A vékonyréteg kromatogram indikálását, módosított vanilinkénsav reagenssel végeztük. 250 mg p. a. vanilint 100 ml absz. etilalkoholban oldottunk. -10 '’Cra történő hűtés után 2,5 ml cc. kénsavat csepegtettünk az oldathoz. Spray (hajtógáz: nitrogén) vagy a reagensen történő áthúzás (merítés) formájában alkalmaztuk. A rétegeket hideg levegőáramban történő szárítás után 105 ’C-on 1-2 percig aktiváltuk.The thin layer chromatogram was indicated with modified vanillin sulfuric acid reagent. 250 mg p. the. vanillin 100 ml abs. dissolved in ethyl alcohol. After cooling to -10 ° C, 2.5 ml cc. sulfuric acid was added dropwise to the solution. Spray (propellant: nitrogen) or reagent dip (immersion). After drying in a stream of cold air at 105 ° C, the layers were activated for 1-2 minutes.
A „Sakaguchy” reakciót két változatban alkalmaztuk:The Sakaguchy reaction was used in two variants:
i) a kellően megszárított rétegeket 8-OH-kinolin(i) sufficiently dried layers, 8-OH-quinoline
0,2%-os acetonos oldatával hidegen kezeltük, majd szárítás után (hideg levegőáramban) 0,2% Br2-t tartalmazó 0,5 N nátrium-hidroxiddal a rétegeket lefújtuk, és hidegen szárítottuk.After being treated with 0.2% acetone in cold solution, the layers were blown dry and freeze dried (in cold air flow) with 0.5 N sodium hydroxide containing 0.2% Br 2 .
ii) 2,5 g nátrium-hidroxidot oldunk 5 ml vízben. Hűtés után (2-5 ’C) 45 m előre hűtött metanollal hígítjuk, majd szűrjük és 50 mg 8-OH-kinolint benne feloldunk. Ez képezi az egyik reagenst. A másik esetében 50 ml 10%-os, előhűtött (2-5 ’C) etilalkoholban 250 mg N-brómszukcinimidet oldunk. A lapok kezelését az i) változat szerint végezzük. Kísérleteink során több ízben alkalmaztunk Sakaguchy-reakciót oldatban lévő primicin kimutatására. Ebben az esetben az irodalomban már leírt mikrokémiai módszert alkalmaztuk az alábbi módosítással. A méréseket N-brómszukcinimiddel (NBS) végeztük.ii) Dissolve 2.5 g of sodium hydroxide in 5 ml of water. After cooling (2-5 'C), it is diluted with 45 m of pre-cooled methanol, filtered and dissolved in 50 mg of 8-OH-quinoline. This forms one of the reagents. In the other case, 250 mg of N-bromosuccinimide were dissolved in 50 ml of 10% pre-cooled (2-5'C) ethyl alcohol. The sheets are treated according to variant i). In our experiments, the Sakaguchy reaction was used several times to detect primicin in solution. In this case, the microchemical method already described in the literature was used with the following modification. Measurements were made with N-bromosuccinimide (NBS).
A standard hígítási sort argininre vettük fel, és a kialakult színt 520 nm-nél Optonspektrofométerben mértük. Az alkalmazott reagensek, melyeket minden esetben frissen készítettünk a következők:The standard dilution series was recorded on arginine and the resulting color was measured at 520 nm in an Opton Spectrometer. The reagents used, freshly prepared in each case, are as follows:
1. 0,01%-os lúgos alfa-naftiol, amely 0,2%-os alfanaftol etanolos oldatából készült 10%-os NaOH vizes oldatával történő hígítással.Claims 1. An alpha-naphthiol, 0.01% alkaline, which is diluted in an aqueous solution of 0.2% alpha-naphthol in 10% aqueous NaOH.
2. 0,45%-os NBS oldat (10%-os etilalkoholban)2. 0.45% NBS solution (in 10% ethyl alcohol)
3. 40%-os, vizes karbamid oldat.3. 40% aqueous urea solution.
A meghatározásokat 0 ’C-on végeztük, eltérve az irodalomban leírtaktól, a reakcióelegy térfogata 1,7 ml volt, mely a következőket tartalmazta:The assays were performed at 0 'C, in contrast to the literature, and the volume of the reaction mixture was 1.7 mL containing:
ció különböző alkoholokra és általában oxo-vegyületekre igen érzékeny. így pl. a primycin esetében már 20% alkohol tartalom (metil-, etil-) az 520 nm-nél mért extinkció jelentős csökkenését eredményezi. E csökkenés viszont nem a kialakult színintenzitással, hanem annak spektrális eltolódásával van összefüggésben (alacsonyabb hullámhossz felé tolódás).The reaction is highly sensitive to various alcohols and generally to oxo compounds. so e.g. in the case of primycin, a 20% alcohol content (methyl, ethyl) results in a significant reduction of the extinction at 520 nm. However, this decrease is not related to the color intensity formed, but to its spectral shift (shift towards a lower wavelength).
Abban az esetben, amikor a primycint nem tiszta vízben, hanem szerves oldószerben vagy keverékben (pl. butanoketanokvíz = 1:1:2) oldjuk, a Sakaguchy-reakció által kialakult jellemző szín a butanolos fázisbaWhen primycin is not dissolved in pure water, but dissolved in an organic solvent or mixture (e.g., 1: 1: 2 butanoketanoic water), the typical color formed by the Sakaguchy reaction into the butanol phase
HU 211 253 A9 kvantitatíve átrázható, mely fázis színének abszorpciós maximuma 480 nm.A9 is quantitatively translucent with a phase color absorption maximum of 480 nm.
A primicin biológiai értékmérését agardiffúziós technikával végeztük. Tesztorganizmusként Bacillus subtilis ATCC 6633-t használtunk.The biological value of primicin was measured by agar diffusion technique. Bacillus subtilis ATCC 6633 was used as test organism.
A B. subtilis (ATCC 6633) tenyésztésére alkalmazott táptalaj (Schaeffer-táptalaj, Nutrient Both No. 2/oxid) összetétele:Composition of B. subtilis (ATCC 6633) medium (Schaeffer's medium, Nutrient Both No. 2 / Oxide):
Beef extrakt 3,2 gBeef extract 3.2 g
Pepton 3,2 gPepton 3.2 g
NaCl 1,6 gNaCl 1.6 g
MgSO4-7H2O 0,25 gMgSO 4 -7H 2 O 0.25 g
KC1 1,0 gKCl 1.0 g
FeSO47H2O 278gg(10^M)FeSO 4 7H 2 O 278 µg (10 ^ M)
900 ml vízben oldva.Dissolved in 900 ml of water.
A kész oldatot 30 percig 1,5 atm. nyomáson autoklávozzuk, majd a pH-t 7,0-7,2-re állítjuk 10 N NaOH-val (5-6 csepp) és 90 ml-ként szétöntjük a megfelelő tárolóedényekben és mindegyikhez 10-10 ml-t adunk az alábbi oldatokból:The final solution was 1.5 atm for 30 minutes. autoclave under pressure, adjust the pH to 7.0-7.2 with 10 N NaOH (5-6 drops) and dispense as 90 ml in appropriate containers and add 10 to 10 ml of each of the following solutions. :
a) Ca(NO3)2-4H2O 236 mg (10-3 M) 100 ml deszt. vízbena) Ca (NO 3 ) 2 -4H 2 O 236 mg (10 -3 M) in 100 mL dist. water
b) MnCl2 4H2O 1,979 mg (10-5 M) 100 ml deszt. vízbenb) MnCl 2 4 H 2 O 1.979 mg (10 -5 M) in 100 mL dist. water
a pH-t beállítani 8-ra. A még meleg oldatot szűrjük, és kihűlés után 900 ml deszt. vizet adunk hozzá, és literenként 20 g agart (Bacto Agár „Difco”), melyet Kochfazékban oldunk, és az oldat pH-ját még meleg állapotban ismételten ellenőrizzük. A kész oldatot 100 miként szétöntjük a megfelelő tárolóedényekbe, ésadjust the pH to 8. The still warm solution was filtered and after cooling, 900 ml of distillate was added. water is added and 20 g / l of agar (Bacto Agar "Difco") are dissolved in Kochfaze and the pH of the solution is checked again while still warm. The final solution is dispensed 100 into appropriate containers and
1,5 atm. nyomáson 20 percig autoklávozzuk.1.5 atm and autoclaved for 20 minutes.
A titráló lemezeket a fenti táptalajból készítettük oly módon, hogy annak 100 ml-es mennyiségét alkalmanként vízfürdőben felolvasztjuk, majd a 40-50 ’Cra visszahűtött, még folyékony táptalajba 0,5 ml B. subtilis (ATCC 6633) tenyésztett spóraszuszpenziót óvatosan belekeverünk. Végül mindezt üvegtálcára (30x30x3 cm méretű, 3-4 mm-es falvastagságú üveglemezből szilikongumi ragasztással készült tepsi) öntjük, s a megdermedt agarlemezbe 0,5-1 órás 37 ’C-on történő preinkubálás után 42 db 10 mm átmérőjű lyukakat vágunk.Titration plates were prepared from the above medium by occasionally thawing a 100 ml volume of water in a water bath and then carefully adding 0.5 ml of B. sp. Finally, all of this is poured into a glass tray (30x30x3 cm baking sheet made of 3-4 mm thick glass plate with silicone rubber adhesive) and after preincubation of the frozen agar plate for 0.5-1 hour at 37 ° C, 42 holes of 10 mm diameter are cut.
A vizsgálandó anyagokból 20-50 pg/ml hatóanyagtartalmú oldatot készítünk [kiindulási vízoldhatatlan primicin, vízoldékony primicin, (Aj) és (A3) komponens keveréke, (Aj) és (A3) komponens] vízben, vagy butanol:etanol:víz = 1:1:2 oldószerrendszer. Ezekből deszt. vízzel/pufferrel (0,15 M foszfát puffer, pH 7,6) 0,05-0,1,0,5-1,0, ill. 2,0 pg/ml koncentrációjú hígításokat készítettünk. Ezekből párhuzamosonként 0,1— 0,1 ml-t a titráló tápagar lemezen lévő lyukakba helyezünk. A 18-20 órás inkubálás (termosztátban, 37 ’Con) után a biológiai aktivitásnak megfelelően kialakult diffúzív kioltási gyűrűk (zónák) átmérőit lemérve (mm), és a nyert értékeket a standard hígítást sor koncentrációinak függvényében szemi-logaritmikusan ábrázolva, az ismeretlen aktivitásoknak megfelelő értékeket extrapolálunk.The test substances from 20-50 pg / mL drug-containing solution [starting primycin is insoluble in water, a mixture of water soluble primycin, (j) and (3) component (Ai) and (A3) component] in water or a butanol: ethanol: water = 1: 1: 2 solvent system. From these, dist. water / buffer (0.15 M phosphate buffer, pH 7.6) 0.05-0.1.0.5-1.0, respectively. Dilutions of 2.0 pg / ml were prepared. 0.1 ml to 0.1 ml of each is placed in duplicate in wells of the titration plate. After incubation for 18-20 hours (in a thermostat, 37 'Con), the diameters of the diffuse quench rings (zones) formed in accordance with the biological activity were measured (mm) and plotted against semi-logarithmic concentration versus unknown dilutions. values are extrapolated.
PéldákExamples
1. példaExample 1
Vízoldékony primicin komplex előállításaPreparation of water soluble primicin complex
250 ml-es, csiszolatos gömblombikba 500 mg (0,46 mM) jól elporított primicint (Pb. szennyezett) és 100 ml absz. etilalkoholt teszünk és nátronmész CaCl2-os csővel ellátott visszafolyós hűtővel refluxáljuk az elérhető maximális oldódásig (kb. 15-30 perc). Ezután 50 μΐ ciánecetsavetilésztert (0,46 mM) adunk a rendszerhez, melyet kevés absz. etanollal bemosunk. 15 perces reflux után összesen 25 mg nátriummetilátot (0,46 mM) három közel egyenlő részletben, 30 perces időeltolódással a reakcióelegyhez adjuk. Minden egyes részletet kevés (1-2 ml) desztillált etilalkohollal 96% bemosunk. Már az első adat nátriummetilát után észrevehetően tisztul a reakcióelegy, fokozatosan feloldódik a primicin teljes menynyisége, és a reakció közeg halvány rózsaszínű lesz. A reakció idő (4 óra) leteltével az elegyet kihűlés után szűrjük (G-4), majd kis térfogatra bepároljuk (RotavaporR 110, „Büchi”). Ezután absz. metil-alkohol alkalmazásával fokozatosan lecseréljük a reakció közeg etanol tartalmát oly módon, hogy a kis térfogatra történő bepárlás után, mindig absz. metanolban oldjuk a kivált terméket. Ezzel azt érjük el, hogy a kezdetben az absz. etanolban csak korlátozottan oldódó termék az absz. metanolban olyannyira oldhatóvá válik, hogy néhány ml-ben is oldatban marad. E maradék, néhány ml-es absz. metanolos közegből absz. éterrel kicsapjuk az anyagot. Szűrjük (G-4 üvegszűrő), absz. acetonnal mossuk és szárítjuk (vákuum szárítópisztoly, blaugel, kloroform/etanol fp: 6570 ’C).In a 250 ml round-bottomed flask, 500 mg (0.46 mM) of well-powdered primicin (Pb. Contaminated) and 100 ml of abs. ethyl alcohol and refluxed with a soda lime CaCl 2 tube until maximum dissolution is achieved (about 15-30 minutes). Then, 50 μΐ of cyanoacetic acid ethyl ester (0.46 mM) was added to the system with little abs. wash with ethanol. After reflux for 15 minutes, a total of 25 mg of sodium methylate (0.46 mM) was added to the reaction mixture in three almost equal portions with a time shift of 30 minutes. Each portion was washed 96% with a small amount (1-2 mL) of distilled ethyl alcohol. Already after the first data, the reaction mixture becomes noticeably clearer, the total amount of primicin gradually dissolves, and the reaction medium becomes pale pink. At the end of the reaction time (4 hours), the mixture was cooled (G-4) after cooling and concentrated to a small volume (Rotavapor R 110, "Büchi"). Then abs. with methanol, the ethanol content of the reaction medium is gradually changed so that after evaporation to a small volume, it is always abs. dissolved in methanol. This achieves that the abs. the product which has only a limited solubility in ethanol is the abs. it becomes so soluble in methanol that it remains in solution in a few ml. These residual, a few ml abs. from methanolic medium abs. precipitate with ether. Filter (G-4 glass filter), abs. washed with acetone and dried (vacuum drying gun, blaugel, chloroform / ethanol bp: 6570 ° C).
Kitermelés 410 mg (82%) vízoldható primicin (vékonyréteg kromatogramja az 5. ábrán látható). Vízoldhatóság: 50 mg/ml. Op.: 162-164 ’C. Biológiai aktivitás: 0,08-0,2 μ g/ml B. subtilis.Yield: 410 mg (82%) of water soluble primicin (thin layer chromatogram shown in Figure 5). Water solubility: 50 mg / ml. Mp 162-164 ° C. Biological activity: 0.08-0.2 μg / ml B. subtilis.
2. példaExample 2
Kétkomponensű vízoldékony primicin előállításaPreparation of a two component water soluble primicin
Kiindulási anyagként az 1. példában szereplő vízben oldható primicin szolgált. A primicin fő-komponenseinek elválasztására szilikagél oszlopkromatográfiát alkalmaztunk. Aszilikagélt (Kieselgel 60,0,2-0,5 mm) ionmentes vízzel többszöri mosással és dekantálással tisztítottuk, és a már homogén gélszuszpenziót az oszlopkészítés előtt vákuumban (vízlégszivattyú) buborékmentesítettük. 2,6x230 cm „Pharmacia” flow adapternél ellátott oszlopot megtöltöttünk szilikagéllel. Anyagfelvitel: 500 mg vízoldható primicin folyamatosan adapteren át, 510 mg/ml vizes oldatban (melyet előzőleg G-3 üvegszűrőn szűrtünk) történt. Ezután vizes elúciót alkalmaztunk. Áramlási sebessége 130 ml/óra volt, azaz 25 ml/ó/cm2. A frakció térfogat: 24 ml.The water-soluble primicin of Example 1 was used as starting material. Silica gel column chromatography was used to separate the primary components of primicin. The silica gel (Kieselgel 60.0.2-0.5 mm) was purified by washing and decanting several times with deionized water and the already homogeneous gel slurry was vacuum-blown prior to column preparation. A 2.6 x 230 cm column with a Pharmacia flow adapter was filled with silica gel. Application: 500 mg of water-soluble primicin was continuously passed through an adapter in 510 mg / ml aqueous solution (previously filtered through a G-3 glass filter). Aqueous elution was then applied. The flow rate was 130 ml / h, i.e. 25 ml / h / cm 2 . Fraction volume: 24 ml.
A kísérleti körülményeket és az eluciogramot a 3. ábra szemlélteti.The experimental conditions and the eluciogram are illustrated in Figure 3.
HU 211 253 A9HU 211 253 A9
A vizes mosás befejezése után a kétkomponensű A3-A, primicint a Partridge keverék (n-butanol:etanol:ecetsav:víz - 38:2:10:50 arányú elegyének felső fázisa) 1%-os vizes oldatával eluáltuk. Az elúció folyamán az egyes csúcsfrakciókat vékonyrétegen ellenőriztük. A két komponenst tartalmazó csúcsfrakciókat összegyűjtöttük, kevés normál n-butilalkohol hozzáadásával (habzásgátlás) kis térfogatra töményítettük (Rotavapor), majd fokozatosan dehidrálást végeztünk, először deszt. metanol, majd absz. metanol alkalmazásával. Végül kis térfogatból a kétkomponensű terméket absz. éterrel, acetonnal mostuk, szárítópisztolyban szárítottuk. Kitermelés 260 mg (52%), Op.: 165-168 ’C, vízoldhatóság: 50 mg/ml, biológiai aktivitás: 0,050,1 pg/ml (B. subtilis).After completion of the aqueous wash, the two-component A 3 -A, primicin was eluted with a 1% aqueous solution of the Partridge mixture (n-butanol: ethanol: acetic acid: water - 38: 2: 10:50). During the elution, each peak fraction was screened in a thin layer. Peak fractions containing the two components were collected, concentrated to a small volume (Rotavapor) by the addition of a small amount of normal n-butyl alcohol (antifoam) and then gradually dehydrated, first by distillation. methanol then abs. using methanol. Finally, from a small volume, the two-component product is absorbed. washed with ether, acetone, dried in a drying gun. Yield: 260 mg (52%), m.p. 165-168 ° C, water solubility: 50 mg / ml, biological activity: 0.050.1 pg / ml (B. subtilis).
3. példaExample 3
Az (AJ vizoldható primicin előállításaPreparation of AJ water soluble primicin
Kiindulási anyagul a 2. példában tárgyalt kétkomponensű, vízoldható primicin szolgált. A komponensek elválasztására ammónium+-ciklusú karboxi-metil cellulóz ioncserés kromatográfiát alkalmaztunk. A vízben szuszpendált H+-ciklusú cellulózt (CM-52 Cellulose, preswollen, microgranular, Whatman) 1 M ammóniumhidrokarbonáttal ciklizáltuk, majd többszöri vizes mosás és dekantálás után vákuumban buborékmentesítettük, majd oszlopot készítettünk (oszlopméret: 2,6x5 cm, flow adapterrel ellátott „Pharmacia” oszlop). A 450 mg kétkomponensű, vízoldható primicint 45 mg/ml koncentrációban vizes közegben alkalmaztuk. Átfolyási sebesség: 150 ml/óra, azaz 29 ml/ó/cm2. Frakció térfogat: 24 ml. A kísérleti körülményeket, s az (A3) kapott elúciógramot, és a vékonyréteg kromatográfiás eredményeket a 4. ábra szemlélteti. Vizes elúciót/mosást alkalmaztunk. A vízzel történő teljes kimosás után 5 mM vizes ammóniumhidrokarbonáttal eluáltuk, melynek csúcsfrakciói a tiszta homogén (A3)-t eredményezte. Az ammóniumhidrokarbonátos, egykomponensű primicint tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, kevés normál butilalkohol hozzáadásával közel szárazra pároltuk. Többszöri vizes mosás, ill. bepárlás alkalmazása után - mely az illékony ammónium-hidrokarbonát eltávolítását szolgálta -, először deszt. metanollal, majd később absz. metanollal teljes dehidrálást végeztünk, s az anyagot végül éterrel kicsaptuk. Szűrés (G-4 üvegszűrő), acetonos mosás, ill. szárítás után 190 mg (42%) egykomponensű (A3) primicin, Op.: 159— 161 ’C, vízoldhatóság: kb. 5 mg/ml (az oldhatóság csökkenés oka a termékben maradható minimális mennyiségű „kötött” NH4 +-, ammóniumhidrokarbonát biológiai aktivitás: 0,5-1 pg/ml (B. subtilis).The starting material was the two-component, water-soluble primicin of Example 2. The components were separated by ammonium + -cycle carboxymethyl cellulose ion exchange chromatography. The H + -cyclic cellulose (CM-52 Cellulose, preswollen, microgranular, Whatman) suspended in water was cyclized with 1M ammonium bicarbonate, washed several times with water and bubbled under vacuum (column size: 2.6x5 cm, flow adapter). Pharmacia column). 450 mg of two-component, water-soluble primicin was used at a concentration of 45 mg / ml in aqueous medium. Flow rate: 150 ml / h, i.e. 29 ml / h / cm 2 . Fraction volume: 24 ml. The experimental conditions, the elution graph (A 3 ) obtained, and the thin layer chromatography results are illustrated in Figure 4. Aqueous elution / washing was used. After complete washing with water, it was eluted with 5 mM aqueous ammonium bicarbonate, the peak fractions of which gave pure homogeneous (A 3 ). The ammonium bicarbonate monocomponent fractions were collected by evaporation to near dryness with the addition of a small amount of normal butyl alcohol. Wash repeatedly with water or wash. After evaporation, which was used to remove volatile ammonium bicarbonate, it was first distilled. methanol, followed by abs. complete dehydration with methanol and finally precipitated with ether. Filtration (G-4 glass filter), acetone wash, After drying, 190 mg (42%) of one component (A 3 ) primicin, m.p. 159-161 ° C, water solubility: ca. 5 mg / ml (due to the decrease in solubility of the product will be a minimal amount of "bound" NH 4 + -, ammóniumhidrokarbonát biological activity: 0.5 to 1 pg / ml (B. subtilis).
Korábban beszámoltunk arról, hogy vízoldhatóságbeli csökkenést okozó ammóniumhidrokarbonát kivonására H+-ciklusú karboxi-metil cellulóz ismételt ioncserét alkalmaztunk. Az elúciót vizes közegben végeztük (2—4 mg/ml koncentrációban), és a teljes vizes kimosás után az ioncserélőt fokozatosan dehidratáljuk először deszt., majd később absz. metanol alkalmazásával. A végső elúciót 10 mM ecetsavat tartalmazó absz. metanollal végezzük. Az eluátumot bepárlás előttIt has been previously reported that repeated ion exchange of H + -cyclo-carboxymethyl cellulose was used to extract ammonium hydrocarbonate, which causes a decrease in water solubility. Elution was carried out in an aqueous medium (2-4 mg / ml) and, after complete washing of the water, the ion exchanger was gradually dehydrated first by distillation and then by abs. using methanol. The final elution was 10mL acetic acid abs. methanol. Elute the eluate before evaporation
G-4 üvegszűrőn, vagy „Whatman” Glass Fibre-en szűrjük, majd kis térfogatra történő bepárlás után az egykomponensű terméket absz. acetonnal kicsapjuk. A további eljárás megegyezik a fentebb már leírtakkal. Az így kapott tiszta (A3) primicin vízoldhatósága: 4050 mg/ml, Op.: 164-166 ’C, szemben a korábbi 159— 161 ’C értékkel. Az ismételt ioncsere alkalmazásakor tapasztalt anyagveszteség maximum 10%.Filter through a G-4 glass filter or "Whatman" Glass Fiber, and after evaporation to a small volume, the one-component product is absorbed. acetone is precipitated. The further procedure is the same as described above. The thus obtained pure (A 3 ) primicin has a water solubility of 4050 mg / ml, m.p. 164-166 ° C as opposed to the previous 159-161 ° C. The material loss during repeated ion exchange is up to 10%.
4. példaExample 4
Az (A, vízoldható primicin komponens előállítása A harmadik példában leírt módszerrel az (A3) komponenst izoláltuk. Az (AJ komponens az NH+4-ciklusú karboximetil cellulóz oszlopon marad.Preparation of water soluble primicin component (A) Compound (A 3 ) was isolated by the method described in Example 3. Component (AJ) remains on the NH + 4-ring carboxymethyl cellulose column.
Az (A,) komponens elúciója a következőképpen történik: az oszlopot vízzel mossuk a teljes ammónium hidrokarbonát eltávolítása érdekében, majd fokozatosan dehidráljuk deszt. metanol alkalmazásával. Az anyag teljes elúcióját absz. metanolban oldott 10 mM ecetsavval végezzük. Az eluátumokat szűrés után (G—4 üvegszűrőn) kis térfogatra bepároljuk, és a terméket absz. acetonnal kicsapjuk. További eljárás megegyezik a 3. példánál leírtakkal.Elution of component (A) is carried out as follows: wash the column with water to remove all the ammonium bicarbonate and then gradually dehydrate the residue. using methanol. Total elution of the material is abs. 10 mM acetic acid in methanol. After filtration, the eluates are concentrated to a small volume (G-4 glass filter) and the product is abs. acetone is precipitated. A further procedure is the same as that described in Example 3.
Kitermelés 150 mg (33%) a 3. példában megadott kétkomponensű termék kiindulási mennyiségére számolva. A termék vízoldhatósága: 50 mg/ml.Yield: 150 mg (33%) based on the starting amount of the two-component product of Example 3. Water solubility of the product: 50 mg / ml.
Op.: 164-168 ’C, biológiai aktivitás: 0,030,06 pg/ml (B. subtilis).M.p .: 164-168 'C, biological activity: 0.030.06 pg / ml (B. subtilis).
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9500219P HU211253A9 (en) | 1988-11-18 | 1995-06-16 | Process for the preparation of water soluble primycin and its components and pharmaceutical compositions containing them |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU885948A HU205366B (en) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | Process for producing water-soluble primycin complexes and pharmaceutical compositions comprising such active ingredient |
| HU9500219P HU211253A9 (en) | 1988-11-18 | 1995-06-16 | Process for the preparation of water soluble primycin and its components and pharmaceutical compositions containing them |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211253A9 true HU211253A9 (en) | 1995-11-28 |
Family
ID=26317858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500219P HU211253A9 (en) | 1988-11-18 | 1995-06-16 | Process for the preparation of water soluble primycin and its components and pharmaceutical compositions containing them |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU211253A9 (en) |
-
1995
- 1995-06-16 HU HU9500219P patent/HU211253A9/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Morimoto et al. | Chemical modification of erythromycins. I. Synthesis and antibacterial activity of 6-O-methylerythromycins A | |
| Hanessian et al. | Procedures for the direct replacement of primary hydroxyl groups in carbohydrates by halogen | |
| Atkins et al. | Kinetic studies on the decomposition of erythromycin A in aqueous acidic and neutral buffers | |
| Majer et al. | Antibiotic glycosides. 8. Erythromycin D, a new macrolide antibiotic | |
| EP0182851B1 (en) | Primycin components and process for the separation of the antibiotic complex | |
| Jolad et al. | 3'-O-Methylevomonoside: a new cytotoxic cardiac glycoside from Thevetia ahouia A. DC (Apocynaceae) | |
| HU211253A9 (en) | Process for the preparation of water soluble primycin and its components and pharmaceutical compositions containing them | |
| HU205366B (en) | Process for producing water-soluble primycin complexes and pharmaceutical compositions comprising such active ingredient | |
| Fried et al. | Streptomycin. VIII. Isolation of mannosidostreptomycin (streptomycin B) | |
| Martinez et al. | Determination of monensin sodium residues in beef liver tissue by liquid chromatography of a fluorescent derivative | |
| Houghton et al. | Quantitation of the pinocembrin content of propolis by densitometry and high performance liquid chromatography | |
| Morozowich et al. | Synthesis and bioactivity of lincomycin-2-phosphate | |
| US5965540A (en) | Cinnamoyl-C-glycoside chromone isolated from aloe barbadensis | |
| Dijkstra | Synthesis of 2‐deoxyinosadiamines‐1, 3 including 2‐deoxystreptamine | |
| US4353895A (en) | Cardenolide-bis-digitoxoside alkyl compounds, pharmaceutical compositions and method of use | |
| Daly et al. | Labilization of Ester Bonds in Aminocyclitol Derivatives. II. Polyacetates of Deoxystreptamine1 | |
| HUT64233A (en) | Process for the production of chemotherapeutical agent of antitumourous effect, small toxicity and big selectivity originated of plants | |
| CN117269375B (en) | Method for determining related substances in vitamin A acetate powder | |
| Hays et al. | Inclusion compounds in pharmaceutical analysis II: Assay of a cream following chemical dehydration | |
| CN112083115B (en) | Kit for detecting residual quantity of 7 barbiturates in raw milk | |
| US3084154A (en) | Water-soluble methylhesperidins and their production | |
| Baigent et al. | Chemical constituents of Tapeinosperma pseudojambosa | |
| King et al. | 634. Trigallic acid, a probable component of tannic acid | |
| Russell | Interpretation of Lignin: The Synthesis of Gymnosperm Lignin | |
| SU1576859A1 (en) | Method of quantitative determination of 5-hydroxyisoflavones |