HU209151B - Method for isolating actinophagous sequence of hft, for transforming host cell of actinomycetales and for producing vectors - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás olyan tanszdukálható vektorok előállítására, amelyek az FP43 fág dezoxi-ribonukleinsav egy szakaszának felhasználásával lehetővé teszik vektorok transzdukcióját. Az FP43 fág nem tartalmaz kohézív (ragadós) végeket, így a találmány szerinti transzdukciós rendszer különbözik az E. coli lambda rendszerétől, a Bacillus subtilis SPO2 rendszerétől, és az S. lividans R4 rendszerétől. A találmány vonatkozik dezoxi-ribonukleinsav bevitelére egy gazdasejtbe, idetartozik a transzdukálódó vektorok felhasználása is. A találmány szerinti módszerrel hatásosan transzformálhatunk dezoxi-ribonukleinsavat sok Streptomyces faj között, és transzdukciót végezhetünk több Actinomycetes-ben.

A leíráshoz mellékelt ábrákon méretarányos távolságokat adunk meg; ugyanakkor a megfigyelt restrikciós fragmens méretek bizonyos mértékig különbözhetnek a számított értéktől. Egyes restrikciós enzimek (például a Mbol esetén) csak egyes hasító helyeket adunk meg, az egyszerűség kedvéért.

Az 1. ábrán megadjuk a pIJ702 plazmid restrikciós és funkcionális térképét.

A 2. ábra a pRHB 101 plazmid restrikciós és funkcionális térképét mutatja.

A 3. ábrán ismertetjük a pRHBlOő plazmid restrikciós és funkcionális térképét.

A 4. ábra mutatja az FP43 fág koncentrációjának hatását a transzdukcióra.

A találmány vonatkozik DNS vektorokra és fágszabályozott olyan transzdukciós rendszerre, amely nemcsak Streptomyces sejtekben, de más mikroorganizmusokban, például Actinomycetales rendbe, például Chainia, Saccharopolyspora és Sterptoverticillium genusba tartozó sejtekben is működik. A transzdukciós rendszer használata során az FP43 bakteriofágból származó dezoxi-ribonukleinsav szakaszt használunk, amelyet a pIJ702 plazmidba [Katz és munkatársai, J. Gén. Microbiol., 192, 2703-1714 (1982)] és a pMT660 [lásd Birch és Cullum, J. Gén. Microbiol., 131, 1299-1303 (1985)] klónoztunk. Ahogy azt Cox és Baltz leírja [J. Bacteriol., 759, 499-504 (1984)], az FP43 egy temperált bakteriofág, ami a Strepcomyces fajokat tekintve széles gazdaspecificitású.

A találmány szerinti eljárás Streptomyces és más gazdasejtekben használható transzdukálható klónozó vektorokra vonatkozik. A Streptomyces-ek körében végzett dezoxi-ribonukleinsav technológiai kísérletek elterjedése a megfelelő klónozó vektorok rendelkezésre állásától függ. A területen való továbblépést korlátozta a Streptomyces sejtekben használható megfelelő vektorok kis száma, mint ahogy más antibiotikumot termelő mikroorganizmusokban használható vektorok kis száma is, továbbá az ismert protoplaszt transzformációs eljárások nehézségei. A találmány szerinti eljárás azért fontos, mivel a módszer használható, és kiterjeszti az alkalmas vektorok és gazdasejtek számát.

A találmány szerinti vektorok előnyösen használhatók, mivel ezek a vektorok kicsik, alakíthatók, és az összes Streptomyces fajban és sok más, mind ez ideig transzformálhatatlan mikroorganizmusban használhatók. A Streptomyces sejtek termelik a klinikailag fontos antibiotikumok több mint a felét, és így gyakorlati szempontból fontos mikroorganizmus csoport tagjai. A találmány szerinti eljárással új és használható klónozó rendszert állíthatunk elő, továbbá olyan vektorokat, amelyek ebben az ipari szempontból fontos csoportban lehetővé teszik gének klónozását mind ismert antibiotikumok termelésének fokozása céljából, mind pedig új antibiotikumok és antibiotikum-származékok előállítására.

A találmány leírása során az alábbi kifejezéseket használjuk, a kifejezések jelentését megadjuk. Antibiotikum:

Mikroorganizmuss által termelt vegyület, természetes eredetű vagy bizonyos mértékig módosított, más mikroorganizmusok vagy eukarióta sejtek növekedését gátolja, vagy elpusztítja azokat.

Antibiotikum bioszintézisben részt vevő gén:

Olyan dezoxi-ribonukleinsav szegmens, amely enzimes vagy más aktivitást határoz meg, amely viszont szükséges a primer metabolitok antibiotikummá alakítására.

Antibiotikum bioszintetikus út:

Azoknak az antibiotikum bioszintézisben részt vevő géneknek az összessége, amelyek szükségesek a primer metabolitok antibiotikummá alakítására.

Antibiotikum rezisztenciát meghatározó gén:

Olyan dezoxi-ribonukleinsav szakasz, amely enzimatikus vagy más aktivitást határoz meg, amely viszont egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát kódol.

Apr:

Ampicillin-rezisztens fenotípus, vagy az ezt meghatározó gén.

cos:

Specifikus fág kohézív végszekvencia (ragadós vég), amely a fág dezoxi-ribonukleinsav pakolása során hasad.

Genetikus könyvtár vagy genomiális génbank:

Olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorkészlet, amelybe egy adott organizmus vagy fág lényegében teljes dezoxi-ribonukleinsava klónozva van.

hft:

Nagyfrekvenciájú transzdukció, használjuk a jelölést egy olyan fág dezoxi-ribonukleinsav szegmens jelölésére is, amelyet tartalmazó vektor nagy frekvenciával képes transzdukálni.

Fertőzés:

A fág replikációjának folyamata, amelynek során a fág hozzákapcsolódik a gazdasejthez, és dezoxi-ribonukleinsava injektálódik, amiután fág-replikáció és fág-érés megy végbe, végül lízist követően felszabadulnak a fág részecskék.

mel:

A tironáz gén.

HU 209 151 Β

Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor: Bármely autonóm replikálódó vagy beépülő dezoxi-ribonukleinsav molekula, ideértve nem limitálóan - a plazmidokat is, amelyek olyan dezoxi-ribonukleinsav molekulák, amelyekhez egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szakaszt kapcsolunk vagy kapcsoltunk.

Restrikciós fragmens:

Bármely olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav molekula, amely egy vagy több restrikciós enzim hatását követően keletkezett.

Szelektálható marker:

Olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorba beépített dezoxi-ribonukleinsav szegmens, amely a vektort tartalmazó sejtek azonosítását lehetővé teszi, miközben vektor szabadon replikálódik vagy beépül a kromoszómába.

Szelektálható markerek például az antibiotikum rezisztenciát meghatározó gének vagy mások, mint például a tirozináz vagy a β-galaktozidáz gén.

Érzékeny gazdasejt:

Olyan gazdasejt, amely egy adott antibiotikum jelenlétében rezisztenciát biztosító dezoxi-ribonukleinsav szegmens hiányában nem képes növekedni.

TcR:

Tetraciklin-rezisztens fenotípus, vagy ezt a fenotípust meghatározó gén.

Transzdukció:

Befogadó gazdasejtbe fág segítségével dezoxiribonukleinsav bejuttatása, amiután változik a genotípus, és megváltozik a recipiens sejt.

Transzduktáns:

Transzdukált (transzdukció után kapott) recipiens gazdasejt.

Transzformáns:

Recipiens gazdasejt, transzformációt követően.

Nagy gyakorisággal transzdukáló vektor:

olyan vektor, mely legalább 10³-szor nagyobb transzdukciós gyakoriságot mutat, egy adott gazdasejtben, mint az azonos, hft szekvenciával nem rendelkező vektor.

Transzformáció:

Dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása egy recipiens gazdasejtbe, amiután változik a genotípus, és megváltozik a befogadó sejt.

tsrR:

Tiosztrepton-rezisztens fenotípus, vagy ezt a fenotípust meghatározó gén.

A találmány tárgya olyan módszer, amellyel aktinofág (Actinomycetales családba tartozó mikroorganizmusokat fertőző fág) dezoxi-ribonukleinsavat izolálhatunk, amely szekvencia nagyfrekvenciájú transzdukálhatóságot biztosít rekombináns vektoroknak. Ezt a fág szekvenciát (hft szekvenciának nevezzük) az alábbiak szerint izolálhatjuk:

1. Elkészítjük az aktinofág dezoxi-ribonukleinsav génkönyvtárát egy aktinomicetákban replikációra képes vektorral;

2. a génkönyvtárt olyan gazdasejtbe transzformáljuk, amelyben az aktinofág fertőz;

3. a második lépésben transzformált sejtet aktinofággal fertőzzük, és összegyűjtjük a kapott lizátumot;

4. a lizátumot felhasználhatjuk egy Actinomycetales családba tartozó mikroorganizmus transzdukálására, végül

5. izoláljuk a vektorokat, amelyek a 4. lépés során nagy frekvenciával transzdukáltak.

A módszer különösen előnyösen használható Streptomyces fágok hft szekvenciáinak izolálására. A módszert a Streptomyces FP43 fág hft szekvenciájának izolálásával mutatjuk be.

A találmány szerinti módszerrel izolált hft szekvenciát hordozó vektorok különösen előnyösen használhatók olyan eljárásokban, amelyek során az aktinomiceták szempontjából fontos vegyületet kódoló dezoxi-ribonukleinsavat juttatunk á sejtekbe. A módszer szerint egy aktinomicetát transzdukálunk egy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorral, amely áll:

1. egy hft szekvenciából;

2. egy hasznos anyagot kódoló dezoxi-ribonukleinsavból;

3. egy plazmidból származó replikációs origóból; és

4. egy szelektálható markerből.

A módszert használva, egy sor dezoxi-ribonukleinsav molekulát juttathatunk be egy Actinomycetales sejtbe. A dezoxi-ribonukleinsav molekulák kódolhatnak előnyös vegyületeket, például antibiotikum bioszintézisben részt vevő enzimeket, intakt antibiotikum bioszintetikus géneket vagy anyagcsere utakat, és gyógyszerészeti szempontból aktív anyagokat, például növekedési hormont, inzulint, interferont és másokat.

A találmány vonatkozik az FP43 bakteriofág egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szegmensére, amelyet nagyszámú mikroorganizmusba nagy gyakorisággal transzdukálható rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós (kifejező) vektorok előállításakor használhatunk fel. Az FP43 bakteriofágot a Streptomyces griseofuscus (FP43) törzsből izolálhatjuk, az 1. példában megadottak szerint eljárva. Az S griseofuscus (FP43) tartalmazza a lizogenizált FP43 fágot, és beszerezhető az alábbi törzsgyűjteményből: Agricultural Research Service, Northern Régiónál Research Center (NRRL), Peoria, IL (61604; a törzsgyűjteményben a mikroorganizmus az NRRL 18184 sorszámmal szerepel.

A nagyfrekvenciájú transzdukálhatóságot biztosító FP43 bakteriofág dezoxi-ribonukleinsav szegmens (hft) könnyen izolálható, és használható fel a találmány szerinti vektorok előállítására. A pRHBlOl szemléltető jelleggel előállított vektort úgy állítjuk elő, hogy a FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmensét beépítjük az Sphl enzimmel emésztett pIJ702 plazmidba. Az FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmense hordozza a hft szekvenciát.

A pIJ702 plazmid 5,8 kb nagyságú széles gazdaspecificitású Streptomyces plazmid, egy sejtben több példány van jelen [Acebal és munkatársai, FEMS Microbiol. Lett., 35, 79-82 (1986); Katz és munkatársai, J. Gén. Microbiol., 792, 2703-2714 (1982); Lampel és

HU 209 151 Β

Strohl, Appl. Environ. Microbiol., 57, 126-131 (1986); Matsushima és Baltz, J. Bacteriol., 163, 180185 (1985)]. A plazmid replikálódik az alábbi mikroorganizmusokban is: Amyclatopsis orientalis, Saccharopolyspóra erythraea [lásd Yamamoto és munkatársai, J. Antibiol., 39, 1304-1313 (1986)], és Thermomonospora fusca [lásd Pidcock és munkatársai, Appl. Enrivon. Microbiol., 50 693-695 (1985)].

A pIJ702 plazmid a több példányban jelen levő, széles gazdaspecificitású pIJlOl plazmidból származik [Kieser és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 185, 223238 (1982)] és ATCC 39 155 sorszámon megrendelheő, az alábbi törzsgyűjteményből: American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852. A pIJ702 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 1. ábrán adjuk meg.

A pRHBlOl plazmid előállítását az FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmenséből és az Sphl enzimmel hasított pIJ702 plazmidból a továbbiakban a 2. példában adjuk meg. A pRHBlOl plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 2. ábrán mutatjuk be.

A találmány szerinti eljárással előállítunk egy másik szemléltető plazmidot is úgy, hogy az FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmensét beépítettük a pMT660 plazmidba, Sphl emésztést követően, amiután a pRHB 106 plazmidot kaptuk meg. A pMT660 plazmid a pIJ702 plazmid egy mutánsa, amely Streptomyces lividans sejtekben hőmérséklet-érzékeny replikációjú [lásd Birch és Cullum, J. Gén. Microbiol., 131, 1299-1303 (1985)]. A pRHB 106 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 3. ábrán mutatjuk be.

A pRHB 106 plazmid előállításáraz S. griseofuscus C581/pRHB106 sejtekből indulunk ki, a leírásban megadott 3. példa szerint. Az S griseofuscus C581/pRHB 106 törzset NRRL 18 183 sorszámon találjuk meg a Northern Régiónál Research Center törzsgyűjteményben.

A fentiekben szemléltető jelleggel megadott vektorok a pIJ702 plazmidból származó Streptomyces replikációs origókat tartalmaznak. Az I. táblázatban megadunk néhány olyan Streptomyces plazmidot, amelyekből Streptomyces replikációs origók állíthatók elő. A témában jártas szakember felismeri, hogy mindaddig, amíg a replikon funkció létezik, a plazmidok teljes mértékben, vagy részben használhatók fel a találmány szerinti hft szekvenciát tartalmazó vektorok előállítására. A plazmidot tartalmazó gazdasejt és a törzsgyűjtemény sorszáma szintén szerepel a következő I. táblázatban.

7. táblázat

Streptomyces plazmidok

Plazmid	Gazdasejt	Törzsgyűjtemény sorszám
SCP2	Streptomyces coleicolor A3(2)	NRRL 15 042
SCP2*	Streptomyces coelicolor M110	NRRL 15041

Plazmid	Gazdasejt	Törzsgyűjtemény sorszám
pEL7	Streptomyces ambofaciens/pEL7	NRRL 12523
pUC6	Streptomyces espinosus	NRRL 11 439
pUC3	Streptomyces 3022A	NRRL 11441
SLP1	Streptomyces lividans	NCIB* 11417
pNMIOO	Streptomyces Virginiáé	NRRL 15156
pEL103	Streptomyces granuloruber A399 12.13/pEL103	NRRL 12549
plJ702	Streptomyces lividans	ATCC** 39 155

* National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Post Office Box 31, 135, Abbey Road, Aberdeen AB98DG, Skócia, Egyesült Királyság.

** American Type Culture Collection, Rockville, MD, 20 852.

A találmány szerinti eljárást szemléltető vektorok előállításakor használt restrikciós fragmenseket a ligálás elősegítésére ismert módon módosíthatjuk. így például molekuláris linkereket kapcsolhatunk egy adott, hft szekvenciát hordozó restrikciós fragmensekhez, vagy dezoxi-ribonukleinsavhoz, amely vektor replikációs funkciókat hordoz. Könnyen létrehozhatunk ligáláshoz szükséges specifikus helyeket. Ezenkívül a különböző hft-szekvenciát tartalmazó restrikciós fragmenseket, replikációs origókat vagy más, egy adott vektorban jelen levő szekvenciákat módosíthatjuk úgy, hogy hozzákapcsolunk, kihasítunk vagy helyettesítünk bizonyos nukleotidokat, amiután megváltozik a dezoxi-ribonukleinsav tulajdonsága, és több, ligáláshoz használható restrikcós helyet kaphatunk. A témában jártasak értik a nukleotid-kémiát és a genetikai kódot, így ismerik azokat a nukleotidokat, amelyek kicserélhetők és ismerik azokat a dezoxi-ribonukleinsav-módosításokat is, amelyek egy adott cél elérése érdekében fontosak. Megjegyzésre érdemes, hogy egy adott hft-szekvenciát tartalmazó restrikciós fragmens nem csupán egy adott helyre építhető be egy klónozó vektorban, hanem máshová is mindaddig, míg a vektor által szabályozott funkciók működnek. A témában járatosak értik és könnyen meghatározzák egy vektor azon helyeit, amelyek előnyösek a ligálás vagy hft-szekvenciát hordozó restrikciós fragmens beépítése szempontjából.

A találmány szerinti eljárást nem korlátozzuk az

FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmensére egy adott vektor transzdukcióra alkalmassá tétele szempontjából. Az FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmense valószínűleg hordoz egy olyan replikációs origót, amely az origót tartalmazó plazmidot képessé teszi ún. „rolling-circle” mechanizmusú replikációra, hasonlóan az E. coli T4 rendszeréhez [lásd Kreuger és munkatársai, PNAS., USA, 82, 3345-3349 (1985)]. Az FP43 replikációs

HU 209 151 Β tartalmazó plazmid lineáris konkatemerjei, amikor az intracelluláris FP43 fág géntermékeivel érintkezik, bepakolódik a „headful” mechanizmussal. Az így létrejövő, bepakolt részecskék képesek a sejtekbe dezoxi-ribonukleinsavat injektálni, amiután a dezoxi-ribonukleinsav újra körré zárul a transzduktánsokban.

Mivel az FP43 fág replikációs origója kisebb mint

7,8 kb, az FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmensének teljes nukleotid szekvenciája nem szükséges a transzdukálhatósághoz. Az FP43 fág replikációs origóját hordozó más FP43 restrikciós fragmensek is felhasználhatók a 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmens helyett a találmány szerinti transzdukciós rendszer előállítására. Természetesen felhasználhatjuk a találmány szerinti transzdukciós rendszer előállítására az FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmensénél nagyobb restrikciós fragmenseket is.

Annak eldöntésére, hogy egy adott FP43 fágból származó restrikciós fragmens tartalmazza-e az FP43 replikációs origót, a későbbiekben megadott eljárást kell megismételnünk úgy, hogy az FP43 fág Sphl emésztése helyett más emésztést alkalmazunk (például EcoRI emésztést, mechanikus tördelést, nukleázos kezelést stb.) az FP43 dezoxi-ribonukleinsav fragmensek előállítására. Az FP43 fág hft szekvenciát tartalmazó Sphl restrikciós fragmensének azonosítására az FP43 fág dezoxi-ribonukleinsavát Sphl restrikciós endonukleázzal kezeljük, és a kapott dezoxiribonukleinsav fragmenseket a pIJ702 és a pMT660 plazmidok mel génjében levő Sphl restrikciós helyre klónozzuk.

A mel gén inaktiválódása bekövetkezik akkor, ha nagyméretű fragmensek épülnek be a pIJ702 vagy a pMT660 plazmidok Sphl helyére. Az inaktíválódás ténye meghatározható, mivel a mel gén terméke a tirozint sötétszínű vegyületté alakítja át. Az érintetlen mel gént tartalmazó transzformánsok sokkal sötétebb színűek, mint az intakt mel gént nem tartalmazó sejtek tirozint tartalmazó táptalajon.

A pIJ702 és pMT660 plazmidok Sphl helyére beépített FP43 fág dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó rekombináns plazmidokat Streptomyces lividans sejtekbe transzformáljuk, és tiosztreptonra rezisztens, fehér színű transzformánsokat izolálunk. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk a transzformánsokól a dezoxi-ribonukleinsav inszert jelenlétének bizonyítására. Az FP43 dezoxi-ribonukleinsavat hordozó plazmidokat S. griseofuscus és S. ambofaciens sejtekbe transzformáljuk, és a transzformánsok FP43 lizátumát izoláljuk. A lizátummal transzdukáljuk a plazmidot a vad típusú S. griseofuscus és S. ambofaciens sejtekbe, majd tiosztrepton-rezisztens transzduktánsokat keresünk. Az FP43 7,8 kb nagyságú Sphl restrikciós fragmense (a nagy gyakoriságú transzdukció miatt hft betűcsoporttal jelöljük), legalább 10⁵szeres növekedést okoz, összehasonlítva azzal az S. griseofuscus transzduktánssal, amely inszert nélküli pIJ702 plazmidot hordoz. Az eredményeket az alábbi, II. táblázatban adjuk meg.

II. táblázat

Az FP43 dezoxi-ribonukleinsav inszertek hatása a pU702 és pMT660 plazmidok transzdukciójára

Plazmid	Eredeti vektor	Az in- szert nagy- sága (kb)	Transzdukció frekvenciája*1
S. ambofaciens	S. griseofuscus
pRHBlOl	pIJ702	7,8		4,0xl0-4
pRHB102	pIJ702	6,9	1.7X10-6
pRHB103	pIJ702	2,4		<l,4xl0-8
pRHB104	pIJ702	1,4	3.1X10-6
pRHB105	pIJ702	2,9	<5,0xl0-7
pRHBlOő	pMT660	7,8		4,0x1ο-4
pRHB107	pMT660	1,5		<4,5xl0-9
pRHB108	pMT660	0,9		<8,3xl0-7
pRHB109	pMT660	1,0
pRHBllO	pMT660	4,1		cVJxlO-6
pIJ702		-		<2,2xl0-8
pMT660		-		<2,2xl0-9

⁼ A transzduktánsok számának aránya az S. griseofuscus sejtekkel meghatározott plakk képző egységhez viszonyítva.

A kapott, átlagos transzdukciós gyakoriság 10^-4 plakk képző egység. A pU702 plazmidot inszert nélkül tartalmazó kísérletek során transzdukciót nem kaptunk (<2,2xl0⁹ plakk képző egység).

Ahogy azt a II. táblázat adataiból látjuk, az FP43 dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó más plazmidok transzdukciós gyakorisága csak alig nagyobb, mint a pIJ702 plazmiddal megfigyelt érték. így az FP43 véletlenszerű fragmenseinek klónozásakor általában véve nem figyelhető meg a transzdukció fokozódása; így ez a rendszer különbözik a 0105 és SPO2 transzdukciós rendszerektől, amiket a Bacillus sejtekben és a P22 rendszertől, amit Salmonella sejtekben tanulmányoztak.

A találmány szerinti transzdukciós rendszer más rendszerekből abban is különbözik, hogy a hft szegmenst a legtöbb Streptomyces fajba transzdukálhatjuk. Azokat az FP43 fáglizátumokat, amelyeket a pRHBlOl plazmidot tartalmazó Streptomyces griseofuscus és a pRHBlOő plazmidot tartalmazó Streptomyces griseofuscus sejtekkel állítottunk elő, felhasználhatjuk igen sok más Streptomyces faj transzdukálására, ezek között a fajok között olyanok is vannak, amelyek nem képeznek plakkokat az FP43 fággal. Egyes vizsgált, plakkokat nem képező fajok olyan restrikciós endonukleázokat tartalmaznak, amelyek hasítják az FP43 dezoxi-ribonukleinsavat [lásd Cox és Baltz, J. Bacteriol., 759, 499-504 (1984)]. Az FP43 fággal plakkokat képző vizsgált 13 faj közül csak egy, a Streptomyces lavendulae nem transzdukálható tiosztrepton rezisztenssé az FP43 fággal.

A transzdukciós kísérletek eredményeit a III. táblázatban adjuk meg.

HU 209 151 Β

JII. táblázat

A pRHBlOl plazmid fajok közötti transzdukciója az FP43 bakteriofággal Streptomyces sejtekben

Törzs	Plakk képzés	Transz- dukció	Transzdukciós gyakoriság3
S. albus P	+	+	2,8x1ο-6
S. albus J107 4	+	+	6,lxlO-8
S. ambofaciens	+	+	4,5x10-5
S. aureofaciens	+	+	l,3xl0-7
S. cinnamonensis	+	+	7,3x1ο-6
S.fradiae PM73	+	+	l,8xl0-7
S.fradiae Ml	+	+
S. griseofuscus	+	+	9,6x1ο-4
S. griseus	+	+	3,2x10-7
S. macrosporeus	+	+	Ι,ΙχΙΟ-6
S. parvulus	+	+	8,7x10-7
S. tubercidicus	+	+	2,3x10-7
S. tennebrarius E	+	+	1.2X10-4
S. lavendulae	+	-	<2,9x10-9
S. coelicolor	-	+	l,9xl0-5
S. felleus	-	+	5.7X/Ö-6
S. lividans	-	+	3,5xl0-5
S. phaeochromogenes	-	+	8,5xl0-9
S. thermotolerans	-	+	5.0X10-6
S. venezuelae	-	+	Ι,ΟχΙΟ-5
S. cirratus	-	+	2,0xl0“7
S. acromogenes	-	-	<4,3x10-9
S. albus G	-	-	<1,3χ10-ιθ
S. fungicidicus	-	-	<2,5x10-8
S. narbonensis	-	-	<2,5x10-8

a) A transzdukánsok számának aránya a plakk képző egységek számához viszonyítvaz S. griseofuscus sejtekkel meghatározva. A transzdukált fajok között ott van az S. albus P, amely termeli a SalPI-et, amely a PstI izoszkizomerje. A pRHB 101 és pRHB 106 plazmidok egyetlen PstI felismerési helyet tartalmaznak, így a jelen rendszer lehetővé teszi ezeknek a restrikciós helyeknek az átlépését. A III. táblázat adataiból az is kiderül, hogy a találmány szerinti transzdukciós renszert felhasználhatjuk még az FP43 fág-fertőzésre rezisztens mikroorganizmusok transzformálására is. Az FP43 fággal plakkokat nem képző 11 Streptomyces faj közül 7 tiosztrepton rezisztenssé transzdukálható az FP43 fággal. így az FP43 bizonyosan kötődik a sejtekhez, és injektálja a dezoxi-ribonukleinsavat ezekbe a fajokba, ahogy az a gazdasejt analízisből megjósolható [lásd Cox és Baltz, J. Bacteriol., 159, 499-504. (1984)]. Az FP43 fág valószínűleg sokkal nagyobb mértékben szenved restrikciót ezekben a fajokban, mint a pRHB 101 és pRHB 106 plazmidok. Az FP43 fág például sok Sphl hellyel bír, ezt az enzimet az S. phaeochromogenes termeli, és ezért a fág teljes mértékben emésztődik, ugyanakkor a pRHB 101 plazmidban csak két Sphl helyet találunk, és alacsony, de meghatározható frekvenciával transzdukálódik: 8,5xl0^-9 per plakk-képző egység.

Az FP43 fág, mint más Streptomyces fágok [Chater, K., Streptomyces phages and their applications to Streptomyces genetics (1986), 119-158., szerkesztő: Queener és Day, The Bacteria, IX. kötet, Antibioticproducing Streptomyces, Academic Press, New York] széles gazdaspecificitású. Baltz és Cox [J. Bacteriol, 159, 499-504. (1984)] kimutatta, hogy az FP43 fág harminc vizsgált fajból tizennégyben plakkot képez, az adatokból az következik, hogy a tizenhat, plakkot nem képző fajban restrikciós endonukleáz rendszerek működnek. Az FP43 fág nem képez plakkokat a sorrendben Sáli, SacI és Sphl restrikciós endonukleázokat termelő S. albus, S. acromogenes vagy az S. phaeochromogenes fajban; az FP43 dezoxi-ribonukleinsavban mindhárom enzim felismerő helye többször előfordul. Az FP43 plakkokat képez az S. albus P és S. tubercidicus sejtekben, ezek sorrendben Sáli (PstI) és Stul endonukleázokat termelnek; az FP43 dezoxi-ribonukleinsavban nem találunk PstI vagy Stul helyet. Ezek a megfigyelések azt támasztják alá, hogy az FP43 kötődik és injektálja dezoxi-ribonukleinsavát a legtöbb, vagy talán az összes Streptomyces fajba. Az FP43 plakk-képző képességének hiánya egyes Streptomyces fajban valószínűleg a gazdasejt restrikciós tulajdonságai miatt áll fenn, nem pedig azért, mert az FP43 fág nem képes kötődni, és nem képes dezoxi-ribonukleinsavát a gazdasejtbe juttatni. A találmány szerinti transzdukciós rendszer lehetővé teszi ezen restrikciós rendszerek kikapcsolását.

Ha az FP43-at viszonylag kisszámú restrikciós helyet tartalmazó plazmidba építjük be, úgy a plazmid transzformálható az FP43-at erősen hasító törzs sejtjeibe. AIII. táblázatban szereplő S. groseofuscus, S. ambofaciens, S. lividans, S. parvulus és S. albus J1074 relatíve nem restrikciós tulajdonságú; az S. albus G (Sáli), S. lavendulae (Slal), S. phaeochromogenes (Sphl), az S. acromogenes (SacI, SacII) és az S. tubercidicus (Stul) jól jellemzett restrikciós rendszereket tartalmaz (a törzsek neve után zárójelben adtuk meg); az S. aureofaciens, S. cirratus, S. coelicolor, S. griseus,

S. narbonensis, S. thermotolerans, S. venezuelae és az S. macrosporeus valószínűleg termel restrikciós rendszereket. A találmány szerinti transzdukciós rendszer jól működik a 14 FP43 fággal plakkokat képző törzs közül 13-ban, és jól működik 11 olyan törzs közül 7-ben, amelyben az FP43 plakkokat nem képez. A nem transzdukálódott 5 törzs közül 4 erős restrikciós renszereket tartalmaz; az S. albus G Sáli enzimet termel, ez a pRHBlOl plazmidot 5 helyen hasítja. A vizsgált törzsek csak 20%-a termel olyan restrikciós enzimeket, amelyeket a találmány szerinti rendszer nem képes túllépni.

A transzdukált fajok közül kettő jól jellemzett restrikciós endonukleázokat termel, amelyek hasítják a

HU 209 151 Β transzdukálódó plazmidot. Az S. albus P SalPI enzimet termel, ez a PstI izoszkizomerje, hasítja egy helyen a pRHBlOl plazmidot; az S. phaeochromogenes Sphl restrikciós endonukleázt termel, ez a pRHBlOl plazmidot két helyen hasítja. Az FP43 az S. albus P és S. phaeochromogenes sejteket 10²-ször és 10⁴-szer alacsonyabb gyakorisággal transzdukálja, mint a nem restrikciós tulajdonságú S. griseofuscus sejteket. Az S. albus P esetén a relatív transzdukciós gyakoriság 100szorosra növelhető úgy, hogy a transzdukciós lizátumot S. albus P setjekkel állítjuk elő. Úgy tűnik, hogy a plazmid jelentősen megváltozott a SalPI restrikciós enzim által történő támadhatóság szempontjából az S. albus P sejtekben való replikációt követően. Ezzel az eljárással megváltoztatjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, ezt felhasználhatjuk más fajok transzdukciós hatékonyságának fokozására is. A módszer használata során a változtató sejtekben (az S. albus P sejtekben) a transzdukálódó dezoxi-ribonukleinsav megváltozik (például metilálódik).

A folyamatot úgy végeztük el, hogy tiosztrepton-rezisztenssé transzdukáltuk az S. albus P törzset az S. griseofuscus pRHBlOl plazmidot tartalmazó sejtekben előállított FP43 lizátummal. A következő FP43 lizátumot az S. albus P sejtekkel állítottuk elő, a sejtek pRHBlOl plazmidot hordoztak. A két transzdukciós lizátumot összehasonlítottuk abból a szempontból, hogy plazmidot nem tartalmazó S. griseofuscus és S. albus P sejteket hogyan tud transzdukálni. Az alábbi, IV. táblázatban bemutatjuk, hogy az S. griseofuscus sejtekkel előállított lizátummal a transzdukciós hatékonyság S. albus P sejtekben csak 1,5%-a a természetes S. griseofuscus törzsben mértnek. Az S. albus P törzzsel előállított lizátum ugyanakkor mindkét fajt azonos hatékonysággal transzdukálja. A plazmidot ésrestrikciót végző sejtekbe juttatva, a restrikciót végző gazdasejt relatív transzdukciós frekvenciája mintegy 100-szorosára növelhető.

ÍV. táblázat

A Streptomyces griseofuscus és a Streptomyces albus P gazdasejtek transzdukciója az S. griseofuscus/pRHBlOl vagy az S. albus P/pRHB101 sejtekkel előállított FP43 lizátummal

A transzdukciós lizátum forrása	Transzdukciós frekvencia	Relatív transzdukció
S. griseofuscus-ban	S. albus P-ben	(S. albus/S. griseofuscus)
S. griseofuscus	6,6x1ο-4	1,0x10-5	0,015
S. albus P	2,4xl0-5	3,5xl0-5	1.5

Az a tény, hogy FP43 fággal plakkot nem képző Streptomyces fajokban igen nagy gyakorisággal végezhetünk sikeres transzdukciót, azt jelenti, hogy a fágok kötődése és a dezoxi-ribonukleinsav injektálódása mellett más események gátolnak, továbbá, hogy a találmány szerinti FP43 transzdukciós rendszer felhasználható más aktinomiceták transzdukálására. Nemek közötti transzdukciókat is végezhetünk széles gazdaspecificitású plazmidokkal; a PU702 plazmid és származékai nemcsak Streptomyces sejtekben replikálódnak, de Saccharopolyspora, Amycolatopsis és Thermomonospora fajokban is.

Az S griseofuscus/pRHBlOl sejtekkel előállított FP43 fág lizátumot több faj sejtjeivel keverjük, a fajok különböző aktinomiceta nemhez tartoznak; a fertőzés után megfigyeljük a plakk-képzést és a transzdukciót. Az eredményeket az alábbi, V. táblázatban adjuk meg.

V. táblázat

A pRHBlOl plazmid nemek közötti transzdukciója az FP43 bakteriofággal

Törzs	Plakk- képzés	Transz- dukció	“Transzdukciós gyakoriság
Chainia minutisclerotica ATCC 19346	+	+	l.lxlO6
Chainia ochracea ATCC 15814	-	+	6,lxl0-7
Chainia olivacea ATCC 15722	-	+	4,1x1ο-8
Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635	-	+	6,0xl0-7
Saccharopolyspora hirsuta ATCC 27 875	-	+	l,4xl0-8
Streptoverticillium olivertículli ATCC 23 943	+	+	7,lxlO-9
Streptoverticillium kentuckense NRRL B-l 831	-	+	2,lxlO-7
Sreptoverticillium albireticuliNRRLB-1670	-	-	<7,lxlO-10

^a A transzdukánsok számának aránya a plakk-képző egységek számához viszonyítvaz S. griseofuscus törzzsel végezve a vizsgálatot.

Az FP43 csak a Streptoverticillium oliverticulli és a

Chainia minutisclerotica mikroorganizmusokban okozott plakk-képződést. Ugyanakkor a transzdukció nemcsak a Sterptoverticillium és Chainia mikroorganizmusokban volt sikeres, de a Saccharopolyspora mikroorganizmusokban is. Ezek az eredmények azt jelentik, hogy az FP43 kötődik és bejuttatja a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat egy sor aktinomiceta nemhez tartozó mikroorganizmusba, és a pRHBlOl plazmid stabilan fennmarad és replikálódik sok különböző nemben. A fentiekben leírt transzdukciós rendszer így egy igen jelentős technikát reprezentál abból a szempontból, hogy géneket juttathatunk át egy sor Streptomyces faj egyes mikroorganizmusai között, és több más aktinomiceta nemhez tartozó sejt között, ez szükségtelenné teszi az egyes fajok közötti transzformáció elvégzésekor a transzformációs rendszer kifejlesztését. A fentiek kiterjesztik a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia aktinomiceták közötti használatát új vagy hibrid antibiotikumok előállítása céljából.

A találmány szerinti széles gazdaspecificitású transzdukciós vektorok jelentős előnnyel rendelkeznek a protoplaszt-transzformációs rendszerekkel szemben olyan

HU 209 151 Β kísérletekben, ahol géneket juttatunk egyik mikroorganizmusból a másikba. Mivel a találmány szerinti transzdukció optimális feltételei az egyik mikroorganizmusban különbözhetnek egy ettől eltérő mikroorganizmus transzdukciós rendszerének optimális feltételeitől. Az optimalizálható egyik körülmény a fertőzés mértéke.

Fontos, hogy megértsük a transzdukció lényegét abból a szempontból, hogy megértsük a transzdukciós hatékonyság összefüggését a fertőzés mértékével. Transzdukálódó plazmid előállítására az FP43 fág hft szekvenciáját beépítjük egy rekombináns, kifejeződő dezoxi-ribonukleinsav vektorba. Ezt a vektort (a pRHBlOl vagy a pRHB106 lazmidot) ezután ismert protoplaszt-transzformációs eljárással transzformáljuk egy mikroorganizmusba, például a Streptomyces griseofuscus C581 (ATCC 23916) sejtekbe. A kapott transzformánsokat ezután FP43 fággal fertőzzük. A fág fertőzés során a hft szekvenciát tartalmazó plazmidok replikálódnak és beépülnek a fág fejekbe. Az így kapott lizátum nem fertőző fág-részecskéket tartalmaz, amelyekbe bepakolódtak a hft szekvenciát tartalmazó plazmid dezoxi-ribonukleinsavak.

A kapott lizátum ugyanakkor fertőző fágrészecskéket is tartalmaz, amelyekbe bepakolódott az FP43 fág genom. Ezek az ún vad típusú fertőző részecskék lízist okozhatnak, és ezért plakk-képző egységeknek nevezzük őket. A plakk-képződés a recipiens gazdasejtekben következik be, amikor a lizátumot transzdukcióra használjuk fel.

A 4. ábrán több tipikus válaszreakciót mutatunk be, amelynek során a transzdukciós gyakoriság az FP43 fág szempontjából gazdasejteknek számító és nem gazdasejtekként tekintett sejtekben mérjük a fág koncentrációt. A transzdukciós hatékonyság az egyes Streptomyces fajokban IO^-8 és 10~⁴ per plakk-képző egység között változik, a transzdukciós hatékonyság nem jelzi a transzdukciós lemezeken kapható transzduktánsok maximális számát. A legnagyobb transzdukciós frekvenciát a nem restrikciós vagy csak kismértékben restrigáló gazdasejtekben kaptuk, ezek érzékenyek az FP43 fággal szemben, azaz lizálnak.

A Streptomyces griseofuscus törzsben, ez egy nem restrigáló gazdasejt, amelyben a transzdukáló lizátumokat előállítjuk, a transzdukciós gyakoriság lineárisan növeksziklO³ és 10⁵ plakk-képző egység per lemez között a növekvő plakk-képző egységek számával, és ezután csökken, ha FP43 antiszérum nincs jelen. Az FP43 antiszérum előállítását a 6. példában adjuk meg. A fágok adagolása után 4 órával antiszérumot adva, a transzdukciós gyakoriság lineárisan növekszik 10⁶ plakk-képző egység per lemez mértékig, majd ezután csökken. Az antiszérum adagolása így felhasználható a transzdukánsok lízisének minimalizálására limitált fágszaporodáskor. Ezenkívül, alig vagy egyáltalán nem figyelhetünk meg lízist, még a fág antiszérum távollétében sem, ha a transzdukált törzs lizogén a transzdukáló fággal szemben. Jelentős transzdukció figyelhető meg a transzduktánsokban nagyobb fágkoncentrációk használatakor. így 2xl0⁶ plakk-képző egység per lemez fágnál lemezenként 200 transzduktánst kapunk.

A Streptomyces thermotolerans sejtek erősen restrikciós jellegűek, és az FP43 fággal plakkokat nem képeznek, még IO¹⁰ plakk-képző egység lemezenkénti adagolásakor sem. A transzduktánsok nem lizálnak.

Az S thermotolerans sejteket használva a transzduktánsok gyakorisága arányosan növekszik a növekvő plakk-képző egységek számával 10⁸ plakk-képző egység per lemezig, ezután maximumgörbe szerint emelkedik 10*° plakk-képző egység per lemez számig. így nincs nehézség a transzduktánsok lízisével nagy fágkoncentráció jelenlétében. Ebben az esetben 1500 transzduktánst kaptunk 10'° plakk-képző egységből. Mivel egy tipikus kísérletben a fágrészecskék és a sejtek száma nem jelent korlátot, igen sok fágot és nagy sejtsűrűséget használhatunk az erősen restrigáló törzsek esetén. Ez nyilvánvalóan előnyös a protoplaszt-rendszerhez képest, amikor a transzformáció gyakran alacsony protoplaszt-koncentrációkkor hatékony, továbbá, ahol a plazmid viszonylag hatástalan, és ahol a protoplasztok regenerációja ritkán éri el a 100%-ot.

Az FP43 fágok plakkokat képeznek a Streptomyces albus P törzsön a lemezrevitel teljes mértékét számolva 10%-os hatékonysággal az S. griseofuscus-hoz képest. Az S. albus P transzduktánsainak gyakorisága lineárisan növekszik a növekvő plakk-képző egységek számával 3xl0⁷ plakk-képző egység per lemezig, majd stabilizálódik. Ugyanakkor, a transzdukció relatív hatékonysága plakk-képző egységre számítva 100-szor alacsonyabb, mint az S. griseofuscus esetén.

Az FP43 fággal plakkokat nem képző Sterptomices cirratus esetén 10⁸ plakk-képző egység per lemeznél kisebb fágkoncentrációnál transzdukciót nem figyeltünk meg, ennél a koncentrációnál nagyobb mennyiségű fágot használva azonban a transzduktánsok gyakorisága arányosan növekszik a fágkoncentráció négyzetével. Ahogy az S. thermotolerans esetén, a lemezeken probléma nélkül következett be a transzdukció; tény azonban, hogy szinergista hatás látszott nagy fágkoncentrációkkor.

Ez a nyilvánvaló bimolekuláris interakció azt jelenti, hogy a transzdukciókor szükségünk van vagy két plazmidra vagy egy plazmidra és fág genomra, a plazmid-replikációhoz. Az egyik lehetőség az, hogy a plazmid együttes fertőzése a fág dezoxi-ribonukleinsavval csökkenti a restrikció hatékonyságát. A fág dezoxi-ribonukleinsav talán abortív infekciót iniciál, ez megszünteti a restrikciós endonukleázok hatását, amiután a plazmid replikáció hatékonyabban indulhat, bár ezt az érdekes jelenséget más lehetőségekkel is magyarázhatjuk. Akárhogy is, sok transzduktánst kaphatunk nagy fágkoncentrációk használatakor restrikciós háttér jelenlétében is, abban az esetben, ha bimolekuláris transzdukciós kinetikát biztosítunk.

A találmány szerinti eljárással több lehetőség nyílik a gazdasejtek endogén dezoxi-ribonukleinsav restrikciós/modifikációs rendszerének kivédésére. Az emelt hőmérsékleten való tenyésztés gyakran gátolja a másodlagos metabolitok keletkezését, például az antibiotikum termelést és a spolurációt Streptomyces sejtekben. Több restrikciós/modifikációs rendszer hasonlóan sza8

HU 209 151 Β bályozott; azaz, ha a sejteket magasabb hőmérsékleten tenyésztjük, a restrikció kisebb mértékű, és bizonyos restrikciót végző törzsek transzdukciója fokozódik. Az endogén restrikciós rendszerek kivédésének módszerét úgy szemléltetjük, hogy az S. griseofuscus, S. albus P, S. phaeochromogenes, S. thermotolerans és S. kentuckense törzseket transzdukció előtt 29 °C-on és 39 ’Con növesztjük, majd transzdukciót követően 29 ’C, 34 ’C és 42 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A kísérlet eredményeit a VI. táblázatban adjuk meg.

VI. táblázat

ApHRBlOl plazmid transzdukciója FP43 fággal különböző hőmérsékleteken

Törzs	Hőmérséklet (”C)	Transzdukciós gyakoriság	Relatív transz- dukció8
növeke- dés	transz- dukció
	29	29	3.3X10-4	1,1
	29	34	2.9X10-4	1,0
S. griseofuscus	29	42	Ι,όχΙΟ-4	0,55
39	29	5,0x10-5	0,17
	39	34	3,Ox10-4	0,10
	39	42	7,3χ10-5	0,25
	29	29	6.2Χ10-6	1,05
	29	34	5,9x1ο-6	1,0
S. albus P	29 39 39 39	42 29 34 42	2.7Χ10-6 4,3x1ο-6 3,9x1ο-6	0,46 0,73 0,73 0,66
	29	29	5,0χ10-9	1,0
	29	34	5,0χ10-9	1,0
S. phaeochromo-	29	42	<5,0χ10-9	<1,0
genes	39	29	3,Οχ1Ο-8	6,0
39	34	5,0x1ο-8	10,0
	39	42	2,0x1ο-8	4,0
S. thermotolerans	29	34	1,5x10-8	1,0
39	34	5.2Χ10-6	350,0
S. kentuckense	29 39	34 34	4,7x10-9 2,2x10-7	1,0 47,0

^a = A transzdukciós gyakoriságot egynek vettük abban az esetben, amikor a sejteket 29 °C hőmérsékleten növesztettük, és a transzdukciót 34 °C hőmérsékleten végeztük.

A restrikciós rendszerrel nem rendelkező S. griseofuscus sejtekben a transzdukció 5-10-szer gyengébb volt a 29 ’C-os kontrolihoz képest, ha a sejteket 39 ’C hőmérsékleten inkubáltuk, ugyanakkor az S. albus P sejtekkel a transzdukciós frekvencia kismértékben változott akkor, ha a sejteket különböző hőmérsékleten növesztettük, vagy különböző hőmérsékleten végeztük a transzdukciót. Az S. phaeochromogenes sejteket 39 ’C hőmérsékleten növesztve 4-10-szer magasabb volt a transzdukálhatóság, mint abban az esetben, ha a növesztést 29 ’C hőmérsékleten végeztük. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az Sphl restrikciós rendszer magasabb hőmérsékleten gyengén funkcionál. A maximális transzdukciót akkor kaptuk, amikor a tenyészeteket 39 ’C hőmérsékleten növesztettük, és a transzdukciós tenyészeteket 34 ’C hőmérsékleten inkubáltuk. Az S. thermotolerans és az S. kentuckense sejteket 39 ’C hőmérsékleten növesztve 350-szeres, illetve 47-szeres transzdukciós gyakoriságot mértünk, összehasonlítva a 29 ’C hőmérsékleten végzett növesztéssel. Ez azt jelenti, hogy a sejtek növekedésének hőmérséklete jelentősen befolyásolja egyes fajoknál a transzdukció hatékonyságát.

A fenti adatok szemléltetik, hogy az ismertetett transzdukciós rendszert könnyen változtathatjuk a sejtek növekedési paramétereinek változtatásával az egyes fajok transzdukciójának optimalizálására. Ez eltér a protoplaszt transzformációs rendszerektől, amelyek gyakran igen stabil igényűek a sejtek protoplasztálás előtti növesztése tekintetében, mivel hatásos sejtregenerálást csak így érhetünk el. Például, ha a sejteket magasabb hőmérsékleten növesztjük, a protoplasztokból való sejtregenerálás drámaian gátlódhat.

A találmány szerinti rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorokat széleskörűen használhatjuk, és velük a Streptomyces és rokon mikroorganizmusokban használható megfelelő klónozó hordozók használatának lehetősége növekszik. Ezenkívül a találmány szerinti vektorok azon képessége, hogy anbitiotikum rezisztenciát határoznak meg, lehetővé teszi a transzduktánsok szelektálását. Ez fontos, mivel gyakorlati szükségünk van arra, hogy a transzformációs eljárás során a vektor dezoxi-ribonukleinsavat felvett egyes sejteket szelektálni tudjuk.

A találmány szerinti vektorokba beépíthetünk olyan további dezoxi-ribonukleinsav szegmenseket is, amelyek funkcionális teszttel nem mutathatók ki, a nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó transzduktánsokat karbomicin rezisztenciára szelektálhatjuk és izolálhatjuk. Ilyen nem-szelektálható dezoxiribonukleinsav szegmenseket bármely helyre beépíthetünk, kivéve azokat a régiókat, amelyek a transzdukcióhoz szükségesek, illetve a szelekcióra használt antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket, de nem limitáló jelleggel, ideértjük az antibiotikumokat módosító enzimeket meghatározó géneket és minden típusú szabályozó gént is.

A találmány szerinti vektorokat felhasználhatjuk annak bizonyítására, hogy a kapcsolt dezoxi-ribonukleinsav szegmensek stabilan fennmaradnak a gazdasejtekben több generáción át. Ezeket a géneket vagy dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket úgy tartjuk fenn, hogy a transzduktánsokat szelektív nyomásnak tesszük ki, azaz a vektorban jelen levő markert használjuk fel (például az antibiotikum rezisztenciát meghatározó gént). így azok a transzduktánsok, amelyek elvesztik a vektort, nem képesek növekedni, és eliminálódnak a tenyészetből. A találmány szerinti vektorok ezért a számunkra érdekes dezoxi-ribonukleinsav szekvenciákat stabilizálják és fenntartják.

A találmány szerinti klónozó vektorokat és transzduktánsokat felhasználhatjuk gének klónozására különböző, Streptomyces sejtek által termelt termékeket meghatározó gének klónozására. Ilyen termékek például, nem limitáló felsorolás szerint a következők: szterptomicin, tilozin, cefalosporinok, aktaplanin, narazin, monenzin, tobramicin, eritromicin és mások. A

HU 209 151 Β találmány szerinti eljárással olyan szelektálható vektorokat állíthatunk elő, amelyekkel klónozhatunk, jellemezhetünk és előállíthatunk olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvenciákat, amelyek gyakorlati szempontból fontos proteineket határoznak meg, például humán inzulint, humán proinzulint, glukagont, interferont és másokat; vagy enzimatikus funkciókat írnak le olyan metabolitikus utakban, amelyek gyakorlati szempontból fontos folyamatokat, illetve vegyületeket határoznak meg; de felhasználhatjuk szabályozó elemek jellemzésére vagy klónozására is, amely elemek fokozzák a gén kifejeződését. Ezek az előnyös dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák magukba foglalják, nem limitáló felsorolással, azokat a dezoxi-ribonukleinsavakat, amelyek antibiotikum-származékok szintézisét katalizáló enzimeket kódolnak, például az alábbi antibiotikumok származékait: szreptomicin, cefalosporin, tilozin, aktaplanin, narazin, monenzin és eritromicin. A dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák antibiotikumok vagy más termékek biológiai előállításának fokozását és szabályozását meghatározó enzimeket is kódolhatnak. Ezen dezoxi-ribonukleinsav szegmensek izolálásának és felhasználásának lehetősége megnyitja az utat a Streptomyces vagy rokon mikroorganizmusok által termelt antibiotikumok termelésének fokozására.

A Streptomyces sejteket különböző táptalajokon, különböző módon tenyészthetjük. Szénforrásként a táptalajban előnyösen például melaszt, glükózt, dextrint és glicerint használunk. Nitrogénforrásként például szójalisztet, aminosavak keverékét vagy peptonokat adagolunk. A táptalaj szervetlen sókat is tartalmaz, és általában olyan sókat adagolunk, amelyek nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, klorid-, szulfát- vagy más ionokra disszociálnak. Mint ahogy más mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez is szükség van, a találmány szerinti eljárás során is adagolunk eszenciális nyomelemeket. Ezeket a nyomelemeket a táptalaj egyéb összetevői általában tartalmazzák.

A Streptomyces sejteket levegőztetett fermentációs körülmények között széles pH-tartományban, 5 és 9 közötti pH-η tenyésztjük, 15 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten. A plazmid stabilitása és fenntartása érdekében előnyös, ha a tenyészetet 7,2 pH-júra állítjuk be, és a tenyésztési hőmérsékletet 30 °C-ban választjuk meg.

A tobábbiakban példákkal szemléltetjük és írjuk le a találmány szerinti eljárást. Az eljárást nem limitáljuk a példákban megadottakra, a reagenseket és eszközöket kényelmi szempontból választottuk meg, és nem limitáljuk a találmányt. Az adott folyamatot, illetve a magyarázatokat a megfelelő helyen megadjuk.

1. példa

Az FP43 izolálása a Streptomyces griseofuscus

C581 (FP43) törzsből

A) Az oldatok felsorolása

A példák során az alábbi összetételű oldatokat használjuk.

1. P-oldat (100 ml):
Összetevő	Mennyiség
szacharóz	10,3 g
dikálium-szulfát	0,025 g
nyomelem-oldat (lásd no. 2)	0,2 ml
magnézium-kloridxó H2O	0,203 g
víz	80 ml.
Sterilezés után (autokláv) a következő összetételű
elegyet adagoljuk:
kálium-dihidrogén-foszfát (0,5%)	Imi
kalcium-kloridx2 H2O (3,68%)	10 ml
(N-trisz-(hidroxi-metil)-metil-
2-amino-etán-szulfonsav),
TES-puffer, 0,25 mól,
pH = 7,2	10 ml.
2. A nyomelem-oldat összetétele (11):
Összetevő	Mennyiség
cink-klorid	40 mg
vas-tirkloridx6 H2O	200 mg
réz-kloridx2 H2O	10 mg
mangán-kloridx4 H2O	10 mg
dinátrium-borátxlO H2O	10 mg
(NH^öMoyO^HaO	10 mg
VÍZ	11.
3. R2 regeneráló táptalaj, módosított R2 táptalajként is
ismeretes (11):
Összetevő	Mennyiség
szacharóz	103 g
dikálium-szulfát	0,25 g
nyomelem-oldat	2 ml
magnézium-kloridxó H2O	10,12 g
glükóz	10 g
L-aszparaginxl H2O	2,0 g
kazaminosav	0,1 g
agar	22 g
víz körülbelül 700 ml.
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,2-re állítjuk be.
Sterilezés után a következő vegyületeket adagoljuk:
kálium-dihidrogén-foszfát (0,05
g/lOOml)	100 ml
kalcium-klorid (2,22 g/100 ml)	100 ml
TES-puffer (5,73 g/100 ml, pH = 7,2)	100 ml.
4, Lágy-agar (SNA, 11):
Összetevő	Mennyiség
Difco Nutrient leves	8g
agar	5g.
5. Az R2YE táptalaj azonosaz R2 táptalajjal, de 1-en-
ként 20 ml 25%-os élesztőkivonat-oldatot adago-
lünk.
6. Élesztőkivonat-malátakivonat (YEME, 11):
Összetevő	Mennyiség
élesztőkivonat	3g
pepton	5g
malátakivonat	3g
glükóz	10 g.

HU 209 151 Β

7. Az YEME + 34% szacharóz folyékony komplett táptalaj azonos az YEME táptalajjal, de 340 g/1 szacha-
rózt adagolunk hozzá. 8. YMX táptalaj (11): Összetevő	Mennyiség
élesztőkivonat	3g
malátakivonat	3g
glükóz	2g
agar	20 g.
9. Az YMX agar 0,3% élesztőkivonatot, 0,3% maláta-
kivonatot, 0,2% dextrózt és 2,0% agart tartalmaz.
10. CSI táptalaj (11):
Összetevő	Mennyiség
szójaliszt	15 g
kazein	lg
cerelóz	25 g
szeder-melasz	3g
kalcium-karbonát	2,5 g
Czapek ásványi oldat	2 ml
ionmentes víz	11.
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,2-re	állítjuk be.
11. Czapek ásványi oldata (11):
kálium-klorid	lOOg
magnézium-
szulfátx7 H2O	100 g
ionmentes víz	900 ml.
100 ml, 2 ml tömény sósavat tartalmazó ionmentes
vízben 2 g vas-szulfátot (7 H2O) oldunk. Ezt az oldatot
a fenti kálium-klorid/magnézium-szulfát elegyhez ad-
juk a Czapek ásványi elegy előállítására.
12. Bennett agar (11):
Összetevő	Mennyiség
ionmentes víz	1000 ml
burgonya-dextrin	10 g
N-Z Amine A (Sigma
Chemical Co,
St. Luis, MO)	2g
*Gibco bakto-agar	15 g
Gibco húskivonat	2g
élesztőkivonat	lg
Czapek ásványi oldat	2 ml.

* = Oibco Laboratories, 3175 Staley Road, Grand Island, N. Y. 14 072.

13. NC leves:

Az NC leves 1 1 ionmentes vízben 8 g Difco (P. 0. Box 1058, Detroit, MI 48232) nutrient levest és 4 mmól kalcium-nitrátot tartalmaz.

14. TES-puffer:

A TES rövidítés megfelel a 2-[(trisz-/hidroxi-metil/-metil)-amino]-etán-szulfonsavnak. A TES-puffer előállítására 1 mólos TES sav-oldatot (125,6 g/500 ml) azonos térfogatú 1 mólos TES bázis-oldattal elegyítünk, és desztillált vízzel úgy hígítjuk, hogy TES végkoncentrációja 0,25 mól/1 legyen.

15. Sevag elegy:

A Sevag elegy kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegye.

16.0-puffer:

A 0-puffer 10 mmól/1 TES oldatot és 10 mmól/1 kalcium-nitrátot tartalmaz.

17. TE-puffer:

A TE-puffer 10 mmól/1 trisz-hidrogén-kloridot tartalmaz, pH = 8,0, továbbá 1 mmól/1 dinátrium-etiléndiamino-tetraecetsavat.

18. R2 réteg (11):

Összetevő Mennyiség szacharóz 103 g magnézium-klorid 10,12 g

0,151 mólos kalcium-klorid-oldat 100 ml

TES-puffer 100 ml

Gibco agar 4,1 g desztillált víz 11-re feltöltve.

19. TSS leves:

A TSS leves előállítására 51,9 ml 60%-os szacharóz-oldatot 250 ml-re töltünk fel TSB-oldattal. A TSSoldat annyi glicint tartalmaz, hogy végkoncentrációja 0,5% legyen.

B) A fág izolálása

A fág lizátum és a dezoxi-ribonukleinsav előállítására lényegében Cox és Baltz módszere szerint járunk el [J. Bacteriol., 159, 499-504 (1984)]. A Streptomyces griseofuscus C581 (FP43) tenyésztését NRRL 18 184 sorszámon rendelhetjük meg az alábbi törzsgyűjteményből: Northern Régiónál Research Center, Agricultural Research Service, Peoria, IL 61604. A fagyasztva szárított tenyészettel 10 ml NC táptalajt oltunk, majd 29 °C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet egy éjszakán át (16 óra), rázógépen. Centrifugáljuk a tenyészetet a sejtek és a sejttörmelék előállítására, a felülúszót 0,45 μ pórusnagyságú szűrőn szűrjük, és a szűrletet, amely az FP43 fágrészecskéket tartalmazza, megőrizzük.

A Streptomyces griseofuscus C581 fagyasztva szárított tenyészetét ATCC 23916 sorszámon rendeljük meg az alábbi törzsgyűjteményből: American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852. A fagyasztva szárított tenyészettel 10 ml TSB táptalajt [Baltimore Biological Laboratories, Inc. (BBL), P. O. Box 243, Cockeysville, MD 21031] oltunk 50 ml térfogatú lombikban. A tenyészetet rázógépen inkubáljuk egy éjszakán át 29 °C hőmérsékleten.

A Streptomyces groseofuscus C581 16 órás tenyészetéből 100 μΐ térfogatú alikvot mintákat készítünk, és sorrendben 1,0 ml, 100 μΐ, 10 μΐ és 1 μΐ lizátummal keverjük. Ezután az elegyeket egyenként NC agaira (NC leves 15 g/1 agarral) szélesztjük, 100x15 mm méretű Petri-csészékben. A tenyészeteket egy éjszakán át 34 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Reggel megvizsgáljuk a lemezeket, és a teljes lízist mutató tenyészeteket felhasználjuk az FP43 fág törzsoldatának előállítására. Az FP43 törzsoldat előállítására 5 ml NC levest adunk a teljes lízist mutató lemezekhez, szobahőmérsékleten 1-2 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd összegyűjtjük a táptalajt. Az oldatot centrifugáljuk, és a kapott felülúszót 0,45 μ méretű szűrőn át szűrjük a sejttörmelék eltávolítására. A kapott FP43 törzsoldat általában

HU 209 151 Β

ΙΟ⁹—10^1θ FP43 fágrészecskét tartalmaz ml-enként, a pontos titert a fág törzsoldat titrálásával határozzuk meg érzékeny törzset, például S. griseofuscus C581 sejteket használva.

C) A fág dezoxi-ribonukleinsav izolálása

Az FP43 fág dezoxi-ribonukleinsavának izolálására az 1. példa B) pontjában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy 4-6,18x18 cm átmérőjű Petri-csészét használunk. A lemezeket 50 ml NC táptalajjal mossuk, a fágrészecskék összegyűjtésére. A lizátumot centrifugáljuk, és a felülúszót 0,45 μ pórusnagyságú szűrőn szűrjük, a setjttörmelék eltávolítására. Ezután 2 órán át 25 °C hőmérsékleten centrifugáljuk a lizátumot, percenként 30000-et forduló rotorban, a fágrészecskék ülepítésére. Az üledéket 1-1 ml 0-pufferban ülepítjük, a kivált anyagok eltávolítására. Ezután cézium-klorid gradiensen rétegezve a felülúszót, centrifugálunk. A céziumklorid gradienst a legsűrűbbtől a legkévésbé sűrű rétekig haladva a következőképpen készítjük el: 750 μΐ, 1,7 g/cm^{2 3} fajsúlyú cézium-klorid-oldat 0-pufferban; 750 μΐ,

1,4 g/cm³ cézium-klorid-oldat 0-pufferban, és 2,45 ml FP43 fág szuszpenzió 0-pufferban.

A gradienst poli-allomer csőben készítjük el, a csövet SW50.1 rotorba helyezzük (Beckman Instruments, Inc., Spinco Division, Ρ. O. Box 10200, Palo Alto, CA 94304). Az oldatot 15 °C hőmérsékleten 1 órán át centrifugáljuk, a rotor percenként 25 000-et fordul. A centrifugálás után két csíkot látunk a csőben, a felső barnás színű, az alsó kékes. A lenti réteget egy injekcióstű segítségével összegyűjtjük, és 2-3 1 0-pufferral szemben egy éjszakán át dializáljuk.

A dializált oldatot 30 percen át 1,5 térfogat alábbi összetételű eleggyel extraháljuk:

0-puffer és telített fenol (15 ml fenol és 10 ml puffer), majd 10 percen át 0-pufferral telített fenol 1,5 térfogatnyi mennyiségével újra extrahálunk. Ezután 1 térfogat Sevag-oldattal háromszor extraháljuk a fágokat tartalmazó szuszpenziót. 0,1 térfogat 3 mólos nátrium-acetát-oldattal (pH=8,0) és 1 térfogat izopropanollal kicsapjuk a fág dezoxi-ribonukleinsavat. Az FP43 fág kivált dezoxiribonukleinsavát ezután összegyűjtjük az oldatból, 70%os etanollal mossuk, és 1 ml TE-pufferben oldjuk, amiután ml-enként 0,5 mg FP43 fág dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot kapunk.

2. példa

A pRHBlOl plazmid előállítása

A plazmid előállítását lényegében Bimbóim és Doly [Nucleic Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)], valamint Kieser [Plasmid, 12, 19-36 (1984)] módszere szerint végezzük.

A) A pIJ702 plazmid izolálása

A Streptomyces lividans/pIJ702 (ATCC 39 155) liofilizált tenyészetével 10 ml, 25 μg/ml tiosztreptont tartalmazó TSS táptalajt oltunk. A tenyészetet 29 °C hőmérsékleten addig inkubáljuk, míg a sejtek növekedése korai stacioner fázisba ér. Ezután homogenizáljuk a tenyészetet, és 5 ml-t használva 100 ml, tiosztreptont tartalmazó TSS táptalajt oltunk. A 100 ml térfogatú tenyészetet 29 °C hőmérsékleten növesztjük addik, míg a Streptomyces lividans/pIJ702 sejtek növekedése stacioner fázist ér el.

Összegyűjtjük a sejteket, és egyszer 10,3% szacharózt tartalmazó oldattal mossuk. Ezután 24 ml 20,3%os szacharóz-oldatban szuszpendáljuk a sejteket, és 6 ml alábbi összetételű 5X lizozim-oldatot adagolunk:

trisz-hidrogén-klorid, pH=8,0,

125 mmól/1 dinátrium-etilén-diamino-tetraecetsav, pH=8,0, mg/ml lizozim és 10,3% szacharóz.

Az oldatokat összekeverjük, és 30-60 percen át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 18 ml alábbi összetételű oldatot adagolunk:

0,2 mmól/1 nátrium-hidroxid és

1,0% nátrium-dodecil-szulfát.

Az oldatot adagolás előtt 50 °C hőmérsékletre melegítjük. Az összekevert elegyet 10 percen át 80 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután szobahőmérsékletre hűtjük, és 12 ml oldathoz 500 g fenolt, 500 g kloroformot és 0,5 g 8-hidroxi-kinolint adunk 200 ml vízben. Az elegyet jól elkeverjük a sejtextraktummal. Centrifugálással (10 perc, 6000-8000 fordulat/perc) elkülönítjük a fázisokat, és a kapott 45 ml felső fázist egy tiszta edénybe öntjük.

Ezután 4,5 ml 3 mólos nátrium-acetát-oldatot és 50 ml izopropanolt adunk a felülúszókhoz, majd összekeverjük az elegyet, és 30 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk. 30 percen át, percenként 8000-et forduló rotorban centrifugáljuk az oldatot, és a kapott felülúszót kiöntjük. A leülepedett anyagot 7,5 ml TE-pufferban (10 mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,0 és 1 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav) szuszpendáljuk, az oldat 8 g cézium-kloridot tartalmaz. Az oldathoz 0,5 ml, 10 mg/ml töménységű etídium-bromid-oldatot adunk, majd 48 órán át 20 °C hőmérsékleten cenrtrifugálunk olyan rotorban, amely percenként 40 000-et fordul. A plazmidcsíkot tartalmazó frakciót 3-5 alkalommal TE-pufferral telített izopropanollal extraháljuk a cézium-klorid és az etídium-bromid eltávolítására. Az extrakciók után 4 térfogat TE-pufferral hígítjuk a mintát, és ezután 2,5 térfogat etanolt adagolunk. A kapott oldatot összekeverjük, és egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

Az éjszakai -20 °C hőmérsékleten való inkubáció után kivált csapadékot centrifugálással (30 perc, 10000 fordulat/perc) összegyűjtjük, szárítjuk és etanollal kétszer újra kicsapjuk. A csapadékokat TE-pufferban szuszpendáljuk, és a kicsapásokhoz 0,3 mól/1 végkoncentrációig nátrium-acetátot és 2,5 térfogat etanolt adunk, majd 10-15 percen át -70 °C hőmérsékleten hűtjük a mintákat, ezután pedig a fentiek szerint centrifugálunk. Az eljárás végén 100 μg pIJ702 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, amit 1 μg/μl koncentrációban TE-pufferban oldunk, és 4 °C hőmérsékleten tárolunk. A pIJ702 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 1. ábrán adjuk meg.

μg (3 μΐ) pIJ702 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk 5 μΐ alábbi összetételű 10X Sphl pufferhoz:

HU 209 151 Β mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4,

1,5 mól/1 nátrium-klorid, mmól/1 magnézium-klorid,

100 mmól/12-merkapto-etanol, mg/ml marha szérum albumin, μΐ víz és μΐ (20 egység) Sphl restrikciós enzim.

A restrikciós enzimek egységének meghatározása megfelel, ha másképpen nem jelezzük, a New England Biolabs., 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915-9990, által megadottnak.

A kapott reakcióelegyet 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. 5 μΐ alábbi összetételű 10X kinázpuffert, 10 μΐ kináz-pufferral 1:3 arányban hígított alkalikus foszfatáz, (CAP, Boehringer-Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive, P. O. Box 50816, Indianapolis, IN 46 250) és 35 μΐ vizet adunk a pIJ702 plazmid dezoxi-ribonukleinsav Sphl enzimmel emésztett oldatához: a 10X kináz-puffer összetétele:

0,1 mól/1 magnézium-klorid, mmól/1 ditio-treitol (DTT) és 0,5 mól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH=9,5.

A reakcióelegyet 30 percen át 38 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 65 ’C hőmérsékletre helyezzük, és további 10 μΐ mennyiségű, 1:3 arányban hígított alkalikus foszfatáz-oldatot adagolunk, és 30 percen át 65 ’C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután újra 10 μΐ 1:3 arányban hígított alkalikus foszfatáz-oldatot adagolunk, és újra inkubálunk 30 percen át, 65 ’C hőmérsékleten. Ezután az Sphl endonukleázzal emésztett, alkalikus foszfatázzal kezelt pIJ702 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 0-pufferral telített fenollal kétszer extraháljuk, ezután az extrakciót éterrel háromszor megismételjük, összegyűjtjük az extraktumot, és az elegy nátrium-acetát koncentrációját 0,3 mól/l-re állítjuk be, majd ezután 2 térfogatnyi etanolt adagolunk, és -70 ’C-ra hűtjük az elegyet, ezt követően pedig a kicsapott dezoxi-ribonukleinsavat centrifugálással összegyűjtjük. A csapadékot 50 μΐ TE-pufferban oldjuk.

μΐ TE-pufferban oldott 7,5 μg FP43 fág dezoxiribonukleinsavat adunk 5 μΐ 10X Sphl puffer, 20 μΐ víz és 5 μΐ (20 egység) Sphl restrikciós enzim oldatából készült elegyhez, és a reakcióelegyet 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Az Sphl enzimmel emésztett FP43 fág dezoxi-ribonukleinsavat ezután kétszer extraháljuk 0-pufferral telített fenollal, háromszor éterrel extraháljuk, a terméket etanollal kicsapjuk és 50 μΐ TE-pufferban szuszpendáljuk.

Az Sphl enzimmel emésztett, alkalikus foszfatázzal kezelt plazmid (pIJ702) dezoxi-ribonukleinsavat hozzáadjuk az Sphl enzimmel emésztett FP43 fág dezoxiribonukleinsavhoz, az elegyhez 37,5 μΐ 10X ligáz puffért és 219 ml vizet adunk. A 10X ligáz puffer összetétele a következő:

660 mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,0, mmól/1 magnézium-klorid,

200 mmól/1 ditio-treitol, mmól/1 adenozin-trifoszfát és 50 μg/ml marha szérum albumin.

A dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 19 μΐ T4 dezoxiribonukleinsav ligáz enzimet adunk, és a reakcióelegyet egy éjszakán át (16 óra) inkubáljuk 15 ’C hőmérsékleten. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a pRHBlOl dezoxi-ribonukleinsavat. A pRHBlOl plazmid restrikciós és funkcionális térképét a leíráshoz mellékelt 2. ábrán adjuk meg.

A ligáit dezoxi-ribonukleinsavat kicsapás és 10 μΐ TE-pufferban való leszuszpendálás után felhasználjuk a Streptomyces lividans TK23 sejtek transzformálására. A transzformálást a 4. példában megadottak szerint végezzük.

3. példa

A pRHB106 plazmid izolálása

A pRHB 106 plazmidot az előző példában megadottak szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pIJ702 plazmid helyett a pMT660 plazmidot használjuk. Ugyanakkor, a pRHB106 plazmidot úgy is megkaphatjuk, hogy izoláljuk a Streptomyces griseofuscus C581 (törzsgyűjteménybeli száma: NRRL 18183) törzsből.

A pRHB106 plazmidot nem kell izolálnunk az FP43 fág genomiális génkönyvtárából, ahogy azt a 2. és a 4. példában a pRHBlOl izolálása kapcsán megadjuk. Használhatjuk az S. griseofuscus C581/pRHB106 jelű törzset a transzdukáló lizátum előállítására, ahogy azt a 4. példában megadjuk. A transzdukcióra használható lizátum tartalmazza azokat a fág részecskéket, amelyekbe beépült a pRHB106 dezoxi-ribonukleinsav, és amelyeket az 5. példában megadottak szerint felhasználhatunk transzdukcióra.

4. példa

A pRHB 106 plazmid azonosítása; az FP43 hft szekvenciát tartalmazó vektor izolálásának szemléltetése

Az alábbiakban megadott eljárást használhatjuk bármely hft szekvenciát tartalmazó FP43 restrikciós fragmens azonosítására. A 2. példában megadottak szerint előállított FP43 fág genomiális könyvtár tartalmazza a hft szekvenciát tartalmazó pRHBlOl plazmidot. Az alábbiakban megadjuk, hogy a pRHB 101 plazmidot hogyan izoláljuk a genomiális könyvtárból. Röviden szólva, az eljárás során először protoplasztokká alakítjuk a Streptomyces lividans TK23 sejteket. A mel^-, tsrR fenotípus alapján azonosított transzformánsokat megvizsgáljuk az FP43 dezoxi-ribonukleinsavinszert nagyságára. Egy sor plazmidot izolálunk, amelyek mindegyike különböző Sphl restrikciós fragmenst tartalmaz, és tartalmaz egy FP43 fágból származó DNS-szakaszt, ezekkel S. griseofuscus sejteket transzformálunk. Az S griseofuscus transzformánsokat FP43 fággal fertőzzük, lizátum előállítására. A lizátumokat megvizsgáljuk S. griseofuscus transzdukciós képességük szempontjából. A legmagasabb transzdukciós frekvenciát adó lizátum tartalmazza a fág részecskékbe beépült pRHB 101 plazmidot.

A) A Streptomyces lividans transzformációja

A Streptomyces lividans TK23 (NRRL 15 826) törzset 10 ml TSS táptalajon tenyésztjük 40-48 órán át

HU 209 151 Β °C hőmérsékleten. Homogenizáljuk a tenyészetet, és ultrahanggal feltárjuk, a micélium fragmenseit centrifugálással elkülönítjük, és 10 ml P-oldattal egyszer mossuk. A centrifugálást 10 percen át végezzük 800 g gyorsulással. A micélium fragmenseit 10 ml, 5-10 mg/ml tojásfehérje lizozimot (Calbiochem-Behring, P. O. Box 12087, San Diego, CA 92112) tartalmazó P-oldatban reszuszpendáljuk. Az elegyet 1 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ez alatt az idő alatt a micéliumdarabok fellazítására egyszer-kétszer pipettázással keverjük az elegyet. A protoplasztokat centrifugálással (10 perc, 800 g) elkülönítjük, és kétszer 10 ml P-oldattal mossuk. Ezután 10 ml P-oldatban szuszpendáljuk a protoplasztokat.

200 μΐ protoplaszt szuszpenziót és 0,3-0,5 μg ligáit, a 2. példában megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsavat elegyítünk transzformáció céljára. 0,5 μΐ 20%-os P-oldattal készült PEG 1000 (polietilén-glikol) vegyületet adagolunk a protoplasztdezoxi-ribonukleinsav keverékhez. Ezután egyszerkétszer pipettázzuk az elegyet a jobb keveredés elősegítésére.

Ezután szélesztjük a szuszpenziót. A sejteket R2 táptalajra szélesztjük, 3-4 ml R2 réteget használunk lemezenként. Az R2 táptalajt 150 μg/ml tirozinnal egészítjük ki a mel⁺ és meU fenotípusú transzformánsok azonosítására. A regeneráló lemezek lemezenként 100 μΐ protoplaszt-dezoxi-ribonukleinsav-PEG 1000 oldatot tartalmaznak.

A tenyészeteket egy éjszakán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 25 μg/ml végkoncentrációt kialakító tiosztreptont tartalmazó R2 réteggel felülrétegezzük. 30 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást. Az intakt tirozináz (mel) gént tartalmazó transzformánsok tirozin jelenlétében növesztve fekete színűek.

A tiosztreptonra rezisztens, fehér színű transzformánsokat izoláljuk, és több telepből kiindulva 10-10 ml, 25 Rg/ml tiosztreptont tartalmazó TSB táptalajt oltunk velük. A tenyészeteket homogenizáljuk, és ezután rázógépen növesztjük egy éjszakán át, 30 °C hőmérsékleten.

Analízisre plazmidot izolálunk, ezt a 2. példa A) pontjában megadottak szerint végezzük. A 2. példa A) pontjában megadott cézium-klorid gradiens centrifugálás helyett etanolos kicsapásokat végzünk. Centrifugálással összegyűjtjük a micéliumot, kétszer 10,3%-os szacharóz-oldattal mossuk, és ezután 1-2 ml 10,3%-os szacharóz-oldatban szuszpendáljuk. 400 μΐ sejtszuszpenziót kis csőbe helyezünk, és 100 μΐ lizozimoldatot adunk hozzá. 30-60 percen át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk a szuszpenziót, majd 300 μΐ 0,3 mólos, 1% nátrium-lauril-szulfátot tartalmazó nátriumhidroxid-odlattal keverjük. Az utóbbi oldatot a sejtkeverékhez adagolása előtt 50 °C hőmérsékleten tartjuk. 10 percen át 80 °C hőmérsékleten tartjuk a sejtkeveréket, majd szobahőmérsékletre hűtjük, és ezután fenol és kloroform 50:50 arányú elegyének 200 μΐ-ével extraháljuk. A vizes fázist tiszta csőbe helyezzük, nátrium-acetát végkoncentrációját 0,3 mól/l-re állítjuk be, és ezután 1 térfogat izopropanolt adunk hozzá. 5 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, majd centrifugálással ülepítjük. 400 μΐ TE-pufferban oldjuk az üledéket, és nátrium-acetát koncentrációját 0,3 mól/l-re állítjuk be. Ezután 2,5 térfogat etanolt adagolunk, és 30 percen át -70 °C hőmérsékleten inkubálunk. Centrifugálást és még egy kicsapást követően 50 μΐ TE-pufferban szuszpendáljuk a kapott dezoxi-ribonukleinsavat.

A plazmid szerkezetének meghatározására restrikciós enzimes analízist és elektroforézist végzünk.

Az eljárással több, különböző plazmidot izolálunk, mindegyik különböző FP43 fágból származó Sphl restrikciós fragmenst tartalmaz.

B) A Streptomyces griseofuscus C581 (ATCC 23 916) transzformálása

A 4. példa A) pontjában megadottak szerint izolált plazmidokkal Streptomyces griseofuscus C581 sejteket transzformálunk. A 4. példa A) pontjában S. lividansra megadottak szerint eljárva 16 órás, 10 ml térfogatú S. griseofuscus tenyészetet állítunk elő. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, 3 ml P-oldattal mossuk, és 3 ml, 5—10 mg/ml lizozimot tartalmazó P-oldatban szuszpendáljuk. Egy órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk a sejteket, centrifugálással összegyűjtjük, 3 ml P-oldattal kétszer mossuk, majd 3 ml P-oldatban reszuszpendáljuk. A 4. példa A) pontjában megadottak szerint előállított mindegyik plazmidot (körülbelül 0,5 μg₎ 10 μΐ TE-pufferban) 150 μΐ protoplaszt szuszpenziójához adjuk. Ezután mindegyik protoplaszt-dezoxi-ribonukleinsav-elegyhez 100 μΐ 55%-os polietilén-glikol 1000 oldatot és 1 ml P-oldatot adunk. A sejteket szélesztjük, és tiosztreptont tartalmazó réteggel felülrétegezzük, ahogy azt a 4. példa A) pontjában megadtuk.

C) Lizátum előállítása és transzdukció

A 4. példa B) pontjában megadottak szerint mindegyik plazmidra kapott több transzformánst használunk fel FP43 fággal lizátumok előállítására, ahogy azt az 1. példában megadtuk. A lizátumokkal azután Streptomyces griseofuscus C581 sejteket transzdukálunk. A transzdukció kivitelezésére először 16 órás S. griseofuscus C581 tenyészetet állítunk elő, a tenyészetet homogenizáljuk és ultrahanggal kezeljük, majd több 100 μΐ térfogatú alikvotot különítünk el. Mindegyik mintához 100 μΐ, az előzőek szerint előállított lizátumot adunk, egyrészt töményen, másrészt sorozathígításokat követően, ezt követően R2 agarra szélesztünk, és R2 táptalajjal felülrétegezünk. A rétegben, a szélesztést követően legfeljebb a 6. órában tiosztreptont adagolunk. A legnagyobb számú tiosztrepton-rezisztens transzduktánst adó lizátum tartalmazza az FP43 fágrészecskékbe pakolt pRHBlOl plazmidot.

5. példa

A transzduktánsok előállítása

A 4. példa C) pontjában Streptomyces griseofuscusra leírt transzdukciós módszer általánosan használható aktinomicetákra. A transzdukció alapvetően azt igényli, hogy egy mikroorganizmus tenyészetet egy

HU 209 151 Β transzdukáló lizátummal keverjünk össze, és a kapott keveréket szélesszük. Ha FP43 antiszérumot használunk a transzdukció során, úgy az antiszérumot a sejtek szélesztését követően 3-6. órában kell adagolnunk. Kényelmes, ha az antiszérumot a felülrétegezéskor adagoljuk. Ha az antiszérumot a 6. példában megadott eljárás szerint állítjuk elő, úgy transzformációs lemezenként csak 3 μΐ antiszérumot adagolunk. Előnyös, ha a tiosztreptont az antiszérumot tartalmazó és felülrétegezésre használt táptalajjal együtt adagoljuk.

6. példa

FP43 bakteriofággal szembeni patkány poliklonális antiszérum előállítása

Az FP43 bakteriofágot 20 mmól/1 trisz-hidrogénkloridot és 4 mmól/1 kalcium-nitrátot tartalmazó, 8,0 pH-jú oldatban levő szuszpenzióként használjuk. A szuszpenziók alikvot mintáit adjuváns keverék emulzióként felhasználva, 4-4 új-zélandi fehér patkányt immunizálunk.

Mindegyik immunizálást vizes-olajos bakteriofág szuszpenzióval végezzük, két adagban adagolva a fágot. Mindegyik patkány 1,32χ10^1θ-3,44χ10^1θ fágot kap hat-hat alkalommal, 16 hétig tartó immunizálás során. A bakteriofágot 1-1,6x10” fág/ml fágtöménységű szuszpenzióként használjuk. 0,858-1,17 ml-nyi szuszpenziókat legalább 1,0 ml steril vízzel keverve adagolunk 1 ml adjuvánshoz. A vizes fág szuszpenzió olajos emulzióban való diszpergálását Sorvall OmiMixerrel végezzük. Az összes emulziókészítés céljából végzett kísérletet jeges vízfürdőben végezzük. A primer emulziót 5 percen át, 4 percen át, végül 1 percen át keverjük 5., 6., illetve 7. fokozaton.

A primer diszperziót mikroszkópon vizsgáljuk annak ellenőrzésére, hogy a diszperzió kicsiny, homogén cseppekből áll, és a fág nagyobb, egységes nagyságú olajcseppekben van. Egy kis csepp emulziót víz felületére cseppentünk, a használható emulzió nem terjed szét. A sűrű, krémszerű emulziót ezután 2 ml nátriumklorid-oldatban reemulzifikáljuk, a fiziológiás sóoldathoz előzőleg 2% Tween 80-at (poliox-etilén-szorbitánmonooleát, Sigma) adagolunk. A kapott, szabadonfolyó emulziót használjuk a patkányok immunizálására. Az első immunizációt Bacto adjuvánssal végezzük. Ez egy komplett H37Ra adjuváns (Difco Laboratories), amely 1 mg megölt és szárított Mycobacterium tuberculosis H37Ra sejtet tartalmaz adjuváns ml-enként, 15% arlacel A (mannid-monooleát) és 85% bayol F (paraffin olaj) mellett. Az összes további immunizációt Bacto adjuvánssal végezzük, inkomplett Freund (Difco Laboratories) oldattal, amely azonos a komplettel, de nincs benne Mycobacterium.

Az immunizációkat 0,86 ml emulzióval végezzük. Az első immunizáció a 0. napon 0,25 ml adjuváns intravénás adagolásával történt, a többi részt intramuszkulárisan adagoljuk. A harmadik immunizációs beavatkozástól kezdve mindegyik oldatba 1 ml, 10 mg Benadrylt (difenil-hidramin-hidroklorid, Park-Davis) adagolunk, és az injekciókat két helyre adagoljuk intramuszkulárisan.

Az alábbiakban közöljük az immunizációs kísérletet és az adagolt bakteriofágok számát:

Hét	Nap	Az utolsó immunizálás óta eltelt napok száma	Az adagolt bakteriofágok száma
1	0	-	3,00x10’°
2	9	9	3,00x10'°
6	35	26	1,89x10'°
8	49	14	1,32x10’°
9	62	13	1,81x10'°
14	93	31	1,60x10'°
16	105	12	vérvétel

Az utolsó immunizációt követő 12. napon a patkányok füleinek centrális artériáját megnyitjuk. A vért 37 °C hőmérsékleten 30 percen át alvasztjuk, majd jégfürdőre helyezzük egy éjszakán át. A vérrögöket centrifugáljuk, és a szérumot elkülönítjük. A szérum tartalmazza az FP43 antiszérumot, amelyet az 5. példában használunk.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás aktinofág hft szekvenciájának izolálására, azzal jellemezve, hogy

   a) egy aktinofág dezoxi-ribonukleinsavából egy aktinomicetákban replikációra képes vektorral genomiális génkönyvtárat készítünk;

   b) a génkönyvtár vektorait aktinofággal fertőzhető gazdasejtbe transzformáljuk;

   c) összegyűjtjük a kapott lizátumot;

   d) a lizátummal Actinomycetales rendbe tartozó mikroorganizmust transzdukálunk;

   e) a d) lépésben nagy gyakorisággal transzdukáló vektorokat izoláljuk, és

   f) a vektorból izoláljuk a hft szekvenciát.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás egy Streptomyces fágból származó hft szekvencia izolálására, azzal jellemezve, hogy egy Streptomyces fág dezoxi-ribonukleinsavából készítünk genomiális génkönyvtárat.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás FP43 fágból származó hft szekvencia izolálására, azzal jellemezve, hogy az FP43 fág dezoxi-ribonukleinsavából készítünk genomiális génkönyvtárat.
4. 4. Eljárás Actinomycetales gazdasejt transzformálására, azzal jellemezve, hogy a sejtet olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorral transzdukáljuk, amely tartalmaz

   a) egy aktinofágból származó hft szekvenciát;

   b) egy plazmid eredetű replikációs origót;

   c) egy szelektálható markert.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet FP43 fágból származó hft szekvenciát tartalmazó vektorral transzdukáljuk.
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hft szekvenciaként az FP43 fág 7,8 kb nagyságú

   HU 209 151 Β

   Sphl restrikciós fragmensét tartalmazó vektorral transzdukálunk.
7. 7. A 4—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás egy Streptomyces gazdasejt transzformálására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a megfelelő vektorral transzdukáljuk.
8. 8. Eljárás a pRHBlOó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a plazmidot a Streptomyces griseofuscus/pRHB 106 (NRRL 18 183) törzsből izoláljuk.
9. 9. Eljárás a pRHBlOl plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy az Sphl enzimmel emésztett pIJ702 5 plazmidot ligáljuk az FP43 fág 7,8 kb nagyságú Sphl fragmensével.

   HU 209 151 Β Int. Cl.⁵: C 12 N 15/76

   A pIJ7O2 plazmid restrikciós és funkcionális térképe