HU208747B - Method for radioimmunologic detection of 9alpha, 11beta-p6f2 content and production of radioligand traced by iodine-125 isotope used in the same method - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás biológiai minták 9α,11βPGF₂ koncentrációjának radioimmunológiai meghatározására, melynek során megmérjük jód—125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású 9a,l^-PGF₂ származék mint nyomjelző anyag (továbbiakban: radioligandum vagy tracer) specifikus antitesthez való kötődését ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú standard 9a,lip-PGF₂ oldatok és a meghatározandó minták jelenlétében, majd a standardokhoz tartozó kötésváltozások ismeretében a mintákhoz tartozó kötésváltozásokból kiszámítjuk azok hatóanyagtartalmát.

A találmány szerint ebben az immunokémiai reakcióban tracerként olyan, egyes prosztaglandin típusokra már korábban síkénél alkalmazott radioligandokkal analóg szerkezetű származékot használunk, amely a találmány tárgyát képező prosztaglandin típusra még nem ismert.

A találmány tárgya továbbá ezen új szerkezetű radioligand előállítására szolgáló eljárás.

Ismert, hogy a prosztaglandin D₂ (PGD₂) enzimatikus átalakulása során - más prosztaglandinoktól eltérően - nemcsak biológiailag hatástalan, hanem az anyavegyülettől eltérő biológiai aktivitással rendelkező származékok is keletkeznek. Ezek egyik fontos képviselője a néhány éve felfedezett 9a,l^-PGF₂, vagy ll-epi-PGF_2a, amely a régóta ismert, legáltalánosabban elterjedt prosztaglandin típusnak, a PGF_2a-nak szerkezeti izomerje. Biológiai aktivitása mint a PGD₂től, mind a PGF_2a-tól eltér. Az elsődlegesen keletkező prosztanoidoktól (pl. PGE₂, PGF_2a, TXB₂) eltérően a különböző szövetekben nem általánosan elterjedt, ennek megfelelően koncentrációja még ezen prosztanoidok igen alacsony koncentrációjánál is kisebb. Emiatt megfelelő érzékenységű mérőmódszer kidolgozása még a többi prosztanoidénál is lényegesebb.

Kis koncentrációjú bioaktív anyagok gyors, olcsó, kellő érzékenységű és megfelelő pontosságú meghatározására legalkalmasabb az antigén-antitest kötésen alapuló radioimmunoassay (RIA) eljárás. A módszer olyan radioizotópos nyomjelzés, amelynek kulcsreagense a mérendő molekula kellően magas fajlagos aktivitású radioizotóppal jelzett formája (tracer).

Ilyen célra eddig kizárólag tríciummal jelzett 9a,l^-PGF₂-t alkalmaztak. A kutatási alkalmazásról csak kevés szakirodalmi forrás ismert (pl. Prostaglandins 33:517, 1987; Brain Rés. 385:321, 1986; Anal. Biochem. 182:1, 1990), és mindössze egy gyártó, az Amersham International plc. (Anglia) gyárt kereskedelmi forgalomban kapható mérőkészletet.

A tríciummal jelzett tracer előnye, hogy az izotóp viszonylag hosszú felezési ideje alapján (12 év) a tracer gyakorlatilag stabilnak tekinthető, és az ezen alapuló RIA-k pontossága, reprodukálhatósága általában igen jó. Az elérhető fajlagos aktivitás (kb. 200 Ci/mmol) általában megfelelő érzékenységet biztosít. Hátránya azonban, hogy a tracer előállítása egyedi, soklépéses kémiai-radiokémiai szintézist igényel, és a trícium mérése költséges és munkaigényes.

Számos kismolekulájú bioaktív anyag, így a prosztaglandinok esetében is a tríciummal jelzett tracer helyett sikerrel alkalmaznak olyan radioligandumokat, amelyek az alapmolekulához kötött funkciós csoporton jód—125 izotópot tartalmaznak. (Eur. J. Clin. Invest. 5:311, 1975; Biochim. Biophys. Acta 431:139, 1976; Anal. Biochem. 87:343, 1978; Prosta. Med. 4:399, 1980; Prostaglandins 16:277, 1978; Adv. Prosta. Thromb. Rés. 6:167, 1980; Izotóptechnika 22:190, 1979; J. Chromatography 189:433, 1980; Mucha István: Kandidátusi értekezés 1985.)

A jód- 125-tel jelzett tracer alkalmazásának nagy előnye, hogy nem magát az alapmolekulát kell jelzett formában előállítani, hanem egy mindössze kétlépéses egyszerű szintézissel jutunk a tracerhez. További lényeges előny, hogy az így nyert tracer fajlagos aktivitása a tríciummal jelzett tracerének akár tízszerese is lehet, és ezáltal a meghatározás érzékenysége jelentősen növelhető. A jód—125 izotóp alkalmazása ugyanakkor gazdaságos is, mivel méréstechnikája gyorsabb, egyszerűbb, és olcsóbb, és a radioimmun meghatározáshoz szükséges specifikus antitest igénye is lényegesen kevesebb.

A jód—125 izotóppal jelzett tracer felhasználásának gyakorlati hátránya, hogy az izotóp felezési ideje rövid, és a vele való műveletek sugárveszélye nagyobb a triciuménál.

A találmány célja olyan RIA eljárás kidolgozása, mellyel a 9ct,l^-PGF₂ koncentrációja egyszerűen, pontosan és az ismert eljárásnál nagyobb érzékenységgel határozható meg trícium helyett jód—125 izotóppal jelzett tracer felhasználásával. A találmány további célja az ehhez szükséges új típusú, a szakirodalomban nem ismert, jód—125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású 9α, 113-PGF₂-monoj ód-tirozin-metilészter származék előállítására szolgáló eljárás kidolgozása.

A találmány alapja az a felismerés, hogy egyéb kismolekulájú anyagokkal - így különböző prosztaglandinokkal is - analóg módon, a általános képletű vegyület radioimmun meghatározása is lehetséges jód— 125 izotóp felhasználásával, ha az alapmolekulához tirozin-metilészter csoportot kapcsolunk és ezt mint prosztetikus csoportot jód—125 izotóppal szelektíven jelöljük.

A találmány tárgya tehát biológiai minták 9α, 11βPGF₂ koncentrációjának radioimmun meghatározása, mely az ismert eljárásoktól abban különbözik, hogy tríciummal jelzett tracer helyett jód—125-tel jelzett, nagy fajlagos aktivitású 9a,l^-PGF₂-monojód-tirozin-metilésztert alkalmazunk radioaktív nyomjelző anyagként.

Ennek során úgy járunk el, hogy megmérjük a tracemek specifikus antitesttel való kötődését ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú standard oldatok, valamint a mérendő minták jelenlétében. Az így kapott értékekből az ismeretlen minták által okozott kötésváltozásokhoz tartozó 9a,ll^-PGF₂ koncentrációkat kiszámítjuk.

A találmány szerint a mérést úgy végezzük el, hogy a mérendő biológiai mintákból a hatóanyagot megfelelő módszerrel kivonjuk, majd a tracert, a hígítást sorozat szerint különböző mennyiségű standard 9α,11β2

HU 208 747 Β

PGF₂-t, illetve a mérendő mintákat specifikus antitesttel reagáltatjuk, majd az antitesthez kötött, ill. nem kötött frakciókat elválasztjuk, és mérjük a kötött frakció radioaktivitását. Az így kapott értékekből az ismeretlen minták által okozott kötésváltozásokhoz tartozó hatóanyag-koncentrációkat kiszámítjuk.

Általában 10 000 és 60 000, előnyösen 20 000 és 40 000 cpm közötti beütésszámú tracert alkalmazunk, amelyet célszerűen pufferben oldunk.

A puffer előnyösen 0,1% zselatint tartalmazó 0,01— 0,2 mólos, 7,4 pH-jú foszfát-puffer.

Az oldat konkrét összetételétől függően az inkubációs hőmérséklet 0 és 40 ’C közötti, az inkubáció időtartama 1 és 40, előnyösen 3 és 20 óra között változik.

A specifikus antitest célszerűen magas titerű, megfelelően magas (ΙΟ⁹—10¹⁰ M) affinitási együtthatóval rendelkező anti-9a,lip-PGF₂ anti-plazma. Ezt olyan hígításban alkalmazzuk, amely a standard 9α,11βPGF₂-t nem tartalmazó mintában a tracer 20-80, előnyösen kb. 40—50%-át képes megkötni.

A tracer kötött és szabad frakcióinak elválasztására előnyösen 1% csontszén szuszpenziót használunk, melyet előnyösen 0,5% dextránt tartalmazó 0,01 mólos foszfát-pufferrel (pH 7,4) készítünk. A csontszén a szabad radioligandumot megköti, és a centrifugálással kapott felülúszó tartalmazza az antitesthez kötött tracert, melynek radioaktivitását szcintillációs módszenei mérjük.

A találmány szerinti eljárás igen lényeges előnye, hogy alkalmazásával nagyon alacsony kimutatási határ érhető el; 23 független mérésből kapott statisztikai adatok alapján a legkisebb kimutatható dózis 0,855 pg (a relatív szórás 42%), míg az 50%-os tracer-kiszorításhoz tartozó koncentráció - az ID₅₀ érték - 6,45 pg (a relatív szórás 22,5%). Ezzel szemben a kereskedelmi forgalomban kapható RIA-készlet ugyanezen paraméterei 4, illetve 20 pg, a korábban említett szakirodalmi forrásokban pedig - ha az érzékenységi adatokat egyáltalán közlik - még kedvezőtlenebb értékeket találunk, így pl. a Prostaglandins 33, 517,1987 közleményben a közölt kimutatási határ 20 pg, az ID₅₀ érték pedig 150 pg.

A minél nagyobb érzékenység elérése elméleti és gyakorlati szempontból egyaránt kulcsfontosságú, mert az érzékenység növekedésének arányában csökkenthető a meghatározáshoz szükséges mintatérfogat is. Ez a 9a,llp-PGF₂ esetében azért különösen is fontos, mivel annak természetes szöveti koncentrációja olyan alacsony, hogy kevésbé érzékeny módszer alkalmazásakor túlságosan nagy térfogatú biológiai mintára van szükség elegendő hatóanyag kinyeréséhez. Ez nemcsak a meghatározás költségeit növeli jelentősen, hanem korlátozza számos olyan szövettípus kísérleti felhasználását, amelyek a kívánt térfogatban nem is gyűjthetők össze (pl. kistestű laboratóriumi állatok vérmintái stb.). A nagy mintatérfogat alapvető elvi hátránya, hogy a nagyobb térfogattal együtt nemcsak a mérendő hatóanyag, hanem a szennyező anyagok mennyisége is arányosan növekszik, és ezáltal romlik a meghatározás specificitása. Ennek kiküszöbölése további tisztítási műveletek alkalmazását igényelheti, és ez újabb jelentős többletköltséggel és munka-ráfordítással járhat. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával mindezen hátrányok a lehetséges minimumra csökkenthetők.

A találmány tárgya továbbá eljárás a radioimmun meghatározáshoz szükséges (I) képletű, nagy fajlagos aktivitású, jód—125 izotóppal jelzett 9α, 1 lp-PGF₂-monojódtirozin-metilészter (9a, 1 ip-PGF₂-TME-¹²⁵I) előállítására.

A találmány szerint az (I) képletű radioligandot úgy állítjuk elő, hogy a (II) képletű 9a,lip-PGF₂TME származékot előnyösen nagy fajlagos aktivitású, (kb. 2000 Ci/mmol; 74 TBq/mmol) Na¹²⁵I-dal reagáltatjuk célszerűen klóramin-T (para-toluol-szulfoklóramin-nátriumsó) reagens jelenlétében pufferolt közegben (előnyösen 7 fölötti pH értéken) rövid (10200 másodperc), előnyösen 30-60 másodperc reakcióidővel, úgy, hogy a (II) képletű 9a,lip-PGF₂TME származékot a Na¹²⁵I-hoz képest 20-200, előnyösen 30-50-szeres mólarányban alkalmazzuk, és a reakcióidőt úgy szabályozzuk, hogy megfelelő időpontban a rendszerben klóramin-T hatására képződő reakcióképes oxidált jódot nátrium-metabiszulfit hozzáadásával jodid ionná redukáljuk. Az (I) képletű célvegyület szintéziséhez célszerűen foszfát puffért alkalmazunk, a (II) képletű anyagot célszerűen etilalkoholos oldatban adjuk a reakcióelegyhez oly módon, hogy az etanol végkoncentrációja a 20%-ot ne haladja meg. Az (I) képletű célvegyület előállításának legfontosabb lépése az előállítani kívánt monojód-származék elválasztása az egyéb jódjelzett származékoktól, valamint a reakció befejeződése után a nagy kiindulási mólfelesleg miatt még mindig nagy feleslegben lévő (II) képletű kiindulási anyagtól. Erre célszerűen adszorbciós oszlop-kromatográfiát alkalmazunk, melyet úgy végzünk, hogy a reakcióelegyet Sephadex LH-20 oszlopra felvisszük, és növekvő etanol koncentrációjú etanol: nátrium-citrát (pH 4,0) kétkomponensű oldószereleggyel eluáljuk a különböző jódjelzett származékokat, miközben az effluens radioaktivitását folyamatosan mérjük, és az ezzel arányos jelet regisztráló készülékkel rögzítjük.

A találmány szerint célszerűen a következő oldószereket alkalmazzuk: tiszta citrát puffer (0,2 mólos, pH 4,0), majd 1 mólos citrát (pH 4,0) és etanol 4: 1 arányú elegye, ahol a tiszta végterméket az utóbbi frakcióban kapjuk meg. Az oldószerek szükséges térfogata az aktuális, és az elválasztás közben folyamatosan regisztrált elúciós profil és a képződött jelzett vegyületek összetételének (arányának) függvénye, általában a tiszta citrát pufferből 40-70 ml-t, a 4 : 1 arányú citrát: etanol elegyből pedig 30-60 ml-t alkalmazunk.

Külön előnye a találmány szerinti eljárásnak, hogy az alkalmazott apoláros dextrán gélen a jódjelzett származékok adszorbciós készsége jelentősen meghaladja a kiindulási (II) képletű inaktív anyagét, ily módon az (I) képletű célvegyület - amelyet még hatásos jódbeépülés mellett is jelentős mennyiségű (II) képletű kiindulási anyag szennyez - teljes biztonsággal választható el, és ezzel a találmány szerinti radioimmun meghatá3

HU 208 747 Β rozáshoz szükséges magas fajlagos aktivitás biztosítható.

A (II) képletű vegyületet a (III) képletű 9α,11βPGF₂ és tirozin-metilészter reakciójával állítjuk elő oly módon, hogy a 9a,llp-PGF₂-t 1-5 előnyösen 2-3 mólarányú tirozin-metil-észterrel reagáltatjuk, 1-5, előnyösen 2-3 mólarányú l-etil-e-(3'dimetil-aminopropil)-karbodiimid-hidroklorid reagens jelenlétében, célszerűen vizes tetrahidrofuránban, 0-50 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten, 3-40, előnyösen 20-24 óra időtartamig. Az oldószert vákuum-desztillációval eltávolítjuk, a maradékot célszerűen etil-acetátban oldjuk, majd az etil-acetátos oldatból híg savas extrakcióval, célszerűen 0,1 n sósavval kimossuk a változatlan tirozin-metilésztert, híg lúgos, célszerűen 0,1 n NaOHos extrakcióval pedig az el nem reagált (III) képletű vegyületet.

A terméket célszerűen vékonyréteg-kromatográfiás úton tisztítjuk, célszerűen olyan szilikagél rétegen, amely fluoreszcens indikátort tartalmaz, a kifejlesztő oldószerelegy pedig célszerűen kloroform : metanol: víz 90 : 10 : 1 térfogatarányú elegye. A terméket 254 nm-es UV-fémiyel megvilágítva mutatjuk ki.

A találmányt a továbbiakban részletesebben példák keretében magyarázzuk, amelyekre a találmány terrncszetesen nem korlátozódik.

1. példa

A jódjelzéshez használt (II) képletű köztitermék előállítása mg (2,74 mikromól) (ΙΠ) képletű 9α, 1 Ιβ-PGF^t,

1,5 mg (8,4 mikromól) l-etil-3-(3'-dimetil-aminopropil)-karbodiimid-hidroklorid-ot és 2 mg (10,5 mikromól) tirozin-metilésztert egyszerre bemérünk, hozzáadunk 100 mikroliter desztillált tetrahidrofuránt és 20 mikroliter desztillált vizet. Az elegyet szobahőfokon 24 órán át kevertetjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékot 30 ml etil-acetátban feloldjuk, és rázótölcsérbe öntjük. Ezt az oldatot sorrendben 3x2 ml 0,1 n sósavval, 3x2 ml vízzel, 3x2 ml 0,1 n nátrium-hidroxiddal és 3x3 ml vízzel összerázzuk. Minden összerázás után a vizes fázist elválasztjuk és elöntjük. Az utolsó mosás után az etil-acetátos oldatot forgóbepárló készüléken (Büchi, Svájci gyártmány) vákuumban bepároljuk. A maradék fehér, kristályos anyagot 100 mikroliter etil-alkoholban oldjuk, majd 0,25x200x 100 mm méretű Kieselgel 60 F 254 (Merck, NSZK gyártmány) szilikagél rétegre 3 cm-es sávban fel visszük, és kloroform: metanol: víz 90 : 10 : 1 térfogatarányú elegybe helyezve a kromatogrammot kifejlesztjük. Kifejlesztés után a réteget hideg levegővel szárítjuk, majd 254 nm hullámhosszú ultraibolya fénnyel megvilágítva a foltokat láthatóvá tesszük. A 0,255 Rf értékű folt helyén a réteget lekaparjuk, 10 ml etil-alkoholt teszünk rá, és 1 óra várakozás után üvegszűrőn szűrjük. A szűrőn lévő gélt 2x5 ml etil-alkohollal mossuk, az alkoholos oldatokat egyesítjük, forgóbepárlón szárazra pároljuk, és mérjük a termék súlyát, majd etil-alkohollal törzsoldatot készítünk belőle.

A kapott (II) képletű termék tömege a kromatográfiás tisztítás után 212 mikrogram, ami 14,6% kitermelésnek felel meg.

2. példa

Az (I) képletű céltennék előállítása

Az 1. példa szerint kapott 9a,l^-PGF₂-TME származék 100 mikro-gramm/ml koncentrációjú etanolos oldatából 30 mikrolitert (6,5 nmol) 1 ml-es talpas Eppendorf csőbe pipettázunk, hozzáadunk 100 mikroliter 50 mM foszfát puffért, (pH 7,4) és 57 MBq radioaktivitású hordozómentes Na¹²⁵I oldatot (MTA Izotópkutató Intézete terméke). Az elegyet összerázzuk, majd 50 mikroliter, 7 mg/ml koncentrációjú nátrium-metabiszulfit oldatot előre felszívunk a reakció leállításához. Az elegyhez ezután hozzápipettázunk 25 mikroliter

4,8 mg/ml koncentrációjú klóramin-T reagens oldatot, az elegyet összerázzuk, és pontosan 60 másodperc múlva az előre elkészített nátrium-metabiszulfit oldat hozzáadásával a reakciót befagyasztjuk.

Az elegyet ezután oszlopkromatográfiás módszerrel választjuk el, a következőképpen:

Sephadex LH-20 (Pharmacia, Svéd gyártmány) gélt desztillált vízben 24 órát duzzasztunk, majd 20x 1 cm méretű, alul elvezető, felül bevezető csővel ellátott üvegcsőbe töltjük, alkalmas oldószeradagoló perisztaltikus pumpával (LKB, Svéd gyártmány) öszszekapcsoljuk, mintegy 10 percig egyensúlyba hozzuk 0,2 mólos citromsavval (pH 4,0) mintegy 0,5 ml/perc áramlási sebességgel. Az így előkészített hordozóra a reakcióelegyet felvisszük, és az elúciót az előző oldószerrel folytatjuk. Az eluens radioaktivitását folyamatosan detektáljuk oly módon, hogy az oszlop elvezető csövét ólommal árnyékolt NaI(Tl) szcintillációs kristály (Gamma gyártmány) előtt vezetjük el, a kristályt pedig számláló berendezéssel (Gamma gyártmány) és vonalíróval (Gamma gyártmány) kötjük össze. Az effluenst mérőhengerbe gyűjtjük, az előző eluensből 50-100 ml-t alkalmazunk, majd 1 mólos citromsav (pH 4) és etil-alkohol 4 : 1 arányú elegyévcl gyűjtjük a kívánt terméket a detektáló készülékben megjelenő csúcs szerint. A radioimmun meghatározáshoz a csúcs közepének megfelelő mintegy 5 ml-es frakciót választjuk külön. Ennek radioaktivitása 13,8 MBq, ami 24,2% radioaktív hozamnak felel meg. A hozam természetesen az elérhetőnél lényegesen alacsonyabb, mivel a terméknek csak egy rész kerül gyűjtésre.

3. példa

Vérplazma 9a,ll^-PGF₂ koncentrációjának radioimmun meghatározására nyúl vénás véréből A meghatározáshoz előbb plazmamintákat gyűjtünk úgy, hogy a kísérleti állatokból a vért műanyag kémcsövekbe, 0,1 térfogatrész - 2% etilén-diamin- tetraecetsav-dinátriumsót és 1 mmol indomethacint tartalmazó - izotóniás sóoldatra vesszük, majd azonnal 4 ’C-on, 10 percig, kb. 1000 xg gyorsulással centrifugáljuk, és a tiszta plazmát különválasztjuk. A centrifugálás és a mintavétel közötti időben a vért jeges fürdőben tartjuk.

A plazmamintákat ezután oldószeres extrakciónak

HU 208 747 Β vetjük alá, a következő módon, 1 ml plazmához hozzáadunk 100 mikroliter 2 mólos citromsav oldatot, majd az elegyet injekciós fecskendőbe pipettázzuk, és átnyomjuk a fecskendőre helyezett ún. „fordított fázisú” szilikagélt tartalmazó műanyag patronon (Amprep C₂, Amersham, Anglia gyártmány), amelyet előzőleg a gyártó cég használati utasítása szerint előkészítettünk. A tölteten ezután átnyomunk 5 ml desztillált vizet, 5 ml 10%-os etilalkoholt és 5 ml n-hexánt. Ezeket a folyadékokat előntjük, majd a patronon 5 ml etil-acetátot nyomunk át, amelyet műanyag kémcsőbe gyűjtünk. Az oldószert nitrogén gázáramban szobahőmérsékleten bepároljuk, a maradékot pedig RIA pufferben oldjuk.

7,5 ng/ml koncentrációjú 9a,llfS-PGF₂ törzsoldatból hígítási sorozatot készítünk úgy, hogy 1-1 ml térfogatú mintákat kapjunk, melyek hatóanyag-koncentrációja 6—19—56—167—500 pg/ml. Sorszámozott műanyag kémcsövekbe automata pipettával a standard és a minta oldatokból 100-100 mikrolitert bemérünk, majd hozzáadunk 100 mikroliter ¹²⁶I-9a,lip-PGF₂-TME tracert, amelynek radioaktivitása 30 000-40 000 cpm/100 mikroliter, és 100 mikroliter specifikus antiszérumot olyan lúgításban, amely a tracer 30-60%-át képes megkötni. A nem-specifikus kötődés (NSB) meghatározására további kémcsövekbe a tracerhez csak tiszta pufferoldatot teszünk, míg a specifikus kötés (Bq/T) és a teljes radioaktivitás meghatározására a standard oldatok helyett is tiszta pufferoldatot adunk az antitesthez. A térfogat valamennyi kémcsőben a művelet végén 0,4 ml lesz. A tracer és az antitest oldásához, valamint a térfogatkiegészítéshez szükséges pufferként 50 mM koncentrációjú, 7,4 pH-jú, 0,1% zselatint tartalmazó foszfát puffért használunk.

A kémcsövek tartalmát néhány másodpercig kevertetjük, majd lezárjuk, és hűtőszekrényben 4 ’C körüli hőmérsékleten egy éjszakán át állni hagyjuk. Ezután a TC csövek kivételével minden kémcsőbe folyamatos keverés közben 2-3 perc alatt bepipettázunk 0,5 ml 0,5% Dextran Τ-70-et (Pharmacia, Svédország) és 1% csontszenet (Norit-A, Serva, NSZK) tartalmazó - 0,01 mólos, 7,4 pH-jú foszfát puffer szuszpenziót, a TC csövekbe pedig azonos térfogatú RIA puffért. A csöveket az előbbiek szerint kevertetjük, majd 0 ‘C-on, 10 percig, 2000 xg gyorsulással centrifugáljuk, és a felülúszókból alkalmas mérőcsövekbe 0,5-0,5 ml-t pipettázunk, majd méqük ezek radioaktivitását Nal(Tl) szcintillációs kristállyal ellátott automatikus mintaváltó berendezésben (pl.: Minigamma, LKB, Svédország gyártmány). A számítást a radioimmun meghatározásokban szokásos módon végezzük.

A fentiekből a szakember felmérheti a találmány előnyeit a technika állásához képest. Az előnyökből kiemeljük:

A találmány szerinti eljárás segítségével elkerülhető a tríciummal jelzett 9α,11β-ΡΰΡ₂ előállításához szükséges soklépéses szintézissor alkalmazása, ehelyett kedvező feltételek között előállíthatunk olyan radioligandumot, nevezetesen az (I) képletű ¹²⁵I9a,lip-PGF₂-TME származékot, amelynek egy moláris aktivitása biztosítja a 9a,lip-PGF₂ koncentrációjának az eddig használt tríciummal jelzett tracerhez képest mintegy tízszer érzékenyebb radioimmunológiai meghatározását.

A nagyobb érzékenység eredményeképpen kisebb térfogatú biológiai minta elegendő a meghatározáshoz, és ez nemcsak gazdaságos, de elvileg is előnyös a minél jobb specifícitás elérése szempontjából.

Az alkalmazott adszorpciós oszlopkromatográfiás elválasztástechnika biztosítja a jódjelzett célterméknek a kiindulási anyagtól való tökéletes elválasztását, és ezáltal a céltermék fajlagos aktivitása nem csökken a tisztítás során.

Az alkalmazott elválasztástechnika fontos gyakorlati előnye, hogy a radiojódos jelzés során nagyobb aktivitás-mennyiségeknél is biztosítja a nyitott radioizotópokkal végzett műveletekre előírt sugárvédelmet és minimálisra csökkenti a radioaktív inkorporáció veszélyét.

Mindezek alapján a találmány szerinti új, jód—125 izotóppal jelzett radioligand alkalmazása olyan új 9a,llp-PGF₂ radioimmunoassay megvalósítását teszi lehetővé, amely miközben megőrzi a tríciummal jelzett tracert alkalmazó assay specificitását, egyúttal jelentősen növeli annak érzékenységét is. A találmány gyorsabbá és olcsóbbá válik, és jelentősen csökkenthető a méréshez szükséges antiszérum mennyisége is.

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás biológiai szövetminta 9a,lip~PGF₂ tartalmának radioimmunológiai reakción alapuló meghatározására ismert mennyiségű, hígítási sorozat szerint különböző koncentrációjú 9a,lip-PGF₂ és a biológiai szövetminta jelenlétében, amelynek során megmérjük nagy fajlagos aktivitású radioaktív nyomjelző vegyületnek (továbbiakban tracer) specifikus antitesttel való kötődését, és az ismert mennyiségű 9α, I ip~PGF₂ hígítási sorozat által okozott kötésváltozás alapján számítjuk a mindenkori szövetminta hatóanyagtartalmát, azzal jellemezve, hogy tracerként új típusú, (I) képletű ¹²⁵Ι-9α, 1 lp-PGF₂-monojódtirozin-metilészter származékot alkalmazunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy háromezer és százezer, előnyösen harmincezer és ötvenezer cpm beütésszámú tracert alkalmazunk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként nyúlban, előnyösen szarvasmarha-szcrumalbuminhoz kötött 9a,lip-PGF₂ mint immunogén anyag ellen keletkezett, anti-9a,l 1βPGF₂ antiplazmát használunk, olyan hígításban, amely a standard 9a,lip-PGF₂-t nem tartalmazó mintában a tracer 25-70, előnyösen 40—60%-át képes megkötni.
4. 4. Az 1-3. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pufferoldatként előnyösen zselatint tartalmazó foszfát puffért alkalmazunk, melynek pH-ja 6-9, előnyösen 7,0-7,5; koncentrációja 0,01-0,2 mól/1, előnyösen 0,05-0,1 mól/1 közötti.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,

   HU 208 747 Β azzal jellemezve, hogy reakcióidőnek egy és ötven, előnyösen tizenöt és huszonnégy óra közötti időtartamot, reakcióhőmérsékletnek pedig nulla és negyven Celsius-fok közötti hőmérsékletet alkalmazunk.
6. 6. Eljárás (I) képletű ¹²⁵I-9a,lip-PGF₂-TME előállítására, azzal jellemezve, hogy (II) képletű 9α,11βPGF₂-TME-t pufferolt közegben jodid ionokból elektrofil jódot képező reagens, előnyösen para-toluol-szulfoklóramin-nátriumsó jelenlétében Na^,25I-dal reagáltatjuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű terméket a (II) képletű 9α,11βPGF₂-TME-től a fajlagos aktivitás csökkenése nélkül, kromatográfiás módszerrel választjuk el.
8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű célvegyület előállításához 9ct,l^-PGF₂, tirozin-metilészter és l-etil-3-(3'-dimetil-aminopropil)-karbodiimid-hidroklorid vizes tetrahidrofuránban történő reagáltatásával előállított (II) képletű reakciótcrmékből indulunk ki.