HU195253B - Microbiological process for producing macrolide antibiotica i sposob poluchenija veterinary compositions containing these antibiotica - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás a tilozin antibiotikum-komplexnek és komponenseinek: a tilozin A-nak, a tilozin C-nek, a tilozin D-nek és a laktenocinnak, valamint állatgyógyászati és takarmányozási szempontból elfogadható sóiknak előállítására aerob fermentációval és adott esetben azt követő sóképzéssel.

A tilozin több rokonszerkezetű komponensből álló antibiotikum-komplex. A komponensek közül a hatástani szempontból legértékesebb tilozin A széles spektrumú antibiotikum, gátolja a legtöbb Gram-pozitív baktérium és számos Gram-negatív baktérium (így pl. a Hemophilus gallinarum, Pasteurella múltoddá, Sphaerophorus necrophorus, Trepanoma hyodysenteriae, Vibrio coli), valamint a mikoplazmák szaporodását. Az antibiotikum-komplex többi komponensei, így a tilozin C (makróéin), a tilozin D (relomicin) és a laktenocin főként Gram-pozitív baktériumokra hatásosak (J.M.Mc. Guire és munkatársai: Antibiotics and Chemotherapy 11, 320 (1961); H.A. Whaley és munkatársai: Antimicrobial Agents and Chemotherapy - 1963, Proceedings of theO. Intersciense Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, 1963).

A tilozin A-t tartarát és foszfát sója formájában, illetve főkomponensként tilozin A-t tartalmazó tilozin antibiotikum-komplexet premixbe keverve az állattenyésztésben és az állatgyógyászatban használják. Az állatgyógyászatban sertés dizentéria (Federal Reg., 27, 3255 (1962); Federal Reg., 30 12730 (1965)) és baromfik mikoplazmák által okozott megbetegedéseinek (Federal Register, 36, 10948 (1971); Federal Reg., 36, 11920 (1971)) kezelésére és megelőzésére alkalmazzák. Az állattenyésztésben testtömegnövelő hatását értékesítik. A tilozin növeli az átlagos napi testtömeg gyarapodást, javítja a fajlagos takarmányértékesülést, csökkenti az elhullást, javítja a húsminőséget, csökkenti az állatok felneveléséhez szükséges időt (Federal Reg., 26, 4359 (1961)).

A tilozin A-t és a tilozin B-t először R.L. Hamill és munkatársai izolálták Streptomyces fradiae mikroorganizmus tenyészetéből (3 178 341 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A.L. Jensen és munkatársai beszámoltak arról, hogy a Streptomyces hygroscopicus főként tilozin D-t termel kevesebb tilozin A mellett (A.L. Jensen és munkatársai: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1963, Proceedings of the 3. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, 1963, 49-53. oldal). Ismeretes továbbá, hogy a Streptomyces rimosus is bioszintetizál tilozin komplexet (H. Papé és G.U. Brillinger: Arch. Microbiol. 88, 25 (1973)), a Streptomyces griseospiralis pedig tilozin D-t (L.I. Feldman és munkatársai: Antimicrobial Agents Chemotherapy, 1963, Proceedings of the 3. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, 1963, 54-57. oldal). A Streptomyces thermotolerans-szal a tilozin A2 ból a 3-as és 4”-es helyzetben acilezett származékok állíthatók elő (7608411 számú holland közrebocsátási irat).

Makrolid típusú antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok természetes forrásokból való izolálására irányuló munkánk során magyarországi talajmintából elkülönítettünk egy T-13 jelű mikroorganizmust, mely tilozin antibiotikum-komplexet bioszintetizál.

E törzset az ISP (International Streptomyces Project) által javasolt morfológiai sajátságok és diagnosztikai bélyegek alapján. (B.E. Schierling és D. Gottlieb: Methods Manual International Cooperative Project fór Description and Deposition of Type cultures of Streptomycetes, Delaware, Ohio, 1964) az alábbiakban írjuk le:

Morfológia

Glicerin-aszpargin agaron (ISP Med. 5) a légmicélium gyér, sárgás. Mikroszkóp alatt a léghifák sterilek, bennük spórák nem figyelhetők meg. A szubsztrát-micélium közepesen fejlett, világos sárga színű, nem indikátor-karakterű. Oldódó pigment nincs.

Anorganikus só-keményítő agaron (ISP Med. 4) némileg fejletteb, porszerű a légmicélium, kifejezettebben sárgás, sárgásszürke színezettel. A spórafórok rövid, tömör, szabálytalan, primitív retinaculum-apertum típusú spirálok. Sok a rövid, rectus-flexíbilis spóratartó is, illetve konidiumhordozó horog és kampó. A spórák száma 10—50 között ingadozik. Felületük az elektronmikroszkópos megfigyelések szerint: sima (ornamentálatlan). A szubsztrát-micélium közepesen fejlett, jellegtelen sárgás színű, megkülönböztető exo-pigmentet nem tartalmaz, nem indikátor-karakterű. Oldódó pigment a közegben nem figyelhető meg.

Élesztőki vonat-ma lát akivonat agaron (ISP Med. 2) gyengén fejlett, steril fehér légmicélium képződik. A mikroorganizmus nem sporulál. A hifafonalakban konidiumok nincsenek jelen. A szubsztrát-micélium halványsárga, jellegtelen, nem indikátor-karakterű. A közegbe világos sárgásbarna oldódó pigment diffundál.

Zabpehely agaron (ISP Med. 3) nagyon gyengén fejlett, sterilis, fehér légmicélium, színtelen, gyenge, jellegtelen szubsztrát-micélium figyelhető meg. Nagyon halványsárga oldódó pigment észlelhető vagy nincs oldódó pigment.

Biokémiai és fiziológiai tulajdonságok

A T-13 jelű törzs jól növekszik 28—37°Con, nem növekszik 44°C-on és efölött.

A szénforrás hasznosítást Pridham-Gottlieb szintetikus alapközegén vizsgáltuk. Glükózt, xilózt, mannitot, fruktózt, ramnózt, inozitot és szacharózt erősen hasznosít a mikroorganizmus. Sporuláció több-kevesebb intenzitással valamennyi szénforráson megfigyel-2195253

Kromogenitás (melanoid-pigment termelés) sem tirozin agaron, sem vas-pepton agáron nem tapasztalható.

A T-13 jelű törzset egybevetve az ismert tilozin típusú antibiotikumokat termelő fajok 5 típus, illetve ipari törzseivel, az eltérések szembetűnőek (1. táblázat). A Streptomyces fradiae, a Streptomyces griseospiralis, a Streptomyces hygroscopicus, a Streptomyces rimosus és a Streptomyces thermotolerans vagy a spórafelszín elektromikroszkópos morfológiájában, a spóra-tömeg szín-szerieszében, az exopigment-termelésben vagy a szénforrás hasznosításban mutatnak jelentős különbségeket, ezért a T-13 jelű törzset fajszinten egyikükkel sem lehet azonosítani.

A 2. táblázat a T-13 jelű törzs összehasonlítását mutatja be a közelrokon fajok autentikus törzseivel.

1, táblázat

Tilozin típusú antibiotikumokat termelő Streptomyces fajok taxonómiai összehasonlítása

	- T-I5 'ÍeTÚ törza	Str. fradlae ISP 5063	Str. fradiae NRRL 2702 és 2703	Str. griseo- spiralis NRRL 3018	Str. hygrosco- picus ISP 5578	- hygrosco- picus NRRL 3017	~3TE7; rimosus NRRL 2234	Str. thermo- tolerans ISP 5227
Spórofor	Spirál	Spirál	Spirál	Spirál	Spirál	Spirál	Spirál	Spirál
/Ret.ap./	/Ret.ap./ /Ret.ap.//Ret.ap.,	/	/Ret.ap./	/Ret.ap./
Spóraszám és	10-50	10-50		sima	10-50		3-10	10-50
felület	/sima/	/sima/		/szemölcsöd	/sima/	/tüskés/
Spóra-tömeg, szín-szériesz	P,S,· S.ill.Sz	V	V	3 2	Sz /feketedő/	V	V; S	V
Szubsztrátmicé- lium szin-3zériesz	SB /nem ind./	SB /nem ind./	SB	SB	SB	SB	SB+V /nem ind./
Oldódó exopigment	világos sárgás barna	nincs	-	nincs vagy vil. nincs sj&ga	nincs	halv. sárga	halvány sárga
Kromogenitás /tirozin-a (jár/	negatív	negatív	-	-	negatív	-	negatív	negatív
kromogenitás /vas-pepton agar/	negatív	negatív	-	negatív	negatív	negatív	negatív	pozitív

Ξzénhidrát-

-hasznosítás:
glükóz	pozitív
arablnóz	pozitív
xilóz	pozitív
mannit	pozitív
fruktóz	pozitív
ramnóz	pozitív
raffinóz	negatív
inozit	pozitív
szacharóz	pozitív

pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív negatív kétes kétes pozitív negatív kétes negatív kétes kétes pozitív pozitív pozitív negatív pozitív negatív kétes negatív pozitív negatív negatív negatív negatív negatív negatív kétes kétes negatív pozitív pozitív negatív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív negatív negatív pozitív negatív pozitív pozitív kétes pozitív pozitív kétes pozitív negatív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív

P = fehér, S = sárga, Sz = szürke, V = vörös, SB - sárgás-barna Ret.ap.= retlnaculum apertum, nem ind. = nem indikátor Jellegű

2. táblázat

A T-13 Jelű Streptomyces törzs taxonómiai összehasonlítása közelrokon fajokkal

	-WaeTS” törzs	Str. albogri- seolus ISP .5.003	ÍSir. flocculus ISP 5327	Str. mutabilis ISP 5169	Str. tendae ISP 5101
Spórofor Spóraszám és felület	Spirál /Ret.ap./ 10-50 /sima/	Spirál /Ret.ap./ 10-50 /szemölosös és sima/	Spirál /Ret.ap./ 3-10 vagy több /sima/	Spirál /Ret.ap./ /sima/	Spirál /Ret.ap./ -— /sima/
Spóra-tömeg, szín-szériesz	P, S; S.ill.Sz	Sz	P; S	P; Sz	Sz
Szubsztrátmicéiium szín-szériesz	SB /nem ind./	SB /nem ind./	SB /nem ind./	sfe /nem pH ind./ sárga nyomok- ban	-- /ind. kar./ világos sárga
Öldódó exo- pigment	világos sárgás barna	nincs	nincs

-3195253

	2. táblázat	; (folytatás)
	T-13 jelű törzs	Str. albogri- seolus ISP 5QP3. .....	Str. flocculua ISP 5327	Str. mutabilis ISP 5169	Str. tendae ISP 5101
Kromogenitaa /tirozin-agar/	negatív	negatív	negatív	negatív	negatív
Kromogenitaa /yaa-pepton agar/ j	negatív	negatív	negatív	negatív	negatív
S zenniarat-has znosixas:

glükóz arabinóz xilóz manni t fruktóz ramnóz raffinóz inozit szacharóz pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív negatív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív negatív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív kétes kétes pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív negatív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív pozitív negatív pozitív pozitív

P = fehér, S = sárga, ΞΒ = sárgás-barna, Sz = szürke Set.ap.= retinaculum apertum, nem ind.= nem indikátor jellegű

A közelrokon fajok törzseivel szemben a hasonlóság feltűnő. Ezek a szervezetek gyakorlatilag valamennyien raffinóz negatívak, más szén-forrásokat általában — egy-egy esetleges kivételtől eltekintve — jól értékesítenek. Elektronmikroszkópos spórafelületi morfológiájuk sima, nem ornamentált. A szubsztrát-micéliumok színe jellegtelenül sárgásbarna. Melanoidokat semmiféle szén- és nitrogén-forrás kombinációban nem termelnek. Spóratartóik szabálytalan primitív retinaculum-apertum típusúak, viszonylag nem nagyszámú spórával.

A T-13 törzs gyengén sporulál. Ezért a szórványos légmicéliumon gyakorta átüt a szubsztrát-micélium sárgás színe, ami sárga -szín-szeriesz meghatározást vonhat maga után. Az érett spóratömeg azonban a szürke-szerieszt képviseli.. A T-13 törzs és a Streptomyces tendae ISP 5101 típus törzs között csak egyetlen eltérés jelentkezik: a Streptomyces tendae ISP 5101 törzs szubsztrát-micéliumának gyenge indikátor-karaktere. Ez viszont nem faji bélyeg. Ennek alapján megállapítható, hogy a Streptomyces T-13 jelű törzs a Streptomyces tendae fajhoz tartozik, amelynek tilozin antibiotikum-komplexet termelő törzse eddig még nem volt ismeretes.

Az antibiotikum termelés fokozása és a termelt antibiotikumok kívánt arányának beállítása céljából a talajból izolált T-13 jelű Streptomyces tendae törzset UV-besugárzással mutagén kezelésnek vetettük alá. A kezelést túlélők közül kiválasztottunk egy olyan izolátumot, mely az állatgyógyászatban hasznosított tilozin A-t főtermékként bioszintetizálja csak kis mennyiségben termel rokonszerkezetű antibiotikumokat. Az így nyert törzs a tilozin A-t nagyobb arányban bioszintetizálja, mint a technika állásából megismert törzsek.

E Streptomyces tendae törzset 1983 augusztus 8-án MNG 00274 szám alatt az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikro4 organizmusok Nemzeti Gyűjteményében letétbe helyeztük.

A T-13 jelű Streptomyces tendae törzzsel az antibiotikum termelés szempontjából optimális tenyésztési körülmények megállapítására fermentációs technológiai kísérleteket végeztünk, és eljárást dolgoztunk ki a bioszin₃Q tetizált antibiotikumok fermentléből történő elkülönítésére, egymástól való elválasztására, és állatgyógyászati és takarmányozási szempontból elfogadható sóik előállítására. Az általunk fermentációs úton előállított tilozint és sóit az állatgyógyászatban és az állattenyésztésben alkalmazzuk.

A fentiek alapján a találmány eljárás tilozin antibiotikum-komplexnek és komponenseinek: az la képletű tilozin A-nak, az Ib képle40 tű tilozin C-nek, az Ic képletű tilozin D-nek és az Id képletű laktenocinnak, valamint állatgyógyászati és takarmányozási szempontból elfogadható sóiknak előállítására aerob fermentációval és adott esetben azt követő só45 képzéssel, amely abban áll, hogy a Streptomyces tendae sugárgomba faj MNG 00274 sz. alatt letétbe helyezett törzsét, vagy annak valamely — tilozin antibiotikum-komplexet termelő — mutánsát vagy variánsát, szerves nitrogén- és széníorrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon 25—40°C-on tenyésztjük, majd a képződött tilozin antibiotikum-komplexet elkülönítjük a fermentléből, kívánt esetben a kapott antibiotikum-komplex komponenseit egymástól elválasztjuk és/vagy kívánt esetben állatgyógyászati és takarmányozási szempontból elfogadható sóvá alakítjuk.

A tilozin-komplex termelésére szolgáló tápgQ talajban a sugárgomba által asszimilálható különféle szén- és nitrogénforrások, szervetlen sók és habzásgátlók lehetnek jelen.

A szén-források közül a melaszt, a lenolajat és a szójaolajat, a nitrogén-források közül a hallisztet, a kukoricalekvárt és a szójalisztet találtuk előnyösnek. Azt tapasztal-4195253

8 tűk továbbá, hogy maleinsav és dimetil-szulfoxid elősegíti a tilozin-komplex bioszintézisét.

A táptalaj pufferkapacitásának növelésére kalcium-karbonátot alkalmazunk.

A fermentáció hőmérséklete 25—40°C kö- 5 zött változhat. Legelőnyösebbnek találtuk a 28—30°C-on végzett fermentációt. A keverés fordulatszáma a fermentor geometriájának függvényében percenként 200-400 között változhat. A levegőztetés előnyösen 1/1 v/v per- ¹θ cenként.

A fermentáció során keletkező antibiotikumok (tilozin A + minor komponensek) összes hatékonyságát Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal állapítjuk meg agar- 15 diffúziós módszerrel (J.S. Simpson: Analytical Microbiology, Acad. Press, New York,

1963, 87—124. oldal) tilozin A standard anyagra vonatkoztatva.

160—180 órás fermentációs idő alatt a 20 fermentlé összaktivitása kb. 2500—3900 E/ml/t ér el. (1 Ε = 1 pg/ml tilozin A hatékonysága). A fermentlében jelenlévő antibiotikum-komplexnek mintegy 85%-át teszi ki a tilozin A. 25

A tilozin-komplexet előnyösen adszorpciós és extrakciós eljárásokkal nyerhetjük ki a Streptomyces tendae fermentléből.

A tilozin-komplex a fermentlé szürletéből 30 adszorpciós kromatográfiával előnyösen úgy különíthető el, hogy a szűrt fermentléből a tilozin típusú antibiotikumokat makropórusos polisztirol-, illetve akrilészter-típusú gyantákon (Diaion HP-20, Mitsubishi Co. Tokió; ³⁵ Amberlite XAD-8, Rohm and Haas, Philadelphia; Servachrom XAD-7, Serva Feinbiochemica, Heidelberg) kötjük meg. A gyantáról az adszorbeált antibiotikumokat előnyösen aceton-ecetsav-víz eleggyel oldjuk le. Az ⁴θ eluátumként kapott tisztított antibiotikum oldatból semlegesítés után az acetont desztillációval eltávolítjuk és a kapott vizes sűrítményt kevés, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, célszerűen etil-acetáttal kivonjuk, 45 majd a kivonat vákuumban történő besűrítése után petroiéter hozzáadásával választjuk le a tilozin-komplexet.

A tilozin-komplex a fermentlé szürletéből ismert módon (3 178 341 számú amerikai 50 egyesült államokbeli szabadalmi leírás) vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel végzett extrakcióval is elkülöníthető. Az extrakció előtt a fermentlé szűrletének pH-ját enyhén lúgosra, célszerűen 8,5 értékre állítjuk. Az extrakció 55 kivitelezését megnehezíti az erős emulzió-képződés, mely klórozott szénhidrogének, szerves észterek, vízzel nem elegyedő szerves ketonok és szerves alkoholok extrahálószerként való alkalmazása esetén egyaránt megfigyel- 60 hető. A szerves oldószeres kivonat bepárlásával tilozin-komplexet tartalmazó nyerstermékhez jutunk, mely célszerűen kristályosítással tisztítható.

A tilozin-komplex komponenseinek egymás- _gg tói való elválasztását oszlopkromatográfiás és preparatív vékonyréteg-kromatográfiás módszerekkel végeztük. Az izolált antibiotikumok szerkezetét IR, Ή NMR és tömegspektroszkópiás vizsgálatokkal igazoltuk.

A tilozin-komplexből és komponenseiből savaddíciós sók képezhetők ásványi savakkal, például sósavval, foszforsavval és szerves savakkal, például borkősavval. Előállításuk során úgy járunk el, hogy az antibiotikum bázist szerves oldószerben, például acetonban vagy dietiléterben feloldjuk és az oldathoz a kívánt szervetlen vagy szerves savat ekvivalens mennyiségben hozzáadjuk. A képződött só csapadék formájában kiválik az oldatból. A találmány szerinti eljárással előállított tilozint és sóit az állatgyógyászatban és az állattenyésztésben alkalmazzuk. Ezen célokra szolgáló készítményt úgy állítjuk elő, hogy a tilozint vagy annak savaddíciós sóit, különösen foszfát, illetve tartarát sóját önmagában vagy egyéb, az állatgyógyászatban és állattakarmányozásban használatos antibiotikummal, továbbá adalékanyagokkal, segéd és/vagy hígító és tartósítószerekkel, valamint adott esetben tápanyagokkal együtt, ismert módon, állatgyógyászati és/ /vagy állattakarmányozási célokra szolgáló orális készítménnyé alakítjuk. E készítményeket célszerű az állatok táplálékába, illetve itatóvízébe keverve adagolni. Állatgyógyászati célból a tilozint injekció formájában is adhatjuk az állatoknak.

A találmány kivitelezését az alábbi példákkal szemléltetjük:

1. példa

A Streptomyces tendae (MNG 00274) spóráival beoltjuk a következő összetételű ferdeagar táptalajt:

vízoldható keményítő 20 g kálium-nitrát 1 g dikálium-hídrogén-foszfát 0,5 g magnézium-szulfát-víz (1/7) 0,5 g nátrium-klorid 0,5 g vas(II)-szulfát-víz (1/7) 0,01 g

Baeto agar 15 g desztillált víz 1000 ml-re.

A ferdeagar tenyészetet 8 napig inkubáljuk 37°C-on, majd a spórákat desztillált vízzel lemossuk. 10 — 10⁷/ml spórával steril körülmények között 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml steril táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő:

kukoricalekvár 7 g glükóz 20 g ammónium-nitrát 6 g kalcium-karbonát 5 g csapvíz 1000 ml-re.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészetet síkrázógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 32°C-on 2 napig rázatjuk. Az így kapott tenyészet 4-4 mL-ével 50 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100—100 ml táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő:

-5195253 halliszt ll,5g melasz 20 g maleinsav 0,3 g dimetil-szulfoxid 4 g szójaolaj 30 ml diammónium-hidrogén-foszfát 0,03 g kalcium-karbonát 1 g nátrium-klorid 1 g csapvíz 1000 ml-re.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészeteket síkrázógépen (260 fordulat/perc, 10 cm kitérés) 28°C-on napig rázatjuk.

Az antibiotikum termelés a fermentáció 84-96. órájában indul meg és a maximális értéket a 220—260. órában éri el.

A fermentáció befejezésekor a fermentlé összes antibiotikum tartalma tilozin A standardra vonatkoztatva 3850 E/ml. (A meghatározást Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal, agardiffúziós módszerrel végeztük.)

A fermentlét 1% perlit hozzáadása után leszűrjük, majd a sejteket kétszer 500 ml vízzel mossuk. A szürletet és a mosóleveket egyesítve 5 liter 3000 E/ml aktivitású oldatot kapunk, melyet 750 ml Diaion HP-20 gyantából készült oszlopon (oszlopátmérő: 4 cm, gyantaágy magasság: 70 cm) folyatunk át. Ezután a gyantaágyat 2500 ml vízzel, majd 1500 ml 20% aceton tartalmú vízzel mossuk. Ezt követően 1800 ml aceton-ecetsav-víz (9:1:40) eleggyel eluáljuk az antibiotikumokat a gyantaoszlopról. Az eluálás során kapott mikrobíológiailag aktív frakciókat egyesítjük. Ezután az egyesített oldat pH-ját

8-rá állítjuk 8%-os nátrium-karbonát oldattal, majd az acetont csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A kapott vizes bepárlási maradékból az antibiotikumokat kétszer 200 ml etil-acetáttal kivonjuk, majd az egyesített etil-acetátos extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk és a sűrítményből 20 ml n-pentán hozzáadásával leválasztjuk a tilozin-komplexet. fgy 13 g, 85% tilozin A tartalmú tilozin-komplexhez jutunk.

2. példa

A Streptomyces tendae (MNG 00274) törzs spóráival beoltjuk az 1. példában megadott összetételű ferdeagar táptalajt. A ferdeagar tenyészetet 8 napig inkubáljuk 37°C-on, majd a spórákat desztillált vízzel lemossuk. 10⁶— 10⁷/ml spórával steril körülmények között 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml steril táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő:

kazein hidrolizátum
(szárazanyag)	2 g
glükóz	30 g
nátrium-glutamát	2g
szójaolaj-pálmaolaj
(1:1)	10 g
ammónium-nitrát	5 g

kalcium-karbonát 5 g csapvíz 1000 ml-re.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,2-re állítjuk be. A tenyészetet síkzárógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 32°C-on 2 napig rázatjuk, majd az így kapott tenyészet 4—4 ml ével 50 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilizett 100—100 ml táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő:

halliszt 10 g melasz 20 g kukoricakeményítő 5 g maleinsav 0,3 g dimetil-szulfoxid 4g szójaolaj 31,5 g szójaliszt 5 g ammónium-hidrogén-foszfát 0,3 g kalcium-karbonát 2 g nátrium-klorid lg csapvíz 1000 ml-re.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészetet síkrázógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 28°C-on 10 napig rázatjuk. Az antibiotikum termelés a fermentáció 80—90. órájában indul meg és a maximális értéket a 230—250. órában éri el.

A fermentáció befejezésekor a fermentlé összes antibiotikum tartalma tilozin A standardra vonatkoztatva 3700 E/ml, Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal, agardiffúziós módszerrel meghatározva.

A fermentlét 1% perlit hozzáadása után leszűrjük, majd a sejteket kétszer 500 ml vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóleveket egyesítve 5,1 liter 2900 E/ml aktivitású oldatot kapunk, melyet 750 ml Amberlite XAD-7 gyantából készült oszlopon (oszlopátmérő:

3,5 cm, gyantaágy magasság: 90 cm) folyatunk át 100—120 ml/óra sebességgel, majd a gyantaágyat 2000 ml vízzel és ezt követően 1500 ml, 20% aceton tartalmú vízzel mossuk. Ezután 2500 ml aceton-ecetsav-víz (9:1:40) eleggyel leoldjuk az antibiotikumokat a gyaniaoszlopról. Az eluálás során kapott mikrobiológiailag aktív frakciókat egyesítjük, ezután az egyesített oldat pH-ját 8-ra állítjuk 8%-os nátrium-karbonát oldattal, majd az acetont csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A kapott vizes bepárlási maradékból az antibiotikumokat kétszer 300 ml etil-acetáttal kivonjuk. Ezután az egyesített etil-acetátos extraktumot vákuumban bepároljuk és a sűrítményből 20 ml n-pentán adagolásával leválasztjuk a tilozin-komplexet. fgy 11 g, 83% tilozin A tartalmú tilozin-komplexhez jutunk.

3. példa

A Streptomyces tendae (MNG 00274) törzs spóráival beoltjuk az 1. példában megadott összetételű ferdeagar táptalajt. A ferdeagar tenyészetet 8 napig inkubáljuk 37°C-on, majd a spórákat desztillált vízzel lemossuk. 10®— 10⁷/ml spórával steril körülmények között 2000 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 500 ml

-6195253 steril táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő;

szójaliszt kukoricalekvár glükóz szójaolaj lenolaj ammónium-nitrát kalcium-karbonát csapvíz

10g

5g g

ml 15 ml g 5 g

1000 ml-re.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészetet síkrázógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 32°C-on, 2 napig rázatjuk. Az így kapott tenyészettel 10 literes üvegfermentorban lévő 5 liter steril táptalajt oltunk be, amelynek összetétele a következő:

halliszt melasz maleinsav dimetil-szulfoxid szójaolaj diammónium-hidrogén-foszfát kalcium-karbonát nátrium-klorid csapvíz

N, 5g 20 g 0,3 g g

ml

O, 03 g lg 1 g

1000 ml-re.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyésztést keverés és levegőztetés közben 160—180 órán át folytatjuk. A tenyésztés hőmérséklete 28°C, a keverés fordulatszáma 400/perc, a levegőztetés 1/1 v/v. Habzásgátlóként 3A jelű habzásgátlót (gyártó: Chinoin, Budapest) használunk. Az antibiotikum termelés a fermentáció 60—72, órájában indul meg, a maximális értéket a 170, óra körül éri el.

Ekkor a fermentlé összes antibiotikum tartalma tilozin A standardra vonatkoztatva — Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal, agardiffúziós módszerrel meghatározva — 3700 E/ml.

A fermentáció befejezés után a fermentlevet (térfogat: 5 liter, pH 6—7) 1% perlit hozzáadása után lecentrifugáljuk. A kiülepedett sejteket 1 liter vízben felszuszpendáljuk és ismét lecentrifugáljuk. A felülúszókat egyesítjük és a kapott oldat pH-ját 8%-os nátrium-karbonát oldattal 8,5 értékre állítjuk, majd a tilozin-komplexet kétszer 2 liter etil-acetáttal kivonjuk. Az etil-acetátos kivonatokat egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfáton megszárítjuk, majd csökkentett nyomáson, 50°C alatti hőmérsékleten 60 ml-re besűrítjük. Ezután az olajos sűrítményből 20 ml n-pentán hozzáadagolásával a hatóanyagot leválasztjuk, fgy 12,25 g nyers tilozin-komplexhez jutunk.

A tilozin-komplex komponenseinek kromatográfiás elválasztása céljából 10 g nyers tilozin-komplexet 200 g szilikagélből (Kieselgel 40, Reanal, Budapest) készített oszlopon fokozatosan növekvő aceton-kloroform elegyekkel kromatografálunk. A tilozin A 20% aceton tartalmú kloroformmal oldódik le az oszlopról. A tilozin A-t tartalmazó kromatográfiás frakciókból bepárlással 7 g kromatográfiásan tiszta tilozin A-hoz jutunk, melyet acetonból kristályosítunk át.

Op.: 134—138°C [a]„= —50° (c=l, metanol)

Infravörös színkép (KBr): vOH 3600—3200 (max. 3460), vC=0 1720 (észter C-l és aldehid C-20), 1670 (keton C-9) cm-'. Mágneses magrezonancia spektrum (CDCI₃, 6): 1,75 s (CH₃ /H-22/), 2,5 s (N/CH₃/₂),

3,5 s, 3,6 s (OCH₃), 5,8-6,4 (H-10, H-13),

7.3 d (H-11), 9,6 (CHO /H-20/) ppm. Tömegspektrum: molekulatömeg (m/z): 915. A jellemző ionok (m/z): 915, 771, 581, 174, 132, 116, 111, 87, 83, 58, 44.

A tilozin D 21% aceton tartalmú kloroformmal eluálódik az oszlopról. A tilozin D-t tartalmazó kromatográfiás frakciókat bepárolva 500 mg kromatográfiásan tiszta tilozin D-t kapunk, melyet acetonból kristályosítunk át.

Op.: 172—175°C [ajn= —49° (c=l, metanol)

Infravörös színkép (KBr): vOH 3600—3100 (max. 3460), vC=0 1720 (észter C-l), 1675 (keton C-9) cm^-1.

Mágneses magrezonancia spektrum (CDC1₃, Ö): 1,8 s (CH₃ /H-22/), 2,5 s (N/CH₃/₂),

3.4 s, 3,55 s (OCH₃), 5,5-6,5 (H-10 és H-13),

7,25 d (H-11) ppm.

Tömegspektrum: molekulatömeg (m/z): 917. A jellemző ionok (m/z): 917, 190, 174, 173, 132, 87, 58.

A tilozin C és a laktenocin 22% aceton tartalmú kloroformmal oldódik le az oszlopról, de kielégítően nem válik el egymástól. A tilozin C-t és a laktenocint tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. Így 680 mg tilozin C és laktenocin keverékhez jutunk, melynek komponenseit preparatív vékonyréteg-kromatográfiával választjuk el. A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztásnál adszorbensként szilikagélt (Kieselgel G (reanal, Budapest) és Kieselgel HF₂₅,- ₃₆₆ (Peanal, Budapest) 2:1 arányú keveréke) és az alábbi kifejlesztő elegyeket alkalmazzuk: a.) etil-acetát-dietil-amin, 95:5; b.) kloroform-metanol-toluol, 80:17:23.

A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztással 260 mg tiszta tilozin C-t kapunk, melyet acetonból kristályosítunk át.

Op.: 134— 138°C [a] = —53° (c=l, metanol)

Infravörös színkép (KBr): vOH 3600-3100 (max. 3480), vC=O 1720 (észter C-I és aldehid C-20), 1670 (keton C-9) cm-¹. Mágneses magrezonancia spektrum (CDCI₃, δ): 1,8 s (CH₃ /H-22/), 2,5 s (N/CH₃/₂),

3,45 s (OCH₃), 5,5-6,5 (H-10, H-13), 7,25 d (H-11), 9,6 (CHO /H-20/) ppm.

A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztás eredményeként 205 mg tiszta laktenocint kapunk, melyet acetonból kristályosítunk át. Op.: 121 —I22°C.

-7195251

Infravörös színkép (KBr): vOH 3600-3100 (max. 3450), vC=0 1720 (észter C-I, aldehid C-20), 1680 (keton C-9) cm’¹.

Mágneses magrezonancia spektrum (CDC1₃, fi): 1,8 s (CH₃ /H-22/), 2,5 s (N/CH₃/₂), 5

3,45 s (OCH₃), 5,5-6,4 (H-10 és H-13),

7,25 d (H-ll), 9,6 s (CHO /H-20/) ppm. Tömegspektrum: molekulatömeg (m/z): 757. Jellemző ionok (m/z): 757, 190, 174, 173, 132,115,88,87. 10

Tilozin A borkősavas sójának előállítása

2,5 g tilozin A-t feloldunk 50 ml acetonban és keverés közben 10 ml acetonban oldott 750 mg borkősavat adunk hozzá. A tilozin A tartarát sója szobahőmérsékleten 4 óra 15 alatt kikristályosodik az oldatból. A kivált sót szűréssel elkülönítjük, acetonnal mossuk és levegőn szárítjuk. így 2,75 g tilozin A tartarát sót kapunk. Op.: 140—146°C.

Tilozin foszfát sójának előállítása g tilozint feloldunk 30 ml acetonban, majd az oldathoz 10°C-on kevertetés mellett hozzáadunk 0,1 ml 85%-os foszforsavat. Az oldatból 15 ml éter hozzáadása után leválik a foszfátsó. A kivált sót szűrjük, kevés éterrel mossuk, majd vákuumban szobahőmérsékleten megszárítjuk. így 1 g tilozin-foszfátot kapunk.

4. példa

Tilozin-tartalmú sertéstápok előállítása

Az 1—3. példák bármelyike szerint előállított tilozinból állatgyógyászati és/vagy állattenyésztési célokra szolgáló sertéstápokat például az alábbi összetételekkel állíthatunk elő:

A) Malac-táp (45 napos kortól) kukorica 29,7% búza 26,0% árpa 16,0% lucernaliszt 4,5% szója (47%-os fehérjetartalom) 15,0% halliszt (70%-os fehérjetartalom) 1,0% tejpor 7,5% takarmánysó 0,3% tilozin* 20,0 mg/kg táp *A tilozint állatgyógyászatilag, ill. állattakar mányozás szempontjából elfogadható só (pl. foszfát v. tartarát) formájában is alkalmazhatjuk.

A fenti összetételű takarmánnyal, mely a tilozint foszfátsó formájában tartalmazza, malacokkal etetési kísérleteket végeztünk. Ennek eredményeit az 1. táblázat tartalmazza.

táblázat

Megnevezés	Mérték	Tilozin tartalmú takarmánnyal etetett csoport	Kontroll csoport
Beáilátási létszám:	db	150	150
Beállítási átlagos testtömeg	kg/db	7,17	7,72
Záró létszám	db	147	146
Elhullás	7,	2,0	2,7
1 kg testtömeg gyarapodásához felhasznált: takarmány	kg/kg	1,88	2,37
takarmány	7,	80,3	100,00
keményítő- érték	kg /kg	1,345	1,648
keményítő- érték	7	80,2	100,00
emészthető fehérje	g/kg	292	364
emészthető f ehérj e	7	80,2	100,00
testtömeg gyarapodás	g/nap	355	287
testtömeg gyarapodás	7	123,7	100,00

-8195253

B) Sertés hízó-táp sertések részére)	(30—50 kg tömegű
búza	44,0%
kukorica	20,3%
napraforgó dara szója (48%-os	2,0%
fehérjetartalom) halliszt (64%-os	5,0%
fehérjetartalom)	1,8%
korpa	6,5%
lizin	2,3%
metionin	0,4%
zsírpor	2,4%
lucernaliszt	7,3%

takarmányliszt 6,0% takarmánymész 0,6% bentonit 1-0% takarmánysó 0,4% tilozin* 15,0 mg/kg táp *A tilozint állatgyógyászatilag, ill. állattakarmányozás szempontjából elfogadható só (pl. foszfát v. tartarát) formájában is alkalmazhatjuk.

A fenti összetételű takarmánnyal, mely a tilozint foszfátsó formájában tartalmazza, hízósertésekkel etetési kísérletet folytattunk le. A kísérlet eredményeit a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

Megnevezés	Mérték	Tilozin tartalmú takarmánnyal etetett csoport	Kontrol1 csoport
Beállítási létszám:	db	147	146
Elhullás	db	4	6
Elhullás	7,	2,7	4,1
1 kg testtömeg gyarapodáshoz felhasznált: takarmány	kg/kg	3,87	4,10
takarmány	7	94,3	100,00
keményítő- érték	kg/kg	2,63	2.33
keményítő- érték	7	94,3	100,00
emészthető fehérj e	g/kg	511	542
emészthető fehérj e	7	94,3	100,00
testtömeg gyarapodás	g/nap	697	659
testtömeg gyarapodás	7	105,8	100,00

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 50

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 50

   1. Eljárás tilozin antibiotikum-komplexnek és komponenseinek:

   az la képletű tilozin A-nak — ahol

   R, jelentése formilcsoport, 55

   R₂ jelentése metilcsoport és

   R₃ jelentése II képletű csoport; az lb képletű tilozin C-nek — ahol

   R, jelentése formilcsoport,

   R₂ jelentése hidrogénatom és θο

   R₃ jelentése II képletű csoport;

   az Ic képletű tilozin D-nek — ahol R, jelentése hidroxi-metil-csoport,

   R₂ jelentése metilcsoport és R₃ jelentése II képletű csoport; és az Id képletű laktenocinnak — ahol

   R, jelentése formilcsoport,

   R₂ jelentése hidrogénatom és R₃ jelentése hidrogénatom — valamint állatgyógyászati és takarmányozási szempontból elfogadható sóiknak előállítására aerob fermentációval és kívánt esetben azt követő sóképzéssel, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces tendae sugárgomba faj MNG 00274 sz. alatt letétbe helyezett törzsét vagy annak valamely — tilozin antibiotikum-komplexet termelő — mutánsát vagy variánsát, szerves nitrogén és szénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon, 25—40°C-on tenyésztjük, majd a képződött tilozin antibiotikum-komplexet a fermentléből elkülönítjük, kívánt esetben a kapott antibiotikum-komplex komponenseit egymástól

   -9195253 elválasztjuk és/vagy kívánt esetben állatgyógyászati és takarmányozási szempontból elfogadható sóvá alakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 5 jellemezve, hogy a mikroorganizmust 150—

   260 órán át, 28—30°C-on tenyésztjük.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elkülöní- 10 tést kromatográfiával végezzük a következő lépésekben: az antibiotikum-komplexet tartalmazó fermentlevet elválasztjuk a micéliumtól, majd makropórusos polisztirol-, illetve akrilészter-típusú gyantán adszorbeáltatjuk, 15 az antibiotikum-komplexet a gyantáról eluáljuk, az eluátumot bekoncentráljuk, a koncentrátumból a tilozin antibiotikum-komplexet kívánt esetben elkülönítjük, tisztítjuk, kívánt esetben adszorpciós kromatográfiával kom- 20 ponenseire szétválasztjuk, majd az ily módon kapott tilozin antibiotikum-komplexet, illetve tilozin A, C és D komponenseket és laktenocint kívánt esetben állatgyógyászati és takarmányozási szempontból elfogadható sókká alakítjuk.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tilozin antibiotikum-komplexet a fermentlé szűrletéből vízzelkorlátoltan elegyedő oldószerekkel végzett extrakcióval különítjük el.
5. 5. Eljárás állatgyógyászati célokra szolgáló készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított tilozint vagy tilozin-sót önmagában vagy egyéb, az állatgyógyászatban használatos — a tilozinnal szinergizmust nem mutató — antibiotikummal, továbbá segédés/vagy vivőanyagokkal, hígító- és tartósítószerekkel, valamint adott esetben tápanyagokkal együtt orális készítménnyé alakítjuk.
6. 6. Eljárás állattakarmányozási célokra szolgáló készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított tilozint vagy tilozin-sót önmagában vagy egyéb, az állattenyésztésben és takarmányozásban szokásos vivőanyagokkal, hígító- és/vagy tartósítószerekkel és/ /vagy egyéb a tilozinnal szinergmizmust nem mutató — az állatoknak szokásosan adagolt anyagokkal, valamint tápanyagokkal együtt orális készítménnyé alakítjuk.