HU191603B - Active substance for diagnosis and process for production of suspensives containing hydrofil latex-sheets - Google Patents
Active substance for diagnosis and process for production of suspensives containing hydrofil latex-sheets Download PDFInfo
- Publication number
- HU191603B HU191603B HU393881A HU393881A HU191603B HU 191603 B HU191603 B HU 191603B HU 393881 A HU393881 A HU 393881A HU 393881 A HU393881 A HU 393881A HU 191603 B HU191603 B HU 191603B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- latex
- latex particles
- particles
- hydrophilic
- emulsion polymerization
- Prior art date
Links
Landscapes
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Polymerisation Methods In General (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
A szuszpenziókat egy vagy több, vízben nehezen oldódó glicidil-metakrilát- . és/vagy glicidil-akrilát bázisú monomerből, vizes diszperzióból, szabad gyököket szolgáltató iniciátor jelenlétében, védőgáz atmoszféra alatt állítják elő oly módon, hogy a monomert emulgeátortói, stabilizátortól és nedvesítőszertől mentes közegben emulziós polimerízálással homovagy kopolimerízálják és kívánt esetben a kapott latex-részecskék terminális epoxicsoportjait vizes alkálifémhidroxid-oldatlal, vizes ammónia-oldattal, primer aminnal vagy hidrazinnal hidrolizálják, ammonolizálják vagy aminolizálják és kívánt esetben a képződött hidroxil-, illetve monoszubsztituált aminocsoportokat perjodáttal, illetve perjódsavval aldehidcs sporttá alakítják. A diagnosztikai reagensek a szuszpenzió részecskéihez kötve biológiailag, célszerűen ímmunológiailag aktív proteint tartalmaznak.The suspensions are hardly one or more in water soluble glycidyl methacrylate. and / or glycidyl acrylate base monomer, aqueous dispersion, free radicals in the presence of a service initiator, a protective gas atmosphere is produced by the monomer emulsifier, stabilizer and wetting agent homogenous by emulsion polymerization in a free medium copolymerize and, if desired, the resulting latex particles its terminal epoxy groups with aqueous alkali metal hydroxide solution, aqueous ammonia solution, primer hydrolysed with amine or hydrazine, ammonolized or aminolysed and, if desired, formed hydroxyl or monosubstituted amino groups aldehyde with periodate or periodic acid converted into sports. Diagnostic reagents for suspension particles bound biologically, preferably immunologically contain an active protein.
Description
A találmány tárgya diagnosztikai reagens és eljárás hidrofil latexrészcskéket tartalmazó szuszpenziók előállítására. A találmány szerinti eljárással előállítható hidrofil latexrcszecskck diagnosztikai reagensekben biológiai, különösen immunológiai hatással rendelkező anyagok hordozójaként alkalmazhatók.The present invention relates to a diagnostic reagent and a process for preparing suspensions containing hydrophilic latex particles. The hydrophilic latex diagnostic reagents obtainable by the process of the present invention are useful as carriers for substances having biological, in particular immunological, activity.
Az immunológiában számos diagnosztikai meghatározás során az antigén-antitest-komplexek agglutinációját használják ki, mert az agglutináció gyakran puszta szemmel észlelhető, és ezért az ilyen teszt gyorsan és egyszerűen elvégezhető. A vizsgálatokhoz régóta használnak hidrofób latexrészecskéket az immunológiailag aktív anyagok, például antitestek hordozójaként. Ezek a hidrofób latexrészecskék többnyire sztirol homo- vagy kopolimerizátumaiból, például sztirol-butadién-kopolimerizátumból vagy akrilnitril-butadién-sztirol-kopolimerizátumból (ABS) állnak, és emulziós polimcrizáhíssal állíthatók elő.In immunology, many diagnostic assays utilize the agglutination of antigen-antibody complexes, since agglutination is often perceptible to the naked eye, and therefore such a test can be performed quickly and easily. For studies, hydrophobic latex particles have long been used as carriers of immunologically active substances, such as antibodies. These hydrophobic latex particles are generally composed of homo- or copolymerizates of styrene, such as styrene-butadiene copolymer or acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer (ABS), and can be prepared by emulsion polymerization.
Az ismert emulziós polimerizálási eljárás során általában négy komponenst használnak, ezek: vízben nehezen oldódó monomer vagy vízben nehezen oldódó különböző monomerek elegye, továbbá víz, cmulgeátor és vízben oldódó inieiátor. Az emnlgeátor hatására a monomer finom cseppekké emulgeálódik, több emulgeátormolekula aggregálódva nagyobb micellákat alkot. A micellák részben üresek, részben a monomer molekuláival ki vannak töltve, az utóbbit a monomer ,,szolubilizálásá”-nak nevezik. A vízben oldódó inieiátor szabad gyököket szolgáltat, amelyek a vizes fázisban levő monomermolekulák polimerizálódását, de a mieellákban levő monomer cs a cseppek ben jelenlevő monomer polimerizálódását is indukálhatják, illetve aktiválhatják. Lényegében azonban a polimerizáció a duzzasztott mieellákban megy végbe, mert egyrészt a mieellákban a monomerkoncentráció lényegesen nagyobb, mint az egyes oldott monomermolekulák környezetében, és másrészt - a micelláknak a monomercseppekhez viszonyítva sokkal nagyobb száma miatt - a micellák aktiválásának valószínűsége nagyobb. A polimerizáció során a micelíák átmérője növekszik, míg a micelíák végül gömbalakú latexrészecskékké alakulnak. Azok az emulgeátormolekulák, amelyek reagáií monomercscppek felületén, illetve a nem aktivál! íniccllákon helyezkednek el, a latexrészecskék felületére tapadnak, így a képződő polimerdiszperzió stabilitását növelik.The known emulsion polymerization process generally employs four components: a poorly water-soluble monomer or a mixture of various water-insoluble monomers, and water, a cosolvent and a water-soluble initiator. The emulsifier causes the monomer to emulsify into fine droplets, with multiple emulsifier molecules aggregating to form larger micelles. The micelles are partly empty and partly filled with monomeric molecules, the latter being called "solubilization" of the monomer. The water-soluble initiator provides free radicals which can induce or activate the polymerization of monomer molecules in the aqueous phase, but also the polymerization of the monomer present in the drops in the myelates. However, in essence, the polymerization takes place in the swollen myels because, on the one hand, the monomer concentration in the myels is substantially higher than that of the individual dissolved monomer molecules and, on the other hand, it is more likely to be activated due to the much larger number of micelles. During polymerization, the diameter of the micelles increases, while the micelles eventually become spherical latex particles. Emulsifier molecules that react on the surface of monomeric moieties or do not activate! They tend to stick to the surface of the latex particles, thereby increasing the stability of the polymer dispersion formed.
Az ismertetett eljárással emulgeátorok vagy emulzióstabilizátorok, például tenzidek vagy nedvesítőszerek hozzáadásával előállított latexeknek azonban hátrányai vannak, amelyek korlátozzák alkalmazhatóságukat immunológiailag aktív anyagok hordozójaként és lehetetlenné teszik alkalmazásukat oldatok folyamatos mérésén alapuló készülékekben.However, the latex produced by the addition of emulsifiers or emulsion stabilizers, such as surfactants or wetting agents, by the process described, has the disadvantages of limiting their applicability as carriers for immunologically active substances and rendering them impossible to use in devices for continuous measurement of solutions.
Ezek a hátrányok az alábbiak:These disadvantages include:
1. A latexrészecskék hidrofób felületén a megkötni kívánt, immunológiailag aktív anyagok — például antitestek - mellett nemszelektív módon a szérum számos egyéb alkotórésze is adszorbeálódik.1. On the hydrophobic surface of the latex particles, besides the immunologically active substances to be bound, such as antibodies, many other constituents of the serum are adsorbed non-selectively.
2. A csupán adszorpcióval, tehát nem kovalens kötéssel kötött, immunológiailag aktív anyagok a mérés során leválhatnak a részecskékről.2. Immunologically active substances bound only by adsorption, ie not by covalent bonding, may be separated from the particles during measurement.
3. Az emulziós polimerizáláshoz emulgeátorként vagy stabilizátorként alkalmazott tenzidek, a vizes oldatba diffundálva, a biológiailag aktív proteinek szerkezetét roncsolhatják és így az aktivitásukat megsemmisíthetik.3. The surfactants used as emulsifiers or stabilizers for emulsion polymerization, when diffused into the aqueous solution, can disrupt the structure of the biologically active proteins and thus destroy their activity.
4. A stabilizáló tenzidek eltávolításakor a latexszuszpenzió koagulál, már a centrifugálás is megtöri a szuszpenziót. A keletkező csapadék nehezen vagy egyáltalán nem vihető újból szuszpenzióba, az előző állapotba.4. When the stabilizing surfactants are removed, the latex slurry coagulates, and the slurry is broken by centrifugation. The resulting precipitate is difficult or not to be re-suspended in the previous state.
Ezen hátrányok megszüntetésére már született néhány megoldás, de mindegyik csak egy részét tudta megoldani az említett problémáknak.Some solutions have already been found to overcome these disadvantages, but each has been able to solve only some of these problems.
A 2 203 377. számú NSZK-beli közzétételi irat biológiailag aktív proteinek szérológiailag közömbös hordozfijaként alkalmazható hidrofób latexrészecskéket ismertet, amelyek karboxilezett ABS-kopolimerekbííi és karboxilezett sztirol-butadién-kopolimerekbő! állnak és 0,01-0,9,cm átmerőjűek. A biológiailag aktív proteinek kovalens kötéssel kötődnek a hordozóhoz, mégpedig amid-kötések kialakulása során a latexbe bevezetett karboxilcsoporíokhoz.German Patent Publication No. 2,203,377 discloses hydrophobic latex particles useful as a serologically inert carrier of biologically active proteins, which consist of carboxylated ABS copolymers and carboxylated styrene-butadiene copolymers. and are 0.01-0.9 cm in diameter. Biologically active proteins are covalently bound to a support, namely carboxyl groups introduced into the latex during the formation of amide bonds.
A 2 812 845. számú NSZK-beli közrebocsátási iratból ismert hidrofób latcxiészecskck 0,05 I μιη átmerőjűek, ABS-kopolimcrekből épülnek lel; a latexet szintén karboxilcsoportokkal módosítják és reakcióképes oldallánccal kondenzálják, aminek révén az immunológiailag aktív anyag ugyancsak kovalens kötéssel kapcsolódik a részecskékhez.The hydrophobic latcx particle known in German Patent Application No. 2,812,845, having a diameter of 0.05 l μιη, is based on ABS copolymers; the latex is also modified with carboxyl groups and condensed with a reactive side chain, whereby the immunologically active substance is also covalently attached to the particles.
Ezen ismert latexek segítségével a fent 2. pont alatt említett hátrány (deszorpció mérés közben) kiküszöbölhető ugyan, de a többi hátrány változatlanul fennáll.With the aid of these known latexes, the disadvantage mentioned above under point 2 (desorption during measurement) can be eliminated, but the other disadvantages remain.
Ezért azzal is kísérleteztek, hogy immunológiailag aktív anyagok hordozójaként hidrofób latex helyett hidrofil gélt alkalmaznak. A hidrofil gélek alig vagy egyáltalán nem rendelkeznek adszorpciós tulajdonságokkal, másrészt viszont ismert, hogy az ilyen gélekhez proteinek kovalens kötéssel kapcsolódni képesek. Ezért úgynevezett mikrogéleket javasoltak, amelyeket — előállításukat és részecskeátmérőjűket figyelembevéve — jogosan latexnek is lehetne nevezni. Ilyen hidrofób latexeket ismertet például a 4 138 383. szánni amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A gélek 0,35 μπι-néi kisebb átmérőjű, gömbalakú részecskékből állnak, előállításukhoz akrilamid, akrilsav, metakrilsav vagy akrilát monomereket vizes emulzióban polimerizálnak szabad gyökös iniciátorral. Emui geál ősze rkent például fémszappanok kerülnek alkalmazásra. Az így kapott hidrofil mikrogélekhez a biológiailag és/vagy immunológiailag aktív anyag önmagában ismert módon, karbodíimíd- vagy glutáraldehid-hidakon keresztül kovalens kötéssel kapcsolódnak. Ezzel az 1. és 2. pont alatt említett problémák megoldódnak, a 3. és 4. pont alatt említettek azonban nem, tekintettel arra, hogy az emulziós polimerizáláshoz itt is emulgeátort vagy stabilizátort alkalmaznak.Therefore, it has also been experimented to use a hydrophilic gel instead of a hydrophobic latex as a carrier for immunologically active substances. Hydrophilic gels have little or no adsorption properties, on the other hand, it is known that proteins can be covalently attached to such gels. Therefore, so-called microgels have been proposed which, given their production and their particle diameters, could rightly be called latex. Such hydrophobic latexes are described, for example, in U.S. Patent 4,138,383. The gels consist of spherical particles less than 0.35 µπι in size and are prepared by polymerizing acrylamide, acrylic acid, methacrylic acid or acrylate monomers in an aqueous emulsion with a free radical initiator. For example, metal soaps are used in the autumn of Emui ge. The hydrophilic microgels thus obtained are covalently bonded to the biologically and / or immunologically active substance in a manner known per se, via carbodiimide or glutaraldehyde bridges. This solves the problems mentioned under (1) and (2), but not (3) and (4), since emulsifier or stabilizer is used here for emulsion polymerization.
A találmány célja olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel a fent említett négy hátránytól mentes latexrészecskék és az ilyen latexrészecskéket tartalmazó diagnosztikai reagensek állíthatók elő. A találmány célja tehát különösen olyan hidrofil latexrészecskék előállítása, amelyek biológiailag és/vagy immunoló-23SUMMARY OF THE INVENTION The object of the present invention was to provide a process for preparing the above-mentioned four disadvantages of latex particles and diagnostic reagents containing such latex particles. Accordingly, it is an object of the present invention to provide hydrophilic latex particles which are biologically and / or immunologically active.
191 603 giailag aktív anyagokat kovalens kötéssel kötni képesek, a biológiailag aktív proteinek szerkezetét nem roncsolják, aktivitásukat nem csökkentik, továbbá a részecskék szuszpenzióját a cen tri fuga lás nem töri meg. A részecskék koagulálhatók legyenek, és a koagulátum könnyen újból szuszpenzióba vihető legyen.191,603 are capable of binding covalently, do not degrade the structure of the biologically active proteins, diminish their activity, and do not break the suspension of particles by centrifugation. The particles may be coagulated and the coagulate easily resuspended.
A fenti cél elérése érdekében olyan eljárást dolgoztunk ki, amelynek során egy vagy több, vízben nehezen oldódó glicidil-metakrilát- és/vagy glicidilakrilát monomerből, vizes diszperzióban, szabad gyököket szolgáltató iniciátor jelenlétében, védőgáz atmoszféra alatt latexszuszpenziót állítunk elő. Az eljárásra jellemző, hogy a monomert emulgeátortól. stabilizátortól és nedvesitőszertől mentes közegben emulziós polimerizálással homo- vagy kopolimerizáljuk és kívánt esetben a kapott latexrészecskék terminális epoxiesoportjait kémiailag módosítjuk.To this end, a process has been developed for preparing one or more water-insoluble glycidyl methacrylate and / or glycidyl acrylate monomers in an aqueous dispersion in the presence of a free-radical initiator under a protective gas atmosphere. The process is characterized in that the monomer is emulsifier. in a medium free of stabilizer and wetting agent, it is homo- or copolymerized by emulsion polymerization, and if desired, the terminal epoxy groups of the resulting latex particles are chemically modified.
Meglepő módon bebizonyosodott, hogy a szak-, körökben régóta uralkodó, a technika fent megadott állásában is tükröződő nézettel ellentétben az emui- i ziós polimerizálás végrehajtható emulgeátorok vagy nedvesítőszerek hozzáadása nélkül. Az emulgeátorrnaradékoknak a polimer latexrészecskékből való eltávolítását célzó bonyolult és körülményes, de mindezideig szükséges művelet feleslegessé válik, hiszen erre a műveletre csak azért volt szükség, mert az emulgeátorként alkalmazott fémszappanok vagy tenzidek a latexrészecskékből kidiffundálnak és a részecskéken kovalens kötéssel kötött proteinek biológiai aktivitását csökkentik vagy teljesen megsemmisítik.Surprisingly, it has been shown that, contrary to the prevailing view in the art, which is reflected in the above state of the art, emulsion polymerization can be carried out without the use of emulsifiers or wetting agents. The complicated and cumbersome but still necessary operation to remove emulsifier residues from the polymeric latex particles is redundant because the metal soaps or surfactants used as emulsifiers are capable of degrading the proteinaceous or activated particles of the latex particles, destroyed.
Monomerként legalább egy polimerizálható kettőskötést tartalmazó glicidil-vegyületeket alkalmazunk. Ezen vegyületek szerkezetében a polimerizálható kettőskötésben hidrofób rész, az epoxiesoportban, azaz az oxirángyú'rűben ugyanakkor hidrofil rész van. A találmány szerinti eljárás során képződő latexszuszpenziók mindennemű emulgeátor, stabiiizátor vagy nedvesítőszer távolléte ellenére sem koagulálnak. A centrifugálás nem töri meg a szuszpenziót. Tekintetttel arra, hogy a terminális epoxidcsoportok igen könnyen reagálnak (hidrolízis, ammonolizis, aminolízis, kondenzációs reakciók), a monodiszperz eloszlásban jelen levő latexgömböcskék felületén az epoxidcsoportoknak úgy keli elhelyezkedniök, hogy kifelé a vizes fázisba orientálódjanak.The monomer used is glycidyl compounds having at least one polymerizable double bond. The structure of these compounds has a hydrophobic moiety in the polymerizable double bond, while the epoxy group, i.e. the oxirane ring, has a hydrophobic moiety. The latex suspensions formed by the process of the invention do not coagulate despite the absence of any emulsifier, stabilizer or wetting agent. Centrifugation does not break the suspension. Since the terminal epoxide groups react very readily (hydrolysis, ammonolysis, aminolysis, condensation reactions), the epoxy groups on the surface of the latex spheres present in the monodisperse distribution need to be oriented outward to the aqueous phase.
A találmány szerinti eljárásban monomerként glicidil-metakrilát vagy glicidil-akrilát alkalmazható. Ha egyetlenegy monomerből indulunk ki, a képződő hidrofil latexrészecskék homopolimerizátumot képeznek, de úgy is eljárhatunk, hogy a fenti monomerek elegyeit kopolimerizáljuk.Glycidyl methacrylate or glycidyl acrylate may be used in the process of the invention. Starting from a single monomer, the hydrophilic latex particles formed form a homopolymerizate, but can also be copolymerized.
Az epoxiesoportok mennyiségének szabályozása céljából az említett glicidil-vegyületekkel együtt egyéb monomereket is kopolimerizálhatunk, példul a következőket: sztirol, diének, akril amid, metakrilamid, alkil-, hidroxi-alkil- és aminoalkil-akriiátok, alkil·, hidroxialkil- és aminoalkil-metakrilátok, viniléterek, vinil-észterek, N-vinil-pirrolidon stb.Other monomers such as styrene, dienes, acrylic amide, methacrylamide, alkyl, hydroxyalkyl and aminoalkyl acrylates, alkyl, hydroxyalkylacrylate and aminoalkyls can also be copolymerized to control the amount of epoxy groups with said glycidyl compounds. , vinyl ethers, vinyl esters, N-vinyl pyrrolidone and the like.
A polimerizálást színezékek vagy fluoreszkáló vegyületek, például fluorcszcin monomer, de polimerizálható származékainak jelenlétében is elvégezhetjük. Ez esetben színes, illetve fluoreszkáló latexrészecskéket kapunk, amelyek állati vagy emberi testszövetekben levő antigének, illetve antitestek kimutatására alkalmazhatók. Az ilyen kimutatás különösen a hisztológiában, szövelmelszetek előállításához alkalmas. A monomer, de polimerizálható származékokként előnyösen olyan színezékeket, illetve fluoreszkáló anyagokat alkalmazunk, amelyekbe önmagában ismert módon metakril- vagy akrilcsonortokat építettünk be.The polymerization can also be carried out in the presence of dyes or fluorescent compounds, such as the fluorescein monomer but also its polymerizable derivatives. This results in colored or fluorescent latex particles which can be used to detect antigens or antibodies in animal or human body tissues. Such detection is particularly useful in histology for the production of tissue sections. Preferred monomeric but polymerizable derivatives are dyes and fluorescent materials in which methacrylic or acrylic moieties are incorporated in a manner known per se.
A képződő latexrészecskék vízben való oldhatatlanságának fokozása céljából az emulziós polimerizálás során a szokásos térhálósító szereket, például alkilén- vagy hidroxi-alkilén-alkriátokat, alkilén- vagy hidroxi-alkilén-metakrilátokat, alkilén-bisz(akiilamid)ot, divlnilbenzolt stb. adagolhatunk.In order to enhance the water-insolubility of the latex particles formed during the emulsion polymerization, conventional crosslinking agents such as alkylene or hydroxyalkylene alkrylates, alkylene or hydroxyalkylene methacrylates, alkylene bis (acyl amyl), etc. are used. added.
Iniciátorként az emulziós polimerizáláshoz szokásosan használt, vízben oldódó iniciátorok bármelyikét alkalmazhatjuk. A peroxodisznlfátokat, peroxoborátokat, hidrogén-peroxidot és alkalmas redoxendszereket előnyben részesítünk.As the initiator, any of the water-soluble initiators commonly used in emulsion polymerization may be used. Peroxodisulfates, peroxoborates, hydrogen peroxide and suitable redox systems are preferred.
A találmány értelmében emulgeálószermetesen végzett emulzós polimerizálás a levegő oxigénjére, illetve minden szabad oxigénre érzékeny. Ezért az összes alkalmazott polimerizációs komponensekből és rz edényekből gondosan végzett kiforralás, védőgáz alatti desztillálás vagy nitrogén, argon vagy egyéb közömbös gáz átbugyborékoltatása útján el kell távolítani az oxigént.Emulsifying polymerization according to the present invention is sensitive to oxygen in the air and to any free oxygen. Therefore, oxygen must be removed by careful boiling, distillation under a protective gas, or bubbling nitrogen, argon, or other inert gas into all polymerization components and vessels used.
Az emulgeátormentes emulziós polimerizálás során a vizes fázis és a monomerfázis térfogataránya előnyösen 8:1 cs 16:1 közötti érték.In emulsifier-free emulsion polymerization, the volume ratio of aqueous phase to monomeric phase is preferably from 8: 1 to 16: 1.
A vizes fázisban oldott iniciátor koncentrációja előnyösen 0,5-1,5 g/1, és a monomer-fázis epoxidt irtalma előnyösen 1—100 t%.The concentration of initiator dissolved in the aqueous phase is preferably 0.5 to 1.5 g / l, and the monomer phase epoxide is preferably present in a concentration of 1 to 100% by weight.
Az emulziós polimerizálást előnyösen 0—80 °Con végezzük. A hőmérséklet az alkalmazott inicíátortól függ: kálíum-peroxo-diszulfát esetén előnyösen 60-70 °C-on dolgozunk. A reakció időtartama szinten az iniciátortól függ, és 5-től 40 óráig terjedhet.Emulsion polymerization is preferably carried out at 0 to 80 ° C. The temperature depends on the initiator used: in the case of potassium peroxodisulphate, it is preferable to operate at 60-70 ° C. The duration of the reaction is level dependent on the initiator and can range from 5 to 40 hours.
A találmány szerint, előállított hidrofil latexrészecskék szigorúan gömbalakú, megközelítően azonos méretű, monodiszperz eloszlásban levő részecskék, átmérőjük mintegy 0,15 és 1,5 pm között változhat.The hydrophilic latex particles produced in accordance with the present invention are strictly spherical particles of approximately the same size and have a monodisperse distribution, ranging in diameter from about 0.15 to about 1.5 µm.
A hidrofil latexrészecskék a polimerizálás után nem reagált monomer nyomait tartalmazhatják, amelyek vízgőzdesztillációval vagy dialízissel távolíthatók el. A latexrészecskék tisztítása szempontjából kídönösen előnyös az a tulajdonságuk, hogy centrifugd lássál leüiepíthetők anélkül, hogy a szuszpenzió megtörne. A leülepített részecskék utána újból diszpergálhatók, így a latex tisztítását egyszerű módon, többszörös centrifugálással és dekantálással végezhetjük el.The hydrophilic latex particles may contain traces of unreacted monomer after polymerization which may be removed by steam distillation or dialysis. It is particularly advantageous for the purification of the latex particles that they can be centrifuged without having to break the suspension. The precipitated particles can then be redispersed so that the purification of the latex can be accomplished in a simple manner by multiple centrifugation and decantation.
A találmány szerint előállított latex terminális szabad epoxiesoportjai a legkülönbözőbb kémiai anyagokkal szemben igen reakcióképesek, így könnyen hidrolizálódnak, peqodáttal vagy perjódsavval aldehid-csoporttá reagálnak, ammóniával, primer aminokkal diaminokkal vagy hidrazinokkal primer vagy szekunder aminocsoporttá alakulnak, vagy egyéb ismert reakciókkal módosíthatók. A találmány szerint előállított latexemulzió az emulgeátorThe terminal free epoxy groups of the latex prepared according to the invention are highly reactive with a variety of chemicals, such as being readily hydrolyzed, reacting with peodate or periodic acid to form an aldehyde group, converting with ammonia, primary amines, diamines or hydrazines, or other known amino groups. The latex emulsion of the present invention is an emulsifier
-3191 603 hiánya ellenére olyannyira slalnl, hogy az epoxiesoportok módosítását kívánt esetben már az emulziós polimerizálás alatt végrehajthatjuk, úgy már a polimerizálás után olyan latexet kapunk, amelynek felülete például primer aminocsoportokkal van módosítva. A módosított vagy átalakított epoxiesoportok majd a biológiai és/vagy immunológiai aktivitású proteinek kapcsolódását szolgálják; a proteinek így kovalens kötéssel kapcsolódhatnak a hordozóként szolgáló latexrészecskékhez.In spite of the lack of -3191603, the modification of the epoxy groups can, if desired, be carried out during the emulsion polymerization, so that after the polymerization a latex having a surface, for example, modified with primary amino groups, is obtained. The modified or modified epoxy groups will serve to attach proteins with biological and / or immunological activity; thus, the proteins may be covalently attached to the carrier latex particles.
A találmány tárgyához a fent részletezett eljárással előállított hidrofil latexrészecskék hordozókénti alkalmazása is tartozik: a latexrészecskék szérológiailag közömbös hordozói alkothatnak biológiailag, különösen iminunológiailag aktív anyagok, például peptidek, proteinek, enzimek, hormonok, vitaminok, antigének, antitestek és mikroorganizmusok számára.The present invention also relates to the use of hydrophilic latex particles prepared by the above-described process as carriers: the serologically inert carriers of the latex particles may form biologically active substances, such as peptides, proteins, enzymes, hormones, vitamins, antigens, antibodies and microorganisms.
A találmány tárgya tehát továbbá olyan diagnosztikai reagens, amely hordozóként a találmány szerint előállított hidrofil latexrészecskékeket és a hordozóhoz közvetlenül vagy hídként működő kapcsoló vegyületen keresztül kovalens kötéssel kapcsolódó biológiailag és/vagy immunológiailag aktív anyagokat tartalmaz.Accordingly, the present invention also provides a diagnostic reagent comprising hydrophilic latex particles of the present invention as well as biologically and / or immunologically active substances covalently attached to the support by covalent bonding, either directly or via a bridge linker.
A találmány szerinti diagnosztikai reagensek különösen a radioinununo-teszt (RíA), enzimimmunotes/.t (ΕΙΛ) és az az. úgynevezett ELlSA-tcsz.t (enz.ymelinked immunosorbent assay) elvégzéséhez alkalmasak.In particular, the diagnostic reagents of the present invention include radioinununo test (Ri), enzyme immunotes / .t (ΕΙΛ), and the like. are suitable for carrying out so-called ELlSA-enzyme enzymatic linking immunosorbent assay.
1. példa ml desztillált vízben 0,08 g káliumperoxodiszulfátot (K2S208) feloldunk, és a levegő eltávolítása céljából 30 percen át nitrogéngázt buborékoltatunk az oldaton keresztül. 10 ml glicidil-metakrilátot ugyanígy oxigénmentesítünk. A két komponenst üvegreaktorba visszük át és további 10 percen át nitrogénnel kezeljük. Utána a reaktort elzárjuk, és a komponenseket állandó keverés közben 65 °C-on 6 órán át reagáltatjuk. A megadott idő elteltével a konverzió 99 %. A kapott latex monodiszperz eloszlásban gömbalakú, 0,44 pm átmérőjű poliglicidilmetakrilát részecskéket tartalmaz.Example 1 0.08 g of potassium peroxodisulfate (K 2 S 2 0 8 ) is dissolved in 1 ml of distilled water and nitrogen is bubbled through the solution for 30 minutes to remove air. 10 ml of glycidyl methacrylate were similarly deoxygenated. The two components were transferred to a glass reactor and treated with nitrogen for an additional 10 minutes. The reactor was then sealed and the components were reacted with stirring at 65 ° C for 6 hours. After the specified time, the conversion is 99%. The resulting latex contains spherical polyglycidyl methacrylate particles of 0.44 µm in monodisperse distribution.
2. példaExample 2
0,08 g kálium-peroxodiszulfát 160 ml desztillált vízzel készített oldatát, valamint 15 t% glicidil-metakrilátból és 85 t% sztirolból álló elegy 10 ml-jét külön-külön az 1. példában leírt módon oxigénmén (esítjük, majd állandó keverés közben 6 órán keresztül 65 °C-on reagáltatjuk. A konverzió 71,6 %. A nem reagált monomer maradványait vízgőzdesztillálással kiűzzük. A kapott monodiszperz latexrészecskék 0,22 pm átmérőjűek.A solution of 0.08 g of potassium peroxodisulphate in 160 ml of distilled water and 10 ml of a mixture of 15% glycidyl methacrylate and 85% styrene were treated separately as in Example 1 with hours at 65 DEG C. The conversion was 71.6% The residual unreacted monomer was removed by steam distillation to give monodisperse latex particles of 0.22 µm diameter.
3. példaExample 3
0,1 g kálium-peroxodiszulfát 100 ml desztillált' vízzel készített odatát, valamint 15 t% glicidil-metakrilátból és 85 t% vinil-acetátból álló elegy 10 ml-jét 4 az I. példában leírt módon oxigéninciilcsítjük és reagáItatjuk. A konverzió 80 %. A monomer maradványait vízgőzdesztillálással távolítjuk el. A kapott latex monodiszperz eloszlásban 0,16 pm átmérőjű, gömbalakú részecskéket tartalmaz.0.1 g of potassium peroxodisulfate in 100 ml of distilled water and 10 ml of a mixture of 15% glycidyl methacrylate and 85% vinyl acetate 4 were oxygenated and reacted as described in Example I. The conversion is 80%. The residual monomer is removed by steam distillation. The resulting latex contains spherical particles with a monodisperse distribution of 0.16 µm in diameter.
Az így kapott latex 100 ml-jét 100 ml 0,1 M nátrium-hidroxid-oldattal összekeverjük és az elegyet 25 °eC-on 24 órán át állni hagyjuk. Hidrolízis alatt és után a latex stabilitása nem romlik. Az emulziót centrifugáljuk, a felülúszó részt leöntjük, és az ülepített fázist vízbeíi diszpergáljuk. Ezt még kétszer megismételjük. A kapott, semleges kémhatású emulzió pH-értékét 1 M kénsavval 3-ra állítjuk be, majd az epoxidesopoi toknak ekvivalens mennyiségű perjódsavat adunk az emulzióhoz. Az elegyet 25 C-on 24 órán át állni hagyjuk, utána a reakcióba nem lépett kismolekuiájü anyagokat dialízissel eltávolítjuk. A stabil emulzióban levő módosított latexrészecskék 2,8 t%, azaz 0,97 nrmól/g aldehid-csoportokat tartalmaznak.100 ml of the latex thus obtained are mixed with 100 ml of 0.1 M sodium hydroxide solution and allowed to stand at 25 ° C for 24 hours. During and after hydrolysis the stability of the latex does not deteriorate. The emulsion is centrifuged, the supernatant is discarded and the sedimented phase is dispersed in water. This is repeated twice more. The resulting neutral emulsion was adjusted to pH 3 with 1 M sulfuric acid and an equivalent amount of periodic acid was added to the epoxidesopols. The mixture was allowed to stand at 25 ° C for 24 hours and then unreacted small molecules were removed by dialysis. The modified latex particles in the stable emulsion contain 2.8% (0.97 µmol / g) of aldehyde groups.
4. példaExample 4
0,1 g kálium-peroxodiszulfát 100 ml desztillált vízzel készített oldatát 15 t% glicidii-metakrilátból cs 85 t% izoprénből álló elegy 10 ml-jével az 1. példában leírt módon 65 °C-on 24 órán át reagáltatjuk, A konverzió 76 %. A monomerek maradékát vízgőzdesztillálással eltávolítjuk. A kapott latex monodiszperz eloszlásban stabil, gömbalakú, 0,25 (um átmérőjű részecskéket tartalmaz.A solution of 0.1 g of potassium peroxodisulfate in 100 ml of distilled water was treated with 10 ml of a mixture of 15% glycidyl methacrylate and 85% isoprene in the same manner as in Example 1 at 65 ° C for 24 hours. . The remaining monomers were removed by steam distillation. The resultant latex contains stable spherical particles with a diameter of 0.25 µm in monodisperse distribution.
A kapott emulzió 100 mi-jéhez 25 t%-os vizes ammóniaoldatot adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, amikoris az epoxidcsoportok ammonolizis révén aminocsoporttá alakulnak. A terméket peqódsawal kezeljük. A kapott latexTo 100 ml of the resulting emulsion is added 25% aqueous ammonia solution and the mixture is allowed to stand at room temperature for 24 hours at which time the epoxide groups are converted to the amino group by ammonolysis. The product is treated with peqodic acid. The resulting latex
4,5 t%, azaz 1,55 mmól/g aldehidcsoportokat tartalmaz.Contains 4.5% by weight, i.e. 1.55 mmol / g of aldehyde groups.
5. példaExample 5
1,5 g kálium-peroxodiszulfát 1,5 liter vízzel készített oldatát és 15 ml glieidil-mctakrilátot az 1. példában leírt módon külön-külön oxigénmentesítünk, majd a komponenseket reagáltatjuk. A reakcióedénybe az oxigén kizárása mellett további 120 ml oxigénmentes glicidil-metakrilátot csepegtetünk 6 óra alatt. Az adagolás befejeztével az elegyet még 30 percen át polimerizáljuk. A konverzió 85 %. A latexrészecskék átmérője 1,1 μηι.A solution of potassium peroxodisulfate (1.5 g) in water (1.5 liters) and glycidyl methacrylate (15 ml) were individually deoxygenated as described in Example 1 and the components reacted. An additional 120 ml of oxygen-free glycidyl methacrylate was added dropwise to the reaction flask over a period of 6 hours, in the absence of oxygen. After the addition was complete, the mixture was polymerized for an additional 30 minutes. The conversion is 85%. The latex particles have a diameter of 1.1 μηι.
6. példaExample 6
0,5 g kálium-peroxodiszulfát 500 ml vízzel készített oldatát, valamint 40 ml glicidil-akrilátot az 1. példában leírtak szerint külön-külön oxigénmentesítünk, majd reagáltatunk. A polimerizálást 65 °C-on 7 órán át folytatjuk. A konverzió 78 %. A képződött latexrészecskék átmérője mintegy 0,68 μιη.A solution of potassium peroxodisulfate (0.5 g) in water (500 mL) and glycidyl acrylate (40 mL) was deoxygenated separately as described in Example 1 and reacted. The polymerization was continued at 65 ° C for 7 hours. The conversion is 78%. The resulting latex particles have a diameter of about 0.68 μιη.
-4191 603-4191 603
7. példa ' 8. példaExample 7 'Example 8
0,12 g kálium-peroxodiszulfát 160 ml desztillált vízzel készített oldatát, valamint glicidil-akrilát és glicidil-metakrilát 1:1 tömegarányú elegyéből 10 ml- g jél az 1. példában leírt módon oxigénmcutcsítjük, majd állandó keverés közben 65 °C-on 8 órán át polimerizáljuk. A konverzió 78 %. A nem reagált monomereket centrifugálással és dekantálássai eltávolítjuk. A kopolimer részecskék átmérője 0,45 pm. jg t% glicidil-metakrilátot és 99 t% sztirolt tártál mazó elegy 10 ml-jét az 1. példában leírt módon 0,1 £ káSium-pcroxidsziilfát 100 ml deszillált vízzel készíted oldatával 65 °C-on 22 órán át reagáltatjuk. 90 %-os konverzió mellett 0,5 μπι átmérőjű latexrészecskék keletkeznek.A solution of 0.12 g of potassium peroxodisulfate in 160 ml of distilled water and a 1: 1 mixture of glycidyl acrylate and glycidyl methacrylate in a 1: 1 weight ratio were oxygenated as described in Example 1, followed by constant stirring at 65 ° C. polymerize for 1 hour. The conversion is 78%. Unreacted monomers are removed by centrifugation and decantation. The copolymer particles have a diameter of 0.45 µm. 10 ml of a mixture of wt% glycidyl methacrylate and 99 wt% styrene were treated with a solution of 0.1 µg of potassium pcoxydisilyl in 100 ml of distilled water at 65 ° C for 22 hours as described in Example 1. At 90% conversion, latex particles with a diameter of 0.5 μπι are formed.
+H2O (Latex)-0CH2 -CH - CH2-\/+ H 2 O (Latex) -OCH 2 -CH-CH 2 - \ /
CC
ENaJO^ (latex)—OCH2—C H-CH2 -> (latex-OCH2-CHOENaJO ^ (latex) -OCH 2 -C H-CH 2 -> (latex-OCH 2 -CHO
OH OHOH OH
9. példaExample 9
Az 1. példa szerint előállított latex-szuszpenzióból 20 ml-t 5 nú 2n nátrium-Iiidiexid-oldattal szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverünk, és utána vízzel szemben 5 órán át dializálj· ik. A kapott szuszpenzióhoz 100 mg nátrium-perjocíátot adunk, pH= 3ra állítjuk be, szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverjük az elegyet, majd vízzel szemben 4 órán át dializáljuk.20 ml of the latex suspension prepared in Example 1 are mixed with 5N 2N NaOH solution at room temperature overnight and then dialyzed against water for 5 hours. To the resulting suspension was added 100 mg of sodium perjocate, adjusted to pH 3, stirred at room temperature overnight and dialyzed against water for 4 hours.
10. példa (Latex)-OCH2-CH-CH2 +NH3 (latex)-OCH2-CH-CH2 Example 10 (Latex) -OCH 2 -CH-CH 2 + NH 3 (latex) -OCH 2 -CH-CH 2
-> I i (aminális) NH2 OH-> I (amino) NH 2 OH
CH2 -CO \ 0CH3 + N- OC CII2-C112 C NllCIlj ΟΊΐζCH 2 -CO \ 0CH 3 + N- OC CII 2 -C 11 2 C NllCllj ΟΊΐζ
CH2-C0 X0CH3 (az acetál savas hidrolízise) (lat ex)-OCH2 -CH-NH-C-CH2 -CH2 -C-NH-CH2 -CHO I II BCH 2 -CO X 0 CH 3 (acid hydrolysis of acetal) (lat ex) -OCH 2 -CH-NH-C-CH 2 -CH 2 -C-NH-CH 2 -CHO I II B
0H-CH2 0 00H-CH 2 0 0
Az 1. példa szerint előállított latex-szuszpenzióból 20 ml-hez 10 ml tömény ammóniaoldatot adunk. 55 Az elegyet szobahőmérsékleten 20 órán át keverjük, majd folyó vízzel szemben 48 órán keresztül dialízáljuk. A kapott szuszpenziót centrifugáljuk. A szárazanyag nitrogéntartalma mintegy 1 t%, ami körülbelül minden 10. epoxiegység aminálásának felel meg. 60 Tekintettel arra, hogy a reakció inkább a részecskék felületén zajlik le, a felületen az átalakulás foka biztos nagyobb. A kicentrifugált szilárd anyagot 20 ml 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatban diszpergáljuk. A diszperzióhoz keverés közben 1,5 g borostyánkősav - hídroxiszukcinimidészter - amid - acetálaldehidacetál 6 ml dimetil-formamiddal készített oldatát csepegtetjük. Utána a szuszpenziót még 3 órán át keverjük, majd In sósavval pH = 3-ra állítjuk és folyó desztillált vízzel szemben 12 órán át dializáljuk.10 ml of concentrated ammonia solution are added to 20 ml of the latex suspension prepared in Example 1. The mixture was stirred at room temperature for 20 hours and then dialyzed against running water for 48 hours. The resulting suspension is centrifuged. The dry matter has a nitrogen content of about 1%, which corresponds to the amination of about every 10 epoxy units. Since the reaction is more likely to occur on the surface of the particles, the degree of transformation on the surface is surely greater. The centrifuged solid was dispersed in 20 ml of 0.1 N sodium hydroxide solution. A solution of 1.5 g of succinic acid hydroxysuccinimide ester, acetalaldehyde acetal in 6 ml of dimethylformamide is added dropwise to the dispersion while stirring. The suspension was then stirred for a further 3 hours, then adjusted to pH 3 with IN hydrochloric acid and dialyzed against distilled water for 12 hours.
-5191 603 ll. példa (lalex)-OCHj-CH-CH, + Na,S(latex)-OCHj_CH-SH \/ -► · I o ch2oh + CH-CO\ >CO-CHj-5191 603 ll. Example (LALEX) -OCHj-CH-CH, + Na, S (latex) -OCHj_CH-SH \ / o -► · CH2 OH + CH-CO \> CO I CH
I N-fCHA-COO-NÍI N-fCHA-COO-Ni
CH-COZ COClb (latex)-OCHj-CH—S-CH-CO\ ^CO-CHjCH-CO Z COClb (latex) -OCH3-CH-S-CH-CO1 ^ CO-CH3
I I .N-(CH2)5-COO-NCHjOH CHj--CO CO-CHjII. N- (CH 2 ) 5 -COO-NCH 3 OH CH 3 - CO CO-CH 3
Az 1. példa szerint készített iatex-szuszpenzióból 20 mi hez 0,5 g Na2S-9H2O2-t adunk, és az elegyet 2 napon keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Utána a szuszpenziót addig dializátjuk folyó desztillált vízzel szemben, míg szag már nem észlelhető. A szuszpcnziőt centrifugáljuk. A száraz anyag mintegy 2 t% kent iurtalmaz, ami körülbelül minden 10. epoxiegység átalakulásának felel meg. Mert a reakció a részecske felületén inkább valószínű, a felületen több átalakult epoxiegység is lehet.0.5 ml of Na 2 S-9H 2 O 2 are added to 20 ml of the latex suspension prepared according to Example 1 and the mixture is stirred for 2 days at room temperature. The suspension was then dialyzed against distilled water until no odor was observed. The suspension is centrifuged. The dry material contains about 2% by weight of lubricant, which corresponds to about every 10th epoxy unit conversion. Because the reaction is more likely to occur on the particle surface, there may be several transformed epoxy units on the surface.
A kiccntriíügált termékhez 1 g 6-maleinimidohexánsav-liídroxi-szukcinimino-észter 6 ml dimetilformamiddal készített oldatát adjuk, az elegyet szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd folyó desztillált vízzel szemben 12 órán át dializátjuk.A solution of 1 g of 6-maleimimidohexanoic acid hydroxysuccinimino ester in 6 ml of dimethylformamide was added to the triflated product, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours and dialyzed against distilled water for 12 hours.
12. példaExample 12
Latex-gamma-globulin-konjugátum előállítása ml gamma-globuHn-oldathoz (protein-tartalma 56,6 mg)Preparation of Latex-Gamma-Globulin Conjugate for ml Gamma-GlobuHn Solution (Protein Content 56.6 mg)
a) az 1. példa szerint előállított,(a) prepared according to example 1,
b) a 9. példa szerint,b) as in Example 9,
c) a 10. példa szerint ésc) as in Example 10; and
d) a 11. példa szerint módosított latexszuszpenziót adjuk 20-20 ml mennyiségben. A kapott elegyeket szobahőmérsékleten 12 órán át dializáljuk, majd centrifugáljuk. A fciülúszó részben levő szabad protein mennyiségét meghatározzuk, és ebből kiszámítjuk a latexrészecskéken kötött proteinmennyiséget. A számítások szerint a protein az alábbi mennyiségekben kötődött:d) 20 to 20 ml of the latex suspension modified as in Example 11 is added. The resulting mixtures were dialyzed at room temperature for 12 hours and then centrifuged. The amount of free protein in the phylluclide is determined and the amount of protein bound to the latex particles is calculated. Calculation of protein binding was as follows:
a) 8 mg gamma-globulina) 8 mg gamma-globulin
b) 43 mg gamma-globulinb) 43 mg gamma-globulin
c) 15 mg gamma-globulinc) 15 mg gamma-globulin
d) 19 mg gamma-globulind) 19 mg gamma-globulin
13. példaExample 13
Latex-lgG-konjugáturn előállításaPreparation of Latex-IgG Conjugate
A 12. példában leírt módon IgG-oldatból és különböző latexszuszpenziókból latex-IgG-konjugátumokat állítunk elő. A latexrcszecskckbez kötődött igG-molekulákat anlitcst-komplcxkcpzéssel mulatjuk be.As described in Example 12, latex IgG conjugates were prepared from IgG solution and various latex suspensions. The IgG molecules bound to the latex fragment are encapsulated by annealing.
(A 14. és a 15. példában egy-egy diagnosztikai eszközt szemléltetünk a találmány szerint előállított hidrofil latexrészecskék alaklmazásának példáiként. A 14. példában a tiroxinnek (T4-nek) a juh aníiT4-szérumából nyer T4-antitestek segítségével végzett immunológiai meghatározását ttjuk le, míg a 15. példa az emberi szérumban levő tireotropin (TSH) meghatározására vonatkozik, amely a kettős antitest elválasztásának technikájával történik.(Example 14 and 15 are illustrated in a diagnostic device of the present invention hydrophilic latex particles alaklmazásának Examples. In Example 14, the thyroxine (T 4 hereinafter) sheep anilide 4 -szérumából gain by means of T 4 antibody forms an immunological Example 15 relates to the determination of thyrotropin (TSH) in human serum by the technique of double antibody separation.
14. példaExample 14
A homopoligíicidil-metakrilát-latexrészecskék alkalmazása a juh anti-T4-szérumának hordozójaként; diagnosztikai eszköz s T4-ELISA-teszt végrehajtásához.Application of homopoligíicidil methacrylate latex particle sheep anti-T 4 -szérumának as a carrier; diagnostic tool for performing s T 4 ELISA test.
A tlroxinnak (T4-nek) ELlSA-teszttel történő meghatározása céljából először a juh anti-T4-szérumából származó T4-antilestckct kovalens kötéssel a hidrofil hon:opo|iglicidil-metaklilát latcxrészecskckhez kötjük oly módon, hogy a latexet a 7—9. példák valamelyike szerint módosítjuk, majd a 12. példa szerint a T4-antitestekkel érintkeztetjük. Az így kapott solid-face-antitestek a teszt első reagensét képezik. Második reagensként tiroxint önmagában ismert módon alkalmas enzimmel, például peroxidázzal (POD) vagy β-galaktozidázzal (β-Gai) jelölünk, azaz enzim-konjugátummá „kapcsoljuk”. Enzimként jelen példában β-galaktozidázt alkalmazunk. A harmadik reagenst az ismeretlen T4-tartalmú minta képezi, míg negyedik reagensként az enzim-konjugátum j3Gal-tartalmának szubsztrátumaként alkalmas anyagot, jelen esetben nitro-fenil-B-galaktozid 7,3 pH-jú triszHCl-pufferrel készített oldatát használjuk.T 4 -antilestckct covalently first from the sheep anti-T 4 -szérumából To determine tlroxinnak (T 4 hereinafter) of ELISA test of the hydrophilic hon OPO | connected iglicidil-metaklilát latcxrészecskckhez such that the latex 7- 9th examples are modified by one, and then as in Example 12 is contacted with T 4 -antitestekkel. The resulting solid-face antibodies form the first reagent of the assay. As the second reagent, thyroxine is labeled in a manner known per se with a suitable enzyme, such as peroxidase (POD) or β-galactosidase (β-Gal), i.e., it is "coupled" to the enzyme conjugate. The enzyme used in this example is β-galactosidase. The third reagent is a sample of unknown T 4 content, while the fourth reagent is a substance suitable for use as substrate for the j3Gal content of the enzyme conjugate, in this case a solution of nitrophenyl B-galactoside in Tris-HCl pH 7.3.
A teszt eleve az alábbi három lépésen alapul:The test is based on the following three steps:
1. A hidrofil latexrészecskékhez kovalensen kötött T4-antitestek reakcióba lépnek mind az enzimmel jelölt tiroxinnal (az enzím-konjugátummal), mind a mintában levő szabad tiroxinnal. A reakció során a solid-face-antitestek és az enzim-konjugátum, valamint a minta tiroxintartalma között kompetitív kötés alakul ki.First covalently bound to the hydrophilic latex particles T 4 antibody forms react with free thyroxine in both the enzyme-labeled thyroxine (enzyme conjugate) and the sample. During the reaction, a competitive bond is formed between the solid-face antibodies and the enzyme conjugate and the thyroxine content of the sample.
2. A Β/Έ-elválasztás (B 7 b und, F - free) során az enzim-konjugátum kötött (bound) és nem kötött (free) részét elválasztjuk. Az elválasztást célszerűen centrifugálással vagy például vízzel vagy alkalmas pufferoldattal szembeni dialízissel végezhetjük.2. During the Β / Έ separation (B 7 b und, F - free), the bound and non-bound portions of the enzyme conjugate are separated. The separation may conveniently be carried out by centrifugation or dialysis against, for example, water or a suitable buffer solution.
3. Az enzim kimutatását szolgáló reakció, amely az enzim-konjugátum és az alkalmazott enzimre fajlagos szubsztrátum között zajlik le. A reakciót vagy kolorimetrikusan vagy más ismert módon követhetjük. Az enzim-aktivitást vagy a lecentrifugált folyadékban (free-rész) vagy az újból felszuszpendált csapadékban (bound-rész) mérjük.3. An enzyme detection reaction which takes place between the enzyme conjugate and the substrate specific for the enzyme used. The reaction may be monitored either colorimetrically or by other known means. Enzyme activity is measured in either the centrifuged liquid (free portion) or the resuspended pellet (bound portion).
A kísérlet végrehajtásaPerform the experiment
A fenti leírt módon készített latex-anti-T4-szuszpenziót vízzel vagy pufferoldattal 1:1000 térfogat-6. 11 ..The latex anti-T 4 suspension prepared as described above was diluted 1: 1000 to 6 with water or buffer. 11 ..
arányban hígíljuk. 0,5 0,5 ml hígítóit szuszpcnzióhoz 100—100 pm T4-szémm-sz.abvány-oldalot és 100—100 pm T4-(3-Gal konjugátum-oldatot adunk (a T4-szabvány-oldatok T4-tartalma különböző, de mindegyik ismert). Az elegyet szobahőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk állandó rázás közben, míg egy azonos T4-tartalmú kontroll-elegyet inkubálás közben állni hagyunk. Utána a szuszpenziót centrifugáljuk és a szabad fázist tartalmazó szűrletet elválasztjuk. A kötött fázis, azaz a solid-face-anti-antitestekhez kötött T4-/5-Gal-konjugátum a csapadékban van. Az enzimaktivitás meghatározásához a csapadékot feleslegben vett szubsztrátumoldatban szuszpendáljuk. A szubszlrálumoldat összetétele az alábbi:diluted proportionally. 0.5 0.5 ml of diluents are added to the suspension at 100-100 µm T 4 standard standard side and 100-100 µm T 4 - (3-Gal conjugate solution (T 4 standard solutions T 4 - The mixture is incubated at room temperature for 30 minutes with constant shaking, while a control with the same T 4 content is allowed to stand during incubation. The suspension is then centrifuged and the filtrate containing the free phase is separated off. that is bound to the solid-face-anti-antibody to T 4 - / 5-Gal conjugate is the precipitation of enzyme activity determination with excess substrate solution, the precipitate is suspended in the composition szubszlrálumoldat the following:..
450 mg/1 p-nitro-fenil-/3-ga!aktozid (gyártja: Sigma cég)450 mg / l p-nitrophenyl-3-galactoside (manufactured by Sigma)
100 mmól nátrium-klorid mmól magnézium-klorid mmól trisz-puffer/HCl100 mmol of sodium chloride, mmol of magnesium chloride, mmol of tris buffer / HCl
0,4 tf% merkapto-etanol pH = 7,3.0.4% v / v mercaptoethanol pH 7.3.
Az extinkciót önmagában ismert módon, 405 mn hullámhosszon mérjük. A mechanikai keverés (rázás) nélkül lebegő állapotban tartott minta jele mintegy 11 %-kal gyengébb volt.Extinction is measured in a manner known per se at 405 nm. The sample floating without mechanical agitation (shaking) was about 11% weaker.
Miután a fenti módon a T4 kalibrációs görbéjét meghatározzuk, ugyanezzel a módszerrel további meghatározásokat végeztünk, amelyekhez ismert T4tartalmú etalonszérum helyett 100-100 pm ismeretlen T4-tartalmú mintákat használtunk. A kötött fázis extinkcióját szintén a csapadék szubsztrátumoldattal készített szuszpenziójában mértük.After the T 4 calibration curve was determined as described above, further determinations were made by the same method using 100 to 100 µm of unknown T 4 containing samples instead of known T 4 containing reference serum. The extinction of the bound phase was also measured in a suspension of the precipitate in the substrate solution.
Megállapítottuk, hogy a hidrofil latexrészecskék kiválóan alkalmasak antitestek és antigének hordozójaként, az immunaktivitást nem csökkentik. Ezért a latexrészecskék solid-face enzim-immunotesztek során hordozóként igen előnyösen alkalmazhatók. Megállapítottuk továbbá, hogy a hidrofil latexrészecskek a pufferközegben hosszú időn keresztül lebegő állapotban maradnak, azaz sűrűségük megközelítően egy. Emellett a hidrofil latexrészecskék jól centrifugálhatok és újból szuszpenzióba vihetők anélkül, hogy az immunreaktivitás csökkenne.Hydrophilic latex particles have been found to be excellent carriers of antibodies and antigens and do not diminish immune activity. Therefore, latex particles can be very advantageously used as carriers in solid-face enzyme immunoassays. It has further been found that the hydrophilic latex particles remain suspended in the buffer medium for a prolonged period of time, i.e. their density is approximately one. In addition, hydrophilic latex particles can be well centrifuged and resuspended without reducing immunoreactivity.
191 603191,603
15. példaExample 15
Enzim-immuno-assay (EIA) emberi tireotropin (TSH) meghatározásáhozEnzyme-linked immunoassay (EIA) for the determination of human thyrotropin (TSH)
Az emberi szérum TSH-szintjének meghatározása a pajzsmirigy megbetegedésének diagnosztikálásában nagy jelentőséggel bír. Elsődleges hipotireozis a bazális TSH-koncentráció erős emelkedésében (10— 100 pU TSH/ml) mutatkozik. Ugyanakkor a hipertireozist biztonsággal ki lehet zárni, ha a szérumban a TSH bazális értéke (0,5-3 pU/ml) TRH (Thyroideareleasing-hormon) beadása után nem emelkedik. Amennyiben a TSH-érték legalább 2,5 pU/ml értékkel, de 25 pU/ml-nél kisebb mértékkel emelkedik, a pajzsmirigy anyagcseréje nagy valószínűséggel zavartalan. Amennyiben a többé-kevésbé emelt bazális értéktől 25 pU/ml-nél nagyobb mértékben emelkedik a TSH-szinl. rejlett prcklinikus hipotireozisre lehet következtetni. A TSI1 meghatározására már mertek enzim-immuno-assay-k (Clinica Chemica Acta 67, 263-268 (1976), Enzyme labelled immunosssay of hormones and drugs, szerkesztő: S. B. Pál, Walter de Gruyter, Berlin—New York, 1978. 327—Determination of the level of human serum TSH is of great importance in the diagnosis of thyroid disease. Primary hypothyroidism is characterized by a sharp increase in basal TSH levels (10-100 pU TSH / ml). However, hyperthyroidism can be safely ruled out if basal TSH levels (0.5-3 pU / ml) in serum do not increase after administration of TRH (Thyroideareleasing Hormone). If the TSH increases by at least 2.5 pU / ml but less than 25 pU / ml, the thyroid metabolism is likely to be smooth. If TSH-sinl increases by more than 25 pU / ml from the basal elevation. may be predictive of underlying clinical hypothyroidism. Enzyme-labeled immunoassays for hormones and drugs, edited by Paul SB, Walter de Gruyter, Berlin-New York, 1978, have already been known to determine TSI1 for enzyme immunoassays (Clinica Chemica Acta 67, 263-268 (1976)). -
370., o. Analytical Biochemistry 96, 419—425 /1979/). Az imsert meghatározási módszerek azonban igen hosszú inkubálási időt igényelnek (5 napig is terjedő időt), nem eléggé érzékenyek (5 pU/ml), vagy végrehajtásukhoz drága műszerek (fluorométer vagy luminométer), valamint az elegyek keveréséhez külön keverőberendezések szükségesek.370, p. Analytical Biochemistry 96, 419-425 (1979). However, the methods used for determination of the immer require a very long incubation time (up to 5 days), not sufficiently sensitive (5 pU / ml) or require expensive instrumentation (fluorometer or luminometer) and separate mixing equipment to mix the mixtures.
Λ találmány szerint előállított hidrofil latcxészecskék alkalmazása lehetővé teszi a TSH fotometrikus meghatározását csupán 2 és 1 /2 nap inkubá’ási idő után. A meghatározás a kettős antitest elvá’asztásának technikája szerint történik. Ennek során a második antitestet a hidrofil latexrészecskékhez kötjük. A kötött enzim aktivitását a B/F-eiválasztás után mérjük. A latexrészecskék — a vizétől alig különböző fajsúlyúk következtében — az. enzimreakció alatt lebegő állapotban maradnak, a szokásos keverés tehát felesleges. Amennyiben igen hígított latexszuszpenziót használunk (és ez a részecskék magas kötési kapacitása miatt minden további nélkül lehetséges), az enzimreakció utáni centrifugálás is elhagyható, mert a fotometrikus mérés a hig szuszpenzión keresztül is elvégezhető.Alkalmazása The use of the hydrophilic lattice particles prepared according to the invention allows for the photometric determination of TSH after only 2 and 1/2 days of incubation. The assay is performed according to the technique of separating the double antibody. In this process, the second antibody is bound to the hydrophilic latex particles. The activity of the bound enzyme is measured after B / F separation. Latex particles have a specific gravity that is slightly different from that of water. they remain in a floating state during the enzymatic reaction, so routine mixing is unnecessary. If a very dilute latex suspension is used (and this is possible without further consideration due to the high binding capacity of the particles), centrifugation after the enzyme reaction may be omitted, since photometric measurement can be performed using the hig suspension.
Az immunológiai tesztekhez szokásosan használt ismert latexek ellentétben a hidrofil, antitestekkel megrakott polimetil-metakrilát-részecskék centrifugálás után könnyen újból szuszpenzióba vihetők. Ugyanazon okból az enzimmel jelöit antigén nemfajlagos adszorpciója (kötött aktivitás primer antitest nélkül) igen csekély.In contrast to known latexes commonly used for immunoassays, hydrophilic antibody-loaded polymethyl methacrylate particles can be readily resuspended after centrifugation. For the same reason, the non-specific adsorption of the enzyme-labeled antigen (bound activity without primary antibody) is very low.
A kísérlet végrehajtásaPerform the experiment
0,2 ml TSH-etalont (nemzetközi referencia készítmény MRC 68/38 TSH-mentes szérumban) ismert anti-TSH-antiszérum (pl. a tengerimalacé) vízzel vagy' alkalmas pufferrrel készített 1:150 000 arányú hígításának 0,1 rnl-jével együtt inkubálunk. 12 óra elteltével az elegyhez pipettával adunk glükózoxidázhoz kovalens kötéssel kötött 1,5X10 9 g TSH mennyiségnek megfelelő enzim-konjugátumot 0,1 ml oldatban. További 12 óra után 0,1 ml latexszuszpenziót adunk az elegyhez.0.2 ml of TSH standard (International Reference Preparation MRC 68/38 in TSH-free serum) with 0.1 ml dilution of 1: 150,000 dilution of known anti-TSH antiserum (eg guinea pig) in water or in a suitable buffer incubate together. After 12 hours, an enzyme conjugate of 1.5 x 10 9 g TSH covalently bound to glucose oxidase is added by pipette in 0.1 mL of solution. After an additional 12 hours, 0.1 ml of latex suspension was added.
A hozzáadott latexszuszpenzió 0,1—1 mg/ml metakrilát-latexet tartalmaz. A latexrészecskékhez előzőleg kovalens kötéssel (a 11. példában leírt módon) 1000 mg száraz latexre számítva 5 — 150 mg olyan proteint kötöttünk, amely kecske-antiszérumból tengerimalac-IgG ellen nyer immuno-globulin-frakcióból származott.The latex suspension added contains from 0.1 to 1 mg / ml methacrylate latex. The latex particles were previously covalently bound (as described in Example 11) to 5 mg to 150 mg of protein derived from the goat antiserum from the immunoglobulin fraction against guinea-pig IgG per 1000 mg of dry latex.
Egy óra elteltével centrifugáljuk az egészet, és a csapadékot 1 ml alkalmas pufferoldattal mossuk, amikoris a latexrészecskék újból szuszpenzióba mennek. A csapadékot még többször mossuk, a felülúszó részt kiöntjük.After 1 hour, the whole is centrifuged and the precipitate is washed with 1 ml of a suitable buffer solution and the latex particles are resuspended. The precipitate is washed several times and the supernatant is discarded.
Mindegyik elegyhez a glükózoxidáz szubsztrátumá7For each mixture, the substrate for glucose oxidase 7
-713-713
191 603 nak oldatából 1 ml-t adunk és az elegyet rövid időn át rázzuk. A latexrészecskék most legalább 2 órán át egyenletes szuszpenziót képeznek. A szuszpenziót mérőküvettába visszük és 405 nmen merjük az extinkciót. A mért értékekből az üres szubsztrátun. extinkciós értékét (Li) levonjuk. Az üres szubsztrátum ugyanannyi megrakott latexrészecskét tartalmaz, mint az anti-TSH-antiszérum és a TSH-glükózoxidáz elegyéhez adagolt latexszuszpenzió. Az üres szubsztrátumoldat 1 nil-jénck az extinkciója = L|.1 ml of a solution of 191 603 was added and the mixture was shaken briefly. The latex particles now form a uniform suspension for at least 2 hours. The suspension is transferred to a measuring cuvette and the extinction measured at 405 nm. From the measured values, the empty substrate. the extinction value (Li) is subtracted. The blank substrate contains the same amount of loaded latex particles as the latex suspension added to the mixture of anti-TSH antiserum and TSH glucose oxidase. The extinction of the blank substrate solution is 1 nil-jenck = L |.
A mért extinkciókat a TS11 különböző etalonkoncentrációinak függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az így nyert kalibrációs görbén az ismeretlen TSH-tartalmú klinikai minták TSH-tartalmát a mért extinkció alapján leolvashatjuk.The extinctions measured are plotted against the different reference concentrations of TS11. From this calibration curve, the TSH content of unknown TSH-containing clinical samples can be read from the measured extinction.
Pufferoldatként előnyösen 0,005 M EDTA-t, 0,1 t% marhaszérum-albumint és 0,15 M konyhasót tartalmazó, 7,4 pH-jú, 0,04 M koncentrációjú foszfátoldatot alkalmazunk.The buffer solution is preferably a phosphate solution of pH 7.4 and 0.04 M containing 0.005 M EDTA, 0.1% bovine serum albumin and 0.15 M saline.
A glükózoxidáz szubsztrátumának oldataként előnyösen olyan oldatot alkalmazunk, amely 100 miben 5 g glükózt, 100 mg 2,2’-azino-di-(3-etil-benztiazolon-6-szulfonsav)-at (ABTS), 5 mg peroxidázt tartalmaz 0,05 M 5,6 pH-jú foszfátpufferben.Preferably, a solution of the glucose oxidase substrate is 5 g glucose, 100 mg 2,2'-azinodi- (3-ethylbenzthiazolone-6-sulfonic acid) (ABTS), 5 mg peroxidase, 05 M in pH 5.6 phosphate buffer.
összehasonlítás céljából három szérumminta TSHtartalmát a fenti EIA-teszttel, majd az ismert kettős antitest RIA teszttel is meghatároztuk. Az alábbi táblázatból kitűnik, hogy az eredmények jól egyeznek.for comparison, the TSH content of three serum samples was determined by the above EIA test and then by the known double antibody RIA test. The table below shows that the results agree well.
A TSH-meghatározás is azt mutatja, hogy a találmány szerint előállított hidrofil latexrészecskék biológiailag és/vagy immunológiailag aktív anyagok, különösen antitestek hordozójaként kiválóan alkalmazhatók.The TSH determination also shows that the hydrophilic latex particles of the present invention are excellent carriers for biologically and / or immunologically active substances, especially antibodies.
A nemfajlagos kötés mennyiségének meghatározásaDetermine the amount of non-specific bond
A TSH egy etalon-mintáját a lentiekben („A kísérlet végrehajtása” cím alatt) leirt módon kezeljük. Hasonló mintát is készítünk, amelyből azonban az anti-TSH-antiszérumot kihagyjuk. A különben azonos módon kezelt két minta extinkciós értékét összehasonlítjuk:A reference sample of TSH is treated as described below (under the heading "Experimentation"). A similar sample is prepared but omits the anti-TSH antiserum. The extinction values of the two otherwise treated samples are compared:
Teljes minta Anti-TSH-antiszérum nélkülComplete sample without anti-TSH antiserum
Szuszpenzióban mért extinkció az Li levonása után 1,028 0,015The extinction measured in suspension after deduction of Li is 1.028 0.015
Az értékek azt mutatják, hogy a nemfajlagos kötésThe values show non-specific bonding
1,5 %-nál kisebb.Less than 1.5%.
Claims (3)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CS923580A CS225010B1 (en) | 1980-12-23 | 1980-12-23 | The hydrophilic latex particles and their preparation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU191603B true HU191603B (en) | 1987-03-30 |
Family
ID=5443438
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU393881A HU191603B (en) | 1980-12-23 | 1981-12-23 | Active substance for diagnosis and process for production of suspensives containing hydrofil latex-sheets |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CS (6) | CS225010B1 (en) |
HU (1) | HU191603B (en) |
-
1980
- 1980-12-23 CS CS923580A patent/CS225010B1/en unknown
-
1981
- 1981-12-23 HU HU393881A patent/HU191603B/en not_active IP Right Cessation
-
1982
- 1982-06-03 CS CS824131A patent/CS225366B1/en unknown
- 1982-06-03 CS CS824134A patent/CS225369B1/en unknown
- 1982-06-03 CS CS824133A patent/CS225368B1/en unknown
- 1982-06-03 CS CS809235A patent/CS231217B1/en unknown
- 1982-06-03 CS CS824132A patent/CS225367B1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CS225010B1 (en) | 1984-02-13 |
CS225367B1 (en) | 1984-02-13 |
CS225368B1 (en) | 1984-02-13 |
CS231217B1 (en) | 1984-10-15 |
CS413582A1 (en) | 1984-01-16 |
CS225369B1 (en) | 1984-02-13 |
CS225366B1 (en) | 1984-02-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4415700A (en) | Hydrophilic latex particles and use thereof | |
EP0054249B2 (en) | Immunoparticles and process for preparing the same | |
US4563431A (en) | Biologically active latex conjugate | |
EP0038960B1 (en) | Diagnostic reagents for immunological tests and a process for preparing the same | |
CA1103153A (en) | Vinyl polymerisate latex particles bonded to immunological material | |
JPH0723893B2 (en) | Antibody immobilization method | |
CA1185174A (en) | Polystyrene latex reagents and related methods for use in immunological diagnostic procedures | |
AU608753B2 (en) | Dispersion polymers, processes for their preparation and their use | |
EP0070527A1 (en) | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor | |
JPH028271B2 (en) | ||
JPH0810224B2 (en) | A latex for immobilizing a physiologically active substance and a latex reagent using this latex | |
EP0466170B1 (en) | Detection reagent | |
JPH02194360A (en) | Immunochemical testing agent containing polymer containing carboxyl group | |
HU191603B (en) | Active substance for diagnosis and process for production of suspensives containing hydrofil latex-sheets | |
KR101690803B1 (en) | Insoluble carrier for use in anti-phospholipid antibody measurement reagent, anti-phospholipid antibody measurement reagent, and method for measuring anti-phospholipid antibody | |
US4792527A (en) | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor | |
JP2947600B2 (en) | Immunoassay | |
JPH0810223B2 (en) | LATEX FOR DIAGNOSTIC AGENT, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DIAGNOSTIC AGENT USING THE LATEX | |
JPS5850646B2 (en) | Method for producing latex for serological diagnostic reagents | |
JPS6253773B2 (en) | ||
JPS63230086A (en) | Preformed chemical mediator immobilizing carrier | |
JP2545503B2 (en) | Immunological diagnostic reagent | |
EP0286687B1 (en) | Carrier latex for diagnostic reagent | |
JPS59182804A (en) | Reactive fine particle and production thereof | |
GB2041940A (en) | Method of Coupling a Protein to an Epoxylated Latex and the Products Formed Therefrom |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 | ||
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |