HU191473B

HU191473B - Process for producing alpha-lipoproteins and pharmaceutical compositions containing them stimulating melanine synthesis of the leather

Info

Publication number: HU191473B
Application number: HU270982A
Authority: HU
Inventors: Carlos M Cao; Manuel T Gonzales
Original assignee: Empresa Cubana Importadora Y Exportadora De Productos Medicos /Medicuba/,Cu
Priority date: 1982-08-10
Filing date: 1982-08-23
Publication date: 1987-02-27

Abstract

A találmány tárgya eljárás a spektrofotometriás analízis alapján 20-150 mcg/ml protein-csúcsot felmutató alfa-lipoprotein előállítására oly módon, hogy az emberi méhlepény cotyledokat etilalkohollal extrahálják, az extraktumot benzoesawal kezelik, majd Sephadex gélen szűrik. A találmány tárgya továbbá eljárás ezt az extraktumot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, melynek során az alfa-lipoproteint szokásos hordozóanyagokkal gyógyszerkészítménnyé feldolgozzák. -1-FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing alpha-lipoprotein having a peak peak of 20-150 mcg / ml protein by spectrophotometric analysis, by extracting human placenta cotyleds with ethyl alcohol, treating the extract with benzoic acid, and then filtering on Sephadex gel. The invention also relates to a method for the preparation of pharmaceutical compositions containing this extract, wherein the alpha-lipoprotein is processed into a pharmaceutical composition with conventional carriers. -1-

Description

A találmány tárgya új eljárás olyan a-lipoproteinek előállítására, melyek a vitiligo kezelésére alkalmas készítmények hatóanyagaként felhasználhatók, továbbá eljárás a készítmények előállítására.The present invention relates to a novel process for the preparation of alpha-lipoproteins which are useful as active ingredients in compositions for the treatment of vitiligo, and to a process for the preparation thereof.

A szóbanforgó készítmény olyan bőrgyógyászati megbetegedés gyógyítására használható, amelyet a melanin hiány okoz az emberi test különböző részein.The present composition is useful in the treatment of a dermatological disorder caused by melanin deficiency in various parts of the human body.

Jelen találmányunkhoz leghasonlóbb prototípusok azok a különböző növényi eredetű vagy félszintetikus vegyületek, amelyeket „pszoraléneknek” nevezünk, és amelyek szájon át vagy a bőrön keresztül alkalmazva felhalmozódnak a bőrpigmentet termelő sejtekben, az úgynevezett melanoforákban, és az ultraibolya sugárzásból energiát elnyelve bőrpigment termelést hozhatnak létre. E vegyületek azonban toxikusak: a bőrön keresztül alkalmazva bőrgyulladást és bőrelhalást, szájon ál történő adás esetén pedig emésztőszervi megbetegedéseket okozhatnak.The most similar prototypes of the present invention are various plant or semisynthetic compounds, called "psoralens", that accumulate orally or transdermally in skin pigment producing cells, so-called melanophores, and can absorb energy from ultraviolet radiation to the skin. However, these compounds are toxic: they may cause dermatitis and necrosis when administered dermally and may cause gastrointestinal diseases when administered orally.

Arnold, M. J. Jr. „Psoralens and Suntan” („Pszoralének és a lesülés”); Hawaii Med. J. 1957, 16, 391.Arnold, M.J. Jr. "Psoralens and Suntan"; Hawaii Med J. 1957, 16, 391.

Becker, S. W. Jr. „Methods of increasing the skin pigmentations” („Módszerek a bőr pigmentációjának fokozására”); J. Soc. Cosmetic. Chem. 1958, 9, 80.Becker, S. W. Jr., "Methods of Increasing Skin Pigmentation"; J. Soc. Cosmetic. Chem. 1958, 9, 80.

Fitzpatric, T. B. „Pigmentary Diseases” („Pigment betegségek”); Current Therapy 1958, 514.Fitzpatric, T. B. "Pigmentary Diseases"; Current Therapy 1958, 514.

Becker, S. W. Jr. „Effects of 8-Methoxy Psoralen and ultraviolet light in humán skin” („A 8-metoxipszoralén és az ultraibolya fény hatása az emberi bőrre”); Science 1958, 127, 878.Becker, S. W. Jr., "Effects of 8-Methoxy Psoralen and Ultraviolet Light on Human Skin" ("Effect of 8-Methoxypsoralen and Ultraviolet Light on Human Skin"); Science 1958, 127, 878.

Sidi, E., Planat, P. „Practical considerations on actual treatment of vitiligo” („Gyakorlati szempontok a vitiligo korszerű kezeléséhez”); Bevue of Medicine 1968, 23 Dec.E. Sidi, Planat, P. "Practical Considerations for the Advanced Treatment of Vitiligo"; Bevue of Medicine 1968, Dec. 23.

A pszoralének a vitiligo vagy leukoderma kezelésében mostanáig a legjobb gyógymódot jelentették, azonban számtalan hátrányuk is van. Ilyenek például: igen költségesek; a kezelés abbahagyásakor hatásuk lassúvá és reverzibilissé válik; alkalmazásuk is nehézségekkel jár, mivel az ultraibolya sugárzás expozíciós idejét fokozatosan kell növelni; súlyos toxikus reakciók is felléphetnek, például égések keletkezhetnek a bőrön keresztül történő alkalmazáskor, szájon át történő adás esetén pedig májelégtelenség, emésztőszervi és idegrendszeri betegségek léphetnek fel.To date, psoralens have been the best cure for vitiligo or leukoderma, but they have many disadvantages. For example: very expensive; when treatment is discontinued, their effects become slow and reversible; their use is also problematic as the exposure time to ultraviolet radiation needs to be gradually increased; serious toxic reactions, such as burns when applied through the skin, and oral administration may result in liver failure, gastrointestinal and nervous system disorders.

A találmány szerinti készítmény stimulálja a bőr melanin szintézisét, és a melanint termelő sejtek szaporodását, amint ezt a gyógyszertani kísérletek bizonyítják.The composition of the invention stimulates the synthesis of melanin in the skin and the proliferation of melanin-producing cells, as evidenced by pharmacological experiments.

Toxikológiai, teratológiai és klinikai kísérletek szintén azt igazolják, hogy nem lépnek fel súlyos másodlagos reakciók.Toxicological, teratological and clinical studies also confirm that no serious secondary reactions occur.

A találmány szerinti készítmény kinyerése és használata könnyű, a beteg embernek csak igen rövid időre kell magát ultraibolya sugárzásnak kitennie, a hatás igen gyorsan, 15-20 nappal a kezelés megkezdése után jelentkezik, a keletkező bőrszín azonos a beteg normális bőrszínével, és az egészséges bőr színének intenzitása nem fokozódik, mint a pszoralének használata esetén.The preparation and use of the composition of the invention is easy, the patient only needs to be exposed to ultraviolet radiation for a very short period of time, the effect occurs very quickly, 15-20 days after the start of treatment, the resulting skin color is the same as the patient color intensity does not increase as with psoralens.

A találmány szerinti készítményt emberi szövetből nyerjük, és a sem immunológia reakciók, sem a korral, nemmel és fajjal kapcsolatos ellenjavallatok nincsenek.The composition of the invention is obtained from human tissue and there are no immunological reactions or contraindications related to age, sex and species.

A találmány célja a vitiligo gyógyítására alkalmas készítmény előállítása. Ez a betegség egyike a legrégebben ismert emberi megbetegedéseknek. Körülbelül a világ népességének 1 %-át érinti, korra, nemre, fajra való tekintet nélkül. Kóroktana ismeretlen, és nincs határozott terápiája sem. Ezt a betegséget nagy idegi megterhelésnek (Stressznek) kitett betegek bőrének fokozatos elszíntelenedése jellemzi, és a tünetek fellépése (fokozott pigmentációjú gyűrűvel körülvett fehér bőrfelületek az arcon, törzsön vagy más területeken) kedvezőtlenül hat a betegek lelkiállapotára és szociális magatartására.It is an object of the present invention to provide a composition for the treatment of vitiligo. This disease is one of the oldest known human diseases. It affects about 1% of the world's population, regardless of age, gender, race. His pathology is unknown and he has no definite therapy. This disease is characterized by the gradual discoloration of the skin of patients exposed to high levels of nerve stress (stress), and the onset of symptoms (white areas of the face, trunk, or other areas surrounded by a ring of increased pigmentation) adversely affect patients' psychological and social behavior.

A találmány értelmében fenti célt úgy érjük el, hogy az emberi méhlepény cotyledokat etilalkohollal és benzoesavval kezeljük, majd Sephadex gélen szűrjük, majd az így nyert terméket, mely elektroforetikus vándorlás során α-lipoproteinnek bizonyult lipoproteint tartalmaz, liofilizáljuk. A termék etilalkoholban való oldásával állítjuk elő a gyógyszerkészítményt.According to the present invention, the above object is achieved by treating the human placental cotyleds with ethyl alcohol and benzoic acid, then filtering the Sephadex gel and lyophilizing the resulting product, which contains an alpha-lipoprotein that has been shown to be α-lipoprotein during electrophoretic migration. The product is prepared by dissolving the product in ethyl alcohol.

7. példa kg méhlepény-cotyledot 7-10 napos fagyasztás után porrá törtünk, majd 95 %-os etilalkoholban áztattuk, egyenlő részekre osztva (súly/térfogat). Ezután meghatároztuk a felülúszó pigment-képző aktivitását, ami a tengerimalac mellbimbó bőrén történt kezelés után 20-50 napig pozitív volt. Ezután a fenti, pigment-képző faktort tartalmazó kivonat 200 ml-éhez 10 ml 95 %-os, benzoesavval telített etilalkoholt adtunk, injekciós tű segítségével. Benzoesav/etilalkohol telített oldatának készítése úgy történt, hogy 5—12 ml 95 %-os etilalkoholhoz 2 - 8 g benzoesavat adtunk.Example 7 Kg of placenta cotyled after being frozen for 7-10 days, it was soaked in 95% ethyl alcohol, divided equally (w / v). The supernatant pigmentation activity was then determined, which was positive for 20-50 days after treatment on guinea pig nipple skin. Subsequently, 200 ml of 95% benzoic acid-saturated ethyl alcohol were added to 200 ml of the above pigment-forming factor extract by means of a needle. A saturated solution of benzoic acid / ethyl alcohol was prepared by adding 2-8 g of benzoic acid to 5-12 ml of 95% ethyl alcohol.

Ezután a keveréket 10-15 percig ráztuk, majd Buchner tölcsérrel, 2—5-ös Whatman szűrőpapíron szűrtük. Ezt követően a csapadékot 200-500 ml, benzoesavval telített vízzel mostuk. Víz/benzoesav telített oldatát úgy készítettük, hogy 300- 1000 ml desztillált vízhez 2- 10 g benzoesavat adtunk.The mixture was shaken for 10-15 minutes and filtered through a Buchner funnel on Whatman filter paper 2-5. The precipitate was then washed with 200-500 ml of water saturated with benzoic acid. A saturated solution of water / benzoic acid was prepared by adding 2-10 g of benzoic acid to 300 ml of distilled water.

Ezután a csapadékot spatula segítségével eltávolítottuk a szűrőpapírról, majd 100-500 ml tiszta vagy 30 %-os acetont adtunk hozzá. Ezt követően 1500-as fordulatszámmal 10—30 percig centrifugáltuk, és félretettük a felülúszót. A csapadékot ezután 2-10-szer újra átmossuk 100 - 500 ml acetonnal, majd vákuumban és környezett hőmérsékleten szárítottuk és a készítményt 95 %-os alkoholban feloldottuk. A fenti, biológiai aktivitású készítmény 5 ml-ét 5* 10-től 5* 10^-6 mólos nátriumfoszfát puffer segítségével 4—8-as pH-ra beállított Spephadex g-30-οη vagy g-100-οη szűrtük, ésThe precipitate was then removed from the filter paper using a spatula and 100-500 ml of pure or 30% acetone was added. Subsequently, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 10-30 minutes and the supernatant was set aside. The precipitate was then washed again with acetone (100-500 mL) 2-10 times, dried in vacuo at ambient temperature and dissolved in 95% alcohol. 5 ml of the above biological activity preparation was filtered through Spephadex g-30-οη or g-100-οη adjusted to pH 4-8 with 5 * 10 to 5 * 10 ^-6 M sodium phosphate buffer, and

191 473191,473

5-10 mi c/u-s frakciókban 1-3 cm széles, 18-40 cm magas oszlopra vittük fel.5-10 ml c / u fractions were applied to a 1-3 cm wide, 18-40 cm high column.

Két fehérje-csúcsot nyertünk, az elsőt 100 — 300 mcg/ml-nél, a másodikat 20—150 meg/ ml-nél. A pigmentképző aktivitás ez utóbbi frakció 5 esetén volt pozitív, mégpedig 10-20 nappal azután, hogy a tengerimalac bőrét kezeltük.Two protein peaks were obtained, the first at 100-300 mcg / ml and the second at 20-150 mcg / ml. Pigment-forming activity was positive for the latter fraction, 10-20 days after the treatment of guinea pig skin.

2. példaExample 2

Emberi méhlepényeket — 10 °C és 5 ’C közötti hőmérsékleten tároltunk 7—15 napig. A méhlepényeket felolvasztottuk és a cotyledokat elválasztot-15 tűk a magzatburoktól és a köldökzsinórtól. A méhlepény cotyledokat desztillált vízzel vagy nátriumklorid-oldattal (9 g x 100 ml desztillált víz) mostuk, míg a vérnyomokat eltávolítottuk. A cotyiedokat lemértük és 30- 100 g cotyledo/100 ml eta- ²⁰nol mennyiségben 95 %-os etanollal kevertük öszsze. A keveréket 8 — 40 órán át állni hagytuk, majd szűrtük és a szürletet 13 — 30 órán át hagytuk ülepedni. A szürlet leülepedése után 50 — 200 ml felülúszóhoz 5 - 20 ml etanolt adtunk, amelyet előzőleg ²⁵benzoesavvai telítettünk. A benzoesavval telített etanol alkalmazása elősegíti a hatóanyagnak a benzoesav-kristályokon való adszorpcióját. A kapott elegyet 50 percig kevertük, vákuumban szűrtük, a felülúszót félretettük, a kivált csapadékot összegyűjtöttük és 200-500 ml benzoesavval telített desztillált vízzel mostuk. Az így kapott csapadékhoz 100 — 300 ml acetont adtunk és a kapott anyagot 1500 ford/perc sebességnél 40 percig centrifu-₃₅gáltuk. A felülúszót félretettük és a csapadékot^Jismét 100 - 200 ml acetonnal mostuk. Szárítás után a csapadékot 95 %-os etanolban oldottuk,Human placenta was stored at -10 ° C to 5 ° C for 7-15 days. The placenta was thawed and the cotyledos were separated from the fetal mantle and umbilical cord. The placental cotyledons were washed with distilled water or with sodium chloride solution (9 g x 100 ml distilled water), while blood traces were removed. The cotyiedokat weighed and 30 g of 100 cotyledon / 100ml ETA phenol amount ^{of 20} 95% ethanol was stirred totality. The mixture was allowed to stand for 8 to 40 hours, then filtered and the filtrate allowed to settle for 13 to 30 hours. After the filtrate had settled, to the supernatant (50-200 ml) was added ethanol (5-20 ml) previously saturated with ²⁵ benzoic acid. The use of ethanol saturated with benzoic acid facilitates the adsorption of the active ingredient on the benzoic acid crystals. The resulting mixture was stirred for 50 minutes, filtered in vacuo, the supernatant was discarded, and the resulting precipitate was collected and washed with distilled water saturated with benzoic acid (200-500 mL). 300 ml of acetone was added and the resulting material speed 1500 rev / min for 40 minutes, vortexed and spun centrifuge ₃₅ - 100 The precipitate thus obtained. The supernatant was discarded and the precipitate was again ^J 100 - with 200 mL of acetone. After drying, the precipitate was dissolved in 95% ethanol,

-10 mg/ml koncentrátumban.-10 mg / ml in concentrate.

- 30 ml előzőek szerint kapott etanolos oldatot ₄₀5 x 10”’ ~ 5 x 10”^s mólos nátriumfoszfát puffer segítségével 3-8 pH-értékre beállított Sephadex G-50 vagy G-80 gélen szűrtük. A szűrésnél 18 - 40 cm magas, 1 - 3 cm átmérőjű üvegoszlopot használtunk. Az oldatot 10 — 30 csepp/perc sebes-45 séggel engedtük át az oszlopon és 5- 10 ml-enként összegyűjtöttük. A frakciók spektrofotometriai analízise során a 20 — 150 mcg/ml értéknek megfelelő 278 nm-nél maximumot mutatott. A frakció liofilizálásával nyert termék etilalkoholos oldata 50 pigmentképző aktivitást mutatott.Filtered, 30 ml of ethanol solution obtained above ₄₀ 5 x 10 '' x 10 ~ 5 ^'s adjusted to pH 3-8 M sodium phosphate buffer using a Sephadex G-50 or G-80 gel -. A glass column 18 to 40 cm high and 1 to 3 cm in diameter was used for filtration. The solution was passed through the column at a rate of 10 to 30 drops / min and collected at 5 to 10 ml. Fraction spectrophotometric analysis showed a maximum at 278 nm corresponding to 20-150 mcg / ml. An ethyl alcohol solution of the product obtained by lyophilization of the fraction showed 50 pigmentation activities.

A proteinek festésére szolgáló festékkel (black amido) megfestett poliakrilamin gélben végzett elektroforézis során kis színes csík volt megfigyelhető a színtelen sáv mellett, mindkettő kismértékű 55 elektroforetikus migrációt jelez,During electrophoresis on a polyacrylamine gel stained with protein dye (black amido), a small colored band was observed along the colorless band, both indicating a slight 55 electrophoretic migration,

A lipidek festésére szolgáló festékkel (Sudan III) festett agaróz-géllel végzett elektroforézis során csak egy csík volt megfigyelhető azon a területen, ahol az alfa-lipoproteinek szoktak megjelenni.During electrophoresis with agarose gel stained with lipid staining (Sudan III), only one band was observed in the region where alpha-lipoproteins are commonly present.

Az általunk izolált alfa-lipoprotein kis molekulasúlyú, molekulasúlya 4000— 1500 dalton.The alpha-lipoprotein isolated by us is low molecular weight and has a molecular weight of 4000 to 1500 daltons.

A találmány szerinti készítmény hatékonyságát a Calixto Garcia Hospital (Havanna City) bőrgyógyászati osztályának 200 férfi- és nőbetegén végzett klinikai vizsgálatok bizonyítják. E betegeken a vitiligoi£ jellemző lézióik voltak, melyek szétszórtan vagy lokalizáltan fordultak elő testükön, különböző méretekben. Koruk 2-64 év közötti volt és kísérletünk megkezdésekor nem álltak semmiféle kezelés alatt.The efficacy of the composition of the present invention is demonstrated in clinical trials of 200 men and women in the dermatology department of Calixto Garcia Hospital (Havana City). These patients had characteristic lesions of vitiligo, which occurred scattered or localized on their bodies in varying sizes. Their age was 2-64 years and at the start of our experiment they were not under any treatment.

Az alábbi táblázat a 4 év és 2 hónap alatt a ta'álmány használatával nyert eredményeket foglalja össze:The following table summarizes the results obtained using the invention over a period of 4 years and 2 months:

összes beteg összes repigmentált beteg Összes teljesen repigmentált beteg összes részben repigmentált beteg összes nem repigmentált beteg A kezelést abbahagyó betegekall patients all repigmented patients all fully repigmented patients all partially repigmented patients all non-repigmented patients patients who discontinued treatment

200 168 200 168 100 % 84 % 100% 84% 63 63 31,5 % 31.5% 105 105 52,5 % 52.5% 5 27 5 27 2,5 % 13,5 % 2.5% 13.5%

Nem léptek fe! sem helyi, sem szisztémás másodlagos reakciók. Kezelés utáni recidiva (visszaesés) nem fordult elő,They didn't go! no local or systemic secondary reactions. There was no recurrence (relapse) after treatment,

A bazális membrán szövettani vizsgálata során bebizonyosodott, hogy készítményünk a melanin szintézisét idézi elő, és ezáltal kiküszöböli a betegségre jellemző, a bazális membrán melaninjának h ánya által okozott zavart.Histological examination of the basement membrane has shown that our preparation induces the synthesis of melanin and thus eliminates the disease-specific disturbance caused by the deficiency of the basement membrane melanin.

Az említett szövettani vizsgálatot a Calixto Garda Hospital kórbonctani részlege végezte.The aforementioned histological examination was performed by the pathological department of Calixto Garda Hospital.

Claims

A process for preparing alpha-lipoprotein having a protein peak of 20-150 mcg / ml by spectrophotometric analysis, characterized in that human placental cotyledons are extracted with 95% ethyl alcohol, preferably 1 to 10 times 95% ethyl alcohol, at room temperature. After treatment with Sephadex gel, the alpha-lipoprotein-containing fraction was lyophilized.

2. A process for the preparation of a medicament for stimulating the synthesis of melanin in the skin, wherein the alpha-lipoprotein prepared according to claim 1 is formulated with topical carriers, preferably 95% ethyl alcohol, for topical administration.