HU185660B

HU185660B - Process for producing factor for stimulating multiplication of cells of the liver

Info

Publication number: HU185660B
Application number: HU812863A
Authority: HU
Inventors: Gerhard Ruhenstroth-Bauer; Michel Goldberg; Hubertus Schneider
Original assignee: Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1980-10-04
Filing date: 1981-10-02
Publication date: 1985-03-28
Also published as: EP0049379A1; EP0049379B1; US4377514A; DE3037600C2; DE3037600A1; JPS5791925A

Description

Szabadalmas: (73)

Max-Planck-Gesselschaft zűr Förderung dér Wissenschaften e. V., Göttingen, DE

54)

ELJÁRÁS MÁJSEJTEK SZAPORODÁSÁT STIMULÁLÓ FAKTOR ELŐÁLLÍTÁSÁRA (57) KIVONAT

A találmány tárgya új eljárás máj sejtek szaporodását stimuláló, 30000—50000 D molekulasúlyú neuraminsavmentes proteinből vagy proteidből álló faktor előállítására.

A találmány szerint — kívánt esetben májuktól részben megfosztott — kísérleti állatok Peyer-féle mirigyeit homogenizáljuk, a pH-t 5,5-re állítjuk, 95 °Con hővel denaturáljuk és centrifugáljuk, majd a faktort tartalmazó felülúszót elkülönítjük, és kívánt esetben a felülúszót neuraminidázzal neuraminsavmentesítjük.

-1185 660

A találmány tárgya új eljárás májsejtek szaporodását stimuláló, 30000--50000 D molekulasúlyú neuraminsavmentes proteinből vagy proteidből álló faktor előállítására.

A 28 14981 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban közölnek egy faktort máj sejtek szaporodási hányadosának stimulálására, amely egy 30000—50000 D molekulasúlyú neuraminsav-mentes proteinből vagy proteidből képződik. Ezt a fakto t úgy kapják, hogy májuktól részben megfosztott kísérleti állatokból a máj maradékát homogenizáljuk, a pH-t 5,5-re állítják, 95 °C-on hődenaturálják és centrifugálják, mikoris a felülúszó tartalmazza a faktort. Hasonlóképpen a májuktól részben megfosztott kíséi leti állatok maradék mája helyett a májuktól részben megfosztott állatok vérplazmáját is használhatják, így azonban nem magát a faktort kapják, hanem egy előfaktort, amelyet neuraminidázzal történő kezeléssel még neuraminsavmentesiteni kell.

A fennálló tudományos nomenklatúrára támaszkodva ennek a faktornak, amely egy hormon, a „hepatopoetin” nevet javasolták.

Ennek a hormonnak a képződése a következő hipotézishez vezetett a szabályozást illetően: a részlegesen eltávolított máj (azaz olyan máj, amelyből egy részt operációval eltávolítottak) visszamaradt része ingert küld egy eddig még ismeretlen szervnek, amely erre az említett előfaktort termeli, és leadja a vérplazmába. Neuraminidázzal való reakcióval keletkezik az előfaktorból a tulajdonképpeni faktor (hepatopoetin), amely magában a májban a májsejtek fokozott osztódási aktivitását okozza.

A hepatopoetinnek az említett szabadalmi leírásban közölt kinyerésének az a hátránya, hogy kiindulási anyagként májuktól részlegesen megfosztott állatok maradék máját vagy vérplazmáját elő kell készíteni. Ez azt jelenti, hogy először az állatoknak viszonylag komplikált operációban el kell távolítani májuk egyrészét; azután viszonylag hosszú ideig várni kell, amíg a faktornak a vázolt szabályzó kör által indukált fel dúsulása a májban és plazmában bekövetkezhet. Utá na le kell ölni az állatokat, a maradék májat ki kell venni, és az említett előállítási eljárást végre kell haj tani.

Ebből a helyzetből adódik az a feladat, hogy az előállítás további lehetőségeit kell keresni, főleg a magát a hepatopoetint termelő szervből való előállítás módját. Ez a szerv azonban eddig nem ismert.

Az említett feladatot úgy oldottuk meg, hogy kísér leti állatok Peyer-féle mirigyeit homogenizáljuk, a pH-t 5,5-re állítjuk, 95 °C-on hődenaturáljuk, és centrifugáljuk, mikoris a felülúszó tartalmazza a faktort.

Ez a megoldás azon a felismerésen alapul, hogy a hepatopoetin emlősállatok testében az úgynevezett Peyer-féle mirigyekben képződik. Ezek nyiroktüszők (limfociták csomói) a terminális ileumon (vékonybél) ennek a vastagbélbe való betorkollása előtt.

Azt tapasztaltuk, hogy a májuktól részben meg fosztott állatok Peyer-féle mirigyeikből nyert extraktum hasonló módon serkentőleg hat a máj sejtek sza porodási hányadosára, mint a 2814981 sz. Némer Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban kö zölt eljárással nyert extraktum. Egyidejűleg tapasztaltuk azt is — és ez a fent említett okokból lényeges elő nyökkel járó eljárás — hogy normális (tehát nem májuktól részben megfosztott) állatok Peyer-féle mirigyeiből kinyert extraktum is lényegében ugyanilyen szaporodásfokozó hatással rendelkezik. Az extraktumot ugyanolyan módon nyerjük ki, mint ahogy a 2814981 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban leírják; azaz az operációval eltávolított Peyer-féle mirigyek homogenizátumának pH-ját 5,5,-re állítjuk, 95 °C-on hődenaturáljuk és centrifugáljuk, majd a hepatopoetint tartalmazó felülúszót elkülönítjük.

A Peyer-féle mirigyekből kinyert extraktumnak ez a szaporodásfokozó hatása neuraminidázzal való kezelés nélkül is, de ezzel való kezelés után fokozott mértékben jelentkezik. Ezért úgy látszik, hogy a Peyer-féie mirigyekből történő extrahálással mind az előbb ismertetett előfaktort (amely ezt követő, neuraminidázzal végzett kezeléssel a faktort adja), mind magát a tulajdonképpeni faktort kinyerjük.

Ez a faktor embernél nyilvánvalóan hasznosítható. Emberen végzett klinikai kísérletek azonban belátható időn belül nem lehetségesek. A hasznosíthatóságot azonban ez nem vonja kétségbe, mivel — amint a következő közleményekből látható — az ezen a területen járatos szakemberek általános véleménye, hogy az ilyen módon kinyert proteinek vagy proteidek nem fajspecifikusak. Bizonyítékként a következő közleményekre hivatkozunk:

a) Iscove, Sieber und Winterhalter; Erythroid Colony Formation in Cultures of Mouse and Humán Boné Marrow: Analysis of the Requirement fór Erythropoietin by Gél Filtration and Affinity on AgaroseConcanavakin A, J. Cell. Physiol 83, 309—320.

Ebben a közleményben juhok vérplazmájából kinyert eritropoietinnek az emberi csontvelősejtekre való hatásosságát írják le.

b) Korner und Hogan; The Effect of Growth Hormoné on Inducuble Liver Enzyms; Growth and Growth Hormoné, 98—105. old., Pecile und Müller kiadás (1972).

Ebben a közleményben egy szarvasmarhából nyert növekedési hormonnak patkányokra gyakorolt hatását írják le, (ld. például a 3. ábrához csatolt magyarázatot).

c) Schally und Arimura, Growth Hormone-Releasing Hormoné (GH—RH) of the Hypothalamus; its Chemistry and in Vivő and in Vitro Effects; Growth and Growth Hormoné, 247—251 old., Pecile und Müller kiadás (1972).

Ebben a kőkeményben egy sertésből kinyert hormonnak patkányokra gyakorolt hatását írják le.

d) A Goldstein, Isolation of Bovine Thymin; a Polypeptide Hormon of the Thymus, Natúré 247, 11 (1974) és a Kagan és mtsai, Induction of Humán Granulocyte Differentiation in Vitro by Ubiquitin and Thymopoietin, Blood 50, 275—288 (1977) közleményekből a szarvasmarhából kinyert timopoietin emberre gyakorolt hatása derül ki. Az elsőként említett közlemény a szarvasmarhából való kinyerésre, a másodikként említett közlemény az emberen való kipróbálásra vonatkozik.

e) Általánosan ismert továbbá, hogy patkányokon és egereken hatást kifejtő inzulin embernél is hatásos: Garda, J. F.: Assays fór Erythropoietin; Kidney Hormones, 7—35. old., J. W. Fischer kiadás (1977).

185 660

A következőkben az extraktum előállítását írjuk le. A példában a májuktól részben megfosztott kísérleti állatok Peyer-féle mirigyeiből való extrahálást ismertetjük.

Példa

A kísérleteket 95—105 g súiyú nőstény SPF-Wistarpatkányokon (Institut für Strahlen- und Umweltforschung, Neuherberg/München) végeztük. Az állatokat leöltük, kivéreztettük és a Peyer-féle mirigyeket mikrosebészetileg eltávolítottuk. Ezután a Peyer-féle mirigyeket 4-szeres (súly) mennyiségű, kétszer desztillált vízzel egy Elvehjem—Potter homogenizátorban homogenizáltuk. Ekkor a Peyer-féle mirigyek sejtanyaga felaprítódott és a lehető legteljesebben elroncsolódott. Az említett készülék ismert; a sejtek ebben egy üveghengerben eközött és egy ebben forgó teflonrúd között őrlődnek. A sejtekben lévő anyagok így a következő koncentrálási, illetve elválasztási műveletekhez hozzáférhetők lesznek.

Ezt a Peyer-féle mirigyekből kinyert sejthomogenizátumot 0,1 n sósavoldattal a megadott pH-értékre állítjuk. Ez a savanyítás fontos elválasztási módszer nagyszámú protein kicsapására: ezek kiválnak, és ezzel a további koncentrálási, illetve elkülönítési eljárásból kimaradnak. Lényegében tehát olyan proteinek maradnak a homogenízátumban, amelyek pH 5,5-re való savanyításkor még stabilak. Azaz ezek pH sS5,5 numerikus értéknél stabilak (mivel egy numerikusán kisebb pH-érték erősebb savanyításnak felel meg). Utána a homogenizátumot 95 °C hőmérsékleten 20 perc időtartamig hődenaturáljuk. Ennek az a célja, hogy további alkotórészeket csapjunk ki, nevezetesen olyanokat, amelyek ezen vagy magasabb hőmérsékleten nem állandók.

Ezzel a két eljárási lépéssel (pH 5,5-re való savanyítás és 95 °C-on való hődenaturálás) tehát a homogenizátum alkotórészeinek nagyrészét elhasítjuk és így kicsapjuk. Ezután 15 perc időtartamú centrifugálás következik 4000 g-vel (Minifuge Christ, Osterrode/Harz). A centrifugálás utáni felülúszó így csak azokat az eredeti homogenízátumban jelenlévő hatóanyagokat tartalmazza, amelyek pH 5,5-nél és 95 ’Con még stabilak, ezeket viszont tisztított formában.

Azon célból, hogy ezen hatóanyagoknak még azt a részét is kinyerjük, amelyek még abban a csapadékban vannak, amelyet a centrifugálásnál kaptunk, ezt a csapadékot kétszer desztillált vízzel ismét feltöltjük az eredeti térfogatra, újból pH 5,5-re savanyítjuk, és 95 °C-on hődenaturálásnak vetjük alá, és centrifugáljuk. Ezt a műveletet összesen kétszer ismételjük.

Az összesen három centrifugálási műveletből származó felülúszókat egyesítjük, és liofilizáljuk, azaz vákuumban vízelvonás közben fagyasztva szárítjuk. Az anyag ezután porszerű formában áll rendelkezésre, és —20 °C-on tároljuk. Ez az anyag a következőkben leírt kísérleteknél használt extraktum (TH-extraktum).

Egyidejűleg ugyanilyen módon készítünk extraktumot olyan állatokból is, amelyeknek nem távolitottuk el részlegesen a májukat. Ez tehát a normális állatok Peyer-féle mirigyeiből készült extraktum (N-extraktum)

Egyidejűleg az N-extraktum egy részét neuraminidázzal kezeljük. A liofilizált N-felülúszót kétszer desztillált vízben oldjuk, a pH-t 5,5-re állítjuk, és egy órán át 37 °C-on 250 egység neuraminidáz adaggal (Behring—Werke, Marburg) inkubáljuk. Utána a fölösleges neuraminidázt 95 °C-on 30 percig tartó melegítéssel inaktiváljuk, centrifugáljuk, és a felülúszót újból liofilizáljuk. A liofilizátum a normális (azaz nem részben májuktól megfosztott) állatok Peyer-féle mirigyeinek neuraminidázzal kezelt extraktuma, az NND-extraktum.

Azt tapasztaltuk, hogy mindegyik extraktum, tehát a májuktól részben megfosztott állatok Peyer-féle mirigyeiből nyert TH-extraktum utólagos neuraminidázkezelés nélkül, a normális állatok Peyer-féle mirigyeiből nyert N-extraktum utólagos neuraminidáz-kezelés nélkül, valamint a normális állatok Peyer-féle mirigyeiből nyert NND-extraktum is utólagos neuraminiá&z-kezeléssel a májsejtek szaporodásának fokozódását idézi elő.

Az illető extraktumok 1 g-ját 0,9%-os nátrium-klorid oldatban oldottuk, és az oldat 2,0 ml-éí injektáltuk intraperitonealisan (i. p.) normál patkányokba.

Ugyanilyen mennyiségű 0,9%-os nátrium-klorid oldatot injektáltunk intraperitonealisan kontroli-állatokba is.

A inájsejtek szaporodásának mérése a TH-extraktum injekciója után a DNS-szintézis mérésével történt. A mérés úgy történik, hogy specifikusan a DNSbe beépült radioaktív anyagok mennyiségét mérjük. Ilyen anyagként ³H-metií-timidint használtunk. Ennek fajlagos aktivitása 25 Ci/mmól volt. (Gyártó: Radiochem. Center, Amersham).

Mind a kísérleti állatokba mind a kontrolállatokba a Th-, N-, illetve NND-extraktumok injekciója után 19 órával 50-50 pCi³H-meíil-timidint injektálunk. Az állatokat 1 óra múlva leöljük. A májat eltávolítjuk, és —20 'C-on tároljuk.

Ezután történik a máj DNS-ének extrakciója Weinbren és Woodward [Br. J. Exp. Path. 45, 442— 449 (1964)] szerint. Ennek az extraktumnak egy részét használjuk radioaktivitás-méréshez. Ezért a PCA (Perklórecetsav)-tartalmú oldat 1,5 ml-ét 0,5 ml 1 n nátrivm-hidroxid oldattal semlegesítettük. A keletkező olratot egy szcintillációs üvegcsében 5 ml Triton X 100-zal és 10 ml toluollal (0,6 PPO; PPO - 1,5-difenil-oxazol) homogenizáljuk. Utána folyadék-scintillációs-számláló (Intertechnique, Paris) segítségével mérjük a radioaktivitást beütésszám/perc-ként. A DNS-extraktum egy további részét a DNS-koncentráció Biirton szerinti meghatározására [Biochem. J. 62, 315—323 (1956)] használjuk. Ezen a módon tehát a fajlagos aktivitást kapjuk beütésszám/perc/mikrogramm DNS-ként.

így a következő táblázatban megadott értékeket kapjuk:

-3185660

1. táblázat

Beadott injekció:	TH-extraktum {májuktól részben megfosztott kísérleti állatok Peyerféle mirigyeiből készített extraktum).	N-extraktum (normális kísérleti állatok Peyer-féle mirigyeiből készített extraktum).	NND-extraktum (normális kísérleti állatok Peyer-féle mirigyeiből készített extraktum; az extraktum neuraminidázzal kezelve).	Kontroll (nátrium-klorid oldat).
DNS-szintézis (beütés szám/perc/μ gDNS)	348 ± 63	255 ± 74	329 ±59	^; 104 ± 22
	n — 4	n — 4	n — 4	n- 12

Ezzel kimutattuk, hogy az említett extraktumok intraperitonealis injekciója normális állatoknál a DNS-szintézis jelentős fokozódásához vezet, ami a maga részéről sejtosztódás és ezzel sejtosztódás útján való májnövekedés szükséges előfeltétele.

Emellett különleges jelentőségű, hogy a N- és az NND-extraktummal, azaz normális kísérleti állatok Peyer-féle mirigyeiből származó extraktummal is hatást értünk el. Ez azt jelenti, hogy a hepatopoetin nyerése céljából többé nem szükséges azon állatok májának részleges eltávolítása, amelyekből ezt kinyerjük. Ezzel az előállítás nagyon jelentősen leegyszerűsödik, és ezzel megnyílik az a lehetőség is, hogy vágóállatokból a Peyer-féle mirigyeket operációval elkülönítsük, és ebből nyerjük ki a hepatopoetint. Ez ismételten jelentős egyszerűsítést jelent az előállításban.

Annak a ténynek az igazolására, hogy a Peyer-féle mirigyek a májsejtek szaporodása szempontjából a vázolt jelentőséggel rendelkeznek, még a következő kísérleteket végeztük:

Az altesti részben részletekben különböző szerveket távolítottunk el. az ilyen állatoknál utána részleges májeltávolítást hajtottunk végre, és vizsgáltuk az erre fellépő reakciót.

Ezen célból 200 g súlyú nőstény SPF-Wistar patkányokon a következő szerveltávolításokat végeztük, és pótlólag még 70%-os részleges májeltávolítást hajtottunk végre rajtuk:

a) Ileotransversotomia (csípőbél átmetszés) (Schein-operáció).

A distalis ileum feltárása után, körülbelül 4 cm-rel a vastagbélbe való beszájadzás előtt, a distalis ileumcsonkon egy vakelzárást végzünk. Utána az orális ileumcsonkon körülbelül 2 cm-re aboralisan az ileocoecalis szöglettől seromuscularis varrástechnikával csípőbélsipolyt készítettünk.

(A 2. táblázatban: Ileo).

b) Részleges ileo-colektomia.

Először feltártuk az ileocoecalis szögletet. Gondos érlekőtés után kivágtuk a distalis ileumból körülbelül 4 cm-es és a proximalis vastagbélből körülbelül 2 cmes részt. Végül seromuscularis betüremkedéses varrat segítségével az ileumcsonk „vég a véghez” összeszájadzását hoztuk létre a vastagbélcsonkkal. Ily módon tehát eltávolítottuk az ileumnak azt a részét, amely a Peyer-féle mirigyeket tartalmazza.

(A következőkben: Il-Co).

c) A Peyer-féle mirigyek eltávolítása.

Először az egész vékonybelet feltárjuk. A Peyer-féle mirigyek megkeresése után az ileocoecalis szöglettől kiindulva a szájnyílás felé eső irányban ékalakú kimetszést végzünk, és a bél „vég a véghez” egyesítését végezzük seromuscularis varrástechnika segítségével. Átlagosan 6 areolát metszünk ki.

(A következőkben: PD).

d) Vastagbél kimetszés,

A vastagbél-feltárás után a vastagbél körülbelül 3 cm-es szakaszát metsszük ki az ileocoecalis szöglettől aboralisan. Ezután a két vastagbélcsonkot „vég a véghez” újból egyesítjük.

(A továbbiakban: Co).

e) Mesenterialis nyirokcsomó extirpatio (bélfodori nyirokcsomók teljes kiirtása).

Elsőként elvégezzük a bélfodori nyirokcsomólánc feltárását, amely az ileocoecalis szöglettől a bélfodorgyökig húzódik. Utána az egyes nyirokcsomókat lépésenként elkülönítjük, majd az érkaput lekötjük, és végül a nyirokcsomókat kivágjuk. Ezzel tehát a Peyerféle mirigyekkel szomszédos hasonló nyiroksejtterületet eltávolítjuk, a Peyer-féle mirigyeket magukat viszont meghagyjuk.

(A következőkben: MLK).

f) Röntgenbesugárzás.

Az egész bélrendszer feltárása után a patkányokat vastag ólomlappal lefedjük. Egy keskeny résen át előhúzzuk ugyanazt a bélterületet, amelyen az ileo-colek: 5 tomiát végeztük. Utána a patkányokat 8 percig összesen 400 R-rel besugározzuk. Ezután minden rétegre kiterjedő seblezárás történik.

(A következőkben: Rönt.).

A Schein-operáció szintén kontroli-célokból tör63 tént, hogy a megfigyelt hatást a narkózis, a szervekre való hideg-behatás, operatív sokk vagy hasonló következményeként kizárjuk.

Azon célból, hogy ezeknél az állatoknál a DNSszintézist is megfigyelhessük, az operáció után 21 órán , val mindegyiküknek 50 μθ ³H-timidint adtunk injek45

185 660 dóban. Pontosan egy órával később a patkányokat leöltük. A májat eltávolítottuk, és után a már fentebb vázolt módon meghatároztuk a szaporodási hányadost.

A 2. táblázatból látható, az eltávolítási módtól füg- 5 gően különböző regenerációs válaszokat kaptuk.

2. táblázat:

Kezelés	Ileo	Il-Co	PD	Co	MLK	Röntg.
faji. aktivitás	889	216	130	912	991	1246
beütés/perc/ gg DNS-ben S±SD	±167	±116	±46	±99	±139	±220
n	8	5	5	5	4	6

A kontrolioperációra (Ileo) vonatkoztatva tehát az ileo-colektomiánál (Il-Co) 24 ± 11%-ra csökkent regeneráció jelentkezett, a Peyer-féle mirigyek eltávolí- 20 tásánál viszont még csak 18 ± 5%-os regeneráció. Olyan eltávolítások esetében, amelyek a Peyer-féle mirigyeket meghagyják (Co, MLK) nem jelentkezett csökkent regeneráció. A röntgenbesugárzás esetében viszont még valamennyire fokozódott regeneráció je- ²⁵lentkezett. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy a röntgenbesugárzás a szövetek roncsolásával a faktort felszabadítja.

Ez a kísérlet megerősíti a Peyer-féle mirigyek jelentőségét. Hogy ezekben mindenesetre nem csak egy a ³⁰hepatopoetin képződése vagy a májban regenerációs válasz fellépése szempontjából döntő folyamat megy végbe, hanem ténylegesen magának a hepatopoeíinnek a termelése történik, az mindenesetre csak az ezekből a Peyer-féle mirigyekből kinyert extraktum hatásának fentebb tárgyalt vizsgálataiból derül ki.

A kapott eredményekből továbbá jelentős az, hogy az extraktum mind neuraminidázzal való utólagos kezelés nélkül, mind neuraminidázzal való utólagos kezeléssel a szaporodási hányados vázolt emelkedését okozza. Ebből arra kell következtetni, hogy az extrakt im mind az előfaktort (amelyből neuraminidázzal maga a tulajdonképpeni faktor keletkezik) mind magát a faktort (amely neuraminsavmentes, és ezért neuraminidázzal való kezeléssel már nem változik) tartalmazza.

Ez talán arra az elképzelésre ad okot, hogy mindkét anyagot, nevezetesen mind magát a faktort, mind az előfaktort a Peyer-féle mirigyek termelik. Ezek azután a véna portae-n keresztül jutnak a májba. A máj magát a faktort befogja, míg az előfaktort a vérkeringésbe átadja, úgy hogy az a plazmában van jelen, és neuraminidáz hatása után a faktort szolgáltatja. Ez magyarázná, hogy a keringő vérplazmában csak az előfsktor található, maga a faktor azonban nem.

Claims

Szabadalmi igénypont

Eljárás májsejtek szaporodását stimuláló, 30000— 50000 D molekulasúlyú neuraminsavmentes proteinből, vagy proteidből álló faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy — kívánt esetben májuktól részben megfosztott — kísérleti állatok Peyer-féle mirigyeit homogenizáljuk, a pH-t 5,5-re állítjuk, 95 °C-on hővel denaturáljuk és centrifugáljuk, majd a faktort tartalmazó felülúszót elkülönítjük, és kívánt esetben a felülúszót neuraminidázzal neuraminsavmentesítjük.

Ábra nélkül