Claims (18)
1. Postupak za pročišćavanje rekombinantne ljudske lizozomske alfa-manozidaze iz stanične kulture, gdje se frakcija navedene stanične kulture koja sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu podvrgava kromatografiji na smoli koja sadrži višemodalni ligand, pri čemu navedeni višemodalni ligand vezan za smolu predstavlja supstancu koja ima grupu karboksilne kiseline ili grupu sulfonske kiseline, i pri čemu je rezultat navedenog postupka pripravak koji sadrži pročišćenu alfa-manozidazu, naznačen time što je najmanje 80% alfa-manozidaze prisutno u vidu glikoproteina od 130 kDa.1. A method for purifying recombinant human lysosomal alpha-mannosidase from cell culture, wherein the fraction of said cell culture containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase is subjected to chromatography on a resin containing a multimodal ligand, wherein said multimodal ligand bound to the resin represents a substance having a carboxylic acid group or a sulfonic acid group, and the result of the mentioned procedure is a preparation containing purified alpha-mannosidase, characterized by the fact that at least 80% of the alpha-mannosidase is present in the form of a glycoprotein of 130 kDa.
2. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, gdje stanična kultura sadrži stanice specifično dizajnirane za izražavanje rekombinantne alfa-manozidaze, pri čemu se navedene stanice biraju iz grupe koja se sastoji od CVI linije bubrega majmuna transformirane pomoću SV40 (COS-7); ljudske embrionalne linije bubrega (293 ili 293 sa subkloniranim stanicama tako da rastu u kulturi u suspenziji); stanica bubrega mladog hrčka (BHK); stanica jajnika kineskog hrčka /-DHFR (CHO); Sertolijevih stanica miša (TM4); stanica bubrega majmuna (CV I); stanica bubrega zelenog zamorca (VERO-76); ljudskih stanica cervikalnog karcinoma (HELA); stanica bubrega psa (MDCK); stanica jetre bivoljeg štakora (BRL 3A); ljudskih stanica pluća (W138); ljudskih stanica jetre (Hep G2, HB 8065); mišjeg tumora mliječnih žlijezda (MMT 060562); TRI stanica; MRC 5 stanica; FS4 stanica; i ljudske linije hepatoma (Hep G2).2. The method according to claim 1, wherein the cell culture comprises cells specifically designed to express recombinant alpha-mannosidase, wherein said cells are selected from the group consisting of the monkey kidney CVI line transformed by SV40 (COS-7); human embryonic kidney lines (293 or 293 with cells subcloned to grow in suspension culture); young hamster kidney (BHK) cell; Chinese hamster ovary cell /-DHFR (CHO); mouse Sertoli cells (TM4); monkey kidney cell (CV I); green guinea pig kidney cell (VERO-76); human cervical carcinoma cells (HELA); dog kidney cell (MDCK); buffalo rat liver cell (BRL 3A); human lung cells (W138); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumor (MMT 060562); THREE cells; MRC 5 cells; FS4 station; and human hepatoma lines (Hep G2).
3. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1 ili 2, gdje se rekombinantna alfa-manozidaza dobiva uporabom stanica transficiranih pomoću konstrukta nukleinske kiseline, i gdje navedeni konstrukt nukleinske kiseline sadrži sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od:
i) sekvence nukleinske kiseline izložene u SEQ ID NO: 1; i
ii) sekvence nukleinske kiseline koja kodira sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 2 ili subsekvence ili analoga sekvence izložene u SEQ ID NO: 2.3. The method according to any one of claims 1 or 2, wherein the recombinant alpha-mannosidase is obtained using cells transfected with a nucleic acid construct, and wherein said nucleic acid construct contains a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
i) nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1; and
ii) a nucleic acid sequence encoding the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a subsequence or analog of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
4. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-3, pri čemu navedena frakcija stanične kulture koja sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu predstavlja izbistreni nerazblaženi sakupljeni medij.4. The method according to any one of claims 1-3, wherein said cell culture fraction containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase is clarified undiluted collected medium.
5. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-4, gdje višemodalni ligand vezan za smolu predstavlja supstancu formule (I), (II) ili (III):
[image]
pri čemu R u supstancama formula (II) i (III) predstavlja funkcionalnu grupu formule (IV):
[image] 5. The method according to any one of claims 1-4, where the multimodal ligand bound to the resin represents a substance of formula (I), (II) or (III):
[image]
where R in substances of formulas (II) and (III) represents the functional group of formula (IV):
[image]
6. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-5, gdje se prvi eluat koji sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu eluira iz smole koja sadrži višemodalni ligand uporabom vodene otopine koja sadrži etilen glikol ili propilen glikol.6. The method according to any one of claims 1-5, wherein the first eluate containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase is eluted from the resin containing the multimodal ligand using an aqueous solution containing ethylene glycol or propylene glycol.
7. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-6, gdje se prvi eluat koji sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu, dobiven iz smole koja sadrži višemodalni ligand, dalje podvrgava postupku koji sadrži korake
i) nanošenje frakcije koja sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu na kromatografsku smolu hidrofobnih interakcija kako bi se dobio eluat koji sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu,
ii) propuštanje frakcije koja sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu kroz ionsku izmjenjivačku smolu kombiniranog funkcioniranja kako bi se omogućilo zadržavanje onečišćenja, da bi se dobila propuštena frakcija koja sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu; i
iii) podvrgavanje frakcije koja sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu kromatografiji na anionskoj izmjenjivačkoj smoli, kako bi se dobio eluat koji sadrži rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu.7. The process according to any one of claims 1-6, wherein the first eluate containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase, obtained from the resin containing the multimodal ligand, is further subjected to a process comprising the steps
i) applying the fraction containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase to a hydrophobic interaction chromatographic resin to obtain an eluate containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase,
ii) passing the fraction containing the recombinant human lysosomal alpha-mannosidase through an ion exchange resin of combined functionality to allow the retention of impurities, to obtain the fraction containing the recombinant human lysosomal alpha-mannosidase; and
iii) subjecting the fraction containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase to chromatography on an anion exchange resin to obtain an eluate containing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase.
8. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-7, pri čemu rekombinantna ljudska lizozomska alfa-manozidaza ima sekvencu izabranu od:
A) sekvence izložene u SEQ ID NO 2,
B) sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 2,
C) podsekvence sekvence iz A) ili B).8. The method according to any one of claims 1-7, wherein the recombinant human lysosomal alpha-mannosidase has a sequence selected from:
A) sequences set forth in SEQ ID NO 2,
B) a sequence that has at least 80% sequence identity with SEQ ID NO 2,
C) subsequences of the sequence from A) or B).
9. Pripravak koji sadrži pročišćenu rekombinantnu lizozomsku alfa-manozidazu koju je moguće dobiti postupkom pročišćavanja prema patentnom zahtjevu 8, gdje je najmanje 80% alfa-manozidaze prisutno u vidu glikoproteina od 130 kDa.9. A preparation containing purified recombinant lysosomal alpha-mannosidase that can be obtained by the purification process according to patent claim 8, where at least 80% of the alpha-mannosidase is present in the form of a glycoprotein of 130 kDa.
10. Postupak za hranjenu šaržu ili kontinuiranu proizvodnju rekombinantne ljudske lizozomske alfa-manozidaze, koji sadrži sljedeće korake:
a. cijepljenje proizvodnog reaktora koji sadrži bazalni medij stanica sposobnih da proizvode rekombinantnu ljudsku lizozomsku alfa-manozidazu na dan 0, kako bi se dobila stanična kultura;
b. dodavanje napojnog medija navedenoj staničnoj kulturi najmanje jednom od prvog dana;
c. podešavanje temperature navedene stanične kulture na najviše 35 °C, ili nakon dana 3 ili kada je gustoća održivih stanica viša od 2.1 MVC/mL, ovisno o tome što prvo nastupi.
d. postupak pročišćavanja prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-8.10. A process for fed-batch or continuous production of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase, comprising the following steps:
a. inoculating a production reactor containing a basal medium of cells capable of producing recombinant human lysosomal alpha-mannosidase on day 0 to obtain a cell culture;
b. adding nutrient medium to said cell culture at least once from the first day;
c. adjusting the temperature of said cell culture to no more than 35 °C, or after day 3 or when the density of viable cells is higher than 2.1 MVC/mL, whichever comes first.
d. the purification process according to any of claims 1-8.
11. Postupak prema patentnom zahtjevu 10, gdje stanična kultura u osnovi ne sadrži bilo koje dodatke dobivene od životinja, kao što su dodaci iz ulja jetre bakalara.11. The process according to claim 10, wherein the cell culture is essentially free of any additives derived from animals, such as cod liver oil additives.
12. Postupak prema bilo kojem od bilo kojih patentnih zahtjeva 10-11, pri čemu se stanice biraju iz grupe koja se sastoji od CVI linije bubrega majmuna transformirane pomoću SV40 (COS-7); ljudske embrionalne linije bubrega (293 ili 293 sa subkloniranim stanicama tako da rastu u kulturi u suspenziji); stanica bubrega mladog hrčka (BHK); stanica jajnika kineskog hrčka /-DHFR (CHO); Sertolijevih stanica miša (TM4); stanica bubrega majmuna (CV I); stanica bubrega zelenog zamorca (VERO-76); ljudskih stanica cervikalnog karcinoma (HELA); stanica bubrega psa (MDCK); stanica jetre bivoljeg štakora (BRL 3A); ljudskih stanica pluća (W138); ljudskih stanica jetre (Hep G2, HB 8065); mišjeg tumora mliječnih žlijezda (MMT 060562); TRI stanica; MRC 5 stanica; FS4 stanica; i ljudske linije hepatoma (Hep G2).12. The method according to any one of claims 10-11, wherein the cells are selected from the group consisting of a CVI monkey kidney line transformed by SV40 (COS-7); human embryonic kidney lines (293 or 293 with cells subcloned to grow in suspension culture); young hamster kidney (BHK) cell; Chinese hamster ovary cell /-DHFR (CHO); mouse Sertoli cells (TM4); monkey kidney cell (CV I); green guinea pig kidney cell (VERO-76); human cervical carcinoma cells (HELA); dog kidney cell (MDCK); buffalo rat liver cell (BRL 3A); human lung cells (W138); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumor (MMT 060562); THREE cells; MRC 5 cells; FS4 station; and human hepatoma lines (Hep G2).
13. Postupak prema patentnom zahtjevu 12, gdje korak d) predstavlja postupak pročišćavanja definiran u patentnom zahtjevu 7.13. The process according to claim 12, where step d) represents the purification process defined in claim 7.
14. Pripravak koji sadrži alfa-manozidazu, koju je moguće dobiti proizvodnim postupkom prema patentnom zahtjevu 13, pri čemu je najmanje 80% alfa-manozidaze prisutno kao glikoprotein od 130 kDa.14. A preparation containing alpha-mannosidase, which can be obtained by the production process according to patent claim 13, wherein at least 80% of the alpha-mannosidase is present as a glycoprotein of 130 kDa.
15. Pripravak prema patentnom zahtjevu 9 ili patentnom zahtjevu 14, gdje rekombinantna alfa-manozidaza ostaje stabilna u tekućoj otopini tokom najmanje 4 dana, kada se skladišti na +5 °C ili tokom najmanje 24 mjeseca kada se skladišti na -20 °C.15. The preparation according to claim 9 or claim 14, wherein the recombinant alpha-mannosidase remains stable in liquid solution for at least 4 days when stored at +5 °C or for at least 24 months when stored at -20 °C.
16. Pripravak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 9, 14 ili 15, pri čemu alfa-manozidaza ima sekvencu izabranu od:
A) sekvence izložene u SEQ ID NO 2,
B) sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 2,
C) podsekvence sekvence iz A) ili B).16. The composition according to any one of claims 9, 14 or 15, wherein the alpha-mannosidase has a sequence selected from:
A) sequences set forth in SEQ ID NO 2,
B) a sequence that has at least 80% sequence identity with SEQ ID NO 2,
C) subsequences of the sequence from A) or B).
17. Pripravak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 9 i 14-16 za uporabu kao lijek.17. A preparation according to any of claims 9 and 14-16 for use as a medicine.
18. Pripravak prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 9 i 14-16 za uporabu u liječenju alfa-manozidoze.18. A preparation according to any one of claims 9 and 14-16 for use in the treatment of alpha-mannosidosis.