HRP20050568A2 - Haplotype partitioning - Google Patents

Description

Predmetni izum se odnosi na novu metodu za određivanje značaja polimorfizama ili mutacija barem u jednom genu i na značajne polimorfizme ili mutacije utvrđene time.

Od otkrića tehnologije sekvenciranja gena u kasnim 1980-tima i utemeljenja Projekta ljudskoga genoma, ogromno mnoštvo informacija bilo je otkriveno o redosljednoj strukturi, ili prirodi jedne nepregledne raznolikosti gena, naročito u čovjeka. Štoviše, kako su se razvijale metode za sekvenciranje gena, tako se povećavao i broj varijacija detektiran unutar nekog datog gena. Uzevši da bi neki tipični gen mogao biti dugačak 30 kilobaza i da se varijacije javljaju u prosjeku svakih 1100 baza, slijedi da se jedan nevjerojatno veliki obim posla mora poduzeti kako bi se odredilo koje varijante imaju kliničko ili tehnološko značenje. To je međutim jedan preduvjetni korak, ako se želi iskoristiti ovo raspoloživo znanje.

Neki su geni češće predmetom varijacija nego drugi. Visoko polimorfni geni predstavljaju jedan naročiti izazov za istraživače koji trebaju odrediti koja varijacija na nekom datom mjestu u nekoj molekuli nukleinske kiseline, ili koja kombinacija varijacija na datim mjestima unutar te molekule nukleinske kiseline jest značajna. Iz toga slijedi da unutar bilo koje date populacije, proučavanje nekog pojedinog gena u nekom broju organizama ili pojedinaca, može proizvesti neku značajnu količinu informacija, jer gdje je prisutna jedna pluralnost polimorfnih mjesta u nekom datom genu, te polimorfne karakteristike mogu varirati od pojedinca do pojedinca. U skladu s tim, kada se istražuje određeni broj polimorfnih mjesta nastaje obrazac, ili potpis, koji je karakterističan za svakog pojedinca. Ovaj je poznat kao haplotip. Svaki haplotip predstavlja neku naročitu kombinaciju varijacija u jednoj pluralnosti polimorfnih mjesta. To je stoga posao za osposobljenog istraživača da probire kroz haplotipove kako bi odredio koji su značajni. Kako će osposobljeni čitalac moći procijeniti, tu se radi o jednom dugom, teškom i često zahtjevnom zadatku. On može uključiti proučavanje različitih svojstava tog gena, ili proteina kojeg on kodira, kako bi se odredilo koje su, ako su uopće, implikacije svakog haplotipa.

S time na pameti mi smo razvili metodologiju koja olakšava studiju genetičkih varijacija. Naša metodologija je usmjerena prema ispitivanju nekog broja varijacija unutar jednog gena i utvrđivanja njihove signifikantnosti. Specifičnije, naša je metodologija usmjerena na opažanje pluralnosti varijacija na nekoj pluralnosti polimorfnih mjesta, barem u jednom genu, kako bi odredili njihovu signifikantnost. U biti, naša se metodologija može koristiti za ispitivanje relativne signifikantnosti diferentnih haplotipova. Ona stoga učinkovito probire kroz neku pluralnost haplotipova kako bi odredila koji su najsignifikantniji. Ona stoga ima sposobnost odjeljivanja ogromnog mnoštva podataka kako bi se odabralo najrelevantnije oblike među njima.

Ljudski stas je jedno vrlo složeno svojstvo koje je rezultat interakcije multiplih genetičkih faktora i faktora okoline. Budući da se za obiteljski niski rast već zna da je povezan s naslijeđenim mutacijama gena za hormon rasta, razumno je pretpostaviti da polimorfne varijacije u ovom genu, koji se eksprimira u hipofizi, utječu na visinu odraslih. Zna se da postoji značajan broj polimorfnih varijacija unutar tog gena, i zaista proksimalna regija promotora GH1 gena hormona rasta pokazuje jednu visoku razinu varijacija sekvenci sa 16 pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms), opisanih unutar jednog odsječka od 535 parova baza. Većina od ovih SNP-ova nalaze se na istim pozicijama u kojima se gen GH1 razlikuje od paralognih gena GH2, CSH1, CSH2 i CSHP1, smještenih u grozdu od pet gena koji sadrži GH1. Ovih je pet gena smješteno na kromosomu 17q23 kao jedan 66kb grozd.

Štoviše, ekspresija ljudskog GH1 gena je također pod utjecajem lokusne kontrolne regije (Locus Control Region, LCR) smještene između 14,5kb i 32kb uzvodno od GH1 gena. Ova LCR sadrži multipla hipersenzitivna mjesta prema DNazi I i potrebna je za aktivaciju gena u skupini GH1 gena, kako u hipofizi tako i u placenti.

U skladu s tim, uzevši visoku razinu varijacija unutar ovog gena, mi smo to iskoristili da razvijemo našu metodologiju. Specifičnije, mi smo uzeli taj gen za procjenu relativne važnosti polimorfne varijacije i u regiji proksimalnog promotora i u LCR regiji za ekspresiju GH1 gena.

Prikaz izuma

Mi ovdje opisujemo metodu za odjeljivanje haplotipova radi identificiranja mutacija i/ili polimorfizama koje su glavne determinante fenotipa, naročito, ali ne isključivo, fenotipa koji je bilo povoljan ili nepovoljan. Na primjer, možda najtipičnije, ova će metoda biti korištena za identificiranje mutacija i/ili polimorfizama koje su odgovorne, potpuno ili djelomično, za neko fiziološko stanje ili poremećaj, tako kao na primjer za neku bolest, ili za abnormalno ili nepoželjno stanje.

U skladu s tim, ova metoda odjeljivanja haplotipova predmetnog izuma sadrži ispitivanje rezidualne devijancije (δ) za svaku odabranu grupu mutacija i/ili polimorfizama nekoga gena koji se razmatra.

Idealnije, ova metoda uključuje ispitivanje rezidualne devijancije (δ) mogućih podgrupa mutacija i/ili polimorfizama i tako najpogodnije, ova metoda se poduzima za ispitivanje rezidualne devijancije (δ) pri odjeljivanju haplotipova {1...m}, bazirane na svakoj mogućoj podgrupi mutacija i/ili polimorfizama.

Najidealnije, ova metoda još uključuje korištenje slijedeće funkcije

[image] =[image] ([image] ) = [image] ([image] i - [image] π(i))2

(Pogledajte stranice 18 i 22 za definicije)

Metoda izuma je primjenjiva, ali ne ekskluzivno, u situacijama gdje su učinci rečenih mutacija i/ili polimorfizama čvrsto uzajamno ovisni, kao na primjer u slučaju gdje postoji disekvilibrij vezanosti.

Koristeći ovu metodologiju moguće je identificirati one mutacije i/ili polimorfizme koje su odgovorne za poveći dio rezidualne devijancije u, na primjer, ekspresijskim razinama (gdje su npr. mutacije i/ili polimorfizmi unutar promotorske regije tog gena) ili na primjer proteinskoj funkciji (gdje se mutacije i/ili polimorfizmi nalaze unutar proteinske kodirajuće sekvence tog gena).

Pogodno, ova metodologija izuma se može koristiti u predviđanju i tako narednoj izvedbi, super-maksimalnih i sub-minimalnih haplotipova, koji bi mogli biti korisni na primjer kao eksperimentalne kontrole u narednim programima testiranja.

Ovdje su opisane i druge metode za identifikaciju mutacija i/ili polimorfizama odgovornih za poveći dio ovog fenotipa koji se razmatra i sačinjavaju razne aspekte i/ili izvedbe ovog izuma.

Prema jednom daljnjem aspektu izuma ovdje su opisane signifikantne mutacije i/ili polimorfizmi, u obliku pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (SNP-ova) koji su glavne determinante barem jednog odabranog fenotipa.

Specifičnije, ovi SNP-ovi mogu biti locirani u proksimalnom promotoru u barem jednom odabranom genu i tako determinirati razinu ekspresije odgovarajućeg proteina i time vjerojatni odabrani fenotip nekog pojedinca.

Slijedi, da je znanje o ovim SNP-ovima, ili ovoj podgrupi SNP-ova korisno u dijagnostičkim tehnikama.

Prema jednom daljnjem aspektu izuma, daje se detekcijska metoda za detekciju nekog haplotipa, koji je učinkovit da djeluje kao indikator za barem jedan fenotip u nekom pojedincu, a koja detekcijska metoda sadrži korake:

(a) dobivanje test uzorka genetičkog materijala od nekog pojedinca kojeg treba testirati, s time da navedeni materijal sadrži barem jedan selekcionirani gen ili jedan njegov fragment; i

(b) analiziranje ove nukleotidne sekvence navedenog gena ili njegovog fragmenta, da se vidi, da li ikoji pojedinačni nukleotidni polimorfizam postoji na bilo kojem pojedinačnom ili na više SNP-mjesta unutar tog gena;

(c) gdje navedeni SNP-ovi postoje, njihovo identificiranje i njihovo podvrgavanje analizi, koristeći prije spomenutu metodu.

Stručna osoba iz odgovarajućeg područja će procijeniti da se prethodna metodologija može primijeniti na ili u jednoj ili više regija nekog gena, i to bilo na N-terminalu, da bi se determinirali učinci polimorfne varijacije unutar nekog promotora, ili unutar kodirajuće regije, kako bi se determinirali učinci polimorfne varijacije na tom proteinu.

Štoviše, metodologija izuma se koristi u determiniranju super-maksimalnog i sub-minimalnog haplotipa i stoga izum, prema jednom daljnjem aspektu, također uključuje identifikaciju super-maksimalnog i/ili sub-minimalnog haplotipa za najmanje jedan gen.

U primjerima koji su ovdje dani, super-maksimalni haplotip za gen hormona rasta je definiran slijedećom kodirajućom sekvencom: AGGGGTTAT-ATGGAG na SNP-476, -364, -339, -308, -301, -278, -168, -75, -57, -31, -6, -1, +3, +16, +25, +59, relativno prema transkripcijskom startnom mjestu gena GH1. Obratno, sub-minimalni haplotip je definiran kao slijedeća kodirajuća sekvenca s obzirom na isto mjesto: AG-TTTTGGGGCCACT.

Prema jednom daljnjem aspektu izuma, daje se barem jedan haplotip identificiran prethodno spomenutom metodologijom i specifičnije, tu se daje korištenje navedenog haplotipa za dijagnozu ili liječenje neke date bolesti ili u razvitku nekog super-ekspresijskog proteina.

Ovdje referenca na izraz super-ekspresija uključuje referencu na prekomjernu ekspresiju nekog datog proteina u odnosu na divlji tip.

Metodologija izuma biti će sada opisana pomoću slijedeće informacije, koja se odnosi na materijale i metode koje su poduzete radi identificiranja različitih haplotipova, na opremu za njihovo odjeljivanje, i na procjenu njihovog funkcionalnog značaja.

Legende slika

Slika 1. Ekspresija promotora GH1 gena u negativnim kontrolama, kako su izmjerene na različitim pločama (a), i normalizirane razine ekspresije haplotipa divljeg tipa (1), prikazane kao multipliciteti prosječne ekspresijske razine po ploči u divljem tipu (b).

Slika 2. Lokacija 16 SNP-ova u GH1 promotoru relativno prema transkripcijskom startnom mjestu (označenom strelicom). Šrafirana ćelija predstavlja ekson 1. Pozicije veznih mjesta za transkripcijske faktore, nuklearni faktor 1 (NF1), Pit-1 i vitamin D receptor (VDRE), TATA ćelija i translacijski inicijacijski kodon (ATG) su također prikazani.

Slika 3. Normalizirane ekspresijske razine u 40 GH1 haplotipova relativno prema divljem tipu (haplotip 1). Haplotipovi povezani sa signifikantno reduciranom razinom ekspresije luciferaznog reporter gena (u usporedbi s haplotipom 1) su označeni šrafiranim stupcima. Haplotipovi povezani sa signifikantno povišenom razinom ekspresije luciferaznog reporter gena (u usporedbi s haplotipom 1) su označeni punim stupcima. Haplotipovi su raspoređeni prema smanjujućem redoslijedu prevalencije.

Slika 4. Minimalna relativna rezidualna devijancija [image] normaliziranih ekspresijskih razina povezana s odjeljivanjem haplotipa, koristeći k SNP-ove (osjenčani stupci). Točkasta krivulja pokazuje broj haplotipova koji sadrže minimum-[image] -odjeljivanja [image] .

Slika 5. Odnos između veličine i unakrsno-validirane [image] vrijednosti za intermedijarna stabla minimalne devijancije, koristeći šest odabranih SNP-ova (br. 1, 6, 7, 9, 11 i 14). Točkasta (horizontalna) crta odgovara jednom SE od unakrsno-validirane [image] potpuno izraslog stabla; crtkana (vertikalna) crta pokazuje najmanje stablo za koje unakrsno-validirane [image] leže unutar jednog SE od onoga u potpuno izraslom stablu.

Slika 6. Regresijsko stablo promotorske ekspresije gena GH1, kako je dobiveno rekurentnim binarnim odjeljivanjem haplotipova, koristeći šest odabranih SNP-ova (br. 1, 6, 7, 9, 11 i 14). Brojevi na čvorovima odnose se na SNP-ove kojima su odgovarajući čvorovi bili rascijepljeni. Terminalni čvorovi ("listovi") prikazani su kao kvadrati i numerirani od lijeva prema desno.

Slika 7. "Reducirana mreža medijana" povezuje ovih sedam haplotipova (krugovi) koji su opaženi barem 8 puta u 154 muškaraca bijelaca ("kavkazaca"). Veličina svakog kruga je proporcionalna frekvenciji respektivnog haplotipa u kontrolnom uzorku. Haplotipovi H12 i H23 su uključeni kao spojni čvorovi, premda su oni opaženi samo 5, odnosno 2 puta. SNP-ovi pri kojima se haplotipovi razlikuju dani su uz svaku granu. Tamna točka označava neopaženi haplotip ili dvostruku mutaciju na SNP mjestima 4 i 5.

Slika 8. Razlike u kapacitetu vezivanja proteina između GH1 promotorskih SNP alela iskazanih testovima pomaka elektroforetske pokretljivosti (Electrophoretic Mobility Shift Assays, EMSA). Strelice pokazuju alelu-specifične interaktivne proteine. Glava strelice označava položaj jednog Pit-1-sličnog veznog proteina. -ve (negativna kontrola), +ve (pozitivna kontrola), S (specifični kompetitor), N (nespecifični kompetitor), P (Pit-1 konsenzus sekvenca), P* (Pit-1 vezno mjesto prolaktinskog gena), TSS (transkripcijsko startno/inicijacijsko mjesto).

Materijali i metode

Ljudski subjekti

DNA uzorci su dobiveni iz limfocita uzetih od 154 muškaraca, novaka Britanske armije kavkaskog porijekla (bjelaca), koji nisu odabirani zbog visine. Podaci o visini su bili raspoloživi za 124 od ovih pojedinaca (aritmetička sredina, 1,76 ± 0,07 m) i nađeno je, da je distribucija visina bila normalna (Shapiro-Wilk statistika W=0,984; p=0,16). Etičko odobrenje za ove studije dobiveno je od lokalnog Multiregionalnog etičkog povjerenstva (Multi-Regional Ethics Committee).

Amplifikacija lančanom reakcijom polimeraze (PCR, Polymerase Chain Reaction)

PCR amplifikacija na jednom 3,2 kb fragmentu specifičnom za GH1 gen izveden je koristeći oligonukleotidne početnice (primers) GH1F (5' GGGAGCCCCAGCAATGC 3'; -615 do -599) i GH1R (5' TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3'; 2598 do 2616) [numeriranje relativno prema transkripcijskom inicijacijskom mjestu na +1 (GenBank Accession No.J03071)]. Jedan 1,9 kb fragment koji sadrži mjesta I i II od GH1 LCR-a bio je amplificiran PCR-om s LCR5A (5' CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3'; -315 do -334) i LCR3,0 (5' CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3'; 1589 do 1698) [LCR sekvenca je dpbivena od GenBank (Accession No. AC005803), dok LCR numeriranje slijedi ono od Jin et al. 1999; GenBank (Accession No. AF010280)]. Uvjeti za obje reakcije bili su identični; ukratko, 200 ng limfocitne DNA amplificirano je koristeći ExpandTM visoko pouzdani sistem (high fidelity system, Roche) koristeći jedan vrući start na 98°C 2 min, iza čega je slijedilo na 95°C 3 min, 30 ciklusa 95°C 30 s, 64°C 30 s, 68°C 1 min. Za posljednjih 20 ciklusa, elongacijski korak na 68°C povećavan je za 5 s po ciklusu. Iza toga je slijedila daljnja inkubacija na 68°C tijekom 7 min.

Kloniranje i sekvenciranje

Početno, PCR produkti su sekvencirani direktno bez kloniranja. Regija proksimalnog promotora GH1 gena je sekvencirana od 3,2 kb GH1-specifičnog PCR fragmenta, koristeći početnicu (primer) GH1S1 (5' GTGGTCAGTGTTGGAACTGC 3'; -556 do -537). 1,9 kb LCR fragment od GH1 je sekvenciran koristeći početnice LCR5,0 (5' CCTGTCACCTGAGGATGGG 3'; 993 do 1011), LCR 3,1 (5' TGTGTTGCCTGGACCCTG 3'; 1093 do 1110), LCR3,2 (5' CAGGAGGCCTCACAAGCC 3'; 628 do 645) i LCR3,3 (5' ATGCATCAGGGCAATCGC 3'; 211 do 228). Sekvenciranje je izvedeno koristeći BigDye v2,0 (Applied Biosystems) i ABI Prism 377 ili 3100 DNA sekvenator. U slučaju heterozigota za promotorsku regiju ili LCR varijante, odgovarajući fragment je kloniran u pGEM-T (Promega) prije sekvenciranja.

Konstrukcija ekspresijskih vektora luciferaznog reporter gena

Individualni primjeri 40 raznih GH1 proksimalnih promotorskih haplotipova (Tablica 1) bili su PCR-amplificirani kao 582 bp fragmenti s primerima GHPROM5 (5' AGATCTGACCCAGGAGTCCTCAGC 3'; -520 do -501) i bilo GHPROM3A (5' AAGCTTGCAGCTAGGTGAGCTGTC 3'; 44 do 62) ili GHPROM3C (5' AAGCTTGCCGCTAGGTGAGCTGTC 3'; 44 do 62) ovisno o bazi na poziciji +59 ovog haplotipa. Za olakšanje kloniranja, svi primeri su imali djelomične ili potpune ne-kalupljene rekognicijske sekvence za restrikcijski enzim dodane na njihove 5' krajeve (naznačeno masno gore); Bg/II (GHPROM5) i HindIII (GHPROM3A i GHPROM3C). PCR fragmenti su tada klonirani u pGEM-T. Plazmidna DNA bila je početno razgrađena s HindIII (New England Biolabs) i 5' prevjes (overhang) uklonjen s "mung bean" nukleazom (New England Biolabs). Promotorski fragment je oslobođen digestijom s Bg/II (New England Biolabs) i gel purificiran. Luciferazni reporter vektor pGL3 Basic priređen je s NcoI (New England Biolabs) digestijom i 5' prevjes uklonjen s "mung bean" nukleazom. Taj vektor je tada razgrađen s Bg/II (New England Biolabs) i gel purificiran. Restrikcijski promotorski fragmenti su klonirani u luciferazni reporterski gen vektor GL3 Basic. Plazmidne DNA (pGL3GH serija) su izolirane (Qiagen midiprep system) i sekvencirane koristeći primere RV3 (5' CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 3'; 4760 do 4779), GH1SEQ1 (5' CCACTCAGGGTCCTGTG 3'; 27 do 43), LUCSEQ1 (5' CTGGATCTACTGGTCTGC 3'; 683 do 700) i LUCSEQ2 (5' GACGAACACTTCTTCATCG 3'; 1372 do 1390) da se osigura da su obje sekvence, kako GH1 promotora, tako i luciferaznog gena, bile točne. Prikraćeni GH1 proksimalni promotorski konstrukt (-288 do +62) je također učinjen restrikcijom pGL3GH1 (haplotip 1) s NcoI i Bg/II iza čega je slijedilo tupo-završavanje/religacija da se uklone SNP mjesta 1-5.

Artificijelni konstrukti proksimalnog promotorskog haplotipa reporter gena bili su učinjeni pomoću na-mjesto-usmjerene mutageneze (site-directed mutagenesis, SDM) [Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)] da bi generirali predviđeni super-maksimalni haplotip (AGGGGTTAT-ATGGAG) i sub-minimalne haplotipove (AG-TTGTGGGACCACT i AG-TTTTGGGGCCACT).

Za pripremu LCR-proksimalnih promotorskih fuzijskih konstrukata, 1,9 kb LCR fragment bio je restringiran s Bg/II i rezultirajući 1,6 kb fragment kloniran je u Bg/II mjesto direktno uzvodno od 582 bp promotorskog fragmenta u pGL3. Tri razna LCR haplotipa su klonirani u pGL3 Basic, 5' prema jednom od tri GH1 proksimalnih promotorskih konstrukata koji su sadržavali, jedan "visoko eksprimirani promotorski haplotip" (H27), jedan "nisko eksprimirani promotorski haplotip" (H23), i jedan "normalno eksprimirani promotorski haplotip" (H1), što daje ukupno devet raznih LCR-GH1 proksimalnih promotorskih konstrukata (pGL3GHLCR). Plazmidne DNA su zatim izolirane (Qiagen midiprep) i sekvenca provjerena koristeći odgovarajuće primere.

Testovi luciferaznog reporterskog gena

Zbog nedostatka jedne ljudske hipofizne stanične linije, koja bi izražavala hormon rasta, štakorske hipofizne stanice (Bancroft 1973; Bodner i Karin 1989) su odabrane za in vitro ekspresijske eksperimente. Štakorske GC stanice bile su uzgajane u DMEM koji je imao 15% konjskog seruma i 2,5% fetalnog telećeg seruma. Ljudske HeLa stanice su uzgajane u DMEM koji je sadržavao 5% fetalnog telećeg seruma. Obje stanične linije su uzgajane na 37°C u 5% CO2 . Liposomom-posredovana transfekcija GC stanica i HeLa stanica izvedena je koristeći TfxTM-20 (Promega) u jednom formatu ploče s 96 bunarića. Konfluentne stanice su uklonjenje iz tikvica za kulturu, razrijeđene svježim medijem i rasađene u ploče s 96 bunarića tako da budu ~80% konfluentne slijedećega dana.

Transfekcijska smjesa sadržavala je bez-serumski medij, 250ng pGL3GH ili pGL3GHLCR konstrukta, 2ng pRL-CMV, i 0,5μl TfxTM-20 Reagensa (Promega) u ukupnom volumenu od 90μl po bunariću. Nakon 1 sat 200μl kompletnog medija dodano je svakom bunariću. Nakon transfekcije, stanice su inkubirane tijekom 24 sata na 37°C u 5% CO2 prije nego su lizirane za reporter testiranje.

Testiranja luciferaze izvedena su koristeći Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). Testovi su provođeni na luminometru za mikroploče (Applied Biosystems) i zatim normalizirani s obzirom na Renilla aktivnost. Svaki konstrukt je analiziran na tri nezavisne ploče sa šest replika po ploči (t.j. ukupno 18 nezavisnih mjerenja). Za testove proksimalnog promotora svaka ploča uključivala je negativne (pGL3 Basic bez promotora) i pozitivne (pGL3 sa SV40 promotorom) kontrole. Za LCR analizu, konstrukti koji su sadržavali proksimalni promotor, ali kojima je nedostajala LCR, korišteni su kao negativne kontrole.

Test pomaka elektroforetske pokretljivosti (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

EMSA je izvedena na dvolančanim oligonukleotidima koji su zajedno pokrivali svih 16 SNP mjesta (Tablica 2). Nuklearni ekstrakti iz GC i HeLa stanica pripremljeni su kako su opisali Berg et al. (1994). Oligonukleotidi su radioaktivno obilježeni s [[image] P]-dATP i detektirani autoradiografijom nakon gel elektroforeze. EMSA reakcije sadržavale su finalnu koncentraciju 20 mM Hepes pH7,9; 4% glicerol, 1mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 50 mM KCl, 1,2 μg nuklearnog ekstrakta iz HeLa stanica ili GC stanica, 0,4 μg poly[dI-dC].poly[dI-dC], 0,4 pM radio-obilježenog oligonukleotida, 40 pM neobilježenog kompetitorskog oligonukleotida (100-struko u suvišku) gdje odgovara, u finalnom volumenu od 10 μl. EMSA reakcije su inkubirane na ledu tokom 60 minuta i elektroforetski razdvojene na 4% PAGE gelovima pri 100 V tokom 45 minuta prije autoradiografije. Za svaku reakciju, jedan dvolančani neobilježeni test oligonukleotid je korišten kao jedan specifični kompetitor, dok je jedan oligonukleotid porijeklom od promotora gena NF1 (5' CCCCGGCCGTGGAAAGGATCCCAC 3') korišten kao nespecifični kompetitor. Dvolančani oligonukleotidi koji odgovaraju Pit-1 veznom mjestu (5' TCATTATATTCATGAAGAT 3') i Pit-1 koncensus veznom mjestu (5' TGTCTTCCTGAATATGAATAAGAAATA 3') ljudskog prolaktinskog (PRL) gena su korišteni kao specifični kompetitori za proteinsko vezanje na SNP 8 mjesto.

Testovi ekstenzije početnica (Primer extension assays)

Testovi ekstenzije početnica su provedeni radi potvrde da su konstrukti, koji nose razne SNP haplotipove koristili identična transkripcijska inicijacijska mjesta. Ekstenzija početnica provedena je metodom Triezenberg et al. (1992).

Normalizacija podataka

Ekspresijska mjerenja za negativne kontrole (pGL3 Basic bez promotora) pokazivala su znatnu varijaciju između ploča (Slika 1a). Za korekciju podataka za ekspresiju na bazičnoj crti i učinaka ploče, aritmetička sredina aktivnosti negativnih kontrola na nekoj ploči suptrahirana je od svih drugih vrijednosti za aktivnosti na toj istoj ploči. Aritmetička sredina aktivnosti (po ploči korigirana) za proksimalni promotor haplotipa 1 (H1) na svakoj ploči je zatim izračunana, i sve druge s haplotipom povezane aktivnosti na istoj ploči su podijeljene s tom vrijednosti. Ove dvije transformacije osigurale su da su aritmetičke sredine negativne kontrolne aktivnosti izjednačene s nulom, dok je aritmetička sredina aktivnosti H1 izjednačena s jedinicom, neovisno o broju ploča. Rezultirajuće vrijednosti aktivnosti mogu stoga biti interpretirane kao multiple promjene u usporedbi prema H1, korigirane i za učinak bazične linije i za učinak ploče. Budući da se nije moglo utvrditi signifikantni učinak ploče nakon transformacije, podaci su kombinirani od svih ploča. Rezultati ovog normalizacijskog postupka ilustrirani su za slučaj H1 na Slici 1b. Postupak sličan onome korištenom za analizu haplotipova proksimalnog promotora bio je također primijenjen za podatke o ekspresiji LCR-promotorskih fuzijskih konstrukata, koristeći haplotip A kao referentni haplotip.

Statistička analiza

Normalizirane ekspresijske razine haplotipova proksimalnog promotora su testirane na valjanost podudaranja s Gauss-ovom distribucijom koristeći Shapiro-Wilk-ovu statistiku (W) kako je implementirana u proceduri UNIVARIATE u SAS softveru za statističke analize (SAS Institute Inc., Cary NC, USA). Procjena signifikantnosti je podešena za multipla testiranja (t.j. 40 puta) postavljanjem pcritical=0,05/40≈0,001. Koristeći taj kriterij, za ekspresijske razine dvaju promotorskih haplotipova nađeno je da se signifikantno razlikuju od Gauss-ove distribucije kao H21 (W=0,727; p=0,0002) i H40 (W= 0,758; p=0,0004). Za drugih 38 haplotipova, za ekspresijske razine se smatralo da su u skladu s normalnošću i stoga su podvrgnute usporedbama u parovima koristeći Tukey-ev studentizirani rasponski test (SAS procedura GLM). Usporedba u paru ekspresijskih razina između grupa raznih haplotipova je provedena koristeći normalnu aproksimaciju z od Wilcoxon-ove statistike rasponskih suma (rank sum statistic, SAS procedure NPAR1WAY).

SNP-ovi analizirani u ovoj studiji vršili su svoje utjecaje na ekspresiju proksimalnog promotora na jedan kompleksan i visoko interaktivni način. Nadalje, zbog disekvilibrija vezanosti, za ekspresijske razine povezane s individualnim polimorfizmima nađeno je da su jako međusobno ovisne. Očekivalo se stoga, da će se značajni dio od opažene varijacije u ekspresijskoj razini moći pripisati varijaciji u maloj podskupini polimorfnih mjesta. Kako bi procijenili formalno ovu korelacijsku strukturu između SNP-ova, i da bismo mogli identificirati odgovarajuću podskupinu kritičnih polimorfizama za daljnju studiju, rezidualna devijancija nakon odjeljivanja haplotipova izračunana je za sve moguće podskupine SNP-ova proksimalnog promotora.

Za dato odjeljivanje {1…m}=[image] za skupinu točkastih podataka x1,...,xm, i s [image] (i)=j ako i[image] [image] j, ova rezidualna devijancija [image] od [image] se definira kao

[image] ([image] )2.

Kada skupina podataka nije bila uopće odijeljena, tada [image] =[image] [image] =421.7 i relativna rezidualna devijancija bilo kojeg drugog odjeljivanja [image] je bila definirana kao [image] .

Šest SNP-ova (br. 1, 6, 7, 9, 11 i 14; vidi dolje) identificirani su kao da su odgovorni za jedan pozamašni dio (~ 60%) od rezidualne devijancije na ekspresijskoj razini, u isto vrijeme dok prizivaju relativno malo haplotipske varijacije. Statistička međuovisnost ovih SNP-ova je dalje analizirana pomoću jednog regresijskog stabla, konstruiranog pomoću ponavljanih binarnih odjeljivanja koristeći statististički softver R (Ihaka i Gentleman, 1996). U ovom procesu konstrukcije stabla, SNP-ovi su korišteni individualno kao prediktorske varijable na svakom čvoru, tako da se odaberu dvije najhomogenije podskupine haplotipova s obzirom na varijablu odgovora (t.j. normaliziranu ekspresiju proksimalnog promotora). Onaj čvor i SNP koji je poslužio da unese jedan novi rascjep odabran je tako da minimizira äR za odjeljivanje kako je definirano s terminacijskim čvorovima ('listovima') rezultirajućeg intermedijarnog stabla. Ovaj je proces nastavljen, dok svi listovi nisu odgovarali individualnim haplotipovima ("potpuno izraslo stablo"). Pouzdanost ovih δR procjena je vrednovana na svakom koraku pomoću 10-erostrukog unakrsnog vrednovanja i izračunana je standardna pogreška (standard error, SE).

Regresijska analiza visine i razine ekspresije proksimalnog promotora in vitro je provedena za proučavane 124 individue poznatih visina koristeći CANCORR proceduru iz SAS softverskog paketa. Neka μ nor,h1 i μ nor,h2 označavaju aritmetičke sredine normalizirane ekspresijske razine ova dva haplotipa koje nosi neki dani pojedinac. Visina pojedinaca koji nisu homozigotni za H1 (n=109) modelirana je kao

visina = [image]

i izračunan je koeficijent determinacije, r2.

Reducirana mreža medijana (Bandelt et al. 1965) konstruirana je za sedam promotorskih haplotipova (H1 – H7) koji su bili opaženi barem 8 puta među 154 pojedinca uključena u studiju.

Analiza disekvilibrija vezanosti

Disekvilibrij vezanosti (linkage disequilibrium, LD) između promotorskih SNP-ova, i između SNP-ova i LCR haplotipova, evaluirani su u 100 pojedinaca slučajno odabranih od ukupno 154 u studiji, koristeći parametar ρ kako je oblikovan za bialeličke lokuse od Mortona et al. (2001). Dok je ρ =1 je ekvivalentan za dva lokusa koji pokazuju potpuni LD, ρ =0 pokazuje potpuno pomanjkanje LD-a. Samo je za osam SNP-ova nađeno da su dovoljno polimorfni u ovom populacijskom uzorku (heterozigotnost iỲ5%) da bi jamčili uključivanje. SNP5 je isključen zbog svoje perfektne LD s SNP 4 (samo dva haplotipa u paru prisutna). Procjene maksimalne vjerojatnosti frekvencija kombinacija LCR-proksimalnog promotorskog haplotipa, kako je potrebno za LD analizu, dobivene su koristeći jednu domaću implementaciju algoritma za maksimizaciju očekivanosti (expectation maximization, EM).

Rezultati

Frekvencije polimorfizama proksimalnog promotora i haplotipova

Promotorska regija GH1 gena opisana je da sadrži 16 polimorfnih nukleotida unutar jednog odlomka od 535 bp (Tablica 3; Giordano et al. 1997; Wagner et al. 1997). Ovi SNP-ovi bili su numerirani 1-16 radi lakšeg identificiranja (Slika 2). U studiji 154 muških Britanskih bijelaca, za 15 od ovih SNP-ova (svi osim br. 2) nađeno je da su polimorfni (minorne alelske frekvencije 0,003 do 0,41; Tablica 3). Varijacija na ovih 16 pozicija bila je pripisana na ukupno 36 raznih promotorskih haplotipova (Tablica 1). Haplotip 1 (H1) može tako biti opisan jednom sekvencom od 16 baza (GGGGGGTATGAAGAAT) koje predstavljaju 16 SNP lokacija od -476 do +59. Frekvencija ovih 36 promotorskih haplotipova varirala je od 0,339 za H1, od sada nadalje oslovljavamo ga kao "divlji tip", do 0,0033 (br. 25-36) (Tablica 1). Za daljnja 4 haplotipa (No. 37-40) nađeno je da su dio odvojene studije u 4 pojedinca koji su pokazivali niski stas (Tablica 1). Ovi su haplotipovi bili odsutni iz ove studijske skupine, ali su bili uključeni u naknadnu analizu radi potpunosti.

Haplotipovi proksimalnog promotora i relativna promotorska snaga

40 promotorskih haplotipova proučeni su pomoću in vitro pokusa za reporterski gen i nađeno je da se razlikuju s obzirom na svoju sposobnost da podržavaju ekspresiju luciferaznog gena u stanicama hipofize štakora (Tablica 4). Za ekspresijske razine je nađeno da variraju u rasponu od preko 12-terostruko s najnižim eksprimiranim haplotipom (br. 17) koji je pokazivao prosječnu razinu koja je bila 30% one od divljeg tipa i najvišim eksprimiranim haplotipom (br. 27) koji je pokazivao prosječnu razinu koja je bila 389% one od divljeg tipa (Tablica 4). Dvanaest haplotipova (br. 3, 4, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 23, 24, 26 i 29) su povezani s jednom signifikantno reduciranom razinom ekspresije luciferaznog reporter gena u usporedbi s H1. Obratno, ukupno 10 haplotipova (br. 14, 20, 27, 30, 34, 36, 37, 38, 39 i 40) su bili povezani s jednom signifikantno povišenom razinom ekspresije luciferaznog reporter gena u usporedbi s H1 (Tablica 4). Konstrukti koji su nosili razne SNP haplotipove prikazani su testom ekspanzije početnice da koriste identična transkripcijska inicijacijska mjesta (podaci nisu prikazani). Za ekspresiju ovih konstrukata s reporter genom je nađeno da je 1000-struko niža u HeLa stanicama, nego u GC stanicama (podaci nisu prikazani).

In vitro ekspresijske razine od 40 raznih haplotipova GH1 promotora grafički su prikazane na Slici 3. Za nisko eksprimirane haplotipove očigledna je tendencija da se događaju češće, dok visoko eksprimirani haplotipovi pokazuju tendenciju manje čestog pojavljivanja (Wilcoxon P<0,01). Kako je ovaj nalaz sugestivan za djelovanje selekcije, selekcijski učinci su traženi na razini individualnih SNP-ova. Za 15 SNP-ova proučenih ovdje je nađeno, da aritmetička sredina ekspresijske razine (odvagana frekvencijom haplotipa) i frekvencija za rjeđe alele u kontrolama, pozitivno koreliraju (Spearmanov rasponski korelacijski koeficijent, rank correlation coefficient, r=0,32). Ako se SNP 7 isključi kao vanjsko pozicionirani (on ima naročito visoku ekspresijsku razinu povezanu s ovim rjeđim alelom), r = 0,53 s jednostranom p<0,05.

In vitro ekspresijska razina povezana s prikraćenim promotorskim konstruktom kojemu nedostaju SNP-ovi 1-5 bila je 102±5% od onoga u divljeg tipa (haplotip 1). Tako se može zaključiti, da je za SNP-ove 1-5 vjerojatno da imaju ograničeni direktni utjecaj na ekspresiju GH1 gena.

Za ekspresijske razine povezane s individualnim SNP-ovima je pronađeno da su čvrsto međusobno ovisne. Stoga je učinjen pokušaj odjeljivanja ekspresijskih podataka na takav način, da bi se identificirala podskupina ključnih polimorfnih mjesta koja neproporcionalno doprinose opaženoj varijaciji u in vitro ekspresijskoj razini. Odjeljivanje s punim haplotipom koji je uključivao svih 16 SNP-ova davalo je relativnu rezidualnu devijanciju od [image] =0,245. Ovo može biti interpretirano kao 24,5% od varijacije u ekspresijskoj razini koja se ne može pripisati varijaciji u haplotipu. Za 1≤k<16, minimalno [image] -odjeljivanje [image] [image] definirano je kao onaj haplotip koji se odjeljuje s k SNP-ova koje je davalo najmanju relativnu rezidualnu devijanciju [image] . Odnos između k i [image] ([image] [image] ), zajedno s brojem haplotipova koji sadrže [image] [image] , je prikazan na Slici 4. Kvalitativna razlika bila je očita između k=6 i k=7 u tome, da se broj haplotipova povezan s [image] [image] povećava od 13 do 22 dok se [image] ([image] [image] ) smanjuje samo marginalno [[image] =0.397 vs [image] =0,371]. Stoga se zaključilo da SNP-ovi 1, 6, 7, 9, 11 i 14, koji definiraju [image] , predstavljaju dobar izbor ključnih polimorfizama za daljnju analizu. Od preostalih SNP-ova, šest (br. 3, 4, 8, 10 i 16) mogu biti klasificirani kao "marginalno informativni". Ovi markeri, u kombinaciji sa šest ključnih SNP-ova, zajedno definiraju 39 od 40 opaženih haplotipova, i tumače virtualno svu rastumačivu devijanciju ([image] =0,245). Druga četiri SNP-a (br. 2, 5, 13 i 15) bili su "neinformativni" s obzirom na normaliziranu razinu in vitro ekspresije, budući da su oni bili bilo monomorfni u našeg uzorku (br. 2) ili su bili u perfektnom (br. 5 i 13) ili skoro perfektnom (br. 15) disekvilibriju vezanosti s drugim markerima.

Korelacijska struktura ovih šest ključnih SNP-ova bila je zatim procijenjena koristeći jednu seriju sukcesivno izrastalih (t.j. ugniježdenih, engl. nested) regresijskih stabala. Slijedeći konvenciju za analizu regresijskog stabla (Therneau i Atkinson 1997), najmanje intermedijarno stablo s unakrsno validiranom [image] unutar jedne SE od one u potpuno izraslom stablu odabrano je kao reprezentativno odjeljivanje (Slika 5). Za ovo "optimalno" stablo nađeno je, da sadrži 10 internih i 11 terminalnih čvorova (Slika 6, Tablica 5). Relativna rezidualna devijancija ovoga stabla jednaka je [image] = 0,398, i time tumači za (1-0,397) / (1-0,245) ≈ 80% ove devijancije koje se mogu rastumačiti pomoću odjeljivanja haplotipa.

Jedan jedini najvažniji rascjep bio je na SNP 7 koji sam iznosi 15% rastumačive devijancije. Četiri haplotipa koji nose C alel od tog SNP-a definiraju homogenu podgrupu (list 11) s aritmetičkom sredinom normalizirane ekspresijske razine 1,8 puta većom od one u H1. Haplotipovi koji nose T alel od SNP 7 dalje su pod-podijeljeni sa SNP 9, s alelom T od ovog polimorfizma koji uzrokuje višu ekspresiju (μnor=1,26) nego alel G (μnor=0,84; Wilcoxon z=7,09; p<0,001). Rezultirajući nnTTnn haplotip je rascijepljen sa SNP 6 (G/T), s nGTTnn oblikujući terminalni čvor (list 8) koji uključuje divlji tip, haplotip H1. Zanimljivo, ovi nTTTnn haplotipovi, kada se pod-podijele sa SNP 11, pokazuju dramatičnu razliku u razini ekspresije. Dok je za nTTTGn nađeno da je niski ekspresor (μnor=0,64), haplotip nTTTAn pokazivao je maksimalnu prosječnu ekspresiju (μnor=3,89; Wilcoxon z=5,11; p<0,001).

Haplotip nnTGnn za SNP-ove 7 i 9 bio je pod-podijeljen sa SNP-ovima 14 i 1, s trima od rezultirajućih haplotipova koji formiraju terminalne čvorove (listove 1, 6, i 7). Četvrti haplotip, GnTGnA, bio je intermedijarni ekspresor (μnor=0,86), koji je dalje rascijepljen sa SNP-ovima 11 i 6. Zanimljivo, samo jedna naročita kombinacija od SNP 14 i 1 alela rezultirala je povećanom ekspresijom sa SNP 7 i 9 nnTGnn zaleđem (AnTGnG, list 7, μnor=1,83). Sličan neaditivni efekt na ekspresiju je također primijećen za SNP-ove 6 i 11 kada su razmatrani na haplotipu GnTGnA: dok je SNP 11 alel A bio povezan s višom ekspresijom nego G u kombinaciji sa SNP 6 alelom T (GTTGAA μnor=1,18 vs. GTTGGA μnor=0,74; Wilcoxon z=7,09; p<0,001), suprotno je pak bio slučaj u kombinaciji sa SNP 6 alelom G (GGTGAA μnor=0,74 vs. GGTGGA μnor=1,04; Wilcoxon z=5,28; p<0,001).

Evolucija haplotipskog diverziteta

Od 15 promotorskih SNP-ova GH1 gena za koji je u ovoj studiji nađeno da su polimorfni, alternativni aleli na 14 pozicija bili su potencijalno razjašnjivi konverzijom gena, budući da su oni bili identični onima na analognim lokacijama barem u jednom od četiri paralogna ljudska gena (Tablica 3). Usporedba s ortolognim promotorskim sekvencama gena za hormon rasta (growth hormone, GH) u drugih 10 sisavaca pokazala je, da su najčešći aleli na nukleotidnim pozicijama -75, -57, -31, -6, +3, +16 i +25 (odgovarajuće za SNP-ove 8-15 uključivo) u ljudskom GH1 genu bili striktno očuvani u toku evolucije sisavaca (Krawczak et al. 1999). Intrigantno, najrjeđi među ovim trima naizmjeničnim alelima baš na -1 poziciji (SNP 12) u ljudskom GH1 genu bio je identičan s ovim striktno očuvanim u ortolozima sisavaca.

"Reducirana Medianska Mreža" (Slika 7, Reduced Median Network) otkrila je da divlji tip, haplotip H1 nije direktno povezan s drugim čestim haplotipovima s jednim mutacijskim događajem. Drugi po redu od najčešćih haplotipova, H2, je srodan s H1 via H23 i H12, dok je treći po redu najčešći haplotip, H3, srodan s H1, bilo preko jednog neopaženog haplotipa ili s jednom dvostrukom mutacijom. Smatralo se, da je širenje mreže, kako bi se uključilo daljnje haplotipove, nepouzdano zbog malog broja opažanja po haplotipu. Nadalje, širenje ove mreže nametnula bi uvođenje multiplih supstitucija pojedinih parova baza. Budući da se ove ne mogu razlikovati od serijskih ciklusa genskih konverzija između prethodno postojećih haplotipova, za rezultirajuće udaljenosti u ovoj mreži ne bi bilo vjerojatno da predstavljaju izvorne evolucijske odnose. Međutim, ovo se sigurno može pretpostaviti da je slučaj za mrežu prikazanu na Slici 7, koja spaja ovih sedam najčešćih haplotipova, budući da se svaka mutacija događa samo jedanput.

Opće slabljenje disekvilibrija vezanosti (LD) s fizičkom udaljenosti opaženo je za većinu SNP-ova, s nekim značajnim izuzecima (Tablica 6). Tako je za SNP 9 nađeno da je u jakom LD s drugim SNP-ovima, uključivo i SNP 16 koji je pokazao komparativno slab LD sa svim drugim proksimalnim promotorskim SNP-ovima. Ovo otkriće sugerira da je podrijetlo SNP 9 relativno kasno. Međutim, za SNP 10 je nađeno da je u perfektnom LD sa SNP 12, ali ne i sa SNP 11 (ρ=0,381), dok je SNP 8 bio u jačem LD sa SNP 11 nego sa SNP 10 (ρ=0,925 vs. 0,687). Ovi anomalni nalazi sugeriraju, da je nevjerojatno da je postojeći obrazac LD među SNP-ovima proksimalnog promotora potekao samo od rekombinacijskog slabljenja s udaljenošću, već je prije vjerojatno da reflektira djelovanje drugih mehanizama, takvih kakve su ponavljana mutacija, genska konverzija ili selekcija.

Predviđanje i funkcionalno testiranje super-maksimalnih i sub-minimalnih haplotipova

Bazirano na "optimalnom" regresijskom stablu dobivenom za ekspresijske podatke o haplotipu-ovisnog proksimalnog promotora, učinjen je pokušaj da se predvide potencijalni "super-maksimalni"'' i "sub-minimalni" haplotipovi u smislu njihovih razina ekspresije. S ovim ciljem, aleli od ovih šest ključnih SNP-ova su odabrani uzimajući aritmetičke sredine ekspresijskih razina odgovarajućih listova od ovog stabla u obzir (Tablica 5). Aleli od preostalih SNP-ova su određeni tako, da odgovarajuće maksimiziraju ili minimiziraju ekspresiju individualnih SNP-ova. Tako, za predviđeni super-maksimalni haplotip, aleli od SNP-ova 6, 7, 9 i 11 su bili kao u listu 10, dok su aleli od SNP-ova 1 i 14 bili kao u listu 7. Sub-minimalni haplotip bio je odabran da predstavlja list 1 (za SNP-ove 1, 7, 9 i 14). Najbolji izbor alela za SNP-ove 6 i 11 bio je međutim ponešto neodređen, budući da listovi 2 (sugerirajući alele T i G) i 4 (sugerirajući alele G i A) predviđaju slično niske aritmetičke sredine ekspresijskih razina Stoga je odlučeno razviti oba konstrukta za testiranje in vitro. Završavanje ovih hipotetičkih haplotipova za preostale SNP-ove dalo je:

super-maksimalni haplotip: AGGGGTTAT-ATGGAG i

sub-minimalne haplotipove: AG-TTGTGGGACCACT, AG-TTTTGGGGCCACT.

Ova tri artificijelna haplotipa tada su konstruirana i eksprimirana u hipofiznim stanicama štakora dajući ekspresijske razine od 145±4, 55 ±5, i 20±8% u usporedbi prema divljem tipu (haplotipu 1).

Razlike između SNP alela otkrivenih testom pomaka mobilnosti (EMSA)

EMSA-e su provođene na svim proksimalnim promotorskim SNP mjestima za sve aleličke varijante koristeći hipofizne stanice štakora kao izvor nuklearnog proteina. Proteinski interaktivni bandovi opaženi su na mjestima -168, -75, -57, 31, -6/-1/+3 i +16/+25 (Tablica 7). Interaleličke razlike u broju proteinski interaktivnih bandova su opažene za mjesta -75 (SNP 8), -57 (SNP 9), -31 (SNP 10), -6/-1/+3 (SNP-ovi 11, 12, 13) i +16/+25 (SNP-ovi 14,15) [Slika 8; Tablica 7]. U slučaju posljednjih dvaju mjesta, EMSA testovi na specifične SNP aleličke kombinacije sugerirali su, da se diferencijalno proteinsko vezivanje može pripisati uz aleličku varijaciju na SNP mjestima 12, odnosno 15 (Tablica 7). Kada je ova analiza ponovljena koristeći HeLa stanični ekstrakt, samo je pozicija -57 pokazivala dokaze proteinske interakcije i tada samo za G alel, a ne za T alel (podaci nisu prikazani). Rezultati kompeticijskih eksperimenata, koristeći oligonukleotide odgovarajuće za dva distinktna Pit-1 vezna mjesta, bili su konzistentni, s time da je jedan od dva SNP 8 interaktivna proteina bio Pit-1 (Slika 8). Međutim, ova alelu-specifična proteinska interakcija ostala je bez utjecaja, što bi impliciralo da drugi uključeni protein nije bio Pit-1.

Veza između ekspresije promotorskog haplotipa in vitro i stasa in vivo

Napravljen je pokušaj da se korelira haplotipu-specifična in vitro ekspresija GH1 proksimalnog promotora s odraslom visinom u 124 muška bijelca. Svakom haplotipu je pripisana njegova aritmetička sredina ekspresijske vrijednosti iz normaliziranih in vitro ekspresijskih podataka (Tablica 4), a prosjek Ax=(μnor,h1+μnor,h2)/2 od ova dva haplotipa je izračunat za svakog pojedinca. Pojedinci homozigotni za H1 bili su isključeni iz ove analize, budući da njihove Ax vrijednosti (1,0) ne bi doprinijele ikakvoj kauzalnoj varijaciji. To je urodilo jednim uzorkom od 109 pojedinaca poznate visine s pogodnim genotipovima (Tablica 8). Kada je visina iznad i ispod srednje (1,765 m) bila uspoređena s Ax vrijednostima iznad i ispod srednje (0,9), pojavio se dokaz za povezanost između visine i s haplotipom-povezane in vitro ekspresije GH1 proksimalnog promotora ([image] 2=4,846, 1 d.f., P=0,028). Tome usprkos, regresijska analiza, koristeći drugostepeni polinom, pokazala je da su dvije μnor vrijednosti same po sebi relativno slabi predskazatelji visine. Budući da je koeficijent determinacije bio r2 = 0,025; može se zaključiti da se približno 2,5% varijabiliteta u visini tijela može razjasniti pomoću haplotipske ekspresije in vitro proksimalnog promotora GH1 gena.

Polimorfizmi lokusne kontrolne regije (LCR) i snaga proksimalnog promotora

Tri nove polimorfne promjene nađene su unutar mjesta I i II (potrebnih za hipofizi-specifičnu ekspresiju GH1 gena; Jin et al. 1999) od GH1 LCR u jednom probiru među 100 pojedinaca nasumce odabranih unutar proučavane grupe. One su locirane na nukleotidne pozicije 990 (G/A; 0,90/0,10), 1144 (A/C; 0,65/0,35) i 1194 (C/T; 0,65/0,35) [numeriranje prema Jin et al. 1999]. Polimorfizmi na 1144 i 1194 bili su u potpunom disekvilibriju vezanosti, i opažena su tri razna haplotipa: haplotip A (990G, 1144A, 1194C; 0,55), haplotip B (990G, 1144C, 1194T; 0,35) i haplotip C (990A, 1144A, 1194C; 0,10).

Kako bi se determiniralo, da li ova tri LCR haplotipa provode diferencijalni učinak na ekspresiju nizvodnoga GH1 gena, učinjen je neki broj različitih LCR-GH1 proksimalnih promotorskih konstrukata. Tri naizmjenična 1,6 kb fragmenta koji su sadržavali LCR klonirani su u pGL3, direktno uzvodno od tri različita tipa proksimalnih promotorskih haplotipova, kao „visoko eksprimirani promotor“ (H27), „nisko eksprimirani promotor“ (H23) i „normalno eksprimirani promotor“ (H1), da proizvedu sveukupno devet raznih LCR-GH1 proksimalnih promotorskih konstrukata. Ti konstrukti su tada eksprimirani i u štakorskim GC stanicama i u HeLa stanicama, a rezultirajuće aktivnosti luciferaze su izmjerene. U GC stanicama, prisustvo LCR-a pojačava ekspresiju do gotovo 2,8-struko kada se uspoređuje s proksimalnim promotorom samim (Tablica 9). Međutim, obim ovog induktivnog učinka bio je ovisan o vezanom promotorskom haplotipu. Dvosmjerna analiza varijance (Tablica 10) otkrila je, da su oba glavna učinka i promotor*LCR interakcija bili značajni, s glavnim utjecajem proizvedenim s proksimalnim promotorom. Također u Tablici 9 uključeni su rezultati Tukey studentiziranog rasponskog testa na razini 95% signifikantnosti, provedenog individualno za svaki promotorski haplotip. U spoju s promotorskim haplotipom 1, aktivnost LCR haplotipa A je signifikantno različita od one u N (konstrukt koji sadrži proksimalni promotor, ali mu nedostaje LCR), ali ne i od one u LCR haplotipovima B i C; LCR haplotipovi B i C signifikantno se razlikuju jedan od drugog i od N. S promotorom 27, međutim, nikakve signifikantne razlike nisu nađene između LCR haplotipova. Nikakva LCR-posredovana indukcija ekspresije nije opažena s bilo kojim od proksimalnih promotorskih haplotipova u HeLa stanicama (podaci nisu prikazani).

Budući da je fizička udaljenost između LCR-a i proksimalnih promotorskih SNP-ova bila isuviše velika da bi dozvoljavala zajedničko fizičko haplotipiziranje, disekvilibrij vezanosti (LD) između njih bio je procijenjen pomoću metode maksimalne vjerojatnosti, koristeći genotipske podatke od 100 pojedinaca uključenih u ovu analizu inter-SNP LD za proksimalni promotor. Za u parovima proveden LD između promotorskih SNP-ova i LCR haplotipova je nađeno, da je visok za sve SNP-ove osim SNP 16 (Tablica 6). Može se stoga zaključiti, da je SNP 16 bio predmetom ponavljanih mutacija prije postanka SNP 9, kao jedinog SNP-a za kojeg je nađeno da je u jakom disekvilibriju vezanosti s SNP 16. Bitne razlike između LCR haplotipova postoje u smislu njihovih LD sa SNP-ovima 4, 8 i 16 (Tablica 6), što sugerira relativno mlađu dob za LCR haplotip B, za razliku od haplotipa A.

U našoj studiji smo utvrdili da su se varijacije dogodile u 15 od ovih 16 SNP lokacija unutar proksimalnog promotora GH1 gena manifestirajući sebe u sveukupnom broju od 40 različitih promotorskih haplotipova. Za 12 haplotipova je nađeno, da su povezani sa značajno smanjenom razinom ekspresije luciferaznog reporterskog gena, u usporedbi s haplotipom 1, dok su 10 haplotipova bili povezani sa značajno povećanom razinom. Naši rezultati ukazuju da će konvencionalna procjena ovih varijanti u visini odraslih, pripisivih polimorfnim varijacijama u ovom GH1 genskom promotoru (2,5), vjerojatno biti konzervativna i trebala bi se smatrati minimalnom.

Od ovih haplotipskih frekvencija opaženih u našoj studijskoj grupi, predviđa se, da nekih 8,2% od normalne populacije posjeduje prenisko eksprimirane GH1 proksimalne promotorske haplotipove (bilo identične ili neidentične) koji su povezani s in vitro GH produkcijom, što je jednako ili manje od 50% od one u divljeg tipa.

Različite cis djelatne regulatorne sekvence identificirane su u ovoj proksimalnoj promotorskoj regiji gena hormona rasta. Neki od ovih faktora mogu vršiti svoje učinke sinergistički, dok drugi izgleda da se vežu uz promotorske motive na jedan uzajamno isključivi način. Inspekcija ove GH1 genske promotorske regije sugerira, da su neki od ovih 15 SNP-ova locirani unutar veznih mjesta za transkripcijske faktore (Slika 2). Stoga se tri SNP-a skupljaju oko transkripcijskog inicijacijskog mjesta (SNP-ovi 11-13), jedan se nalazi na 3' kraju od proksimalnog VDRE susjednog TATA boksu (SNP 10), jedan unutar distalnog VDRE (SNP 9), jedan unutar proksimalnog veznog mjeta za Pit-1 (SNP 8) i jedan unutar veznog mjesta za NF1 (SNP 6). Ekspresijska analiza prikraćenog promotorskog konstrukta je bila u skladu s ograničenim utjecajem SNP-ova 1-5 na ekspresiju GH1 gena.

Odjeljivanje haplotipova identificiralo je 6 SNP-ova (br. 1, 6, 7, 9, 11 i 14) kao glavne determinante razine ekspresije GH1 gena, s daljnjih 6 SNP-ova koji su samo marginalno informativni (br. 3, 4, 8, 10, 12 i 16). Funkcionalni značaj svih 16 SNP-ova je istražen pomoću EMSA testova koji su ukazali da 6 polimorfnih mjesta u ovom GH1 proksimalnom promotoru ostvaruju interakcije s proteinima koji se vežu s nukleinskom kiselinom; za pet od tih mjesta [SNP 8 (-75), 9 (-57), 10 (-31), 12 (-1) i 15 (+25)] alternativni aleli pokazivali su diferencijalno vezivanje proteina.

Naša studija fokusirala se također na predviđanje potencijalnih super-maksimalnih i sub-minimalnih haplotipova u smislu njihovih ekspresijskih razina. Kada je testiran, jedan od sub-minimalnih haplotipova je pokazivao nižu razinu ekspresije, nego bilo koji prirodno postojeći haplotip, koji rezultat indicira učinkovitost ovog procesa odjeljivanja haplotipova opisanoga ovdje.

Mi smo pretpostavili, da bi molekularne osnove za o haplotipu-ovisne razlike u snazi promotora GH1 gena, mogle stoga ležati u čistom učinku diferencijalnog vezivanja multiplih transkripcijskih faktora uz alternativne verzije njihovih istorodnih veznih mjesta. Alternativne verzije ovih mjesta razlikuju se na temelju njihovog sadržavanja različitih alela od ovih različitih SNP-ova, ali kombinatorički konstituiraju opaženu postavu promotorskih haplotipova. Transkripcijska aktivacija ljudskih gena je posredovana interakcijom transkripcijskih faktora s raznim kombinacijama i permutacijama njihovih istorodnih veznih mjesta na genskom promotoru. Neki transkripcijski faktori su koordinirani direktno s cis-djelatnim DNA sekvencijskim motivima, drugi indirektno posredstvom proteinsko-proteinskih interakcija u nečemu što je nalikovalo trodimenzionalnoj slici-slagalici: ovi DNA sekvencijski motivi predstavljaju šablonu slagaljke, a transkripcijski faktori predstavljaju komadiće slagaljke. Ovakav modularni pogled na promotor pomaže nam da sagledamo, kako bi se efekt raznih SNP kombinacija u nekom datom haplotipu, mogao pretočiti tako da izvede diferencijalne učinke na vezivanje transkripcijskog faktora, sastavljanje transkriptosoma i time gensku ekspresiju. Tako, na primjer, opaženi ne-aditivni učinci od SNP-ova GH1 promotora na gensku ekspresiju, mogli bi biti shvaćeni u smislu ovih alelima-specifičnih diferencijalnih vezivanja nekog datog proteina na 1-SNP mjesto, utječući sa svoje strane na vezivanje nekog drugog proteina na neko drugo SNP mjesto, koje je i samo predmetom alelu-specifičnog proteinskog vezivanja.

U našoj studiji, LCR fragmenti služe da pojačavaju aktivnost GH1 proksimalnog promotora do 2,8-strukoga, iako je za stupanj pojačavanja bilo nađeno da je ovisan o identitetu vezanoga proksimalnog promotorskog haplotipa. Obratno, za pojačavanje aktivnosti proksimalnog promotora datog haplotipa je također bilo nađeno, da je ovisno o identitetu LCR haplotipa. Uzevši zajedno, ovi nalazi impliciraju da je genetska osnova inter-individualnih razlika u ekspresiji GH1 gena vjerojatno ekstremno kompleksna.

Prema tome, naši rezultati demonstriraju značaj haplotipa u predviđanju funkcionalnosti određene molekule nukleinske kiseline i tako predstavljaju koristan stupanj u analizi genetičkih podataka.

Tablica 1

GH1 proksimalni promotorski haplotipovi definirani genetičkim varijacijama na 16 lokacija

[image]

n: frekvencija u 154 muških britanskih bijelaca; §: haplotipovi koji pokazuju signifikantno reduciranu razinu (≤ 55% onoga u haplotipu 1) luciferazne aktivnosti kod GC stanica; $: nađeno samo u pojedinačnim slučajevima GH deficijencije. –naznačava odsutnost ove baze o kojoj se radi.

Tablica 2

Dvolančane oligonukleotidne primer-sekvence (početnice) za EMSA analizu SNP mjesta, koja pokazuju alelu-specifično proteinsko vezivanje. SNP mjesta 11-15 proučena su u raznim kombinacijama alela. TSS: transkripcijsko inicijacijsko mjesto (Transcription initiation site).

[image] [image]

Tablica 3

Frekvencije alela od 15 SNP-ova u promotoru GH1 gena od 154 muških bijelaca i odgovarajući nukleotidi na analognim lokacijama u paralognim genima GH skupine

[image] [image]

$: relativno prema GH1 transkripcijskom startnom mjestu; §: baze na analognim pozicijama u sekvencama divljeg tipa od četiri paralogna gena u ljudskoj GH skupini.

Tablica 4

In vitro analiza ekspresije GH1 genskog promotora s 40 raznih SNP haplotipova

[image] [image]

n: broj mjerenja; μnor:aritmetička sredina normalizirane ekspresijske razine (t.j. mnogostrukost promjena u usporedbi s H1); σnor: standardna devijacija razine ekspresije; Tukey: rezultat Tukey-evog studentiziranog rasponskog testa, haplotipovi s preklapajućim nizovima slova nisu statistički različiti u smislu njihove aritmetičke sredine ekspresijskih razina; *: ne-Gauss-ova distribucija

Tablica 5

Odjeljivanje haplotipova promotorskih ekspresijskih podataka GH1 gena

[image]

nhap : broj haplotipova uključenih u list;μnor:aritmetička sredina normaliziranih razina ekspresije; σnor : standardna devijacija razine ekspresije; δ(list): rezidualna devijancija unutar lista; § : aleli su dati u redoslijedu SNP 1, 6, 7, 9, 11 i 14 (n: bilo koja baza); &: numeracija kao na Slici 4.

Tablica 6

Disekvilibrij vezanja, ρ, između SNP-ova GH1 proksimalnog promotora i LCR haplotipova kod 100 muških bijelaca

[image]

&: ustanovljeno je da jedan jedini kromosom od 200 nosi SNP 12 alel C; ovaj kromosom isključen je iz svih LD analiza koje su uključivale SNP 12; $: za svaki LCR haplotip, ρ je izračunat prema kombinaciji od druga dva LCR haplotipa, time pretvarajući taj LCR u bialelički sistem.

Tablica 7

Rezultati EMSA testova koji prikazuju alelu-specifično diferencijalno vezivanje proteina na različitim SNP mjestima u GH1 genskom promotoru koristeći nuklearne ekstrakte iz stanica hipofize štakora

[image] [image]

TSS: Transkripcijsko startno mjesto; 5'UTR: 5' neprevedena regija

Tablica 8

Povezanost između visine odraslih i haplotipu-pridruženih in vitro ekspresijskih podataka od GH1 proksimalnog promotora u 124 muška bijelca

[image]

Ax : prosječna normalizirana in vitro razina ekspresije u dva haplotipa pojedinca t.j. Ax=(μnor,h1+μnor,h2)/2 .

Tablica 9

Prosječne normalizirane luciferazne aktivnosti ± standardna devijacija od raznih LCR-GH1 proksimalnih promotorskih konstrukata porijeklom od GC stanica

[image]

x,y,z: Tukey-ev studentizirani rasponski test unutar promotorskog haplotipa; LCR haplotipovi (A, B i C) s preklapajućim nizovima slova nisu statistički različiti u smislu njihove aritmetičke sredine ekspresijskih razina. N: Konstrukt koji sadrži proksimalni promotor, ali nema LCR. LCR haplotipovi normalizirani su s obzirom na N u svakom slučaju.

Tablica 10

Dvosmjerna ANOVA za normalizirane aktivnosti luciferaze u konstruktima od LCR-GH1 proksimalnih promotora

[image]

Claims (8)

1. Metoda za identificiranje mutacija i/ili polimorfizama koje su glavne determinante za fenotip, naznačena time, da se sastoji od ispitivanja rezidualne devijancije ( [image] 1. ) za svaku odabranu skupinu mutacija i/ili polimorfizama za neki gen koji se razmatra.

2. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 1, naznačena time, da se rezidualna devijancija ( [image] 2. ) određuje za svaku podskupinu mutacija i/ili polimorfizama.

3. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 2, naznačena time, da se rezidualna devijancija ( [image] 3. ) za odjeljivanje haplotipova {1...m} zasniva na svakoj mogućoj podskupini mutacija i/ili polimorfizama.

4. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačena time, da je rezidualna devijancija ( [image] ) jednaka [image] = [image] ( [image] ) = [image] ( [image] i - [image] 4. π(i))2 .

5. Uporaba metode u skladu s patentnim zahtjevima 1 do 4, naznačena time, da je za predviđanje super-maksimalnih i/ili sub-minimalnih haplotipova koji su glavne determinante odgovarajućeg, super-maksimalnog fenotipa i sub-minimalnog fenotipa.

6. Uporaba metodologije u skladu s patentnim zahtjevima 1 do 4, naznačena time, da je za identificiranje pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama SNP-ova koji su od fenotipskog značaja.

7. Metoda za detekciju haplotipa koji je učinkovit da djeluje kao indikator barem jednog fenotipa u pojedincu, naznačena time, da metoda detekcije sadrži korake: (a) dobivanje test uzorka genetičkog materijala od pojedinca kojeg treba testirati, s time da navedeni materijal sadrži barem jedan selekcionirani gen ili jedan njegov fragment; (b) analiziranje nukleotidne sekvence navedenog gena, ili njegovog fragmenta, da se vidi, da li ikoji od pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama SNP-ova postoje na bilo kojem pojedinačnom ili na više SNP-mjesta unutar tog gena; i (c) gdje navedeni SNP-ovi postoje, njihovo identificiranje, kako bi se odredio haplotip navedenog pojedinca i zatim podvrgavanje navedenog haplotipa analizi u skladu s gornjim patentnim zahtjevima 1 do 4.

8. Uporaba metode u skladu s patentnim zahtjevima 1 do 4, naznačena time, da je za identificiranje nekog fenotipički signifikantnog haplotipa za korištenje u dijagnozi ili liječenju neke bolesti karakterizirane navedenim fenotipom.