HK40070552B - Improvements in nucleic acid sequencing - Google Patents

Claims (12)

1. Verfahren zum Herstellen einer Matrize für eine Nukleinsäuresequenzierungsreaktion, das Verfahren umfassend:

   a) Bereitstellen eines festen Trägers, wobei der feste Träger eine Vielzahl von Nukleinsäureprimer umfasst, die darauf immobilisiert sind;

   b) Kontaktieren einer Nukleinsäurebibliothekspräparation mit dem festen Träger, die Bibliothekspräparation umfassend eine Vielzahl von einzelsträngigen Fragmenten einer zu sequenzierenden Matrizennukleinsäure, die Matrizennukleinsäurefragmente ferner umfassend eine oder mehrere Adapternukleinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren der Nukleinsäureprimer hybridisieren, und wobei die Bibliothekspräparation eine Nukleinsäurekonzentration von 400 pM oder weniger aufweist;

   c) Ermöglichen von einzelsträngigen Fragmenten der Matrizennukleinsäure, an die Nukleinsäureprimer zu binden, wobei dadurch die einzelsträngigen Fragmente auf dem festen Träger immobilisiert werden; und

   d) Wiederholen der Schritte b) und c) mindestens drei weitere Male; wobei eine Wiederholung des Kontaktierungsschritts mit der gleichen Bibliothekspräparation erfolgt, die in Schritt (b) verwendet wird; um dadurch einen festen Träger bereitzustellen, der einzelsträngige Fragmente einer Matrizennukleinsäure darauf immobilisiert aufweist; wobei das Verfahren keinen Amplifikationsschritt umfasst, bis die Schritte b) und c) mindestens dreimal wiederholt wurden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ein Verfahren zum Herstellen einer Matrize für eine Nukleinsäuresequenzierungsreaktion ist, das Verfahren umfassend:

   a) Bereitstellen einer Durchflusszelle, umfassend einen festen Träger, der eine Vielzahl von Nanowells aufweist, die darauf ausgebildet ist, jedes Nanowell umfassend eine Vielzahl von Nukleinsäureprimern, die auf dem festen Trägerimmobilisiert sind, und die Nanowells in einem gemusterten Array ausgebildet sind, das einen Abstand von 500 nm oder weniger aufweist;

   b) Kontaktieren einer Nukleinsäurebibliothekspräparation mit der Durchflusszelle, die Bibliothekspräparation umfassend eine Vielzahl von einzelsträngigen Fragmenten einer zu sequenzierenden Matrizennukleinsäure, die Matrizennukleinsäurefragmente ferner umfassend eine oder mehrere Adapternukleinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren der Nukleinsäureprimer hybridisieren, und wobei die Bibliothekspräparation eine Nukleinsäurekonzentration von 400 pM oder weniger aufweist;

   c) Ermöglichen der einzelsträngigen Fragmente der Matrizennukleinsäure, an die Nukleinsäureprimer zu binden, wobei dadurch die einzelsträngigen Fragmente in den Nanowells immobilisiert werden; und

   d) Wiederholen der Schritte b) und c) mindestens drei weitere Male; wobei eine Wiederholung des Kontaktierungsschritts mit der gleichen Bibliothekspräparation erfolgt, die in Schritt (b) verwendet wird; um dadurch eine Durchflusszelle bereitzustellen, die einzelsträngige Fragmente von Matrizennukleinsäure aufweist, die in Nanowells immobilisiert sind; wobei das Verfahren keinen Amplifikationsschritt umfasst, bis die Schritte b) und c) mindestens dreimal wiederholt wurden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine effektive Nukleinsäurekonzentration, die als Anzahl von Zyklen von Schritt (c) multipliziert mit der Bibliotheknukleinsäurekonzentration berechnet wird, mindestens 800 pM beträgt.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Bibliothekspräparation eine Nukleinsäurekonzentration von 250 pM oder weniger aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend ein Denaturieren einer Bibliothekspräparation, umfassend doppelsträngige Fragmente einer zu sequenzierenden Matrizennukleinsäure, um die einzelsträngigen Fragmente der zu sequenzierenden Matrizennukleinsäure zu erhalten, die in Schritt (b) verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend ein Amplifizieren der immobilisierten einzelsträngigen Nukleinsäurefragmente, um dadurch mehrere Kopien der Fragmente zu erzeugen.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der feste Träger Glas ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3 bis 7, in Abhängigkeit von Anspruch 1, wobei sich der feste Träger auf einer Durchflusszelle befindet, wobei der feste Träger eine Vielzahl von Nanowells darauf ausgebildet aufweist, jedes Nanowell umfassend eine Vielzahl von Nukleinsäureprimern, die auf dem festen Träger immobilisiert sind, und die Nanowells in einem gemusterten Array ausgebildet sind.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Abstand des Nanowellarrays 500 nm oder weniger beträgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei der Abstand des Nanowellarrays 350 nm oder weniger beträgt.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3 bis 7, in Abhängigkeit von Anspruch 1, wobei der feste Träger ein Mikrokügelchen ist.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend eine Sequenzierung der immobilisierten einzelsträngigen Nukleinsäurefragmente.