HK40032905A - 多肽的放射性标记 - Google Patents

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多肽的放射性标记

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相关申请的交叉引用

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技术领域

本发明涉及用于放射性标记多肽诸如抗体的方法。具体地讲，本发明涉及使用点击化学以用放射性金属离子标记多肽的方法。本发明还涉及放射性标记的多肽的药物组合物和用途。

背景技术

发射α粒子的放射性核素由于其高能量与短程作用的组合，对于癌症治疗具有良好前景，提供了主要定位于肿瘤细胞的强效杀灭的可能性(Kim，Y.S.和M.W.Brechbiel，Anoverview of targeted alpha therapy.Tumour Biol，2012.33(3)：第573-90页)。使用抗体、支架蛋白质、小分子配体、核酸适体或对癌症抗原具有特异性的其他结合部分靶向递送α发射体，提供了一种将放射性核素选择性递送至肿瘤以增强其效力并减轻脱靶效应的方法。在惯例上，结合部分附接到螯合剂，该螯合剂结合到发射α的放射性金属，以产生放射性复合物。许多此类示例使用单克隆抗体(mAb)作为靶向配体，以产生称为放射性免疫缀合物的化合物。

锕-225(²²⁵Ac)是用于医学应用的特别受关注的发射α的放射性同位素(Miederer等人，Realizing the potential of the Actinium-225radionuclide generator intargeted alpha particle therapy applications.Adv Drug Deliv Rev，2008.60(12)：71-82)。²²⁵Ac的10天半衰期足够长以有利于放射性缀合物产生，但也足够短以匹配递送溶媒诸如抗体的循环药代动力学。因此，²²⁵Ac放射性免疫缀合物特别受关注。此外，²²⁵Ac在达到稳定同位素²⁰⁹Bi之前最终发射4个α粒子的一系列步骤中衰减，从而增加效力。另一种用于医学应用的受关注的放射性同位素为镥177(¹⁷⁷Lu)，其发射适用于成像的γ辐射和适用于放射治疗的中能β辐射。已显示¹⁷⁷Lu标记的肽表现出减少的正常组织损伤，并且¹⁷⁷Lu标记使得可以使用单一放射性标记剂进行治疗和成像(Kwekkeboom DJ等人，[177Lu-DOTAOTyr3]octreotate：comparison with[111In-DTPAo]octreotide in patients.Eur JNucl Med.2001；28：第1319-1325页)。用于治疗应用的其他放射性同位素包括例如β或α发射体，诸如例如钍、镭、³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²⁵⁵Fm和²²⁷Th。用于成像应用的其他放射性同位素包括发射γ的放射性同位素，诸如例如⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr和¹¹¹In。

先前的临床和临床前程序主要使用1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)来进行锕螯合。然而，已知的是，锕的DOTA螯合可以是具有挑战性的(Deal，K.A.等人，Improved in vivo stability of actinium-225 macrocyclic complexes.J MedChem，1999.42(15)：第2988-92页)，并且通常需要苛刻的条件或每个抗体高水平的DOTA。因此，已利用了两种不同的方法，称为“一步”和“两步”放射性标记方法，每种方法具有其自身的缺点。

首先开发“两步”法，其包括涉及锕的2个化学步骤(McDevitt，M.R.等人，Tumortherapy with targeted atomic nanogenerators.Science，2001.294(5546)：第1537-40页)。通过双官能螯合剂(BFC)DOTA-异硫氰酸酯(DOTA-SCN)在pH 4.5-5下，使用2M乙酸盐缓冲液在55℃至60℃下以高放射性化学收率(约95％)螯合²²⁵Ac 30min。随后，使²²⁵Ac-DOTA-SCN与靶向抗体反应，以产生放射性免疫缀合物。两步法的主要缺点是约90％的SCN不能在标记条件下存活，因此约90％的输入²²⁵Ac缀合到DOTA的非反应形式，该DOTA的非反应形式不能缀合到抗体。这不仅导致收率低(通常仅约10％)且成本更高，而且导致可限制最终缀合物的功效的比活性降低。

最近开发了“一步”法用于锕(Maguire，W.F.等人，Efficient 1-stepradiolabeling of monoclonal antibodies to high specific activity with 225Acfor alpha-particle radioimmunotherapy of cancer.J Nucl Med，2014.55(9)：第1492-8页)。该方法仅具有1个涉及锕的化学反应步骤。首先将DOTA-SCN缀合到抗体。然后，在温和条件(37℃、pH 7.5)下将²²⁵Ac螯合到DOTA-mAb，从而实现高达80％的放射性化学收率。然而，有必要缀合高水平的DOTA(每个抗体约10或更多)以实现高收率。高螯合剂：抗体比率(CAR)，在这种情况下为高DOTA∶Ab比率(DAR)，物质更可能具有受损的免疫反应性；此外，虽然平均DAR可为10，但是²²⁵Ac可能在甚至高于平均值的比率下与群体螯合。因此，该方法存在将²²⁵Ac连接到抗体螯合剂缀合物的最小活性部分的风险。此外，有必要在无金属条件下处理抗体和DOTA-mAb缀合物，以避免常见金属诸如铁、锌和铜的螯合，这在生产过程中引入了重大挑战。

点击化学是由Sharpless于2001年引入的化学方法，并且其描述了通过将小单元连接在一起而被调制为快速且可靠地生成物质的化学。参见例如Kolb，Finn andSharpless Angewandte Chemie Intemational Edition(2001)40：2004-2021；Evans，Australian Journal of Chemistry(2007)60：384-395)。偶合反应(其中的一些可被分类为“点击化学”)包括但不限于由活化的酸或卤化酰基形成酯、硫酯、酰胺(例如，诸如肽偶合)；亲核置换反应(例如，诸如卤化物的亲核置换或应变环系的开环)；叠氮-炔Huisgen环加成(例如，叠氮化物与炔烃之间的1，3-偶极环加成以形成1，2，3-三唑连接基)；巯基炔加成；亚胺形成；四嗪与反式环辛烯(TCO)之间的狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alderreaction)；以及迈克尔加成(Michael addition)(例如，马来酰亚胺加成)。

炔烃与叠氮化物之间的点击化学反应通常需要添加铜催化剂以促进1，3-环加成反应，并且称为铜催化的叠氮-炔环加成(CuAAC)反应。然而，环辛炔或环辛炔衍生物与叠氮化物之间的点击化学反应通常不需要添加铜催化剂，而是经由应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)进行(Debets，M.F.等人，Bioconjugation with strained alkenes andalkynes.Acc Chem Res，2011.44(9)：第805-15页)。

位点特异性已成为抗体药物缀合物(ADC)领域中的关键聚焦区域(Agarwal，P.和C.R.Bertozzi，Site-specific antibody-drug conjugates：the nexus ofbioorthogonal chemistry，protein engineering，and drug development.BioconjugChem，2015.26(2)：第176-92页)，因为已证明，与随机缀合相比，用位点特异性方法可增加ADC的功效和安全性。据认为，放射性免疫缀合物可实现类似的安全性和功效有益效果。

如上所指出，本领域仍需要产生具有高比活性和高收率的稳定放射性免疫缀合物的有效方法。

发明内容

本发明通过提供用于使用点击化学放射性标记多肽诸如抗体的方法来满足此需要。在本发明的方法中，将叠氮化物修饰的抗体以及包含与含有炔烃基团的螯合部分缔合的放射性金属离子的放射性复合物用于点击化学反应中，以产生具有低螯合剂：抗体比率(CAR)和高放射性化学收率的稳定放射性免疫缀合物，同时需要减少放射性金属的使用并且在用于产生初始放射性复合物的步骤中仅需要无金属条件。本发明的方法简化了用于产生具有增加的安全性、功效和均匀度的放射性免疫缀合物的先前方法。

在一个总体方面，本发明涉及一种用放射性金属离子标记多肽的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；

b.提供放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的所述放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；以及

c.使所述修饰的多肽与所述放射性复合物在允许所述第一点击反应配偶体与所述第二点击反应配偶体反应的条件下接触，从而用所述放射性金属离子标记所述多肽。

在另一个总体方面，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体以及通过本发明的方法制备的放射性标记的多肽。

在另一个总体方面，本发明涉及一种在对其有需要的受治疗者中治疗肿瘤性疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用本发明的药物组合物。

在另一个总体方面，本发明涉及一种组合或试剂盒，所述组合或试剂盒包含：

a.修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；以及

b.放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；

其中所述组合或试剂盒将用于用所述放射性金属离子标记所述多肽。

在其他总体方面，本发明涉及一种治疗或诊断剂(“诊疗剂”)，所述治疗或诊断剂包含通过本发明的方法制备的放射性标记的多肽。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。

在附图中：

图1示出根据本发明的方法的放射性标记抗体的示意图；图中示出随机缀合，并且当叠氮化物与单克隆抗体(mAb)位点特异性缀合时，使用类似的放射性标记方案；

图2示出根据本申请的实施方案，经由点击化学对⁸⁹Zr-DOTA-mAb进行改善的两步制备的合成方案；

图3示出In-111放射性免疫缀合物的细胞结合：结合的放射性随着细胞数量的增加而增加；具体地讲：

图3A示出根据本申请的实施方案，通过PSMA结合抗体(“PSMB127'’)In-111放射性免疫缀合物和人转铁蛋白In-111放射性缀合物来与人前列腺癌细胞系C4-2B(PSMA+，转铁蛋白受体+)结合；并且

图3B示出根据本申请的实施方案，通过EGFR-结合抗体西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)In-111放射性免疫缀合物来与人表皮样癌细胞系A431(EGFR+)结合，以及这些缀合物缺乏与对照(EGFR-)人AML细胞系MOLM-13的结合；

图4示出根据本中请的实施方案，用抗PSMA mAb In-111放射性免疫缀合物治疗的人前列腺癌细胞系C4-2B中In-111的细胞内化的动力学；表面结合的In-111从细胞表面快速消失并重新分布在细胞内；并且

图5示出小鼠肿瘤异种移植研究的结果；将人前列腺癌LNCaP细胞植入小鼠；当肿瘤达到100mm³时，用一系列活性的根据本申请的实施方案的单剂量的点击放射性标记的抗PSMA mAb(“PSMB127”)锕放射性缀合物或结合在该系统放射性缀合物中不存在的病毒靶的同种型对照即人IgG4抗体治疗小鼠；具体地讲：

图5A示出每组的肿瘤体积；绘制尺寸，直到剩余低于一半的组；

图5B示出对照mAb组的存活曲线；并且

图5C示出抗PSMA mAb组的存活曲线。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文引用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。

应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。

当在本文使用时，“由......组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由......组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本发明的一个方面或实施方案的情境时，任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由......组成”或“基本上由......组成”替代以改变本公开的范围。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

为了帮助本申请的读者，已将说明书分成各个段落或章节，或者涉及本申请的各个实施方案。这些分割不应被认为是将段落或章节或实施方案的实质与另一段落或章节或实施方案的实质拆开。相反，本领域技术人员将理解，本说明书具有广泛的应用，并且涵盖可设想到的各个章节、段落和句子的所有组合。对任何实施方案的讨论仅意图是示例性的，并且不旨在表明本公开(包括权利要求书)的范围限于这些示例。

多肽的点击放射性标记

与已知程序相比，本发明的方法提供了一种用于产生适用于例如在对其有需要的受治疗者(例如，人)中进行医学应用的放射性免疫缀合物的改善方法。具体地讲，本文所述的方法通过提供用于高收率螯合金属离子(包括但不限于²²⁵Ac、¹¹¹In和⁸⁹Zr)以及用于低DAR的工艺解决了当前方法的主要限制。本发明允许产生单一批次的叠氮化物标记的多肽，诸如叠氮化物-mAb缀合物，然后可将该缀合物用于产生放射性标记的诊断(例如，当用⁸⁹Zr或¹¹¹In标记时)或治疗(例如，当用²²⁵Ac标记时)目的，其中放射性标记附接在该批次的叠氮化物标记的多肽内的一个或多个相同位点处，该多肽可通过位点特异性修饰或通过随机叠氮化物缀合获得。例如，在随机叠氮化物缀合的情况下，可使用本发明的点击化学对一批包含单一分布的叠氮化物修饰的位点的叠氮化物标记的多肽的样品进行放射性标记以用于不同的目的。

依赖于点击化学并称为“点击放射性标记”的本发明的方法涉及(1)获得修饰的多肽，诸如抗体，其包含第一点击化学反应配偶体，例如叠氮化物部分；(2)获得放射性复合物，该放射性复合物包含与螯合部分缔合的放射性金属离子(例如，²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr)，其中螯合部分包含共价连接到第二点击化学反应配偶体(例如炔烃基团)的螯合剂，该复合物诸如DOTA-二苯并环辛炔(DOTA-DBCO)或去铁胺-DBCO(DFO-DBCO)；以及(3)在修饰的肽的点击化学反应配偶体与放射性复合物之间进行反应，诸如叠氮化物部分与炔烃基团之间的应变促进的炔-叠氮环加成(SPAAC)。

本发明的方法允许放射性金属在低或高pH和/或高温条件下螯合以使效率最大化，这可在没有使炔烃反应配偶体失活的风险的情况下实现。叠氮基-mAb与放射性复合物之间的有效螯合和有效SPAAC反应允许以高放射性化学收率产生放射性免疫缀合物，即使叠氮化物：mAb比率低。在本发明的方法中，必须排除痕量金属的唯一步骤是放射性金属离子与螯合部分的螯合；抗体产生、纯化和缀合步骤不需要在无金属条件下进行。

如本文所用，术语“点击化学”是指由Sharpless引入的化学理念，其描述了通过将包含反应性基团的小单元连接在一起而被调制为快速且可靠地生成共价键的化学(参见Kolb等人，同上)。点击化学不是指特定反应，而是指包括但不限于模拟自然界中存在的反应的反应的概念。在一些实施方案中，点击化学反应是模块化的，范围广泛，给出高化学收率，生成无害的副产物，是立体特异性的，表现出大的热力学驱动力以有助于与单一反应产物反应，和/或可在生理条件下进行。在一些实施方案中，点击化学反应表现出高原子经济性，可在简单的反应条件下进行，使用易得的起始材料和试剂，不使用毒性溶剂或者使用良性或易于去除的溶剂，诸如水，和/或通过非色谱方法诸如结晶或蒸馏提供简单的产物分离。在某些实施方案中，点击化学反应是叠氮化物(-N3)与炔烃或炔烃部分之间的Huisgen环加成或1，3-偶极环加成，以形成1，2，4-三唑连接基。

在一个总体方面，本发明涉及一种用放射性金属离子标记多肽、核酸适体或小分子配体的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；

b.提供放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的所述放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；以及

c.使所述修饰的多肽与所述放射性复合物在允许所述第一点击反应配偶体与所述第二点击反应配偶体反应的条件下接触，从而用所述放射性金属离子标记所述多肽。

如本文所用，术语“多肽”是指由经由肽键连接的氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。该术语是指具有任何尺寸、结构或功能的多肽。通常，多肽为至少三个氨基酸长。多肽可为天然存在的、重组的、或合成的、或它们的任何组合。合成多肽可例如使用自动多肽合成器合成。根据优选的实施方案，多肽为抗体，优选地单克隆抗体或其片段，诸如其抗原结合片段。根据优选的实施方案，抗体或其片段对癌症抗原具有特异性。根据其他实施方案，多肽为工程化结构域或支架蛋白质。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”广义地使用并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括鼠科、人、人适应的(human-adapted)、人源化和嵌合单克隆抗体)及其抗原结合片段。

一般来讲，抗体是对特定抗原(在本文中称为“靶”)表现出结合特异性的蛋白质或肽链，。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ或λ轻链恒定结构域。根据特定实施方案，本发明的抗体包括来自小鼠抗体或人抗体的重链和/或轻链恒定区。四种IgG亚类中的每一种具有不同的生物功能，这些生物功能被称为效应子功能。这些效应子功能通常通过与Fc受体(FcγR)的相互作用或者通过结合C1q并固定补体来介导。结合FcγR可导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解，而结合补体因子可导致补体介导的细胞裂解。可用于本发明的抗体可不具有效应子功能或具有最小效应子功能，但保留其结合FcRn的能力。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如例如双抗体、Fab、Fab′、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，这种单链抗体包含通过约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单结构域抗体”是指本领域中的常规单结构域抗体，这种单结构域抗体包含重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。

如本文所用，术语“支架”或“支架蛋白质”是指具有靶结合结构域并且可结合到靶的任何蛋白质。支架含有“框架”，该框架在很大程度上是结构化的，以及“结合结构域”，该结合结构域与靶接触并提供特异性结合。支架的结合结构域不需要由支架的一个连续序列限定。在某些情况下，支架可为较大结合蛋白质的一部分，该较大结合蛋白质本身可为含有多个支架的多聚体结合蛋白质的一部分。某些结合蛋白质可为双特异性或多特异性的，因为其可结合到两个或更多个不同的表位。支架可来源于单链抗体，或支架可不来源于抗体。

根据本公开，可使用本领域技术人员已知的用于对多肽进行化学或酶修饰的任何方法来将本发明的多肽共价连接到第一点击反应配偶体。与存在于每条多肽链的N端和赖氨酸残基的侧链中的伯胺反应的胺反应性基团可在用于随机修饰多肽的方法中使用。适用于本发明中的胺反应性基团的示例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、取代的NHS(诸如磺基一NHS)、异硫氰酸酯以及四氟苯基酯和全氟苯基酯。与存在于半胱氨酸残基的侧链中的硫醇或巯基反应的硫醇反应性基团可在用于随机修饰多肽的方法中使用。适用于本发明中的硫醇反应性基团的示例包括但不限于马来酰亚胺、卤代乙酰基和苯基恶二唑砜。根据优选的实施方案，修饰的多肽通过使侧链(优选地赖氨酸的氨基侧链)与共价连接到第一点击反应配偶体(例如NHS-叠氮化物)的亲电体反应来获得。

本发明的方法还允许产生位点特异性放射性标记的多肽。本发明的点击放射性标记方法通过利用已建立的方法将叠氮基团位点特异性地安装在抗体上来有利于放射性免疫缀合物的位点特异性产生(Li，X.等人，Preparation of well-defined antibody-drugconjugates through glycan remodelingand strain-promoted azide-alkynecycloadditions.Angew Chem Int Ed Engl，2014.53(28)：第7179-82页；Xiao，H.等人，Genetic incorporation of multiple unnatural amino acids into proteins inmammalian cells.Angew Chem Int Ed Engl，2013.52(52)：第14080-3页)。以位点特异性方式将分子附接到蛋白质或抗体的方法是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的位点特异性标记抗体的任何方法可用于本发明中。适用于本发明中的位点特异性修饰抗体的方法的示例包括但不限于掺入工程化半胱氨酸残基(例如，THIOMAB^TM)、使用非天然氨基酸或聚糖(例如，硒代半胱氨酸、p-AcPhe、甲酰甘氨酸生成酶(FGE、SMARTag^TM)等)、以及酶学方法(例如，使用糖基转移酶、内切糖苷酶、微生物或细菌转谷氨酰胺酶(MTG或BTG)、转肽酶A等)。根据优选的实施方案，修饰的多肽为通过用对抗体的Fc糖基化位点中的核心GlcNac残基之间的β-1，4键联具有特异性的细菌内切糖苷酶(诸如GlycINATOR(Genovis))修剪抗体或其抗原结合片段来获得的抗体或其抗原结合片段，其使最内的GlcNAc完整保留在Fc上，从而允许叠氮基糖位点特异性掺入在该位点处。然后，可在糖转移酶诸如GalT半乳糖基转移酶或GalNAc转移酶的存在下，使修剪的抗体或其抗原结合片段与叠氮化物标记的糖(诸如UDP-N-叠氮基乙酰半乳糖胺(UDP-GalNaz)或UDP-6-叠氮基6-脱氧GalNAc)反应，从而获得修饰的抗体或其抗原结合片段。根据其他优选的实施方案，修饰的多肽为通过用酰胺酶使抗体或其抗原结合片段去糖基化来获得的抗体或其抗原结合片段。然后，可使所得去糖基化抗体或其抗原结合片段与叠氮基胺(优选地3-叠氮基丙胺、6-叠氮基己胺、或任何叠氮基-连接基-胺或任何叠氮基-烷基-胺，诸如叠氮基-聚乙二醇(PEG)-胺，例如O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)四乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)五乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)三乙二醇等)反应，或在微生物转谷氨酰胺酶的存在下反应，从而获得修饰的抗体或其抗原结合片段。

如本文所用，术语“核酸适体”是指可以高亲和力特异性地结合其靶的单链寡核苷酸(单链DNA或RNA分子)。核酸适体可用作靶向各种有机和无机材料的分子。

如本文所用，术语“小分子配体”是指低分子量有机化合物。如本文所用，小分子配体可指具有小于约1000道尔顿的尺寸的化合物，并且可在实验室中合成或天然存在。

如本文所用，术语“点击反应配偶体”或“点击化学柄”是指可参与点击化学反应的反应物或反应性基团。点击反应配偶体可为很少存在于天然存在的生物分子中并且对生物分子呈化学惰性的部分，但是，例如当与叠氮化物反应性或炔烃反应性基团反应时，该反应可在生物相关条件下，例如在细胞培养条件下，诸如在不存在过量的热或苛刻的反应物的情况下有效地发生。一般来讲，点击化学反应需要至少两个包含可彼此反应的点击反应配偶体的分子。彼此反应的此类点击反应配偶体有时在本文中称为点击化学柄对或点击化学对。在一些实施方案中，点击反应配偶体是叠氮化物和应变炔烃，例如环辛炔或任何其他炔烃。在其他实施方案中，点击反应配偶体是反应性二烯和合适的四嗪亲双烯体。例如，反式环辛烯、降冰片烯或双环壬烯可与合适的四嗪亲双烯体配对作为点击反应对。在其他实施方案中，四唑可充当腈亚胺的潜在来源，其可在紫外光的存在下与未活化的烯烃配对以产生点击反应对，称为“光点击”反应对。在其他实施方案中，点击反应配偶体是半胱氨酸和马来酰亚胺。例如，来自肽(例如，GGGC)的半胱氨酸可与和螯合剂(例如，NOTA)缔合的马来酰亚胺反应。其他合适的点击化学柄是本领域技术人员已知的(参见，例如，Spicer等人，Selective chemical protein modification.Nature Communications.2014；5：第4740页)。在其他实施方案中，点击反应配偶体是施陶丁格连接(Staudinger ligation)组分，诸如膦和叠氮化物。在其他实施方案中，点击反应配偶体是狄尔斯-阿尔德反应组分，诸如二烯，诸如四嗪，以及烯烃，诸如反式环辛烯(TCO)或降冰片烯。示例性点击反应配偶体描述于US20130266512和WO2015073746中，两者中对于点击反应配偶体的相关描述均以引用方式并入本文。根据优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含炔烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含叠氮化物。根据其他优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含二烯。

如本文所用，术语“炔烃”、“炔烃基团”或“炔烃部分”是指包含碳-碳三键的官能团。炔烃部分包括末端炔烃和环状炔烃，优选地与叠氮基团反应的末端炔烃和环状炔烃。末端炔烃具有至少一个结合到三键碳原子的氢原子。环状炔烃是包含一个或多个三键的环烷基环。环状炔烃的示例包括但不限于环辛炔和环辛炔衍生物，诸如双环壬炔(BCN)、二氟化环辛炔(DIFO)、二苯并环辛炔(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛酮(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔(DIBAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、二苄基环辛炔(DBCO)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)、单苯并环辛炔(MOBO)和四甲氧基DIBO(TMDIBO)。根据优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含环状炔烃，优选地DBCO。根据优选的实施方案，另一个点击反应配偶体包含叠氮化物，优选地NHS-叠氮化物。

如本文所用，术语“二烯”是指具有两个碳-碳双键的化合物，其中这些双键在1，3-位置共轭。二烯的双键可为顺式或反式的。二烯的示例包括但不限于四嗪或四唑基团。

如本文所用，术语“烯烃”、“烯烃基团”或“烯烃部分”是指包含碳-碳双键的不饱和烃分子。根据特定实施方案，烯烃可包含2至100个碳原子。烯烃的示例包括但不限于降冰片烯和反式环辛烯(TCO)。根据其他优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，优选地降冰片烯或TCO。根据优选的实施方案，另一个点击反应配偶体包含二烯，优选地四嗪或四唑基团。

如本文所用，术语“共价连接”意指多肽经由至少一个共价键联附接到第一点击反应配偶体，并且螯合剂经由至少一个共价键联附接到第二点击反应配偶体。键联可为直接的，即没有连接基，或间接的，即经由连接基。

如本文所用，术语“连接基”是指将多肽或螯合剂连接到点击反应配偶体的化学部分。根据本公开，本领域技术人员已知的任何合适的连接基可用于本发明中。连接基可为例如单个共价键、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基部分、聚乙二醇(PEG)连接基、肽连接基、基于糖的连接基或可裂解的连接基，诸如二硫键联或蛋白酶裂解位点，诸如缬氨酸-瓜氨酸-PAB。

如本文所用，术语“放射性金属离子(radiometal ion)”或“放射性金属离子(radioactive metal ion)”是指发射粒子和/或光子的元素的一种或多种同位素。根据本公开，本领域技术人员已知的任何放射性金属可用于本发明中。适用于本发明中的放射性金属的示例包括但不限于³²P、⁴⁷Sc、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁷As、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹¹¹In、¹¹⁷Sn、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、²²⁷Th和²⁵⁵Fm。如本文所用，术语“诊断发射体”是指可用于诊断或成像应用中的放射性金属离子。诊断发射体的示例包括但不限于γ发射体，诸如⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr和¹¹¹In。如本文所用，术语“治疗发射体”是指可用于治疗应用中的放射性金属离子。治疗发射体的示例包括但不限于β或α发射体，诸如钍、镭、³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、²⁵⁵Fm和²²⁷Th。根据优选的实施方案，放射性金属离子为²²⁵Ac。根据其他实施方案，多肽可用非金属放射性标记物进行标记以用于预靶向或诊疗应用中。适用于本发明中的非金属放射性标记物的示例包括但不限于¹²⁵I和¹⁸F。

本文所述的放射性复合物包含与螯合部分缔合的放射性金属离子。根据本发明的实施方案，螯合部分包含共价连接到点击反应配偶体的螯合剂，并且有时在本文中称为“双官能螯合剂”。

如本文所用，术语“螯合剂(chelant)'’或“螯合剂(chelator)”是指放射性金属(诸如²²⁵Ac)或金属可经由配位结合与其螯合的化合物。根据本公开，本领域技术人员已知的任何螯合剂可用于本发明中。在一个实施方案中，螯合剂包含大环。适用于本发明中的包含大环的螯合剂的示例包括但不限于去铁胺(DFO)、乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA)。在另一个实施方案中，螯合剂包含开链配体。适用于本发明中的包含开链配体的螯合剂的示例包括但不限于1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10，13，16-六氮杂环十六烷-N，N′，N″，N″′，N″″，N″″′-六乙酸(HEHA)、1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷-N，N′，N″，N″′，N″″-五乙酸(PEPA)、Macropa(Thiele等人，An Eighteen-Membered Macrocyclic Ligand for Actinium-225 Targeted Alpha Therapy.AngewChem Int Ed Engl.2017年11月13日；56(46、)：第14712-14717页)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四丙酸(DOTPA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四丙酸(TETPA)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四亚甲基膦酸(DOTMP)。根据优选的实施方案，螯合剂包含式(I)的结构：

其中R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基；并且

Z为(CH2)_nY，其中

n为1-10，并且

Y为共价连接到第二点击反应配偶体的亲电或亲核部分；

另选地，Z为氢；并且

R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基或者共价连接到第二点击反应配偶体的亲电或亲核部分。

根据优选的实施方案，螯合部分包含式(II)的结构：

根据优选的实施方案，螯合部分包含式(III)的结构：

在一个实施方案中，本发明涉及一种使用本发明的方法用两种或更多种放射性金属离子标记多肽的方法。例如，用两种放射性金属离子双重标记多肽的方法包括：

a.提供修饰的多肽，该修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体的多肽；

b.提供第一放射性复合物，该第一放射性复合物包含与螯合部分缔合的第一放射性金属离子，其中螯合部分包含共价连接到第三点击反应配偶体的螯合剂；以及

c.提供第二放射性复合物，该第二放射性复合物包含与螯合部分缔合的第二放射性金属离子，其中螯合部分包含共价连接到第四点击反应配偶体的螯合剂；以及

d.使修饰的多肽与第一放射性复合物和第二放射性复合物在允许第一点击反应配偶体与第三点击反应配偶体反应并且允许第二点击反应配偶体与第四点击反应配偶体反应的条件下接触，从而用第一放射性金属离子和第二放射性金属离子标记多肽。

根据优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含炔烃基团，并且第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的另一个包含叠氮化物，并且其中第三点击反应配偶体和第四点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，并且第三点击反应配偶体和第四点击反应配偶体中的另一个包含二烯。

根据优选的实施方案，第一放射性金属离子或第二放射性金属离子为诊断发射体，并且另一个为治疗发射体。根据其他优选的实施方案，第一放射性金属离子和第二放射性金属离子两者为治疗发射体。

用于进行点击化学反应的条件是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的用于进行点击化学反应的任何条件可用于本发明中。条件的示例包括但不限于在4至10的pH和20℃至70℃的温度下以1∶1至1000∶1的比率温育修饰的多肽和放射性复合物。

根据本公开，可使用本领域技术人员已知的方法分析本发明的点击放射性标记方法的产物。例如，LC/MS分析可用于测定螯合剂与标记的多肽的比率；分析性尺寸排阻色谱法可用于测定多肽和多肽缀合物的低聚状态；放射性化学收率可通过瞬时薄层色谱法(例如iTLC-SG)测定，并且放射性化学纯度可通过尺寸排阻HPLC测定。示例性方法在本文中描述于例如以下实施例中。

药物组合物和治疗方法

可将本发明的点击放射性标记方法修改为预靶向方法(Kraeber-Bodere，F.等人，A pretargeting system for tumor PET imaging and radioimmunotherapy.FrontPharmacol，2015.6：第54页)。首先，给予叠氮基-mAb，使其与靶细胞结合，并允许其随时间推移从循环中清除，或用清除剂去除。随后，施用放射性复合物并使其经历与在靶位点处结合的叠氮基-mAb进行的SPAAC反应，而剩余的未结合的放射性复合物快速从循环中清除(Deal，K.A.等人，Improved in vivo stability of actinium-225 macrocycliccomplexes.J Med Chem，1999.42(15)：第2988-92页)。该预靶向技术提供了一种增强受治疗者中靶位点处的放射性金属离子定位的方法。

因此，在另一个总体方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体以及通过本发明的方法制备的放射性标记的多肽。

如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于药物制剂中的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据特定实施方案，适用于基于抗体或基于放射性复合物的药物组合物中的任何药学上可接受的载体均可用于本发明中。

根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受治疗者的预期途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适于静脉内、皮下、肌内或瘤内施用。

根据特定实施方案，修饰的多肽和放射性复合物可以相同或不同的组成施用。

在另一个总体方面，本发明涉及一种在对其有需要的受治疗者中治疗肿瘤性疾病或障碍的方法，该方法包括向受治疗者施用本发明的药物组合物。

根据特定实施方案，本发明的方法包括施用治疗有效剂量的本发明的药物组合物，其中组合物包含用于靶向与肿瘤性疾病或障碍相关的细胞的放射性标记的多肽，使得在靶向时，来自²²⁵Ac及其子代的α粒子被递送到靶向细胞并对其产生细胞毒性效应，从而治疗肿瘤性疾病或障碍。

根据特定实施方案，以不同的组成施用治疗有效量的修饰的多肽和放射性复合物。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受治疗者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验并以常规方式进行确定。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。基于若干因素的考虑，包括要治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及技术人员已知的其他因素，本领域的技术人员可确定具体有效剂量的选择(例如，经由临床试验)。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。

如本文所用，术语“处理”和“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)均旨在是指与其中放射性金属离子的施用将会有益的疾病、障碍或病症，诸如肿瘤性疾病或障碍有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是在受治疗者中可识别的，但可能是在受治疗者中可识别的。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻与其中放射性金属离子的施用将会有益的疾病、障碍或病症，诸如肿瘤性疾病或障碍相关的一种或多种症状，预防该一种或多种症状的发展或发作，或者缩短该一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受治疗者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受治疗者中疾病、障碍或病症的消除。

肿瘤性疾病或障碍的示例包括但不限于播散性癌症，实体肿瘤癌，肥大，冠状动脉疾病或血管闭塞性疾病，与受感染细胞、微生物或病毒相关的疾病或障碍，或者与炎性细胞相关的疾病或障碍，诸如类风湿性关节炎(RA)。

如本文所用，术语“受治疗者”是指动物，并且优选地指哺乳动物。根据特定实施方案，受治疗者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠、绒猴或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受治疗者是人。

根据本公开，可使用修饰的多肽和放射性复合物的任何给药计划表。一般来讲，当以不同的组成施用修饰的多肽和放射性复合物时，可在施用修饰的抗体后的任何时间施用放射性复合物。

根据特定实施方案，用于治疗肿瘤性疾病或障碍的组合物可与有效治疗相关肿瘤性疾病或障碍的其他药剂联合使用。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受治疗者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受治疗者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受治疗者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

在另一个总体方面，本发明涉及一种诊疗剂，该诊疗剂包含药学上可接受的载体以及通过本发明的方法制备的放射性标记的抗体，其中保留了放射性标记的抗体的免疫学特性。

如本文所用，术语“诊疗”是指提供诊断功能和治疗功能中的任一种的能力。在一个实施方案中，诊疗剂提供诊断功能和治疗功能两者。在另一个实施方案中，诊疗剂是无诊断功能的活性药剂。在另一个实施方案中，诊疗剂是可用于诊断但不具有治疗功能的药剂。

根据优选的实施方案，放射性金属离子为诊断发射体，优选地⁸⁹Zr。根据其他优选的实施方案，放射性金属离子为治疗发射体，优选地²²⁵Ac。根据优选的实施方案，诊疗剂用于向对其有需要的受治疗者提供诊断功能和治疗功能两者。

组合和试剂盒

本文提供了一种组合，该组合包括：

a.修饰的多肽，该修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；以及

b.放射性复合物，该放射性复合物包含与螯合部分缔合的放射性金属离子，其中螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；

其中组合将用于用放射性金属离子标记多肽。

根据特定实施方案，本发明的组合是用于用放射性金属离子标记多肽的反应混合物。根据其他实施方案，组合是用于在体外或体内产生放射性标记的多肽的包装或试剂盒。该组合可以任选地随附呈管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府部门规定的形式的通知或说明书，该通知或说明书反映了管理部门批准用于人类施用的制造、使用或销售。本文所涵盖的组合可用于用放射性金属离子标记多肽或者在对其有需要的受治疗者中治疗肿瘤性疾病或障碍的上述方法中。

实施方案

本发明还提供了以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种用放射性金属离子标记多肽的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；

b.提供放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的所述放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；以及

c.使所述修饰的多肽与所述放射性复合物在允许所述第一点击反应配偶体与所述第二点击反应配偶体反应的条件下接触，从而用所述放射性金属离子标记所述多肽。

实施方案1a是根据实施方案1所述的方法，其中所述螯合剂包含大环。

实施方案1b是根据实施方案1所述的方法，其中所述螯合剂包含开链配体。

实施方案2是根据实施方案1所述的方法，其中所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的一个包含炔烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含叠氮化物。

实施方案3是根据实施方案2所述的方法，其中所述第一点击反应配偶体包含叠氮基团，并且所述第二点击反应配偶体包含炔烃基团。

实施方案3a是根据实施方案2或3所述的方法，其中所述炔烃基团包括末端炔烃。

实施方案3b是根据实施方案2或3所述的方法，其中所述炔烃基团包括环状炔烃，优选地环辛炔或环辛炔衍生物。

实施方案3c是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括双环壬炔(BCN)。

实施方案3d是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括二氟化环辛炔(DIFO)。

实施方案3e是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括二苯并环辛炔(DIBO)。

实施方案3f是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括二芳基氮杂环辛酮(BARAC)。

实施方案3g是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括二苯并氮杂环辛炔(DIBAC)。

实施方案3h是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)。

实施方案3i是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括二苄基环辛炔(DBCO)。

实施方案3j是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括二氟苯并环辛炔(DIFBO)。

实施方案3k是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括单苯并环辛炔(MOBO)。

实施方案31是根据实施方案3b所述的方法，其中所述炔烃基团包括四甲氧基DIBO(TMDIBO)。

实施方案3m是根据实施方案2至31中任一项所述的方法，其中所述叠氮基团包括NHS-叠氮化物。

实施方案4是根据实施方案1所述的方法，其中所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含二烯。

实施方案4a是根据实施方案4所述的方法，其中所述二烯包含四嗪或四唑基团。

实施方案4b是根据实施方案4或4a所述的方法，其中所述烯烃基团包括降冰片烯。

实施方案4c是根据实施方案4或4a所述的方法，其中所述烯烃基团包括反式环辛烯(TCO)。

实施方案5是根据实施方案1至4c中任一项所述的方法，其中所述多肽为抗体或其抗原结合片段。

实施方案6是根据实施方案5所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段。

实施方案6a是根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽通过将一个或多个叠氮基团随机缀合到所述多肽来获得。

实施方案6b是根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽为通过位点特异性掺入所述第一点击反应配偶体来获得的修饰的抗体或其抗原结合片段。

实施方案6c是根据实施方案6b所述的方法，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过用对所述抗体的一个或多个Fc糖基化位点中的一个或多个核心GlcNac残基之间的β-1，4键联具有特异性的细菌内切糖苷酶修剪所述抗体或其抗原结合片段，以获得修剪的抗体或其抗原结合片段，以及在糖转移酶，优选地GalT半乳糖基转移酶的存在下使所述修剪的抗体或其抗原结合片段与叠氮糖，优选地UDP-GalNaz叠氮基糖底物反应来获得。

实施方案6d是根据实施方案6b所述的方法，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过用酰胺酶使所述抗体或其抗原结合片段去糖基化，以获得去糖基化的抗体或其抗原结合片段，以及在微生物转谷氨酰胺酶的存在下使所述去糖基化的抗体或其抗原结合片段与叠氮基胺，优选地3-叠氮基丙胺反应来获得。

实施方案6e是根据实施方案6至6d中任一项所述的方法，其中所述抗体为结合人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体或其抗原结合片段，优选地所述抗体包含SEQ ID NO：3的HC CDR1序列、SEQ ID NO：4的HC CDR2序列、SEQ ID NO：5的HC CDR3序列、SEQ ID NO：6的轻链(LC)CDR1序列、SEQ ID NO：7的LC CDR2序列和SEQ ID NO：8的LC CDR3序列。

实施方案6f是根据实施方案6e所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的HC序列和SEQ ID NO：10的LC序列。

实施方案7是根据实施方案1至6d中任一项所述的方法，其中所述放射性金属离子为³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、²⁵⁵Fm、²²⁷Th、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr或¹¹¹In。

实施方案7a是根据实施方案1至6d中任一项所述的方法，其中所述放射性金属离子为²²⁵Ac。

实施方案7b是根据实施方案1至6d中任一项所述的方法，其中所述放射性金属离子为¹¹¹In。

实施方案7c是根据实施方案1至6d中任一项所述的方法，其中所述放射性金属离子为⁸⁹Zr。

实施方案8是根据实施方案1至7c中任一项所述的方法，其中所述螯合部分经由连接基共价连接到所述第二点击反应配偶体。

实施方案9是根据实施方案1至8中任一项所述的方法，还包括使位于所述多肽上或引入到所述多肽的侧链，优选地赖氨酸的氨基侧链上的亲电体与共价连接到所述第一点击反应配偶体的巯基基团反应，以获得所述修饰的多肽，优选地NHS-叠氮化物。

实施方案10是根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽包括直接或经由连接基共价连接到叠氮、四嗪或四唑基团的多肽。

实施方案11是根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述螯合剂包含大环，优选地式(I)的结构：

其中R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基；并且

Z为(CH2)_nY，其中

n为1-10，并且

Y为共价连接到所述第二点击反应配偶体的亲电或亲核部分；

另选地，Z为氢；并且

R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基或者共价连接到所述第二点击反应配偶体的亲电或亲核部分。

实施方案12是根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述螯合部分包含式(II)的结构：

实施方案12a是根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述螯合部分包含具有开链配体的螯合剂，优选地具有式(III)的结构的螯合部分：

实施方案12b是根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述螯合部分包含选自由以下项组成的组的螯合剂：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、去铁胺(DFO)、1，4，7，10，13，16-六氮杂环十六烷-N，N′，N″，N″′，N″″，N″″′-六乙酸(HEHA)、1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷-N，N′，N″，N″′，N″″-五乙酸(PEPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、Macropa(Thiele等人，An Eighteen-MemberedMacrocyclic Ligand for Actinium-225 Targeted Alpha Therapy.Angew Chem Int EdEngl.2017年11月13日；56(46)：第14712-14717页)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四丙酸(DOTPA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四丙酸(TETPA)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四亚甲基膦酸(DOTMP)。

实施方案12c是根据实施方案12b所述的方法，其中所述螯合剂包括1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)。

实施方案12d是根据实施方案12b所述的方法，其中所述螯合剂包括去铁胺(DFO)。

实施方案13是一种用放射性金属离子，优选地²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr标记多肽，优选地抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，优选地修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段包含共价连接到叠氮、四嗪或四唑基团的多肽或抗体或其抗原结合片段；

b.提供放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的所述放射性金属离子，优选地²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr，其中所述螯合部分包含共价连接到炔烃或烯烃基团的螯合剂；以及

c.使所述修饰的多肽或抗体或其抗原结合片段与所述放射性复合物在允许所述叠氮、四嗪或四唑基团与所述炔烃或所述烯烃基团反应的条件下接触，从而用所述放射性金属离子，优选地²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr标记所述多肽或抗体或其抗原结合片段，其中所述螯合剂包含式(I)的结构：

其中R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基；并且

Z为(CH2)_nY，其中

n为1-10，并且

Y为共价连接到所述炔烃基团的亲电或亲核部分；

另选地，Z为氢；并且

R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基或者共价连接到所述炔烃基团的亲电或亲核部分。

实施方案13a是根据实施方案13所述的方法，其中所述螯合剂包括1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)。

实施方案13b是根据实施方案13所述的方法，其中所述螯合部分包含式(II)的结构：

实施方案13d是一种用放射性金属离子，优选地²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr标记多肽，优选地抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，优选地修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段包含共价连接到叠氮、四嗪或四唑基团的多肽或抗体或其抗原结合片段；

b.提供放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的所述放射性金属离子，优选地²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr，其中所述螯合部分包含共价连接到炔烃或烯烃基团的螯合剂；以及

c.使所述修饰的多肽或抗体或其抗原结合片段与所述放射性复合物在允许所述叠氮、四嗪或四唑基团与所述炔烃或所述烯烃基团反应的条件下接触，从而用所述放射性金属离子，优选地225Ac、111In或89Zr标记所述多肽或抗体或其抗原结合片段，

其中所述螯合剂包含开链配体，优选地去铁胺(DFO)。

实施方案14是根据实施方案13至13c中任一项所述的方法，其中所述螯合剂经由连接基共价连接到所述炔烃或烯烃基团。

实施方案15是根据实施方案13至14中任一项所述的方法，还包括使位于所述多肽，优选地所述抗体或其抗原结合片段上或引入到所述多肽的侧链，优选地赖氨酸的氨基侧链上的亲电体与共价连接到叠氮化物，优选地NHS-叠氮化物的巯基基团反应，以获得所述修饰的多肽或抗体或其抗原结合片段。

实施方案16是根据实施方案13至15中任一项所述的方法，其中所述多肽，优选地抗体或其抗原结合片段经由连接基共价连接到所述叠氮化物。

实施方案17是根据实施方案13所述的方法，其中所述多肽为抗体或其抗原结合片段，所述放射性金属离子为²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr，并且所述螯合部分包含式(II)的结构：

实施方案17a是根据实施方案13c所述的方法，其中所述多肽为抗体或其抗原结合片段，所述放射性金属离子为²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr，并且所述螯合部分包含式(III)的结构：

实施方案17b是根据实施方案13至17a中任一项所述的方法，其中所述多肽为结合人前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗原结合片段的抗体，优选地所述抗体包含SEQ ID NO：3的HC CDR1序列、SEQ ID NO：4的HC CDR2序列、SEQ ID NO：5的HC CDR3序列、SEQ ID NO：6的轻链(LC)CDR1序列、SEQ ID NO：7的LC CDR2序列和SEQ ID NO：8的LC CDR3序列。

实施方案17c是根据实施方案17b所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的HC序列和SEQ ID NO：10的LC序列。

实施方案18是一种用两种放射性金属离子双重标记多肽的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体的多肽；

b.提供第一放射性复合物，所述第一放射性复合物包含与螯合部分缔合的第一放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第三点击反应配偶体的螯合剂；以及

c.提供第二放射性复合物，所述第二放射性复合物包含与螯合部分缔合的第二放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第四点击反应配偶体的螯合剂；以及

d.使所述修饰的多肽与所述第一放射性复合物和所述第二放射性复合物在允许所述第一点击反应配偶体与所述第三点击反应配偶体反应并且允许所述第二点击反应配偶体与所述第四点击反应配偶体反应的条件下接触，从而用所述第一放射性金属离子和所述第二放射性金属离子标记所述多肽。

实施方案19是根据实施方案18所述的方法，其中所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的一个包含炔烃基团，并且所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的另一个包含叠氮化物，并且其中所述第三点击反应配偶体和所述第四点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，并且所述第三点击反应配偶体和所述第四点击反应配偶体中的另一个包含二烯。

实施方案20是根据实施方案18或19所述的方法，其中所述第一放射性金属离子或所述第二放射性金属离子为诊断发射体，并且另一个为治疗发射体。

实施方案21是根据实施方案18或19所述的方法，其中所述第一放射性金属离子和所述第二放射性金属离子两者为治疗发射体。

实施方案21a是根据实施方案20或21所述的方法，其中所述诊断发射体为⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr或¹¹¹In。

实施方案21b是根据实施方案20至21a中任一项所述的方法，其中所述治疗发射体为³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、²⁵⁵Fm或²²⁷Th。

实施方案22是一种药物组合物，包含药学上可接受的载体以及通过根据实施方案1至21b中任一项所述的方法制备的放射性标记的多肽。

实施方案23是一种在对其有需要的受治疗者中治疗或诊断疾病或障碍，特别是肿瘤性疾病或障碍的方法，包括向所述受治疗者施用根据实施方案22所述的药物组合物。

实施方案24是根据实施方案23所述的方法，其中所述药物组合物包括待依次施用的两种组合物，第一组合物包含所述修饰的多肽，并且第二组合物包含一种或多种放射性复合物。

实施方案25是一种诊疗剂，包含药学上可接受的载体以及通过根据实施方案1至21b中任一项所述的方法制备的放射性标记的抗体，其中保留了所述放射性标记的抗体的免疫学特性。

实施方案26是根据实施方案25所述的诊疗剂，其中所述放射性金属离子为诊断发射体，优选地⁸⁹Zr。

实施方案27是根据实施方案25所述的诊疗剂，其中所述放射性金属离子为治疗发射体，优选地²²⁵Ac。

实施方案27a是根据实施方案25所述的诊疗剂，其中所述放射性金属离子为111In。

实施方案27b是根据实施方案25至27a中任一项所述的诊疗剂，其中所述多肽为结合人前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗原结合片段的抗体，优选地所述抗体包含SEQ IDNO：3的HC CDR1序列、SEQ ID NO：4的HC CDR2序列、SEQ ID NO：5的HC CDR3序列、SEQ IDNO：6的轻链(LC)CDR1序列、SEQ ID NO：7的LC CDR2序列和SEQ ID NO：8的LC CDR3序列。

实施方案27c是根据实施方案27b所述的诊疗剂，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的HC序列和SEQ ID NO：10的LC序列。

实施方案27d是根据实施方案25至27c中任一项所述的诊疗剂，其中所述放射性标记的抗体具有式(IV)的式：

式(IV)(DOTA-Ac-DBCO-蛋白质)，另选地，所述²²⁵Ac被另一种放射性金属离子取代，所述另一种放射性金属离子诸如³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²⁵⁵Fm、²²⁷Th、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr或¹¹¹In。

实施方案27e是根据实施方案25至27c中任一项所述的诊疗剂，其中所述放射性标记的抗体具有式(V)的式：

式(V)(DOTA-In-DBCO-蛋白质)。

实施方案27f是根据实施方案25至27c中任一项所述的诊疗剂，其中所述放射性标记的抗体具有式(VI)的式：

式(VI)(DFO-Zr-DBCO-蛋白质)，另选地，所述⁸⁹Zr被另一种放射性金属离子取代，所述另一种放射性金属离子诸如³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、²⁵⁵Fm、²²⁷Th、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y或¹¹¹In。

实施方案27g是根据实施方案25至27c中任一项所述的诊疗剂，其中所述放射性标记的抗体具有式(VII)的式：

式(VII)(DOTA-Zr-DBCO-蛋白质)。

实施方案27h是根据实施方案25至27g中任一项所述的诊疗剂，其中所述放射性标记的抗体具有小于3的螯合剂：抗体比率(CAR)。

实施方案27i是根据实施方案25至27h中任一项所述的诊疗剂，其中所述放射性标记的抗体具有2的螯合剂：抗体比率(CAR)。

实施方案28是一种组合，优选地试剂盒，包括：

a.修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；以及

b.放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；

其中所述组合将用于用所述放射性金属离子标记所述多肽。

实施方案28a是根据实施方案28所述的组合或试剂盒，其中所述螯合剂包含大环。

实施方案28b是根据实施方案28所述的组合或试剂盒，其中所述螯合剂包含开链配体。

实施方案29是根据实施方案28所述的组合或试剂盒，所述组合或试剂盒将用于经由所述第一点击反应配偶体与所述第二点击反应配偶体之间的体外反应用所述放射性金属离子标记所述多肽。

实施方案30是根据实施方案28所述的组合或试剂盒，所述组合或试剂盒将用于经由所述第一点击反应配偶体与所述第二点击反应配偶体之间的体内反应用所述放射性金属离子标记所述多肽。

实施方案31是一种组合物，所述组合物包含修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽。

实施方案32是一种组合物，所述组合物包含放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂。

实施方案32a是根据实施方案32所述的组合物，其中所述螯合剂包含大环。

实施方案32b是根据实施方案32所述的组合物，其中所述螯合剂包含开链配体。

实施方案33是根据实施方案28至30中任一项所述的组合或试剂盒或者根据实施方案31或32所述的组合物，其中所述多肽为抗体或其抗原结合片段。

实施方案33a是根据实施方案33所述的组合或试剂盒或组合物，其中所述抗体能够结合人前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其抗原结合片段，优选地所述抗体包含SEQ ID NO：3的HC CDR1序列、SEQ ID NO：4的HC CDR2序列、SEQ ID NO：5的HC CDR3序列、SEQ ID NO：6的轻链(LC)CDR1序列、SEQ ID NO：7的LC CDR2序列和SEQ ID NO：8的LC CDR3序列。

实施方案33b是根据实施方案33a所述的组合或试剂盒或组合物，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的HC序列和SEQ ID NO：10的LC序列。

实施方案33c是根据实施方案33a或33b所述的组合或试剂盒或组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段共价连接到叠氮基团。

实施方案33d是根据实施方案33c所述的组合或试剂盒或组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段随机地共价连接到所述叠氮基团。

实施方案33e是根据实施方案33c所述的组合或试剂盒或组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地共价连接到叠氮基团位点。

实施方案33f是根据实施方案33e所述的组合或试剂盒或组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段经由这样的方法共价连接到所述叠氮基团，所述方法包括：用对所述抗体的一个或多个Fc糖基化位点中的一个或多个核心GlcNac残基之间的β-1，4键联具有特异性的细菌内切糖苷酶修剪所述抗体或其抗原结合片段，以获得修剪的抗体或其抗原结合片段，以及在糖转移酶，优选地GalT半乳糖基转移酶的存在下使所述修剪的抗体或其抗原结合片段与叠氮糖，优选地UDP-GalNaz叠氮基糖底物反应。

实施方案33g是根据实施方案33e所述的组合或试剂盒或组合物，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过这样的方法来获得，所述方法包括：用酰胺酶使所述抗体或其抗原结合片段去糖基化，以获得去糖基化的抗体或其抗原结合片段，以及在微生物转谷氨酰胺酶的存在下使所述去糖基化的抗体或其抗原结合片段与叠氮基胺，优选地3-叠氮基丙胺反应。

实施方案34是根据实施方案33至33g中任一项所述的组合、试剂盒或组合物，其中所述放射性金属离子包括²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr。

实施方案35是根据实施方案34所述的组合、试剂盒或组合物，其中所述螯合剂包含大环，优选地式(I)的结构：

其中R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基；并且

Z为(CH2)_nY，其中

n为1-10，并且

Y为共价连接到所述炔烃基团的亲电或亲核部分；

另选地，Z为氢；并且

R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基或者共价连接到所述炔烃基团的亲电或亲核部分。

实施方案36是根据实施方案35所述的组合、试剂盒或组合物，其中所述亲电或亲核部分经由连接基共价连接到所述炔烃基团。

实施方案37是根据实施方案35或36所述的组合、试剂盒或组合物，其中所述螯合部分包含式(II)的结构：

实施方案37a是根据实施方案34所述的组合、试剂盒或组合物，其中所述螯合部分包含具有开链配体的螯合剂，优选地所述螯合部分包含式(III)的结构：

实施方案38是根据实施方案34至37中任一项所述的组合、试剂盒或组合物，其中所述多肽经由连接基共价连接到叠氮化物。

实施方案39是一种在对其有需要的受治疗者中治疗或诊断疾病或障碍，特别是肿瘤性疾病或障碍的方法，包括向所述受治疗者施用根据实施方案25至27d中任一项所述的诊疗剂或根据实施方案28以及33至38中任一项所述的组合。

实施方案40是一种在对其有需要的受治疗者中治疗或诊断疾病或障碍，特别是肿瘤性疾病或障碍的方法，包括向所述受治疗者施用根据实施方案31所述的组合物和根据实施方案32所述的组合物，优选地所述多肽为抗体。

实施例

本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。

实施例1：叠氮化物/柄与抗体的随机缀合

单克隆抗体(mAb)：结合人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人IgG4抗体在本文中称为“抗PSMA mAb'’，命名为“PSMB127'’，具有SEQ ID NO：3的重链(HC)CDR1序列、SEQ ID NO：4的HC CDR2序列、SEQ ID NO：5的HC CDR3序列、SEQ ID NO：6的轻链(LC)CDR1序列、SEQ IDNO：7的LC CDR2序列和SEQ ID NO：8的LC CDR3序列，并且具有SEQ ID NO：9的HC序列和SEQID NO：10的LC序列。使用标准色谱方法表达并纯化抗PSMA mAb。

抗PMSA mAb(在本文中称为“对照mAb”)的人IgG4 S228P/F234A/L235A(IgG4-PAA)抗体同种型对照具有SEQ ID NO：1的HC序列和SEQ ID NO：2的LC序列。商业抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin))、西妥昔单抗(cetuximab)(爱必妥(Erbitux))、帕妥珠单抗(pertuzumab)(Perjeta)和帕尼单抗(panitumumab)(维克替比(Vectibix))分别购自Roche、Lilly、Roche和Amgen。小鼠抗人Her2 mAb获自BioXCell(目录号BE0277)。曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和抗人Her2 mAb与人Her2结合。西妥昔单抗和帕尼单抗与人EGFR结合。

缀合：将抗体(1mg/mL-10mg/mL)在10mM乙酸钠pH 5.2、磷酸盐缓冲盐水pH 7或其他相容缓冲液中的储备溶液与20％(v/v)的1M碳酸钠缓冲液pH 9混合至约9的最终pH。将NHS-PEG4-叠氮化物(Thermo目录号26130)溶解于DMSO中至最终浓度为100mM，并且添加0.2％(v/v)的储备液以产生相对于mAb约3-10的摩尔过量。将反应物在22℃下温育10分钟，之后通过添加1M Tris pH 7.5淬灭至最终浓度为50mM Tris。

纯化：使用这样的方法将叠氮化物-mAb缀合物纯化并交换到相容缓冲液(PBS；20mM HEPES 150mM，NaCl pH 7.5；或10mM乙酸钠pH 5.2)，该方法诸如具有7K截留分子量(Thermo)的Zeba脱盐柱，透析；标准蛋白质A亲和色谱法；或另一种相容的方法。在纯化后，使用具有50K截留分子量的Amicon浓缩器(Millipore)将缀合物浓缩至10mg/mL-20mg/mL。

LC/MS分析：通过LC/MS分析使用Agilent G6224 MS-TOF仪器测定螯合剂：抗体比率(CAR)，该仪器配备有Agilent PLRP-S柱(300埃，2.1mmx150mm；目录号PL1912-3301)(表1)。对于质量140kDa-170kDa，使用最大熵算法在m/z范围2000-3200内，使质谱解卷积。

分析性尺寸排阻色谱法(SEC)：进行分析性SEC以确定抗体和抗体缀合物的低聚状态，并确保缀合过程未导致聚集。使用配备有Tosoh TSKgel G3000SWxl(TosohBioscience#08541)7.8mm×30cm柱的Agilent 1200系列HPLC；流动相1X PBS；流速0.8ml/ml；注入体积15μL；蛋白质浓度0.1mg/mL-2mg/mL。

表1：缀合效率

抗体	同种型	CAR
			抗PSMA mAb	人IgG4	2.4
对照mAb	人IgG4	2.0
			曲妥珠单抗	人源化IgG1	2.5
西妥昔单抗	嵌合人/小鼠IgG1	3.6
			帕妥珠单抗	人源化IgG1	2.3
帕尼单抗	人IgG2	3.0
			抗人Her2	小鼠IgG2a	3.1

实施例2：叠氮化物/柄与非抗体多肽的随机缀合

非抗体多肽：转铁蛋白(人全铁转铁蛋白)购自R&D Systems(目录号2914-HT)并溶解于水中至10mg/mL。EGF(人表皮生长因子(EGF))购自Sino Biological(目录号10605-HNAE)。

缀合：将多肽(1mg/mL-10mg/mL)在10mM乙酸钠pH 5.2、磷酸盐缓冲盐水pH 7或其他相容缓冲液中的储备溶液与20％(v/v)的1M碳酸钠缓冲液pH 9混合至约9的最终pH。将NHS-PEG4-叠氮化物(Thermo目录号26130)溶解于DMSO中至最终浓度为100mM，并且添加0.2％(v/v)的储备液以产生相对于蛋白质约3-10的摩尔过量。将反应物在22℃下温育10分钟，之后用1M Tris pH 7.5淬火至最终浓度为50mM。缀合效率示于表2中。

表2：缀合效率

蛋白质	螯合剂：蛋白质比率
		转铁蛋白	3.6
EGF	1.1

实施例3：叠氮基糖到抗体聚糖中的位点特异性掺入

用对一个或多个Fc糖基化位点中的核心GlcNac残基之间的β-1，4键联具有特异性的细菌内切糖苷酶GlycINATOR(Genovis)修剪抗体聚糖，从而使最内的GlcNAc完整保留在Fc上，然后可将其用于位点特异性掺入叠氮基糖。更具体地，将填充到柱(Genovis)中的琼脂糖珠上的固定化GlycINATOR在Tris缓冲盐水(TBS)pH 7.4中进行平衡。将1mL的5mg/mL-10mg/mL mAb添加到树脂中，并在室温下在摇臂上温育1小时。通过以100x g旋转1分钟来洗脱mAb。用0.5mL TBS再洗脱柱3次。将含有修剪的mAb的洗脱液合并，并添加所提供的缓冲添加剂(Genovis)以及UDP-GalNaz叠氮基糖底物和GalT半乳糖基转移酶。将反应物在30℃下温育过夜。使用mAb Select柱(GE)在AKTA Avant仪器上纯化最终叠氮基mAb。通过LC-MS确认叠氮化物修饰，其中测定CAR恰好为2。

实施例4：使用微生物转谷氨酰胺酶(MTG)进行的3-叠氮基丙胺的位点特异性掺入

将叠氮基基团位点特异性地安装在抗体上的位置Gln295处，基本上如所述(Dennler等人，Transglutaminase-based chemo-enzymatic conjugation approachyields homogeneous antibody-drug conjugates.Bioconj Chem 2014年3月19日；25(3)：第569-78页)。用酰胺酶Rapid PNGase F(New England Biolabs)使抗PSMA mAb去糖基化，该酰胺酶在高甘露糖、杂交体和复合寡糖的最内GlcNAc与天冬酰胺残基之间裂解，并且允许所有N-聚糖(包括来自保守(例如，Fc Asn297)糖基化位点和非保守(例如，Fab N-聚糖)糖基化位点两者的N-聚糖)的完全去糖基化和释放。将10mL于乙酸钠缓冲液pH 5.2中的1mg/mL抗体与5μL的PNGase F在37℃下温育过夜，并通过LC-MS确认去糖基化。通过用Amicon装置(50kDa截留分子量)进行4个循环的浓缩和稀释来去除PNGase F。用于缀合3-叠氮基丙胺(3-APA；Click Chemistry Tools)，通过添加2％(v/v)的0.5M HEPES pH 7.5将去糖基化的mAb(0.5mg/mL-1mg/mL)调至pH 7-7.5。添加100当量的3-APA以及5％-10％w/v的一种MTG，即Activa TI转谷氨酰胺酶(Ajinomoto)。将反应物在37℃下温育1-4小时，之后使用标准色谱方法在mAbSelect Sure柱上纯化叠氮化物修饰的mAb。通过LC-MS表征缀合物，并且测定CAR为2。

实施例5：放射性金属与双功能螯合剂(BFC)的螯合

²²⁵Ac-DOTA-GA-DBCO的合成：²²⁵Ac(NO₃)₃购自Oak Ridge National Laboratory。定制合成1，4，7，10-四氮杂环十二烷，1-(戊二酸)-4，7，10-三乙酸-(3-氨基-丙酸)二苯并环辛炔(DOTA-GA-DBCO)。该合成基于Bernhard等人，Chem.Eur.J.2012，18，7834-7841。使DBCO-胺(3-氨基-1-[(5-氮杂-3，4：7，8-二苯并环辛-1-炔)-5-基]-1-丙酮，Sigma)与DOTA-GA酸酐反应，并且通过反相HPLC纯化产物。

使用Capintec CRC-55TW剂量校准器完成锕-225的定量，从而将²²⁵Ac(NO₃)3溶解于0.1N HCl中以制备10mCi/mL溶液。向塑料小瓶中的四甲基乙酸铵(1M溶液，7.5μL，7.5μmol)、DOTA-GA-DBCO(1mg/mL于水中，2.5μL，3.4nmol)和NaOH(0.1N，2.5μL，0.25μmol)的溶液中添加²²⁵Ac(NO₃)₃(10mCi/mL于0.1N HCl中，5μL，50μCi，0.0038nmol)。通过pH试纸观察到混合物的pH为约6.5。将小瓶置于80℃和290rpm的振荡块上30min，并允许小瓶冷却至室温。

¹¹¹In-DOTA-GA-DBCO的合成：0.05M HCl中的¹¹¹InCl3购自GE Healthcare。向塑料小瓶中的四甲基乙酸铵(1M溶液，7.5μL，7.5μmol)、DOTA-GA-DBCO(1mg/mL于水中，2.5μL，3.4nmol)和HCl(0.1N，5μL)的溶液中添加0.05N HCl中的¹¹¹InCl₃(5μL，在Capintec CRC-55TW剂量校准器中测量为104.3μCi，0.0022nmol)。通过pH试纸观察到混合物的pH为约5.5。将小瓶置于60℃和290rpm的振荡块上30min，并允许小瓶冷却至室温。

⁸⁹Zr-DFO-DBCO的合成：⁸⁹Zr草酸盐购自3D Imaging。DFO-DBCO购自Macrocyclics(Plano，TX目录号B-773)，将其溶解于DMSO中至0.5mg/mL，并在水中稀释至25μg/mL。

将2mCi的Zr-89转移到不含金属的微量离心管中，并且添加1M草酸以达到80μL的总体积。以2μL增量添加12μL的2M碳酸钾，并且用吸移管尖端搅拌混合物直至停止鼓泡。然后添加120μL的1M HEPES，之后添加300μL的水。测试溶液的pH，并且如果有必要的话，添加另外2M碳酸钾以将pH升高至6-6.5。添加136μL的DFO-DBCO储备液(3.4μg)，并且将反应物在室温下温育1小时。通过将0.5μL的反应物点样在TLC Green条(Biodex)上并用20％NaCl洗脱来分析螯合物。在洗脱后，用PerkinElmer Cyclone Plus磷光成像仪扫描条，以确保大部分Zr-89保留在基线处，这表明DFO-DBCO螯合。

⁸⁹Zr-DOTA-GA-DBCO的合成：向Waters Sep-pak Light QMA强阴离子交换柱(二醇二氧化硅上的丙烯酸/丙烯酰胺共聚物，表面官能团：C(O)NH(CH₂)₃N(CH₃)₃ ⁺Cl^-，孔径，37μm-55μm粒度，230μeq/g离子交换容量)中添加MeCN(6mL)，之后添加0.9％盐水(10mL)，然后添加水(10mL)。将⁸⁹Zr(ox)₂(2μL，290μCi)于1.0M草酸中的溶液添加到预调理柱中。继而用去离子水(20ml)洗涤柱以去除过量的草酸，之后用1.0M HCl(水溶液)(每次100μL)将⁸⁹ZrCl₄从柱上洗脱出来，以得到400μL的总体积，回收得到248μCi(86％)，大部分活性物在级分3中。然后将组合的等分试样蒸发至干。

将10μL的DOTA-GA-DBCO(1.0mg/mL于无金属水中，10μg，13.6nmo1)添加到⁸⁹ZrCl₄(268uCi，50μL)中。将DOTA-GA-DBCO/⁸⁹Zr溶液在150μL的1.0M HEPES中稀释。将混合物的pH调节至pH 7.5(Pandya等人，Zirconium tetraazamacrocycle complexes displayextraordinary stability and provide a new strategy for zirconium-89-basedradiopharmaceutical development.Chem Sci.2017年3月1日；8(3)：第2309-2314页)。然后将溶液在90℃下温育60min。通过用1％NH₄OH溶液洗脱的SPC25柱(Sigma Aldrich部件号SPC25120-50G)，测定⁸⁹Zr-DOTA-GA-DBCO复合物的收率为98％。未螯合的⁸⁹Zr留在柱上，而⁸⁹Zr-DOTA-GA-DBCO复合物被洗脱出来。

实施例6：抗PSMA mAb的点击标记的放射性缀合物的合成

关于根据本发明的方法的放射性标记抗体的示意图的示意图参见图1和图2。

抗PSMA mAb-二苯并-[1，2，3]-三唑并吖辛因-GA-DOTA-225Ac(位点特异性，CAR＝ 2)的合成：将PBS或其他相容缓冲液(10mg/mL-20mg/mL)中的随机或位点特异性叠氮化物修饰的抗体(位点特异性，CAR＝2或随机，平均CAR介于1和4之间)添加到如所述产生的²²⁵Ac-DOTA-GA-DBCO溶液中。通过pH试纸，混合物的最终pH为约6.5。轻轻搅拌反应溶液并允许其在室温下静置3h，然后使用以15mL NaOAc缓冲液(10mM，pH 6-6.5)或另一种相容缓冲液预调理的PD-10柱(GE Healthcare)纯化。将反应混合物移取到预调理的PD-10柱的贮存器中，并将洗脱液收集在塑料管中。用NaOAc缓冲液(0.2mL×3)洗涤反应小瓶，将洗涤液移取到PD-10柱的贮存器中，并收集洗脱液。将NaOAc缓冲液连续施加到PD-10柱的贮存器中，并且将洗脱液收集在塑料管中，其中每个管收集约1mL的洗脱液，直至收集到总共10mL的洗脱液。

使用柠檬酸盐-H₂O-MeOH溶液作为流动相，通过iTLC-SG (Agilent)评估所收集的每种级分的纯度。组合一种或多种纯级分，以得到10mM NaOAc缓冲液中的最终产物。通过HPLC分析产物溶液的化学和放射性化学纯度。使用标准曲线通过UV吸收测定产物溶液中的抗体浓度。继而使用Capintec CRC-55TW剂量校准器定量产物溶液的活性。

Ac-225螯合的质量控制：使用二乙三胺五乙酸(DTPA)作为纯化产物的质量控制，采用螯合攻击。将10mM Na₅DTPA水溶液添加到含有²²⁵Ac标记的mAb的样品溶液中，直到[DTPA]/[mAb]＝500-1,000。将50mM Na₅DTPA水溶液添加到含有²²⁵Ac标记的mAb的溶液中的纯化产物的等份试样中，直到[DTPA]/[mAb]＝50,000-100,000。在室温和290rpm下，将两种混合物置于振荡块上30min。将混合物点样在iTLC-SG上，并用柠檬酸盐-H₂O-MeOH溶液作为流动相显色。在这些条件下，游离的²²⁵Ac迁移到溶剂前沿，并且结合的²²⁵Ac-mAb保持在基线处。

抗PSMA mAb-二苯并-[1，2，3]-三唑并吖辛因-GA-DOTA-¹¹¹In的合成：将10mMNaOAc中的随机或位点特异性叠氮化物修饰的抗PSMA mAb(位点特异性，CAR＝2或随机，平均CAR介于1和4之间)添加到如所述产生的¹¹¹In-DOTA-GA-DBCO溶液中。轻轻搅拌反应溶液，并且允许其在室温下静置2h，之后使其通过PD-10柱。通过使15mL的NaOAc缓冲液(10mM，pH6-6.5)通过柱对PD-10柱进行预调理，并移除洗涤液。然后将反应混合物移取到预调理的PD-10柱的贮存器中，并将洗脱液收集在塑料管中。用NaOAc缓冲液(0.2mL×3)洗涤反应小瓶，将洗涤液移取到PD-10柱的贮存器中，并收集洗脱液。将NaOAc缓冲液连续施加到PD-10柱的贮存器中，并且将洗脱液收集在塑料管中，其中每个管收集约1mL的洗脱液，直至收集到总共10mL的洗脱液。

使用10mM EDTA水溶液(pH＝5-6)作为流动相，通过iTLC-SG评估所收集的每种级分的纯度。组合一种或多种纯级分，以得到10mM NaOAc缓冲液中的最终产物。通过HPLC分析产物溶液的化学和放射性化学纯度。使用标准曲线通过UV吸收测定产物溶液中的抗体浓度。继而使用Capintec CRC-55TW剂量校准器定量产物溶液的活性。

In-111螯合的质量控制：使用DTPA作为纯化产物的质量控制，采用螯合攻击：将10mM Na₅DTPA水溶液添加到含有¹¹¹In标记的mAb的样品溶液中，直到[DTPA]/[mAb]＝1000-10,000。在室温和290rpm下，将混合物置于振荡块上30min。将混合物点样在iTLC-SG上，并用10mM EDTA水溶液(pH＝5-6)作为流动相显色。游离的¹¹¹In或松散结合的¹¹¹In迁移到溶剂前沿，并且紧密结合的¹¹¹In-mAb保持在基线处。

抗PSMA mAb--二苯并-[1，2，3]-三唑并吖辛因-DFO-Zr-89的合成

将800μg随机叠氮化物修饰的抗PSMA mAb(平均CAR介于1和4之间；相同的程序可用位点特异性叠氮基-mAb进行)于10mM HEPES 50mM NaCl pH 7.5或其他相容缓冲液中添加到如所述产生的⁸⁹Zr-DFO-DBCO溶液中，并在37℃下温育1.5小时，然后使其通过PD-10柱。通过使15mL的等渗盐水通过柱对PD-10柱进行预调理，并移除洗涤液。然后将反应混合物移取到预调理的PD-10柱的贮存器中，并将洗脱液收集在塑料管中。将盐水连续施加到PD-10柱的贮存器中，并且将洗脱液收集在塑料管中，其中每个管收集0.5mL的洗脱液，直至收集到总共10mL的洗脱液。用剂量校准器测定每种级分和保留在柱上的材料的活性。合并产物峰(通常为级分4-7)以得到最终产物。通过HPLC分析产物溶液的化学和放射性化学纯度。使用标准曲线通过UV吸收测定产物溶液中的抗体浓度。使用剂量校准器定量产物溶液的活性。

抗PMSA mAb-DOTA-⁸⁹Zr的合成

将在20mM HEPES 50mM NaCl pH 7.5(10.1mg/mL，200μL，约13.5nmol)中通过随机叠氮化物缀合修饰的叠氮化物修饰的抗PSMA mAb缀合物(CAR＝1-4)添加到如上所述产生的⁸⁹Zr-DOTA-GA-DBCO溶液中。将混合物的最终pH调节至7.0。将反应溶液在37℃下温育2h，之后在PD-10柱(GE Healthcare)上用0.9％盐水、HEPES缓冲液或PBS纯化，以得到64％的产物⁸⁹Zr-DOTA-mAb。

Zr-89螯合的质量控制：对于Zr-DFO-mAb，仅通过HPLC分析纯化产物。在用DTPA或EDTA攻击时，这些缀合物不保留Zr-89。通过添加EDTA至33mM来攻击Zr-DOTA-mAb，并在室温下温育过夜。在攻击后通过在PD-10柱上运行来分析缀合物，并且发现保留80％的放射性。

实施例7：点击标记的放射性缀合物的分析表征

测定放射性化学转化率

放射性化学转化率(RA转化率％；参见表3至表5)通过iTLC-SG(使用浸渍有硅胶(SG)的无粘结剂玻璃微纤维色谱纸的瞬时薄层色谱法(iTLC))测定。通过将产物峰的无线电信号(放射性起始材料和副产物的不同保留时间)的积分值除以在对存在于基线与溶剂前沿之间的所有无线电信号峰取积分时获得的值来计算RA转化率％。然后将该产物分数表示为转化率百分比。

对于掺入了Ac-225的产物，将含有约0.1μCi-1μCi的²²⁵Ac的样品溶液点样在离底部边缘大约2cm的iTLC-SG条的基线上。使用柠檬酸盐-水-甲醇流动相(20mL 0.4M柠檬酸三钠/3mL 2N HCl/2.3mL MeOH)使iTLC-SG条显色，允许其在室温下干燥，并且在分析之前储存最少6h(达到225Ac和所有子体核素的长期平衡)。使用利用99mTc设置的Bioscan AR2000放射性TLC成像扫描仪扫描iTLC-SG。

对于In-111螯合物，将含有约0.5μCi-2.5μCi的¹¹¹In的样品溶液点样在离底部边缘大约2cm的iTLC-SG条的基线上。使用10mM EDTA钠pH 5-6作为流动相使iTLC-SG条显色，并且然后允许其在室温下干燥。使用利用In-111设置的Bioscan AR2000放射性TLC成像扫描仪扫描干燥的iTLC-SG。

对于Zr-89螯合物，通过将产物峰上的活性除以总活性(包括PD-10柱中的活性)来确定RA转化率％，该总活性通过用剂量校准器计数来确定。

测定放射性标记的蛋白质的放射性化学纯度

Ac-225和In-111螯合物的放射性化学纯度(RA纯度％；参见表3至表4)通过SE-HPLC(尺寸排阻HPLC)测定。对于Ac-225，使用Tosoh TSKgel柱(G3000SWxl7.8mm×30cm，5um)；用DPBS缓冲液(1x，不含钙和镁)洗脱柱；流速：0.7mL/min；20min运行；室温。在HPLC后，将洗脱液收集在预先编号的小瓶中，其中每个小瓶收集0.5min或1min的洗脱液级分。使容纳洗脱液的小瓶在室温下静置＞6h，以允许²²⁵Ac与其子体核素达到长期平衡。然后在Capintec CRC-55TW孔计数器中对每个小瓶中的活性进行计数。基于小瓶中的活性重建放射性色谱图。

对于In-111，使用Tosoh TSKgel柱(G3000SWxl7.8mm×30cm，5um)；用DPBS缓冲液(1x，不含钙和镁)洗脱柱；流速：0.7mL/min；20min运行；室温。使用上述HPLC系统和PerkinElmer无线电流量检测器Radiomatic 625TR完成放射性检测，并且配备有0.5mL流动池，使用In-111设置和Ultima FloTM M混合物，流速为1.4mL/min。

对于Zr-89(参见表5)，使用Tosoh TSKgel柱(G3000SWxl7.8mm×30cm，5um)。用柠檬酸缓冲盐水洗脱柱；流速：1mL/min；20min运行；室温。使用上述HPLC系统和耦接到Bioscan Flow Count仪器的Beckman流过检测器来完成放射性检测。

表3：锕-225放射性标记蛋白质

*步骤1是将锕-225螯合到DOTA-GA-DBCO

**步骤2是使双官能螯合物与蛋白质进行点击反应

表4：铟-111放射性标记蛋白质

*步骤1是将铟-111螯合到DOTA-GA-DBCO

**步骤2是使双官能螯合物与蛋白质进行点击反应

表5：用DFO-DBCO进行Zr-89放射性标记抗PSMA mAb

实施例8：修饰的mAb与DOTA-GA-DBCO的点击反应

将1mg/mL-10mg/mL的随机和位点特异性叠氮基-mAb(抗PSMA mAb、西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)与5x至20x过量的未螯合DOTA-GA-DBCO混合，并在室温或37℃下温育1-24小时。用Zeba脱盐离心柱(Thermo)对mAb进行脱盐，并且用Amicon离心浓缩器(Millipore)浓缩，用缓冲液再稀释，并且再次浓缩以去除任何剩余的DBCO-DOTA。通过LC-MS确认所有游离叠氮化物与DBCO-DOTA的完全点击反应。

实施例9：修饰的mAb与DFO-DBCO的点击反应

将1mg/mL-10mg/mL的随机和位点特异性抗PSMA mAb叠氮基-mAb与5x至20x过量的未螯合DOTA-GA-DFO混合，并在室温或37℃下温育1-24小时。用Zeba脱盐离心柱(Thermo)对mAb进行脱盐，并且用Amicon离心浓缩器(Millipore)浓缩，用缓冲液再稀释，并且再次浓缩以去除任何剩余的DBCO-DFO。通过LC-MS确认所有游离叠氮化物与DBCO-DFO的完全点击反应。

实施例10：细胞结合(FACS)

将叠氮化物修饰的抗体、DOTA-DBCO-叠氮化物修饰的抗体和DFO-DBCO-叠氮化物修饰的抗体的细胞结合与表1中所述的缀合物的亲本mAb进行比较。用一定浓度范围内的抗体或缀合物处理表达mAb靶的细胞系，并且通过流式细胞术测量结合。评估帕尼单抗和西妥昔单抗缀合物与EGFR+A431细胞的结合。评估赫塞汀和帕妥珠单抗与HER2+SK-BR-3细胞的结合。评估抗PSMA mAb与PSMA+C4-2b细胞的结合。

细胞系：人前列腺癌细胞系C4-2B细胞获自Janssen Oncology(Spring House，PA)。人表皮样癌细胞系A431细胞和人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞获自JanssenBioTherapeutics(Spring House，PA)，其细胞原产于ATCC(Manassas，VA)。将EGFR受体阴性MOLM-13人急性髓性白血病悬浮细胞维持在补充有20％加热灭活胎牛血清(Gibco)的RPMI1640+25mM Hepes(Gibco)中。使细胞在具有10％FBS(Gibco，Waltham，MA)的RPMI1640+25mM Hepes(Gibco，Waltham，MA)中生长。

流式细胞术：使用无酶细胞解离缓冲液(Gibco，Waltham，Ma)将细胞从烧瓶中分离，并且通过40um过滤器(Falcon)过滤。在96孔u形底板中每孔接种5x10⁴个细胞。将细胞与在BSA染色缓冲液(BD Bioscience，San Jose，CA)中稀释的缀合抗体或亲本抗体在4℃下温育1小时。将细胞用染色缓冲液洗涤两次。然后将细胞与AlexaFluor647标记的抗人IgG二级抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)在4℃下在黑暗中温育30min。将二级抗体在含有3％驴血清(Rockland Immunochemicals、)的染色缓冲液中以1∶200稀释。在温育的最后10分钟，将SYTOX^TMGreen Nucleic Acid Stain(ThermoFisher)以30nM的最终浓度添加到细胞中。将细胞用染色缓冲液洗涤两次，然后重悬于最终体积为25μL/孔的染色缓冲液中，并在iQue Screener流式细胞仪(Intellicyt)上读数。使用ForeCyt软件分析数据。通过排除具有高核酸染色的事件来测定活细胞。测定活细胞的平均荧光强度(MFI)并在GraphPad Prism 7(GraphPad Software)中作图为抗体浓度的对数对比MFI。将非线性回归曲线拟合添加至数据并计算EC₅₀值。

对于所有测试的mAb和缀合物，亲本mAb和修饰的mAb示出类似的细胞结合(表6)。

表6：结合靶细胞的mAb/缀合物的EC50(nM)

实施例11：In-111细胞结合测定

使用表4中描述的In-111放射性标记的蛋白质，用辐射测定法测量细胞结合。对C4-2B细胞(PSMA+和转铁蛋白+)测试抗PSMA mAb和转铁蛋白。对A431细胞(EGFR+)和MOLM-13细胞(EGFR-)测试西妥昔单抗和帕尼单抗。

用无酶细胞解离缓冲液(Gibco)分离贴壁细胞。对分离的贴壁细胞和收集的悬浮细胞进行计数并用冷染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤。将200μL染色缓冲液中不同数量的细胞添加到微量离心管中并置于冰上。将0.5μCi的In-111标记的蛋白质添加到每个管中，并在冰上温育1小时。用冷PBS(Gibco、)洗涤细胞以去除未结合的抗体，并将其重悬于500μL冷PBS中。将样品转移到计数小瓶中，并通过γ计数(Hidex Automatic GammaCounter)来测定细胞相关的放射性。

使用利用以已知量的In-111标记的蛋白质建立的线性回归的CPM值，将研究样品的每分钟计数(CPM)转换成In-111的μCi。使用以下计算将μCi结合值转换成结合的摩尔数：(μCi结合/比活性)/MW mAb或蛋白质。每个数据点是一式两份样品的平均值。

点击标记的In-111抗-PSMA mAb和In-111转铁蛋白结合到C4-2B细胞，其中细胞相关的放射性的量随着细胞数量的增加而增加(图3A)。点击标记的In-111抗EGFR抗体帕尼单抗和西妥昔单抗结合到A431细胞，其中细胞相关的放射性的量随着细胞数量的增加而增加；用阴性对照MOLM-13细胞未检测到点击标记的抗EGFR抗体的特异性结合(图3B)。

实施例12：铟细胞摄取测定

测定In-111点击标记的抗-PSMA mAb在C4-2B细胞中内化的动力学。

将细胞以3×10⁶个细胞/60mm培养皿(Coming)接种并置于37℃潮湿的CO₂培养箱中过夜。移除接种培养基并用2mL冷染色缓冲液(BD Biosciences)替代。然后将培养皿置于冰上。将0.5μCi In-111标记的抗体添加到每个培养皿中，并在冰上温育1小时。用冷PBS(Gibco)洗涤细胞以从细胞表面去除未结合的抗体。在各个时间点，如下所述测定细胞的表面膜结合放射性和细胞内放射性。

使用酸洗涤剥离程序剥离表面结合的放射性：向细胞中添加1.5mL剥离缓冲液(50mM甘氨酸、150mM NaCl pH 2.7以及添加至25μg/mL的胃蛋白酶(Amresco))，并将培养皿在冰上温育15分钟。将剥离缓冲液转移到计数小瓶中。用冷PBS洗涤细胞，并将洗涤液转移到计数小瓶中。通过γ计数(Hidex Automatic Gamma Counter)测定放射性。测定的表面膜结合放射性为剥离缓冲液+PBS洗涤液的总和。

通过制备细胞裂解物来测定细胞内放射性：在剥离表面结合的放射性并洗涤细胞后，将1.5mL 1M NaOH(Teknova)添加到细胞中，并将培养皿在冰上温育5分钟。将表面剥离的细胞裂解物转移到计数小瓶中。用冷PBS洗涤培养皿，并将洗涤液转移到计数小瓶中。通过γ计数(Hidex Automatic Gamma Counter)测定放射性。测定的细胞内放射性为表面剥离的细胞裂解物+PBS洗涤液的总和。

对于时间＝0的样品，在初始抗体在冰上结合后立即测定细胞的表面膜结合放射性和细胞内放射性。对于10分钟、30分钟、1小时和2小时的样品，在初始抗体结合后将3mL细胞培养基添加到每个培养皿中，并将培养皿置于37℃潮湿的CO₂培养箱中。在每个时间点，将培养皿从培养箱中移除并置于冰上。将细胞培养基转移到计数小瓶中，并用冷PBS洗涤细胞。将PBS洗涤液收集到计数小瓶中。如所述测定细胞的表面膜结合放射性和细胞内放射性。在每个时间点，通过在细胞裂解之前将细胞与PBS而不是剥离缓冲液温育来生成未剥离的样品。这些样品用于评估剥离效率并将结果与剥离的样品相比较。

使用来自利用已知量的In-111标记的mAb建立的线性回归的CPM值，将研究样品的CPM转换成μCi In-111。使用下式测定In-111mAb在细胞表面膜(剥离的样品)和细胞内(裂解的样品)的定位百分比：定位％＝100*(样品μCi/平均总μCi)，其中总μCi是指添加所有收集的样品，包括温育培养基、PBS洗涤液、甘氨酸冲洗液和裂解的细胞。每个数据点是一式两份样品的平均值。

表面结合的In-111从细胞表面快速消失并重新分布在细胞内。剥离技术在时间0时释放约80％的细胞表面相关的放射性；到温育结束时，仅20％通过剥离释放，并且超过60％的放射性在细胞裂解物中(图4)。

实施例13：小鼠肿瘤异种移植模型中的功效

抗PSMA mAb-DOTA-Ac-225的剂量范围研究：向雄性NSG小鼠(每组N＝8)皮下植入10⁶个LNCaP细胞，并且使肿瘤生长至100mm³-150mm³。以一系列活性(10nCi、25nCi、70nCi、200nCi)向小鼠静脉内注射单剂量的抗PSMA mAb-叠氮化物-DOTA-²²⁵Ac或同种型对照即对照mAb-叠氮化物-DOTA-²²⁵Ac。每只小鼠的注射剂量为最多达总共10μg具有冷抗体的蛋白质。一周两次测量肿瘤尺寸和体重。当肿瘤尺寸超过1,500mm³时，或体重减轻超过20％时，将动物安乐死。

抗PSMA mAb-DOTA-Ac-225在单次给药之后，特别是在较高放射性剂量下，显示出肿瘤生长抑制，并且在所有剂量下优于同种型对照(图5A)。所有剂量的对照mAb放射性缀合物具有与溶媒对照类似的存活曲线(图5B；表7)；抗PSMA mAb缀合物示出明显的剂量响应，其中存活率随着放射性剂量增加而增加(图5C；表7)。在209天后终止研究，其中剩余3只小鼠，所有小鼠来自抗PSMA mAb 200nCi组，并且未示出可检测到的肿瘤。

表7：中值存活率

本发明的实施方案旨在仅为示例性的，并且本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本发明的特定程序的许多等同形式。所有此类等同形式被认为是在本发明的范围内并且由以下权利要求书涵盖。

本文引用的所有参考文献(包括专利申请、专利和出版物)全文并出于所有目的以引用方式并入本文，其程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体地和单独地表示为全文并出于所有目的以引用方式并入。

Claims (32)

1.一种用放射性金属离子标记多肽的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；

b.提供放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的所述放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；以及

c.使所述修饰的多肽与所述放射性复合物在允许所述第一点击反应配偶体与所述第二点击反应配偶体反应的条件下接触，从而用所述放射性金属离子标记所述多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的一个包含炔烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含叠氮化物，或者其中所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含二烯。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽为抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体为抗PSMA单克隆抗体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述放射性金属离子为²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，还包括使侧链上的亲电体与共价连接到所述第一点击反应配偶体的巯基基团反应，以获得所述修饰的多肽。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽为通过位点特异性掺入所述第一点击反应配偶体来获得的修饰的抗体或其抗原结合片段。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过这样的方法来获得，所述方法包括：用对所述抗体的Fc糖基化位点中的核心GlcNac残基之间的β-1，4键联具有特异性的细菌内切糖苷酶修剪抗体或其抗原结合片段，以获得修剪的抗体或其抗原结合片段，以及在糖转移酶诸如GalT半乳糖基转移酶或GalNAc转移酶的存在下使所述修剪的抗体或其抗原结合片段与叠氮化物标记的糖反应，从而获得所述修饰的抗体或其抗原结合片段。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述叠氮化物标记的糖为UDP-N-叠氮基乙酰半乳糖胺(UDP-GalNaz)或UDP-6-叠氮基6-脱氧GalNAc。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述糖转移酶为GalT半乳糖基转移酶或GalNAc转移酶。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过这样的方法来获得，所述方法包括：用酰胺酶使抗体或其抗原结合片段去糖基化，以获得去糖基化的抗体或其抗原结合片段，以及在微生物转谷氨酰胺酶的存在下使所述去糖基化的抗体或其抗原结合片段与叠氮基胺反应，从而获得所述修饰的多肽。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述叠氮基胺选自3-叠氮基丙胺、6-叠氮基己胺、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)四乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)五乙二醇和O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)三乙二醇。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰的多肽包括直接或经由连接基共价连接到叠氮、四嗪或四唑基团的多肽。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述螯合剂包含具有式(I)的结构的大环：

其中R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基；并且

Z为(CH2)_nY，其中

n为1-10，并且

Y为共价连接到所述第二点击反应配偶体的亲电或亲核部分；

另选地，Z为氢；并且

R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基或者共价连接到所述第二点击反应配偶体的亲电或亲核部分；

另选地，所述螯合剂包含开链配体。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述螯合部分包含式(II)的结构：

或式(III)的结构：

16.一种用²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr标记抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段包含共价连接到叠氮、四嗪或四唑基团的抗体或其抗原结合片段；

b.提供放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr，其中所述螯合部分包含共价连接到炔烃或烯烃基团的螯合剂；以及

c.使所述修饰的抗体或其抗原结合片段与所述放射性复合物在允许所述叠氮、四嗪或四唑基团与所述炔烃或所述烯烃基团反应的条件下接触，从而用²²⁵Ac、¹¹¹In或⁸⁹Zr标记所述抗体或其抗原结合片段，

其中所述螯合剂包含式(I)的结构：

其中R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基；并且

Z为(CH2)_nY，其中

n为1-10，并且

Y为共价连接到所述炔烃基团的亲电或亲核部分；

另选地，Z为氢；并且

R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地为CHQCO₂X，其中

Q独立地为氢、C₁-C₄烷基或(C₁-C₂烷基)苯基，并且

X独立地为氢、苄基、C₁-C₄烷基或者共价连接到所述炔烃基团的亲电或亲核部分，

或者，另选地，所述螯合剂包含开链配体。

17.根据权利要求16所述的方法，还包括使侧链上的亲电体与共价连接到所述叠氮、四嗪或四唑基团的巯基基团反应，以获得所述修饰的抗体或其抗原结合片段。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过位点特异性掺入所述第一点击反应配偶体来获得。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过这样的方法来获得，所述方法包括：用对所述抗体的Fc糖基化位点中的核心GlcNac残基之间的β-1，4键联具有特异性的细菌内切糖苷酶修剪抗体或其抗原结合片段，以获得修剪的抗体或其抗原结合片段，以及在糖转移酶的存在下使所述修剪的抗体或其抗原结合片段与叠氮化物标记的糖反应，从而获得所述修饰的抗体或其抗原结合片段。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述叠氮化物标记的糖为UDP-N-叠氮基乙酰半乳糖胺(UDP-GalNaz)或UDP-6-叠氮基6-脱氧GalNAc。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述糖转移酶选自GalT半乳糖基转移酶或GalNAc转移酶。

22.根据权利要求16所述的方法，其中所述修饰的抗体或其抗原结合片段通过这样的方法来获得，所述方法包括：用酰胺酶使抗体或其抗原结合片段去糖基化，以获得去糖基化的抗体或其抗原结合片段，以及在微生物转谷氨酰胺酶的存在下使所述去糖基化的抗体或其抗原结合片段与叠氮基胺反应，从而获得所述修饰的多肽。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述叠氮基胺选自3-叠氮基丙胺、6-叠氮基己胺、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)四乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)五乙二醇和O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)三乙二醇。

24.根据16所述的方法，其中所述螯合部分包含式(II)的结构：

或式(III)的结构：

25.一种用两种放射性金属离子双重标记多肽的方法，所述方法包括：

a.提供修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体的多肽；

b.提供第一放射性复合物，所述第一放射性复合物包含与螯合部分缔合的第一放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第三点击反应配偶体的螯合剂；以及

c.提供第二放射性复合物，所述第二放射性复合物包含与螯合部分缔合的第二放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第四点击反应配偶体的螯合剂；以及

d.使所述修饰的多肽与所述放射性复合物在允许所述第一点击反应配偶体与所述第三点击反应配偶体反应并且允许所述第二点击反应配偶体与所述第四点击反应配偶体反应的条件下接触，从而用所述第一放射性金属离子和所述第二放射性金属离子标记所述多肽。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的一个包含炔烃基团，并且所述第一点击反应配偶体和所述第二点击反应配偶体中的另一个包含叠氮化物，并且其中所述第三点击反应配偶体和所述第四点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，并且所述第三点击反应配偶体和所述第四点击反应配偶体中的另一个包含二烯，并且其中所述第一放射性金属离子或所述第二放射性金属离子为诊断发射体，并且另一个为治疗发射体，或者其中所述第一放射性金属离子和所述第二放射性金属离子两者为治疗发射体。

27.一种药物组合物，包含药学上可接受的载体以及通过根据权利要求1或16所述的方法制备的放射性标记的多肽。

28.一种在对其有需要的受治疗者中治疗肿瘤性疾病或障碍的方法，包括向所述受治疗者施用根据权利要求27所述的药物组合物。

29.一种诊疗剂，包含药学上可接受的载体以及通过根据权利要求1或16所述的方法制备的放射性标记的抗体，其中保留了所述放射性标记的抗体的免疫学特性。

30.一种通过根据权利要求1所述的方法制备的诊疗剂，所述诊疗剂具有

式(VIII)的结构：

或式(IX)的结构：

31.根据权利要求29所述的诊疗剂，其中所述放射性金属离子选自³²P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、²⁵⁵Fm、²²⁷Th、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr或¹¹¹In。

32.一种组合，包括：

a.修饰的多肽，所述修饰的多肽包括共价连接到第一点击反应配偶体的多肽；以及

b.放射性复合物，所述放射性复合物包含与螯合部分缔合的放射性金属离子，其中所述螯合部分包含共价连接到第二点击反应配偶体的螯合剂；

其中所述组合将用于用所述放射性金属离子标记所述多肽。