HK40015744B - Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger rna - Google Patents

Claims (9)

1. Méthode sans cellules nourricières, sans composants xénogènes et sans intégration permettant de dédifférencier ou reprogrammer des cellules somatiques humaines pour produire des cellules souches pluripotentes induites sans cellules nourricières, sans composants xénogènes et sans intégration, comprenant :

   la transfection des cellules somatiques humaines isolées avec une composition comprenant une quantité efficace de ;

   (1) un ARNm synthétique codant le facteur de reprogrammation M₃O, et (2) des ARNm synthétiques codant les facteurs de reprogrammation Sox2, Klf4, cMyc-T58A, Nanog et Lin28 ;

   et ladite composition étant sans cellules nourricières et sans composants xénogènes, et étant ajoutée aux cellules somatiques isolées avec des changements de milieu quotidiens en utilisant des milieux sans cellules nourricières et sans composants xénogènes ; grâce à quoi la cellule somatique est reprogrammée ou dédifférenciée, ce qui produit des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sans cellules nourricières, sans composants xénogènes et sans intégration.
2. Méthode sans cellules nourricières, sans composants xénogènes et sans intégration permettant de reprogrammer des cellules somatiques humaines en utilisant une combinaison de (1) un ARNm synthétique codant le facteur de reprogrammation M₃O et (2) des ARNm synthétiques codant les facteurs de reprogrammation Sox2, Klf4, cMyc-T58A, Nanog et Lin28, ladite méthode comprenant :

   a) la culture de cellules cibles à une densité de 25 k à 250 k cellules/puits d'une plaque standard à 6 puits dans une surface sans cellules nourricières ni composants xénogènes ou à des nombres proportionnellement réduits de cellules/puits dans des puits d'autres surfaces ; et

   b) la transfection de cellules avec des doses variables de 50 ng/ml à 800 ng/ml d'ARNm à chaque fois pendant la reprogrammation, lesdits ARNm étant ajoutés aux cellules de mammifères avec des changements de milieu quotidiens, en utilisant des milieux sans cellules nourricières et sans composants xénogènes ; et ainsi la production de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sans cellules nourricières, sans composants xénogènes et sans intégration.
3. Méthode selon la revendication 1, lesdites cellules cibles étant cultivées à une densité de 50 k, 75 k, 100 k ou 150 k cellules/puits dans une surface sans cellules nourricières ni composants xénogènes ; la méthode comprenant

   a) la transfection de cellules avec des doses variables de 50 ng/ml à 800 ng/ml d'ARNm à chaque fois pendant la reprogrammation, alors que des doses plus faibles sont utilisées à des instants plus précoces qu'à des instants ultérieurs ; et

   b) le fait d'atteindre les iPSC sans passage.
4. Méthode selon la revendication 2, lesdites cellules cibles étant cultivées à une densité de 50 k, 75 k, 100 k ou 150 k cellules/puits d'une plaque standard à 6 puits dans une surface sans cellules nourricières ni composants xénogènes, alors que le volume de chaque puits est ajusté entre 0,5 ml et 5 ml de milieu approprié ; la méthode comprenant

   a) la transfection de cellules avec des doses variables de 50 ng/ml à 800 ng/ml d'ARNm à chaque fois pendant la reprogrammation, alors que des doses plus faibles sont utilisées à des instants plus précoces qu'à des instants ultérieurs ; et

   b) le fait d'atteindre les iPSC sans passage.
5. Méthode selon la revendication 1, lesdites cellules somatiques de mammifère humain étant sélectionnées dans le groupe constitué par les cellules unipotentes, multipotentes, pluripotentes et différenciées.
6. Méthode selon la revendication 1, lesdits un ou plusieurs ARN induisant une dédifférenciation des cellules somatiques en cellules unipotentes, multipotentes ou pluripotentes.
7. Méthode selon la revendication 1, les cellules transfectées étant maintenues en culture sous forme de cellules souches pluripotentes induites (iPS).
8. Méthode selon la revendication 1, lesdites cellules transfectées formant des cellules souches pluripotentes induites, comprenant en outre l'induction des cellules iPS pour former des cellules différenciées.
9. Méthode selon la revendication 1, ladite composition comprenant en outre des domaines d'activation de transaction Rarg et LrH-1.