HK40015744B - Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger rna - Google Patents

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HK40015744B
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HK
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feeder
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xeno
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HK42020005984.8A
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HK40015744A (en
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Jiwu Wang
Luigi Warren
Yuhui NI
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Allele Biotechnology And Pharmaceuticals, Inc.
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Claims (9)

  1. Feeder-freies, xenofreies und integrationsfreies Verfahren zur Dedifferenzierung oder Reprogrammierung menschlicher somatischer Zellen zur Erzeugung von Feeder-freien, xenofreien und integrationsfreien induzierten pluripotenten Stammzellen, umfassend:
    Transfizieren der isolierten menschlichen somatischen Zellen mit einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von Folgendem umfasst:
    (1) einer synthetischen mRNA, die den Reprogrammierungsfaktor M3O codiert, und (2) synthetischen mRNAs, welche die Reprogrammierungsfaktoren Sox2, Klf4, cMyc-T58A, Nanog und Lin28 codieren;
    und wobei die Zusammensetzung Feeder-frei und xenofrei ist und mit täglichen Medienwechseln unter Verwendung von Feeder-freien und xenofreien Medien zu den isolierten somatischen Zellen hinzugefügt wird; wodurch die somatische Zelle reprogrammiert oder dedifferenziert wird, wobei dadurch Feeder-freie, xenofreie und integrationsfreie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) erzeugt werden.
  2. Feeder-freies, xenofreies und integrationsfreies Verfahren zur Reprogrammierung menschlicher somatischer Zellen durch Verwendung einer Kombination aus (1) einer synthetischen mRNA, die den Reprogrammierungsfaktor M3O codiert, und (2) synthetischen mRNAs, welche die Reprogrammierungsfaktoren Sox2, Klf4, cMyc-T58A, Nanog und Lin28 codieren, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    a) Züchten von Zielzellen mit einer Dichte von 25 k bis 250 k Zellen/Vertiefung einer Standardplatte mit 6 Vertiefungen in einer Feeder-freien, xenofreien Oberfläche oder mit einer proportional reduzierten Anzahl von Zellen/Vertiefung in Vertiefungen anderer Oberflächenbereiche; und
    b) Transfizieren von Zellen mit variierenden Dosen von 50 ng/ml bis 800 ng/ml mRNA jedes Mal während der Reprogrammierung, wobei die mRNAs den Säugerzellen mit täglichen Medienwechseln unter Verwendung von Feeder-freien und xenofreien Medien zugesetzt werden; und dadurch Erzeugen von Feeder-freien, xenofreien und integrationsfreien induzierten pluripotenten Stammzellen_(iPSCs).
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Zielzellen mit einer Dichte von 50 k, 75 k, 100 k oder 150 k Zellen/Vertiefung in einer Feeder-freien, xenofreien Oberfläche gezüchtet werden; wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    a) Transfizieren von Zellen mit variierenden Dosen von 50 ng/ml bis 800 ng/ml mRNAjedes Mal während der Reprogrammierung, wohingegen zu früheren Zeitpunkten niedrigere Dosen verwendet werden als zu späteren Zeitpunkten; und
    b) Erhalten von iPSCs ohne Passagieren.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei Zielzellen mit einer Dichte von 50 k, 75 k, 100 k oder 150 k Zellen/Vertiefung einer Standardplatte mit 6 Vertiefungen in einer Feeder-freien, xenofreien Oberfläche gezüchtet werden, wohingegen das Volumen jeder Vertiefung so eingestellt wird, dass es 0,5 ml bis 5 ml geeignetes Medium darstellt; wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    a) Transfizieren von Zellen mit variierenden Dosen von 50 ng/ml bis 800 ng/ml mRNA jedes Mal während der Reprogrammierung, wohingegen zu früheren Zeitpunkten niedrigere Dosen verwendet werden als zu späteren Zeitpunkten; und
    b) Erhalten von iPSCs ohne Passagieren.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die somatischen Zellen menschlicher Säuger ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus unipotenten, multipotenten, pluripotenten und differenzierten Zellen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die eine oder mehreren RNAs die Dedifferenzierung der somatischen Zellen zu unipotenten, multipotenten oder pluripotenten Zellen induzieren.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die transfizierten Zellen als induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) in Kultur gehalten werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die transfizierten Zellen induzierte pluripotente Stammzellen bilden, ferner umfassend Induzieren der iPS-Zellen zur Bildung differenzierter Zellen.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ferner Rarg- und LrH-1-Transaktionsaktivierungsdomänen umfasst.
HK42020005984.8A 2012-05-13 2020-04-16 Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger rna HK40015744B (en)

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