HK1204792B - 多种化合物 - Google Patents

Description

多种化合物

技术领域

本发明涉及血管破坏剂的前体药物，并涉及这些化合物在癌症靶向治疗上的用途。

背景技术

将肿瘤血管靶向为癌症治疗的分子生物学方法正在成为最高端的科学研究重点之一。两种药物模式将合并，也就是，一种模式是避免在肿瘤中新血管的形成(抗血管生成)，而另一种模式是破坏靶向血管。

即使破坏一小部分肿瘤血管，已经被证实会诱导宽范围的肿瘤死亡和转移迟缓，因为单个血管是负责支持许多肿瘤细胞的生存的。作为形成血管的主要成分，内皮细胞是高度依赖于供它运动、浸润、附着、排列和增殖的微管骨架((Denekamp,J,Br J Cancer,45,136-139(1982))。因此，能破坏内皮微管网络的试剂可导致肿瘤血流的快速崩解和延长血管关闭的时间，刺激广泛的肿瘤细胞凋亡(Tozer et al.,Nat Rev Cancer,5,423-435(2005)；Lippert JW,Bioorg Med Chem,15,605-615(2007))。

癌症治疗药物的一个最有效类别是血管破坏剂(VDAs)，它们在体外有显著好的细胞毒性，但通常也显示出在体内对杀灭肿瘤的弱特异性(相对于正常组织)。而且，许多VDAs，例如微管蛋白结合剂，是水不溶性的，并需要在临床评价之前制备为剂型。本发明的目标是处理上述的这些问题。

秋水仙碱和它的类似物都是有效的VDAs，可在肿瘤中导致出血，继而广泛凋亡(Tozer et al.,Nat Rev Cancer,5,423-435(2005))，作为一种微管蛋白结合的直接结果，并诱导微管解聚(Chaudri et al.,J Mol Biol,303,679-692(2000))。然而，秋水仙碱未显示出作为一种可临床应用的抗癌治疗剂的内在价值，因为其高水平的毒性和由此产生的非常窄的治疗指数(Tozer et al.,Nat Rev Cancer,5,423-435(2005)；Quinn et al.,J MedChem,24,636-639(1981))。因此，能使诸如秋水仙碱等VDA选择性地靶向于肿瘤是人们所期望的。

本发明的发明人已开发出一种系统，用于克服在特定血管破坏剂内的有效抗癌剂的全身用药的毒性反应。

发明内容

本发明是基于(至少是部分)蛋白裂解位点的选择，这使得能在肿瘤血管选择性地释放血管破坏剂，例如秋水仙碱。

根据本发明的第一个方面，提供了一种化合物，或者它的在药学上可接受的盐，包括与MMP蛋白裂解位点相关联的血管破坏剂(VDA)。术语“相关联(associated with)”在本发明的内容中是指包括所有直接和间接的联接手段，通常是共价的，包括但不限于化学交联或肽键联接。

本发明所述的化合物可以是盐的形式。特别地，这些盐可以是药学上可接受的盐。本说明书所述的药学上可接受的盐可以是从母化合物中合成的，该母化合物包含由传统化学方法制备的碱性或酸性部分。通常，这些盐可以通过这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的合适的碱或酸在水或有机溶剂中进行反应而得到，或者混合上述两种反应而得到。通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈，都是优选的。合适盐的列表可在Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,US,1985,p.1418中找到，该说明书在此整体引入作为参考。还可参见Stahl et al,Eds,Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use,VerlagHelvetica Chimica Acta and Wiley-VCH,2002。

因此，本说明书包括所揭示的化合物在药学上可接受的盐，其中，母化合物是通过制成它们的酸盐或碱盐来被修饰。例如，从无机或有机酸或碱形成传统的非毒性盐或季铵盐。这样的酸添加盐的例子包括：醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天门冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑盐、樟磺酸盐、环戊丙酸盐、葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、脲硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟乙基磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐，草酸盐，羟萘酸盐、梳状盐，过硫酸盐，3-苯丙酸盐，苦味酸盐，三甲基乙酸盐，丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐，甲苯磺酸盐和十一酸盐。碱性盐包括：铵盐，诸如钠和钾等碱金属盐，诸如钙和镁等碱土金属盐，诸如二环己胺盐、N-甲基-D-葡萄糖胺盐等带有机碱的盐，带有如精氨酸、赖氨酸的氨基酸盐，等。同时，碱性含氮基团可以被季铵化，带有较低烷基卤化物的试剂，例如，甲基、乙基、丙基和丁基氯，溴化物和碘化物；烷基硫酸盐，例如二甲基、二乙酯、二丁酯；以及二戊硫酸盐，长链卤化物，例如癸、月桂、十四酸和硬脂氯化物，溴化物和碘化物，如苯和苯溴芳烷基卤化物，以及其他。

在本发明的一个优选方面，提供了式(I)的化合物：

X–Y (I)

其中，X是血管破坏剂(VDA)；Y是基质金属蛋白酶(MMP)蛋白裂解位点。

根据本发明所述的化合物提供了前体药物，在肿瘤环境中通过过度表达MMP，这些前体药物可被转变为活性和有效的VDA。肿瘤对于本发明所述的前体药物的选择性活化会增加肿瘤水平而降低系统水平，可选地添加活性成分，因而大为增强它们的治疗指数和效率。

VDA包括多环系统，例如融合的或未融合的双环或三环系统。因此，X包括VDA的任意多环系统，它能结合并破坏肿瘤血管。

VDA可被划分为三类：

(i)在微管蛋白的秋水仙碱结合位点与微球蛋白相互作用的那些化合物；

(ii)在微管蛋白上与长春花生物碱在微管蛋白上共享共同的结合位点的那些化合物；

(iii)以类似于紫杉醇的方式促进稳定的微管的形成，一个新的紫杉烷二萜从太平洋紫杉树皮中分离出来。

在本发明的一个优选方面，VDA是微管蛋白结合剂。该微管蛋白结合剂可选自：i)在秋水仙碱结合位点与微球蛋白相互作用的那些化合物，包括但不限于秋水仙碱(包括秋水仙碱的类似物，例如N-乙酰基秋水仙醇-O-磷酸(ZD6126)，以及ABT-751)、colchicinoids、考布他汀phenstatin、鬼臼毒素、五加前胡脂素、amphethinile和二苯乙烯；以及ii)与微管蛋白的长春花结合位点相互作用的那些化合物，包括但不限于：长春新碱，长春碱，长春氟宁，美登醇，phomopson A、根瘤菌素、auristatin(包括它的类似物)和多拉司他汀。

在本发明的一个优选方面，VDA是一种微管蛋白结合剂，在微管内的秋水仙碱结合位点相互作用。在本发明的一个实施例中，该VDA是秋水仙碱或者它的类似物或衍生物。秋水仙碱的类似物或衍生物可包括但不限于：氮杂去甲基秋水仙碱、氮杂秋水仙碱、N-甲基去乙酰基秋水仙碱、去乙酰基秋水仙碱。

在本发明的一个实施例中，VDA是非多肽的VDA。例如，根据本发明所述的VDA可以是一种微管蛋白结合剂，该接合剂不是auristatin或者它的衍生物。

可选地，所述VDA可以是一种微管蛋白结合剂，选自但不限于：考布他汀(例如，考布他汀A-43-O-磷酸)，auristatin(包括它的类似物)，多拉司他汀和黄酮类(例如，肿瘤凋亡因子α和5,6－二甲基呫吨酮－4－乙酸(DMXAA)、黄酮醋酸(FAA))。因此，在本发明的可选实施例中，所述VDA是考布他汀。

本发明包括MMP家族的任意成员。在所述MMP裂解位点进行蛋白裂解，通过一个MMP释放所述VDA，以及任意其他与该MMP裂解位点相关联的活性剂，以其活性形式释放。

MMP家族可划分为八个结构组：其中五个是分泌型MMP，另三个是膜型MMP(MT-MMP)。MT-MMP是位于细胞表面。本发明包括分泌型MMP与膜型MMP。

在本发明的一个优选方面，所述MMP是膜型MMP(MT-MMP)。因此，本发明提供了一种式I的化合物，其中，Y包括多肽序列，它是由MT-MMP选择性裂解而来。该MT-MMP可选自：

(i)I型转膜型MT-MMP，例如MMP-14(MT1-MMP)、MMP-15(MT2-MMP)、MMP-16(MT3-MMP)和MMP-24(MT5-MMP)；

(ii)糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定型MT-MMP，例如MMP-17(MT4-MMP)和MMP-25(MT6-MMP)；

(iii)II型转膜型MT-MMP，例如MMP-23。

所述MMP裂解位点可包括任意多肽序列，该序列具有可被一个MMP裂解的一个氨基键，典型的是一个肽键。优选地，Y是一个包括2至20个氨基酸的多肽序列，例如，具有6至10个氨基酸(例如，6、7或8个氨基酸)。这些氨基酸可以是D-氨基酸或者L-氨基酸。

所述MMP蛋白裂解位点可包括以下序列：

(i)P3’-P2’-P1’-P1-P2-P3；

其中，P1’到P3’与P1到P3是相同或不同的氨基酸残基，而在残基P1’与P1之间的键上发生蛋白裂解。优选地，该MMP蛋白裂解位点是MT-MMP特异性裂解位点，以致在P1’与P1之间由MT-MMP(例如MT-MMP14)选择性发生裂解。

所述MMP蛋白裂解位点可包括以下序列：

(ii)P3’-P2’-P1’-P1-P2-P3-P4；

其中，P1’到P3’与P1到P4是相同或不同的氨基酸残基，而在残基P1’与P1之间发生蛋白裂解。

所述MMP蛋白裂解位点可包括以下序列：

(iii)P4’-P3’-P2’-P1’-P1-P2-P3-P4；

其中，P1’到P4’与P1到P4是相同或不同的氨基酸残基，而在残基P1’与P1之间发生蛋白裂解。

在本发明的一个优选方面，P1与P1’是不同的。

优选地，所述MMP裂解位点包括可由MT-MMP选择性裂解的多肽序列。因此，本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P1’是疏水氨基酸。这里所采用的术语“疏水”是指具有疏水性大于或等于–1.10和/或净电荷大于或等于0的氨基酸，正如在Fauchere和Pliska Eur.J.Med Chem.10:39(1983)中所描述。疏水性或非极性氨基酸也可指具有侧链是在生理pH下不带电荷的氨基酸，是非极性的，通常是由水溶液所排斥。疏水性氨基酸可选自：亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和酪氨酸。P1’可以是带有脂肪族侧链的氨基酸。可选地，P1’可以是带有芳香族侧链的氨基酸。P1’也可以包括非天然的疏水氨基酸，例如苯基丁氨酸(Hof)。

本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P1是极性氨基酸，例如选自：天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)或甘氨酸。为改善MT-MMP在所述裂解位点的选择性，P1优选地不是脯氨酸。因此，在本发明的一个实施例中，P1是除了脯氨酸之外的氨基酸。在本发明的进一步实施例中，P1是甘氨酸。

本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P2’是选自：极性、不带电荷的氨基酸和/或碱性氨基酸，例如精氨酸(R)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)和脯氨酸(P)。为改善MT-MMP在所述裂解位点的选择性，P2’可以是甲基氨基酸，例如N-甲基酪氨酸。本发明人已经发现：当P2’是酪氨酸时，可由非MT-MMP(例如MMP2)在包括P1’-P2’与P2’-P3’位点发生裂解。因此，在本发明的一个实施例中，P2’不是酪氨酸。

正如这里所采用的，P3′残基可包括任意氨基酸。在本发明的一个实施例中，P3′是亮氨酸(L)。无论在哪里，P4′残基可包括带有亲核侧链的氨基酸，例如赖氨酸(L)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或天门冬氨酸(D)。

本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P2是选自：酸性氨基酸(例如谷氨酸)，碱性、疏水或极性氨基酸。P2也可包括非天然疏水氨基酸，例如瓜氨酸(Cit)。为改善MT-MMP在所述裂解位点的选择性，P2优选地不是脯氨酸。因此，在本发明的一个实施例中，P2是除了脯氨酸之外的氨基酸。

本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P3是极性氨基酸，例如选自：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和苏氨酸(T)。优选地，P3不是脯氨酸。因此，在本发明的一个实施例中，P3不是脯氨酸。在本发明的进一步实施例中，P3是丝氨酸。

本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(ii)或序列(iii)，其中，P4是包含实质侧链的氨基酸，例如在它的侧链上具有碱性基团的氨基酸，选自：精氨酸(R)和赖氨酸(K)。为改善MT-MMP在所述裂解位点的选择性，P4优选地是精氨酸。因此，在本发明的一个实施例中，P4是精氨酸。

本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，没有一个残基是脯氨酸，而P4是精氨酸。

P1到P3或P4的每个残基可以是不同的。可选地，P1’到P3’或P4’的每个残基也是不同的。

本发明的一个优选方面提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P1和/或P2和/或P3是除了脯氨酸之外的氨基酸。而且，在本例中，P4是精氨酸。

本发明的进一步实施例中提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P1’是疏水氨基酸，而P1和/或P2和/或P3是除了脯氨酸之外的氨基酸。

本发明的进一步实施例中提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(ii)或序列(iii)，其中，P1’是疏水氨基酸，而P4是精氨酸。而且，在本例中，P1和/或P2和/或P3是除了脯氨酸之外的氨基酸。

在另一个实施例中，P1’是苯基丁氨酸。在更进一步或更优选的实施例中，P1是甘氨酸。

所述MMP蛋白裂解位点Y可以包括氨基酸序列(iv)：

-Hof-Gly- (iv)；

所述MMP蛋白裂解位点Y可以包括氨基酸序列(v)：

-P2’-Hof-Gly-P2- (v)；

其中，P2和P2’是如上述所定义的。

所述MMP蛋白裂解位点Y可以包括氨基酸序列(vi)：

-P2’-Hof-Gly-P2-P3-P4- (vi)；

其中，P2’到P4’和P2’是如上述所定义的。优选地，P4是精氨酸，P3不是脯氨酸。

本发明的一个实施例中提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列-Leu-Tyr-Hof-Gly-Cit-Ser-Arg-。

本发明的进一步实施例中提供了式(I)的化合物，其中Y不包括序列-Leu-Gly-Leu-Pro-，其中，在Leu-Gly残基间发生裂解。

本发明可提供式(I)的化合物，其中蛋白裂解位点Y包括氨基酸序列，其中，在该序列中的一个或多个氨基酸是糖基化的，以增强疏水性以至溶解性。残基的糖基化可以是以下方式：

序列中氨基酸的O-糖基化，通过侧链的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；

序列中氨基酸的N-糖基化，通过侧链的天门冬氨酸、谷氨酸；和/或

序列中氨基酸的S-糖基化，通过侧链的半胱氨酸。

本发明可提供式(I)的化合物，其中蛋白裂解位点Y包括氨基酸序列，其中，在该序列中的一个或多个氨基酸是磷酸化的，以增强疏水性以至溶解性。合适的氨基酸包括：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。在本发明的一个实施例中，提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P2’是磷酸化的，例如酪氨酸。

本发明的进一步实施例中提供了式(I)的化合物，其中Y包括序列(i)、序列(ii)或序列(iii)，其中，P3(可选的P2’)是磷酸化的氨基酸。

本发明还提供了式(I)的化合物，其中蛋白裂解位点Y包括多肽类似物，例如模拟肽，例如，通过用烯键取代氨基键、用Nα-和/或Cα-甲基氨基酸、非天然氨基酸取代，以及本领域已知的其他途径。这些拟肽方法是本领域常用的，以便增强裂解的特异性，因而用作减少不想要的酶的水解。在本发明的一个实施例中，Y包括类似物，在该氨基酸序列内的一个或多个氨基酸是以Nα-和/或Cα-甲基氨基酸取代的。

本发明的一个实施例中包括式(I)的化合物，其中Y包括C-端和N-端，其中C-端是直接或间接连接到X，而N-端是直接或间接连接到另一半，例如下面所述的c或Z。

本发明的一个可选实施例包括式(I)的化合物，其中Y包括C-端和N-端，其中N-端是直接或间接连接到X，而C-端是直接或间接连接到另一半，例如下面所述的c或Z。

在本发明的一个优选实施例中包括式(I)的化合物，其中X是秋水仙碱或其类似物，而Y是多肽，包括这里所定义的序列(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)。

在本发明的一个优选方面，提供了式(II)的化合物：

X–Y–c (II)

其中，X和Y如上述所定义；c是末端基团或“加帽基团”。加帽基团可以是用于对药用的肽链加帽，以便避免多肽的非特异性降解，例如，在除了MMP之外的其他酶作用下发生降解。c可以包括在N-端或C-端的任意合适部分，用作阻断基团，选自但不限于：脂肪烃、芳烃、多环芳烃、碳水化合物(例如，单糖)和氨基酸(包括D-氨基酸)。为改善溶解性，c可以是疏水基团，例如上述的任意附加的极性功能基团(例如，酸、胺、醇、酚)。

c可以由式(c)n表示，其中，n是1至5的整数。在本发明的一个实施例中，c是由式(c)n表示，其中，c是氨基酸(例如，非天然氨基酸)而n是3。在本发明的一个实施例中，c不是是丝氨酸，而n是3。在进一步的实施例中，c不是是丝氨酸或者奎尼酸。

本发明进一步可提供“连接物(linker)”。该连接物可以是被提供在Y的C端和/或N端。优选地，该连接物是被提供在Y的C端。该连接物可以包括与Y相关联的任意部分，该部分可被化学去除、酶去除或者自发分解。该连接物可以包括单个氨基酸(例如，酪氨酸)或者可包括氨基酸序列。当该连接物包括氨基酸序列时，该许可可提供一疏水区，可便于由MMP在Y上进行裂解。在序列中合适氨基酸(也就是，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)的O-糖基化可增强疏水性以致溶解性。

在本发明的一个优选方面，提供了式(III)的化合物：

X–a–Y (III)；

其中，X和Y如上述所定义；以及A是连接物，其中，该连接物是直接或间接与X相关联。

在本发明的一个实施例中，提供了式(IV)的化合物：

X–a–Y–c (IV)；

其中，X、a、Y和c是如上述所定义的。

在本发明的进一步的优选方面，提供了“间隔物(spacer)”，它可以与这里所述的连接物相同或不同。该间隔物可被提供在Y的C端和/或N端。优选地，该间隔物被提供在Y的N端，用作避免在合成过程中c的不想要的移除。该间隔物可以直接或间接与Y相关联。该间隔物可包括：单个氨基酸(例如β-丙胺酸)、氨基酸序列、琥珀酰基团。因此，本发明优选地提供了式(V)的化合物：

X–Y–b–c (V)

其中，X、Y和c是如这里所定义的；b是如这里所定义的间隔物。

在本发明的进一步实施例中，提供了式(VI)的化合物：

X–a–Y–b–c (VI)

其中，X、Y、a和b是如这里所定义的。

在本发明的一个实施例中，提供了式(VI)的化合物，其中X是秋水仙碱(或其类似物)，Y是多肽，包括这里所定义的氨基酸序列(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)，而a是酪氨酸，b是丙胺酸。

在本发明的第二个方面，提供了式(VII)的化合物或者它的药学上可接受的盐：

X–Y–Z (VII)；

其中，X和Y是如这里所定义的；Z是抗癌剂。

优选地，Z是抗癌剂，选自：与X是相同或不同的血管破坏剂、抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶)、细胞毒性剂或抗增殖剂(例如，蒽环类抗生素(例如，阿霉素)、长春碱、紫杉烷、细胞毒素核苷)、生物毒素、放射治疗剂和激素剂或者已知的可诱导生物毒性、细胞毒性、抗血管生成或破坏血管效应的任意天然产物或试剂。

在本发明的进一步优选方面，提供了式(VIII)的化合物：

X–a–Y–Z (VIII)；

其中，X、a、Y和Z是如这里所定义的。

在本发明的进一步优选方面，提供了式(IX)的化合物：

X–a–Y–b–Z (IX)；

这里，X、a、Y、b和Z是如这里所定义的。在本发明的这个方面，间隔物b的目的是将Y的N-端氨基转变为羧酸，以允许化合物Z的附着，其中，Z负载游离氨基(例如，Z是阿霉素)。这里，Z负载游离羧酸，而b不需要。

在本发明的一个优选方面，提供了式(VII)的化合物，其中，X是秋水仙碱或者其衍生物，例如氮杂去甲基秋水仙碱，而Z是细胞毒性剂，例如阿霉素。优选地，Y仍是多肽，包括这里所定义的氨基酸序列(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)。

在本发明的一个优选方面，提供了式(VII)的化合物，其中，X和Z是选自：秋水仙碱或者其类似物或衍生物。也提供了本发明所述的化合物，其中X和Z可以都是秋水仙碱。在这个方面，Y可以是多肽，包括这里所定义的氨基酸序列(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)。

根据本发明所述的化合物可以由固相法制备，例如，附着到聚合支持物，也可以由液相合成，例如，在偶联剂存在下，或者采用收敛合成。

因此，本发明的进一步方面提供了一种制备根据本发明所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供附着于X的固体支持物；

ii)可选地将连接物a附着到X的C端或N端；

iii)将氨基酸残基分步附着到X的C端或N端，或者附着到在步骤(ii)已附着X的连接物a上，以提供包含MMP蛋白裂解序列的多肽序列Y；

iv)可选地将加帽基团c分别附着到Y的C端或N端。

在一种优选的方法中，该固体支持物是任意聚合支持物，例如，任意的聚苯乙烯基树脂或者PEG基树脂(例如，三苯甲游基树脂)。所述连接物可以是琥珀酸盐或者丙二酸衍生物，例如琥珀酰酐。

本发明的进一步方面提供了一种制备根据本发明所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

i)制备多肽序列Y；

ii)将加帽基团c分别附着到Y的C端或N端；

iii)在偶联剂存在下制备X与在步骤(ii)中已制备的加帽的多肽的溶液，分离想要的化合物。

在优选的方法中，Y是通过将氨基酸分步附着到固体支持物上以提供多肽序列。可选地，序列Y可以是在溶液中合成的。

本领域已知的任意偶联剂都可被用于本发明所述的方法，例如，在合适溶剂(例如DMF、THF等)中的EDAC、DCC、DiC、PyBOP、HCTU等。

在可选的液相合成中，序列Y的C-端的一个或多个氨基酸可以是在溶液中被结合到X，以使得该多肽序列的剩余残基(例如，如前所述的在固体支持物上的预合成物)在溶液中以收敛合成方式而被结合。

本发明所述的优选方法提供了将X附着到Y的C末端。而且，该方法可包括将Z附着到Y的N末端。例如，该方法可包括以下步骤：

i)将一个氨基基团引导到X，用于附着到Y的C末端；并可选地

ii)将一个羧酸基团(或异硫氰酸盐或异氰酸盐基团)引导到Z，用于附着到Y的N末端。

进一步的方法提供用于将X附着到Y的N末端。同时，该方法也包括将Z附着到Y的C末端。例如，该方法可包括以下步骤：

i)将一个羧酸基团(或异硫氰酸盐或异氰酸盐基团)引导到X，用于附着到Y的N末端；并可选地

ii)将一个氨基基团引导到Z，用于附着到Y的C末端。

在本发明的一个优选方法中，X是秋水仙碱或者其类似物或衍生物，例如氮杂去甲基秋水仙碱，而Z是细胞毒素剂，例如阿霉素。

在本发明的进一步方面，提供了MMP蛋白裂解位点的用途，尤其是这里所定义的MT-MMP特异性裂解位点在VDA的位点特异性活化作用中的用途。这里所采用的术语“位点特异性活化作用”通常是指(但不限于)VDA通过在MMP蛋白裂解位点上的位点特异性裂解而被活化。在蛋白裂解位点上的位点特异性裂解被期待为与VDA的释放一同发生，因而使VDA活化。

药物成分与用途

在本发明的其他方面，提供了前面所述的化合物或其在药学上可接受的盐用作药物的用途。在进一步的方面，提供了包括前面所述的化合物的药物制剂。该制剂可包括至少一种附加的在药学上可接受的成分，例如赋形剂、稀释剂或载体。优选地，该制剂是用于肠胃外注射用药的。

本发明提供了一种包括根据本发明所述的化合物的药物制剂。在一个优选实施例中，该化合物是式(VII)的化合物。

在本发明的一个优选方面，所述成分包括药学上可接受的载体或稀释液。

本发明所述的成分通常是以有效量用药的。“有效量”是指该成分单独或与进一步剂量一起的量产生想要的反应。当用药时，本发明所述的药物成分是以药学上可接受的制备物来用药的。这些制备物通常可包括：药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、兼容载体，以及可选的其他治疗剂(例如，顺铂、卡铂、环磷酰胺、马法兰、卡氯芥、甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、巯嘌呤、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、长春碱、长春新碱、更生霉素、丝裂霉素C、紫杉醇、L-天冬酰胺酶、G-CSF、依托泊苷、秋水仙碱、去铁胺甲磺酸，和喜树碱)。

本发明所述的成分可通过任意传统途径来用药，包括注射或者一定时间内逐步输液。例如，该用药途径可以是：口服，静脉、腹腔、肌肉注射，内腔、皮下或经皮吸收。在治疗特定疾病(例如癌症)的例子中，想要的反应是抑制疾病的发展。这将仅涉及暂时减缓疾病的发展，虽然更希望能涉及长期地停止疾病的发展。这能通过本领域已知的常规方法来监测。

这些成分用药于人类以外的哺乳动物(例如，用于测试目的或者兽医治疗目的)，是在如上所述的基本相同条件下进行。这里所采用的对象是哺乳动物，优选是人，也包括非人的灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或鼠。

当用药时，本发明所述的药物制剂是以药学上可接受的量并以药学上可接受的成分来用药的。术语“药学上可接受”是指非毒性材料，不会干扰活性成分的生物学活性的效力。

如果需要的话，这些药物成分可以结合药学上可接受的载体。这里所采用的“药学上可接受的载体”是指一个或多个兼容的固体或液体装填物、稀释物或胶囊物质，它们都适用于用药于人体内。术语“载体”是指有机或无机成分，天然或合成的，与活性成分结合，以便于用药。

这些药物成分可包括合适的缓冲剂，包括：醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐及磷酸盐。

可选地，这些药物成分也可包括合适的防腐剂，例如：苯扎氯、三氯叔丁醇、苯甲酸酯和硫柳汞。适用于口服的成分可被表示为离散单元，例如：胶囊、片剂、菱形剂，每种都包含预定量的活性化合物。其他成分包括：在水溶液或非水溶液中的悬浮剂，例如糖浆、西也剂或乳剂。

适用于肠胃外用药的成分包括化合物的无菌水或非水制备物，优选地是与受体的血液等渗的。这个制备物可以是根据已知方法采用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来进行制剂的。无菌注射制备物液可以是无菌注射液或者在非毒性肠胃外可接受的稀释液或溶剂内的悬浮物，例如，在1,3-丁烷二醇中作为溶液。在可接受的载体与溶剂之间，也可应用水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发的油通常也可应用为溶剂或悬浮介质。为了这个目的，任意牌子的不挥发的油可被应用，包括合成的单甘油或双甘油。此外，诸如油酸等脂肪酸可被用于注射剂的制备。适用于口服、皮下用、静脉注射、肌肉注射等的载体制剂可在Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA中找到。

根据本发明所述的化合物可被用于治疗与组织过度表达MT-MMP尤其是MT-MMP相关联的疾病或症状。因此，本发明提供了一种在对象中治疗癌症的方法，包括给药有效量的根据本发明所述的化合物。在本发明的优选方法中，所述对象是人。

这里所采用的术语“癌症”是指细胞支配自主生长的能力，也就是，由于快速增值的细胞生长的特征而导致不正常的状态或症状。该术语是指包括所有类型的癌变生长或者瘤原性过程、转移性组织或恶性转变细胞、组织或器官，入侵的无论哪种组织病理学类型或阶段。该术语“癌症”包括上皮的、内皮的和间叶细胞来源的恶性病变，尤其是癌和肉瘤，例如那些影响呼吸系统(嘴、鼻、气管、肺)、消化系统(舌头、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、胰腺、胆囊、直肠)、内分泌系统(甲状腺、脑垂体、肾上腺)、生殖泌尿系统(尿道膀胱、肾脏)、生殖系统(乳腺癌、卵巢、子宫、宫颈、前列腺、阴茎、阴囊、睾丸)、皮肤(黑色素细胞、表皮、内皮)、神经系统(脑、脊髓、神经胶质细胞、神经元)和淋巴系统。

术语“癌(carcinoma)”是本领域熟知的，是指上皮来源的恶性肿瘤，包括：呼吸系统癌、消化系统癌、内分泌系统癌、生殖泌尿系统癌、皮肤癌、生殖系统癌。术语“癌”还包括：“腺癌”，指源于腺体组织的癌；“鳞片状癌”，指鳞片状来源的癌；“癌肉瘤”，指癌瘤和肉瘤组织组成的癌症。示例性的癌包括那些从宫颈、前列腺癌、乳腺癌、鼻、头部和颈部、口腔、食道、胃、肝脏、胰腺、结肠、卵巢、膀胱和肺形成的癌，尤其是非小细胞肺癌。

术语“肉瘤(sarcoma)”是本领域熟知的，是指软组织或连接或支持组织(包括骨、软骨、脂肪组织、平滑肌、骨骼肌、神经、血管、间皮和胃肠道间质)的恶性肿瘤。癌症的进一步类型包括：“白血病”，是指来源与白细胞的肿瘤；以及“淋巴瘤”，指淋巴系统的肿瘤。

包括根据本发明所述的化合物的药物制剂可以是结合用药，或者顺序用药，或者在基本相近时间内用药，它作为一种抗癌剂(化学治疗剂)包括但不限于：抗代谢物(例如5-氟二氧嘧啶)、细胞毒性剂或抗增殖剂(例如，蒽环类抗生素、长春碱、紫杉烷、细胞毒素核苷)、生物毒素、放射治疗剂和激素剂或者已知的可诱导生物毒性、细胞毒性、抗血管生成或破坏血管效应的任意天然产物或试剂。

这里所采用的术语“治疗”是指临床干涉以试图改变被治疗的个体或细胞的自然过程，也可用于预防或在临床病理学的过程中进行。

在本发明的一个进一步方面，提供了根据本发明所述的化合物在制备治疗癌症的药物的用途。

在本发明的一个方面，本发明所述的化合物或成分可被用于治疗炎症疾病和/或炎症反应。因此，根据本发明的进一步方面，提供了一种在对象中治疗炎症疾病的方法，包括给药有效量的根据本发明所述的化合物。

所述炎症疾病可选自：动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风、红斑狼疮、硬皮病、Sjorgen氏症、多发皮肌炎和皮肌炎、血管炎、肌腱炎、滑膜炎、细菌性心内膜炎、牙周炎、骨髓炎、牛皮癣、肺炎、致纤维性肺泡炎、慢性支气管炎、肺气肿、硅肺、支气管扩张、尘肺、肺结核、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、多发性硬化、Guillan-Barre综合症和重症肌无力、乳房炎、蹄叶炎、喉炎、慢性胆囊炎、桥本氏甲状腺炎以及炎症性乳房疾病。在一个实施例中，所述炎症疾病可以是在移植后组织或器官的排斥反应。在特定实施例中，所述炎症疾病是选自：动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒症和多发性关节炎。

本发明的化合物可以被用于治疗心力衰竭。这里所述的化合物的用途也提供用于制备治疗心力衰竭的药物。

在本发明的一个实施例中，本发明所述的化合物可被用于治疗受伤状况(例如，溃疡、包括皮肤的或烧伤等损伤)。因此，本发明提供了一种在对象中治疗受伤的方法，包括给药有效量的根据本发明所述的化合物。在本发明的优选方法中，所述对象是人。

本发明所述化合物也可被用于治疗与月经有关的疾病和症状。

进一步提供了治疗包或治疗盒，包括：

(1)这里所描述的化合物或成分；以及

(2)这里所描述的使用该化合物用途或方法的说明书。

这里所定义的治疗包可包括多于一个剂量单元，以便提供用于重复用药。如果存在多于一个剂量单元，这些单元可以是相同的，或者是不同的，根据该剂量的化合物成分和/或物理形态而定。

本发明保护范围还包括伪造品或欺诈产品，它们包含或声称包含本发明所述的化合物，无论它们是否实际包含这样的化合物，也无论这样的化合物是否具有治疗上的有效量。

本发明的包含范围包括包装，它包括指示以下内容的说明书或用法说明：该包装包含本发明所述的种类或药物制剂，它包括或声称包括这样的剂型或种类。这样的包装可以是(但不是必需)被伪造或欺诈的。

贯穿本说明书和权利要求书，术语“包括”和“包含”以及这些词的变化，例如“包括但不限于”，都是不试图(不是)排除其他部分、添加、元件、整体或步骤。

贯穿本说明书和权利要求书，单数包括复数，除非内容上另有要求。特别地，当采用不定冠词时，本说明书应被理解为包括复数以及单数，除非内容上另有要求。

与本发明的特定方面、实施例或例子结合描述的特征、整体、特色、化合物、化学部分或基团都应被理解为可应用于这里所描述的其他方面、实施例或例子，除非它们不兼容。

附图说明

现在，本发明将通过实施例结合附图的方式进行说明，在附图中：

图1是图表，显示体外在肿瘤和非肿瘤组织中前体药物-1的代谢对于时间的关系；

图2是图表，显示在腹膜内给药之后，在带有肿瘤的小鼠内前体药物-1的聚集和水平；

图3是图表，显示在对带有肿瘤的小鼠给药前体药物-1之后，VDA聚集的水平；

图4是图表，显示前体药物-2的不同代谢，在肿瘤组织匀浆表达高MT1-MMP水平(HT1080)对比肿瘤组织匀浆表达低MT1-MMP水平(MCF-7)的关系；

图5是图表，显示在在腹膜内给药之后，在带有HT1080肿瘤的小鼠中前体药物-2的聚集和水平；

图6是图表，显示在对带有HT1080肿瘤的小鼠给药前体药物-2之后，VDA聚集的水平；

图7：在剂量增加研究过程中，相对小鼠的体重；

图8：在以ICT-2522(弹头)治疗过程中，肿瘤的生长；

图9：在以ICT-2588(前体药物)治疗过程中，肿瘤的生长；

图10：以前体药物(ICT-2588)治疗小鼠与以弹头(ICT-2552)治疗小鼠进行比较，当用药等摩尔剂量的药物时的肿瘤生长曲线；a)ICT-2588，37.5mg/kg与ICT-2552，7.5mg/kg；b)ICT-2588，50.0mg/kg与ICT-2552，10.0mg/kg；c)ICT-2588，62.5mg/kg与ICT-2552，12.5mg/kg；以及d)ICT-2588，75.0mg/kg与ICT-2552，15.0mg/kg；

图11：前体药物ICT-2588显示修饰，包括：磷酸化氨基酸残基，末端加帽，弹头和P2’选择；

图12：图表，显示ICT3053(P2’＝Ala)在肿瘤(HT1080)与肝脏(鼠)匀浆中的稳定性。这是一个数据的示例，所获得的用于这个系列的分子的数据和数据的总结在表1中给出；以及

图13：对于以磷酸附着到丝氨酸的分子(ICT3047)、以磷酸附着到酪氨酸的分子(ICT3048)，以及以磷酸同时附着到丝氨酸与酪氨酸的分子(ICT3028)的稳定性数据。数据显示，在与肿瘤(HT1080，关闭符号)和鼠肝(打开符号)匀浆孵育指定时间之后，母分子的比例保持情况。这是来自多个实验的代表性数据。建立色谱分离，以监控每个分子的脱磷酸作用。

具体实施方式

材料与方法

实施例1

固定的秋水仙碱衍生物氮杂去甲基秋水仙碱的合成

化合物1的合成：

氨水溶液(35％，15mL)加入到秋水仙碱(750mg，1.88mmol，1.00eq)，混合物在室温下搅拌反应过夜。将粗产物用KHSO₄(1M,aq)洗，用MgSO₄干燥，过滤和减压浓缩。继而通过急骤层析法在硅胶上纯化(梯度洗脱液：CH₂Cl₂/甲醇95:5至10:1)，得到化合物1，是黄色固体(427mg，1.11mmol，59％)。

δH(600MHz,CDCl₃),7.99(1H,broad s,NH),7.56(1H,d,J2.1,C8-H),7.32(1H,d,J10.7,C11-H),6.88(1H,d,J11.0,C10-H),6.52(1H,s,C4-H),6.03(2H,broad s,NH₂),4.68(1H,ddd,J12.6,6.5和6.5,C7-H),3.93(3H,s,OCH₃),3.88(3H,s,OCH₃),3.60(3H,s,OCH₃),2.47(1H,dd,J13.4和6.2,C5-CH₂),2.35(1H,ddd,J13.4,12.7和6.9,C5-CH₂),2.29-2.23(1H,m,C6-CH₂),1.98(3H,s,CH₃),1.90-1.88(1H,m,C6-CH₂)；ES m/z(％)385[M++H](100).

化合物2的合成：

HCTU(642mg，1.55mmol，1.50eq)和二异丙基乙胺(DiPEA，516μL，404mg，3.11mmol，3.00eq)加到Fmoc-tyr(tBu)-OH(714mg，1.55mmol，1.50eq)的DMF(10mL)溶液中。在室温搅拌5分钟后，将化合物1(398mg，1.04mmol，1.00eq)加入该溶液中。混合物在50℃搅拌反应22小时。真空去除DMF，将产生的油溶解于CH₂Cl₂(20mL)。用KHSO₄(aq，2x20mL)洗有机相，用MgSO4干燥，减压浓缩。粗产物通过急骤层析法纯化(梯度洗脱液：CH₂Cl₂/甲醇100:0至99:1至98:2)，得到化合物2，是黄色固体(530mg，642μmol，67％)。

δH(600MHz,CDCl₃),10.42(1H,broad s,NH),9.02(1H,d J10.7,C11-H),7.75(2H,d,J7.2,C23-H,C24-H),7.54(2H,d,J7.2,C20-H,C27-H),7.45(1H,d,J11.0,C10-H),7.39(2H,dd,J7.2和7.2,C22-H,C25-H),7.29(2H,dd,J6.6和6.6,C21-H,C26-H),7.19(1H,broads,C8-H),7.03(2H,d,J7.9,C14-H,C17-H),6.81(2H,d,J7.9,C15-H,C16-H),6.50(1H,s,C4-H),5.88(1H,broad s,NH),5.25(1H,broad s,C12-H),4.73-4.67(1H,m,C7-H),4.43(1H,dd,J10.0和7.6,C18-CH₂),4.28(1H,dd,J10.0和7.2,C18-CH₂),4.16(1H,dd,J7.2和6.19,C19-H),3.93(3H,s,OCH₃),3.88(3H,s,OCH₃),3.62(3H,s,OCH₃),3.21(1H,dd,J13.1和4.8,C13-CH₂),3.11(1H,dd,J13.1和5.5,C13-CH₂),2.53(1H,dd,J13.4和6.2,C5-CH₂),2.40(1H,ddd,J13.4,12.7和6.9,C5-CH₂),2.22-2.15(1H,m,C6-CH2),1.88(3H,s,CH3),1.80(1H,ddd,J11.5,11.3和6.9,C6-CH₂),1.22(9H,s,C(CH₃)₃)；ES m/z(％)826[M+](100).

化合物3的合成：

TFA(2mL)加入到化合物2(486mg，589μmol，1.00eq)的溶液中，混合物搅拌反应20分钟。TLC指示定量转变为产物。将该产物减压浓缩，以甲苯共蒸发，得到定量的化合物3。

δH(600MHz,CDCl₃),10.08(1H,broad s,NH),8.99(1H,d J10.7,C11-H),7.71(2H,d,J6.2,C23-H,C24-H),7.55(1H,s,C8-H),7.49(2H,dd,J6.5和6.5,C20-H,C27-H),7.41(1H,d,J10.2,C10-H),7.33(2H,dd,J6.2和6.2,C22-H,C25-H),7.26-7.21(2H,m,C21-H,C26-H),6.91(2H,d,J8.3,C14-H,C17-H),6.56(2H,d,J7.2,C15-H,C16-H),6.45(1H,s,C4-H),5.93(1H,broad s,NH),5.28(1H,s,NH),4.95-4.90(1H,m,C12-H),4.60(1H,ddd,J11.7,5.8和6.9,C7-H),4.39(1H,dd,J8.9和8.6,C18-CH₂),4.29-4.24(1H,m,C18-CH₂),4.12(1H,dd,J6.9和6.9,C19-H),3.90(3H,s,OCH₃),3.84(3H,s,OCH₃),3.54(3H,s,OCH₃),3.08(2H,d,J5.2,C13-CH₂),2.44(1H,dd,J13.4和6.2,C5-CH₂),2.33-2.26(1H,m,C5-CH₂),2.15-2.09(1H,m,C6-CH₂),1.82(3H,s,CH₃),1.75-1.69(1H,m,C6-CH₂)；ES m/z(％)770[M+](100).

化合物4的制备

2-氯三苯甲基氯树脂(Novabiochem，100-200网孔，替代1.4mmolg^-1，589mg，0.765mmol，1.00eq)悬浮在化合物3(589mg，0.765mmol，1.00eq)、二甲氨基吡啶(10mg，76.5μmol，0.01eq)、DiPEA(247mg，1.913mmol，333μL，2.50eq)和嘧啶(241mg，3.061mmol，248μL，4.00eq)在THF(10mL)的溶液中，在50℃搅拌6小时。该树脂继而过滤，并用THF洗彻底。然后，通过用甲醇(CH₂Cl₂:MeOH:DiPEA17:2:1,100mL)小心地洗该该树脂而使该树脂封闭。树脂4由P₂O₅过夜干燥。干树脂重量：593mg(装填56％)。

关于肽链内切酶激活的前体药物的合成的总体过程

5 fluo-bala-glu-pro-cit-gly-hof-tyr-leu-tyr-colch

作为一个实施例，多肽结合5是采用传统固相多肽合成法，采用Fmoc基策略从固定的秋水仙碱衍生物4来进行合成。

采用2-hlorotritylderivatised树脂可人工获得Nα-Fmoc策略合成。该树脂是在DMF中充分膨胀的，在去除NFmoc保护基团后，以20％v/v哌啶的DMF溶液(3x3分钟)来处理。在DMF中进行的所有偶联，应用2.5倍摩尔的Nα-Fmoc保护氨基酸(带有合适的侧链保护基团)，并采用HCTU/HOBt/DiPEA激活。采用20％哌啶的DMF溶液(3x3分钟)进行Nα-Fmoc去保护。采用ninhydrinbased Kaiser测试来检测偶联和去保护的。充复进行未成功的偶联。在最终Nα-Fmoc去保护之后，该多肽链是以荧光素异硫氰酸盐(2.50eq，DiPEA存在条件下，1.50eq)来末端加帽的。通过Kaiser测试来监控这个反应是否成功。

附加的β-丙胺酸残基是被整合到所述序列，以便克服硫脲连接与裂解的酸性条件的不兼容性(硫脲可重新排列)，前面的氨基键的羰基碳可接受巯基类似功能来承受亲核攻击。这导致氨基键的裂解，伴随环化thiazolinone的形成。该thiazolinone能承受在水溶性酸存在下的再次安排，以形成硫代乙内酰脲)。一旦所述序列完成，洗树脂(DMF、CH₂Cl₂、CH₂Cl₂/MeOH)，真空干燥，去除KOH，得到恒定重量。采用TFA-H₂O-三异丙基硅烷95:2.5:2.5通过适度酸水解从树脂上裂解多肽，室温下2小时，同时侧链去保护。在裂解之后，减压去除TFA。粗产物被萃取进入95％乙酸，冻干。继而采用反相HPLC分析粗多肽，并采用制备HPLC进行纯化(纯度>97％)。合并纯片段，并冻干。采用C18制备柱(Zorbax Eclipse，21.2x150mmXDB-C18，Agilent)用于多肽联合纯化。移动相如下：移动相A：HPLC级水和0.045％TFA；移动相B：包括10％HPLC级水，90％乙腈和0.045％TFA。移动相是通过真空过滤来脱气，通过0.45μm多孔纤维素硝酸盐过滤器(Sartolon，Sartorius，英国)。在室温和保持在21.2ml/min的流速下进行层析。移动相梯度是理想化的，从室内设计的前述梯度放大用于类似的化合物。在255nm处对UV吸收的检测是最佳的。ES m/z(％)951.8[M+H]2+(100)。RP-HPLC(梯度：0min30％B；5min35％B；25min80％B；26min100％B；27min100％B；30min30％B)Rt＝11.98min。

将秋水仙碱通过它的B-环附着到多肽序列的N-端

为能使秋水仙碱部分附着到多肽N-端，将采用以下策略。可采用公开方法使B-环氨基去面罩。以天门冬氨酸进行酰化，将引导羧酸到该分子(从氨基酸侧链)，因而使得在多肽的N-端结合游离氨基(参见下面)。

也检测氨基键的乙酰化作用，以便评估母秋水仙碱是否被释放，在MMP活化之后，继而外肽酶降解。

将秋水仙碱类似物通过它的C环附着到多肽N-端

为能使秋水仙碱类似物通过它的C环附着到多肽N-端，将采用以下策略：氮杂去甲基秋水仙碱的乙酰化可入前面描述的来实施。当Boc-保护基团被去除时，以琥珀酸酐(或者单一保护的琥珀酸盐或单一(或类似)衍生物)进行乙酰化。去保护将提供羧酸，功能性地适用于附着到多肽的N-端。

用于将阿霉素附着到多肽序列的策略：

N-端阿霉素连接

为增强阿霉素通过多肽N-端(采用前面所述的固定的秋水仙碱衍生树脂合成多肽之后)的附着能力，首先需要被修饰，以便引入羧酸。例子包括：以琥珀酰酐进行反应(策略I，见下)。然而，通过利用天门冬氨酸(两者都是天然氨基酸)的侧链，正如下面所示(策略2)天然氨基酸(相对于外源化学整体)是在代谢上被释放的。

策略1：(琥珀酰间隔物)

策略2：(氨基酸间隔物)

策略3：以类似于策略1和2所述的某种方式，阿霉素糖胺能通过氨基酸而被酰化，在去保护上可由琥珀酸盐(或其他)间隔物来产生一个衍生物，它能被附着多肽N-端。

2)C-端阿霉素连接

以Dde(在多肽化学上一种通用的保护基团)对阿霉素的氨基基团的保护将允许该试剂固定在三苯甲游基树脂(或其他)上。后来移除Dde基团，将是氨基基团去除面罩，允许多肽序列从该点(也就是，通过C-端)被构建。标准的Fmoc基固相合成将会产生多肽序列。合适的衍生VDA能通过N-端而被结合。树脂裂解和纯化将如前面所述的。

糖基化氨基酸的引入

带有合适侧链功能性(例如，丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸)的氨基酸能被糖基化(带有单糖、二糖或三糖)以产生带有增强的水溶性的多肽。这样的糖类衍生部分可被用于取代丝氨酸，例如(参见下面)。

结果

1)MMP-活化的前体药物

——泛MMP靶向：

结构：

(Hof＝苯基丁氨酸；Cit＝瓜氨酸；VDA-2＝氮杂去甲基秋水仙碱)

a)前体药物-1已经采用正常鼠血浆、正常鼠肝匀浆和实验性人肿瘤模型匀浆(HT1080异种移植物；已知表达大多数MMP)在体外进行筛选。采用LC/MS/MS检测前体药物裂解和代谢。

a、前体药物-1在血浆和肝中是稳定的，支持这些治疗剂的系统稳定性(图1)。

b、前体药物-1是在肿瘤匀浆中代谢的，支持在表达MMP的肿瘤中这些治疗剂的活化(图1)。

b)前体药物-1是在甘氨酸-苯基丁氨酸(Gly-Hof)间快速裂解的，通过重组体，至少MMP-2、MMP-9、MMP-10和MMP-14。通过LC/MS/MS与质谱分析进行说明(数据未示出)。

c)前体药物-1是通过腹膜内途径体内给药于小鼠，该小鼠带有皮下HT1080肿瘤模型(表达大多数MMP)。在给药后的规则的时间间隔收集血浆、组织和肿瘤。前体药物和VDA2的水平通过LC/MS/MS来评估。

a、前体药物-1聚焦，并在全部分析的组织中都被检测到(图2)。

b、在肿瘤中观察到最高的前体药物-1水平(图2)。

c、在给药后24小时之后未检测到前体药物-1(图2)。

d、在给药前体药物-1之后，在正常组织中检测到低水平的VDA2(图3)。

e、在给药前体药物-1之后，在肿瘤组织中检测到高水平的VDA2(图3)。

f、在给药前体药物-1后24小时之后，仍在肿瘤组织中检测到高水平的VDA2，而在正常组织中未检测到VDA2(图3)。

2)MMP-活化的前体药物(ICT-2588)

——靶向到膜型MMP(MT-MMP)

结构：

d)化合物1是被修饰的以便改变该化合物的MMP靶向性，从泛-MMP改变为MT-MMP选择性(前体药物-2)

a、精氨酸被引入，在P4位置上替换谷氨酸

b、脯氨酸被移除，在P3位置上替换为丝氨酸

e)前体药物-2已经采用正常鼠血浆、正常鼠肝匀浆和实验用人肿瘤模型匀浆来进行筛选，该实验用人肿瘤模型匀浆在体外显示出高的MT1-MMP(MMP-14)表达和高活性(HT1080)以及低的MT1-MMP表达和低的活性(MCF-7)。前体药物-2裂解和代谢是采用LC/MS/MS来检测的。

a、前体药物-2在血浆中保持完整，支持该治疗剂的系统稳定性。

b、前体药物-2在鼠肝匀浆中保持稳定。

c、前体药物-2在肿瘤匀浆中是快速代谢的，表达高的MT-MMP水平(HT1080)，

相对于肿瘤匀浆表达低的MT-MMP水平(MCF7)(图4)。

d、这些数据支持这个前体药物的系统稳定性和由MT-MMP活化的选择性。

f)前体药物-2是由多种MMP不同地裂解的，由LC/MS/MS和质谱分析来显示(数据未示出)。

a、由重组体MMP-14在甘氨酸-苯基丁氨酸(Gly-Hof)之间快速裂解。

b、由重组体MMP-2在苯基丁氨酸-酪氨酸(Hof-Tyr)之间缓慢裂解。显示了在前体药物-1所观察到的不同的裂解。

c、前体药物-2不能被重组体MMP-9裂解，相比于前体药物-1。

d、这些数据支持前体药物-2的MMP选择性裂解。

g)前体药物-2是通过腹膜内途径在体内给药于带有皮下HT1080肿瘤模型(MT1-MMP正)的小鼠。在给药后的规则时间间隔收集血浆、组织和肿瘤。前体药物-2和VDA2的水平是通过LC/MS/MS来评估。

a、在所有分析大的组织中，前体药物-2聚焦并被检测到(图5)。

b、在肿瘤中观察到最高的前体药物-2水平(图5)。

c、肝是所有分析的正常组织中代表性的组织(图5)。

d、在给药前体药物-2之后，在血浆中检测不到VDA2(图6)。

e、在给药前体药物-2之后，在肿瘤中检测到高浓度的VDA2(图6)。

f、在给药前体药物-2之后，在肿瘤中检测到10倍高于在正常组织中检测到的VDA2水平。

g、在给药后48小时后，在肿瘤中仍检测到高水平的前体药物-2和VDA2。

3、合成结合(基于MT-MMP前体药物)，已证实为不成功的。包括以下端帽的前体药物在血浆和/或肝中是不足够稳定的：

(1)3xD-丝氨酸；(2)奎尼酸+2xD-丝氨酸

实施例2：剂量反应抗肿瘤研究

材料与方法

ICT-2588的合成——参见实施例1

ICT-2552的合成：氨水溶液(35％，15mL)加入秋水仙碱(750mg，1.88mmol，1.00eq)，混合物在室温下搅拌反应过夜。将粗产物用KHSO₄(1M,aq)洗，用MgSO₄干燥，过滤和减压浓缩。继而通过急骤层析法在硅胶上纯化(梯度洗脱液：CH₂Cl₂/甲醇95:5至10:1)，得到ICT-2552，是黄色固体(427mg，1.11mmol，59％)。

δH(600MHz,CDCl₃),7.99(1H,broad s,NH),7.56(1H,d,J2.1,C8-H),7.32(1H,d,J10.7,C11-H),6.88(1H,d,J11.0,C10-H),6.52(1H,s,C4-H),6.03(2H,broad s,NH₂),4.68(1H,ddd,J12.6,6.5和6.5,C7-H),3.93(3H,s,OCH₃),3.88(3H,s,OCH₃),3.60(3H,s,OCH₃),2.47(1H,dd,J13.4和6.2,C5-CH₂),2.35(1H,ddd,J13.4,12.7和6.9,C5-CH₂),2.29-2.23(1H,m,C6-CH₂),1.98(3H,s,CH₃),1.90-1.88(1H,m,C6-CH₂)；ES m/z(％)385[M+H]+(100).

ICT-2552和ICT-2588(前体药物)是作为单一剂量通过腹膜内途径给药于带有皮下HT1080异种移植物的Bal b/C小鼠。9个用药组的每组包括8只小鼠。这些化合物的抗肿瘤效果是通过确定肿瘤体积来评估的，脱靶毒性的存在是通过检测小鼠体重来确认的。

这些用药组评估ICT-2588(前体药物)，相对于等摩尔剂量的ICT-2552(弹头)，它们是：

10％DMSO/oil(溶剂对照)

ICT-2588剂量为37.5mg/kg、50.0mg/kg、62.5mg/kg、75.0mg/kg

ICT-2552剂量为7.5mg/kg、10.0mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg

结果

通过研究，观察到在体重上没有显著减轻(图7)。所有小鼠的重量都在允许损失15％体重的范围内，因此该化合物不被归类为堆整体系统是毒性的。

实施例3：肿瘤反应研究

结果：研究的结果显示在图8和图10以及下表中。在ICT-2522和ICT-2588的所有测试剂量水平都观察到肿瘤反应。

表1：化合物相对于未治疗对照组的抗肿瘤功效

^a统计是基于肿瘤从第0天起使尺寸增倍的时间而作出的。

^b最大的体重损失刚好落入可接受的15％范围内。

^c一个动物显示出完全的肿瘤消失(第21天最后测量)。

在ICT-2552(弹头)和ICT-2588(前体药物)的所有评估剂量都观察到肿瘤生长的显著延迟。

观察了两种化合物在化合物剂量与肿瘤生长延迟之间的关系。这些效果是以ICT-2588(前体药物)的效果更大。

在ICT-258的剂量为62.5mg/kg时，一个动物显示出完全的肿瘤消失。表2：以等摩尔剂量给药ICT-2588(前体药物)和ICT-2552(弹头)之间的抗肿瘤功效的比较

^a统计是基于肿瘤从第0天起使尺寸增倍的时间而作出的。

^c一个动物显示出完全的肿瘤消失(第21天最后测量)。

当给药等摩尔剂量时，ICT-2588(前体药物)诱导比ICT-2522(弹头)显著更大的抗肿瘤反应。

实施例4：对于ICT-2588的修饰

i)通过引入磷酸化的氨基酸侧链以改善前体药物的溶解性

为了增加前体药物的溶解性，磷酸化的氨基酸侧链被引入ICT-2588的多肽序列中(可由血浆磷酸酶来水解)。磷酸衍生的氨基酸是商业上可用的，作为苯甲基保护的部分，它们是采用我们的合成方法引入多肽中。我们合成和评价了在该多肽序列内的两个位点的磷酸化修饰：P2’(Tyr)、P3(Ser)，以及同时P2’和P3(见图11)。此外，我们介绍了在通过MT-MMP活化前体药物(在P1-P1’裂解)和MMP-2活化前体药物(在P1’-P2’裂解)的基础上的P2’(Tyr)的磷酸化效应，陈述了对于进一步增加MMP选择性的潜力。

ii)通过前体药物端帽基团的修饰以改善溶解性

我们探索了以多个疏水基团替代荧光素基团(见图11)作为可选的前体药物以改善溶解性。我们的目标是改善前体药物溶解性，同时保持MT-MMP选择性、肿瘤选择性活化和抗肿瘤活性。引入这些可选的端帽到ICT2588所产生的前体药物是根据以下因素来进行评估的：相对于在体外母前体药物的化合物溶解性，体外在HT1080肿瘤模型、小鼠血浆和肝匀浆中的前体药物稳定性和活化性，MT-MMP选择性的保持和潜在改善。

iii)在前体药物内P2’位点的修饰

对于体外的组织稳定性、肿瘤裂解和MMP活化，已经评估了前体药物的P2’位点(Tyr)的修饰效果。焦点是在该前体药物的P2’位点上，我们已经说明了通过其他非MT-MMP在包括P1’-P2’位点与P2’-P3’位点进行裂解。我们采用前体药物的变体，这些变体引入了主要类型的氨基酸侧链(Ala、Asp、Asn、Leu、Ser、Pro)。

iv)引入阿霉素的双头前体药物的开发

在以ICT2588治疗之后，在肿瘤周边可观察到肿瘤细胞的薄可变边缘。目前对肿瘤血管形成的认识表明：该可变边缘是由立即环绕正常组织的血管来维持的。这样的一个结果是：将VDA-释放的前体药物的用药结合标准化疗将会增加观察到的抗肿瘤效果。本发明开发了一种双头前体药物，该药物包括本发明的氮杂去甲基秋水仙碱弹头(ICT2552)和阿霉素弹头(替代端帽)(参见下面)。根据体外在HT1080肿瘤模型、小鼠血浆和肝匀浆中的前体药物稳定性和活化性，我们评价了这个双头前体药物。

需要在氨基进行衍生，因为将通过N-末端附着到所述多肽。目前的策略是以琥珀酰酐来酰化，产生带有游离羧酸的琥珀酰盐衍生物，它能通过氨基键被连接到多肽。可供评价的可选策略是采用带有烷基/芳基阻断基团R的天门冬氨酸的侧链。

表3是带有在P2’位点的改变的一系列分子的稳定性数据的总结。半活性是从四个独立实验中取得的平均数。“肝”代表鼠肝匀浆，而“肿瘤”代表HT1080。

	P2’AA	肝t1/2(分钟)	肿瘤t1/2(分钟)
				ICT2588	Tyr	149	33
ICT3055	Asp	67	7
				ICT3053	Ala	76	17
ICT3054	Ser	66	9
				ICT3078	Asn	76	11
ICT3097	Pro	110	24
				ICT3080	Leu	134	48

Claims (29)

1.一种化合物，或者它的在药学上可接受的盐，包括与蛋白裂解位点的多肽相关联的血管破坏剂(VDA)，其中，所述VDA是：(a)一种抗癌的与微管蛋白在秋水仙碱结合位点相互作用的微管蛋白结合剂，选自：氮杂去甲基秋水仙碱、氮杂秋水仙碱、N-甲基去乙酰基秋水仙碱、去乙酰基秋水仙碱、N-乙酰基秋水仙醇-O-磷酸、秋水仙素、考布他汀、Phenstatin、鬼臼毒素、五加前胡脂素、二苯乙烯；或者(b)紫杉烷二萜；所述蛋白裂解位点是氨基酸序列-Leu-P2′-Hof-Gly-Cit-Ser-Arg-，其中P2′是一个非Tyr的氨基酸，选自以下之一：Asp、Ala、Ser、Asn、Pro和Leu。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物是式(I)的化合物：

X–Y (I)；

其中，X是所述VDA；Y是包含蛋白裂解位点的多肽。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：所述VDA是选自：氮杂去甲基秋水仙碱、氮杂秋水仙碱、N-甲基去乙酰基秋水仙碱、去乙酰基秋水仙碱。

4.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述VDA是选自：氮杂去甲基秋水仙碱。

5.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：还包括抗癌剂，形成式(VII)的化合物：

X–Y–Z (VII)；

其中，X是所述VDA；Y是包含蛋白裂解位点的多肽；Z是抗癌剂。

6.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述抗癌剂是5-氟尿嘧啶或者阿霉素。

7.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述抗癌剂是选自：抗代谢物、细胞毒性剂、抗增殖剂、蒽环类抗生素、长春碱、紫杉烷、细胞毒素核苷、生物毒素、放射治疗剂、激素剂、秋水仙碱。

8.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述秋水仙碱是选自：氮杂去甲基秋水仙碱、氮杂秋水仙碱、N-甲基去乙酰基秋水仙碱，或者去乙酰基秋水仙碱。

9.根据权利要求6或7所述的化合物，其特征在于：所述抗癌剂是阿霉素。

10.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：还包括加帽基团，其被连接到Y的C端或N端，所述加帽基团避免所述多肽的非特异性降解。

11.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：所述化合物是式(II)的化合物：X–Y–c (II)；

其中，c是加帽基团。

12.一种根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：所述化合物的结构式为X–Y–(c)n，其中，c是加帽基团，n是从1至5的整数。

13.根据权利要求11或12所述的化合物，其特征在于，所述c是选自：脂肪烃、芳烃、多环芳烃、碳水化合物和氨基酸。

14.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于：所述c是非天然氨基酸，且n是3。

15.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：所述化合物是式(III)的化合物：

X–a–Y (III)；

其中，a是直接或间接与X相关联的连接物。

16.根据权利要求15所述的化合物，其特征在于：所述连接物是单个氨基酸或者氨基酸序列。

17.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是式(IV)的化合物：

X–a–Y–c (IV)；

其中，a是直接或间接与X相关联的连接物；c是加帽基团。

18.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是式(V)的化合物：

X–Y–b–c (V)；

其中，b是直接或间接连接到Y的间隔基团；c是加帽基团。

19.根据权利要求18所述的化合物，其特征在于，所述间隔基团是选自：单个氨基酸、氨基酸序列和琥珀酰基团。

20.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是式(VI)的化合物：

X–a–Y–b–c (VI)；

其中，a是直接或间接与X相关联的连接物；b是直接或间接连接到Y的间隔基团；c是加帽基团。

21.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是式(VII)的化合物：

X–Y–Z (VII)；

其中，Z是抗癌剂。

22.根据权利要求21所述的化合物，其特征在于，所述Z是选自：血管破坏剂、抗代谢物、细胞毒性剂、生物毒素、放射治疗剂和激素剂。

23.根据权利要求22所述的化合物，其特征在于：所述Z是细胞毒性剂阿霉素。

24.根据权利要求21或22所述的化合物，其特征在于，所述X是选自：氮杂去甲基秋水仙碱、秋水仙碱、氮杂秋水仙碱、N-甲基去乙酰基秋水仙碱、去乙酰基秋水仙碱。

25.根据权利要求21所述的化合物，其特征在于，所述X和Z是选自：氮杂去甲基秋水仙碱、秋水仙碱、氮杂秋水仙碱、N-甲基去乙酰基秋水仙碱、去乙酰基秋水仙碱。

26.根据前述任意权利要求之一所述的化合物或者它的在药学上可接受的盐用于制备药物的用途。

27.一种药物制剂，包括：根据权利要求1至25之一所述的化合物，以及至少一种附加的在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

28.一种药物制剂，包括：根据权利要求1至25之一所述的化合物，以及可选的另一种治疗剂，所述的另一种治疗剂是选自：顺铂、卡铂、环磷酰胺、马法兰、卡氯芥、甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、巯嘌呤、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、长春碱、长春新碱、更生霉素、丝裂霉素C、紫杉醇、L-天冬酰胺酶、G-CSF、依托泊苷、秋水仙碱、去铁胺甲磺酸，或者喜树碱。

29.一种化合物，或者它的在药学上可接受的盐，包括与蛋白裂解位点相关联的血管破坏剂(VDA)，其中，所述蛋白裂解位点是氨基酸序列-Leu-Tyr-Hof-Gly-Cit-Ser-Arg-，所述VDA是选自：长春新碱，长春碱、长春氟宁、美登醇、拟茎点霉毒素A、根瘤菌素、阿里他汀，或者多拉司他汀。