HK1136847B - Targeted integration into the ppp1r12c locus - Google Patents

Claims (21)

1. Un procédé in vitro pour l'intégration et l'expression du produit d'une séquence exogène d'acides nucléiques dans une cellule, le procédé comprenant :

   (a) l'expression d'une première protéine de fusion dans la cellule, la première protéine de fusion comprenant un premier domaine de liaison d'ADN et un premier domaine de clivage ou moitié du domaine de clivage, dans lequel le premier domaine de liaison d'ADN a été fabriqué pour se lier à un site ciblé du gène PPP1R12C du génome de la cellule ; et

   (b) le contact de la cellule avec un polynucléotide comprenant une séquence exogène d'acides nucléiques avec pour conditions que la première protéine de fusion clive le génome de la cellule dans le gène PPP1R12C et que la séquence exogène d'acides nucléiques soit insérée dans le site de clivage et exprimée.
2. Le procédé in vitro de la revendication 1, dans lequel le domaine de liaison de l'ADN est un domaine de liaison à doigts de zinc.
3. Le procédé in vitro de la revendication 2, comprenant en plus :

   l'expression d'une seconde protéine de fusion dans la cellule, la seconde protéine de fusion comprenant un second domaine de liaison à doigts de zinc et une seconde moitié du domaine de clivage, dans lequel le second domaine de liaison à doigts de zinc se lie au second site cible du gène PPP1R12C du génome de la cellule, dans lequel le second site cible diffère du premier site cible ;

   dans lequel la liaison de la première protéine de fusion au premier site cible, et la liaison de la seconde protéine de fusion au second site cible, positionne les moitiés de domaines de clivage de sorte que le génome de la cellule est clivé au gène PPP1R12C, résultant ainsi en l'intégration de la séquence exogène dans le génome de la cellule dans le gène PPP1R12C, et en l'expression du produit de la séquence exogène.
4. Le procédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la séquence exogène d'acides nucléiques code pour un polypeptide, ou dans lequel la séquence exogène d'acides nucléiques produit un polynucléotide.
5. Le procédé in vitro selon la revendication 4, dans lequel le polypeptide est sélectionné à partir du groupe formé par un anticorps, un antigène, une enzyme, un facteur de croissance, un récepteur (de surface cellulaire ou nucléaire), une hormone, une lymphokine, une cytokine, un rapporteur, des fragments de ceux-ci et des combinaisons de ceux-ci, dans lequel le polynucléotide est sélectionné à partir du groupe qui consiste en un ou plusieurs shARN, une ou plusieurs molécules d'ARNi, un ou plusieurs miARN et des combinaisons de ceux-ci.
6. Le procédé in vitro de la revendication 5, dans lequel le rapporteur comprend de la GFP.
7. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la séquence exogène comprend en plus un promoteur.
8. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la séquence exogène comprend en plus une première séquence de nucléotides qui est homologue mais non-identique à la première séquence du gène PPP1R12C et, alternativement, une seconde séquence de nucléotides qui est homologue mais non-identique à une seconde séquence du gène PPP1R12C.
9. Le procédé in vitro selon la revendication 8, dans lequel les première et seconde séquences de nucléotides flanquent la séquence exogène.
10. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la séquence exogène est un plasmide ou dans lequel le polynucléotide est une molécule d'ADN linéaire.
11. Un procédé in vitro pour identifier l'intégration d'une séquence exogène dans le génome d'une cellule, le procédé comprenant :

    l'expression d'une séquence exogène dans la cellule selon une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle la séquence exogène d'acides nucléiques comprend un gène marqueur ; et

    l'identification des cellules exprimant le gène marqueur, identifiant ainsi les cellules dans lesquelles la séquence exogène a été intégrée.
12. Le procédé in vitro selon la revendication 11, dans lequel le gène marqueur comprend un marqueur de criblage,
13. Le procédé in vitro de la revendication 12, dans lequel le marqueur de criblage comprend de la GFP.
14. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel la cellule est arrêtée en phase G2 du cycle cellulaire.
15. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel au moins une des protéines de fusion comprend une altération dans la séquence d'acides aminés de l'interface de dimérisation du demi-domaine de clivage.
16. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel la cellule est une cellule mammalienne, et facultativement une cellule humaine.
17. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 2 à 16, dans lequel un domaine de liaison à doigts de zinc est sélectionné à partir du groupe composé d'un domaine de liaison à doigts de zinc comprenant quatre doigts de zinc, ordonné de F1 à F4 du N-terminal au C-terminal et en plus dans lequel :

    F1 comprend YNWHLQR (ID SEQ NO:16)

    F2 comprend RSDHLTT (ID SEQ NO:8)

    F3 comprend HNYARDC (ID SEQ NO:9) ; et

    F4 comprend QNSTRIG (ID SEQ NO:15) ; et un domaine de liaisons à doigts de zinc comprenant quatre doigts de zinc, ordonné de F1 à F4 du N-terminal au C-terminal et de plus dans lequel :

    F1 comprend QSSNLAR (ID SEQ NO:3) ;

    F2 comprend RTDYLVD (ID SEQ NO:11) ;

    F3 comprend YNTHLTR (ID SEQ NO:12) ; et

    F4 comprend QGYNLAG (ID SEQ NO:13)
18. Une protéine à doigts de zinc fabriqués qui se lie au gène PPP1R12C, dans laquelle la protéine est sélectionnée à partir du groupe composé d'une protéine comprenant quatre doigts de zinc et dont la séquence d'acides aminés de la région de reconnaissance de chacun des doigts de zinc est comme suit :

    F1 comprend YNWHLQR (ID SEQ NO:16)

    F2 comprend RSDHLTT (ID SEQ NO:8)

    F3 comprend HNYARDC (ID SEQ NO:9) ; et

    F4 comprend QNSTRIG (ID SEQ NO:15) ; et

    une protéine comprenant quatre doigts de zinc et dont la séquence d'acides aminés de la région de reconnaissance de chacun des doigts de zinc est comme suit :

    F1 comprend QSSNLAR (ID SEQ NO:3) ;

    F2 comprend RTDYLVD (ID SEQ NO:11) ;

    F3 comprend YNTHLTR (ID SEQ NO:12) ; et

    F4 comprend QGYNLAG (ID SEQ NO:13)
19. La protéine à doigts de zinc fabriquée de la revendication 18 comprenant en plus un domaine de clivage ou une moitié du domaine de clivage.
20. Le procédé in vitro selon une quelconque des revendications 1 à 17 ou la protéine selon la revendication 19, dans lequel la moitié du domaine de clivage provient d'une endonucléase de restriction de type IIS
21. Le procédé in vitro ou la protéine selon la revendication 20, dans lequel l'endonucléase de restriction de type IIS est sélectionnée à partir du groupe composé de FokI et StsI.