HK1136847B - Targeted integration into the ppp1r12c locus - Google Patents

Claims (21)

1. In-vitro-Verfahren zur Integration und Expression des Produkts einer exongenen Nukleinsäuresequenz in einer Zelle, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

   a) die Expression eines ersten Fusionsproteins in der Zelle, wobei das erste Fusionsprotein eine erste DNA-bindende Domäne sowie eine erste Spaltungsdomäne oder Spaltungs-Halbdomäne umfasst, wobei die erste DNA-bindende Domäne derart technisiert worden ist, um sich an eine erste Zielstelle im PPP1R12C-Gen im Genom der Zelle zu binden; und

   b) das Kontaktieren der Zelle mit einem Polynukleotid, umfassend eine exogene Nukleinsäuresequenz unter solchen Bedingungen, sodass das erste Fusionsprotein das Genom der Zelle im PPP1R12C-Gen spaltet und die exogene Nukleinsäuresequenz in die Spaltungsstelle eingefügt und exprimiert wird.
2. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-bindende Domäne eine Zinkfinger-bindende Domäne ist.
3. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 2, ferner umfassend:

   die Expression eines zweiten Fusionsproteins in der Zelle, wobei das zweite Fusionsprotein eine zweite Zinkfinger-bindende Domäne sowie eine zweite Spaltungs-Halbdomäne umfasst, wobei sich die zweite Zinkfinger-bindende Domäne an die zweite Zielstelle im PPP1R12C-Gen im Genom der Zelle bindet, wobei die zweite Zielstelle verschieden von der ersten Zielstelle ist;

   wobei das Binden des ersten Fusionsproteins an die erste Zielstelle und das Binden des zweiten Fusionsproteins an die zweite Zielstelle die Spaltungs-Halbdomänen derart positioniert, dass das Genom der Zelle im PPP1R12C-Gen gespalten wird, wodurch es zu einer Integration der exogenen Sequenz in das Genom der Zelle im PPP1R12C-Gen und zur Expression des Produkts der exogenen Sequenz kommt.
4. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die exogene Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert oder wobei die exogene Nukleinsäuresequenz ein Polynukleotid produziert.
5. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen, einem Enzym, einem Wachstumsfaktor, einem Rezeptor (Zellenoberfläche oder nuklear), einem Hormon, einem Lymphokin, einem Cytokin, einem Reporter, funktioneller Fragmente davon sowie Kombinationen dafür, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem oder mehreren shRNAs, einem oder mehreren RNAi-Molekülen, einem oder mehreren miRNAs sowie Kombinationen davon.
6. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Reporter GFP umfasst.
7. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die exogene Sequenz ferner einen Promotor umfasst.
8. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die exogene Sequenz ferner eine erste Nukleotidsequenz umfasst, die zwar homolog, jedoch nicht identisch mit einer ersten Sequenz im PPP1R12C-Gen ist und wahlweise eine zweite Nukleotidsequenz umfasst, die zwar homolog, jedoch nicht identisch mit einer zweiten Sequenz im PPP1R12C-Gen ist.
9. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 8, wobei die ersten und zweiten Nukleotidsequenzen die exogene Sequenz flankieren.
10. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die exogene Sequenz ein Plasmid ist, wobei das Polynukleotid ein lineares DNA-Molekül ist.
11. In-vitro-Verfahren zum Identifizieren der Integration einer exogenen Sequenz in das Genom einer Zelle, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

    die Expression einer exogenen Sequenz in der Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die exogene Nukleinsäuresequenz ein Markergen umfasst; und

    das Identifizieren von Zellen, die das Markergen exprimieren, wodurch Zellen identifiziert werden, in welche die exogene Sequenz integriert worden ist.
12. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Markergen einen Screening-Marker umfasst.
13. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Screening-Marker GFP umfasst.
14. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Zelle in der G2-Phase des Zellenzykluses arretiert wird.
15. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei wenigstens eins der Fusionsproteine eine Änderung in der Aminosäuresequenz der Dimerisierungsschnittstelle der Spaltungs-Halbdomäne umfasst.
16. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, wobei die Zelle eine Säugetierzelle, wahlweise eine menschliche Zelle ist.
17. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, wobei eine Zinkfinger-bindende Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Zinkfinger-bindenden Domäne, umfassend vier Zinkfinger, geordnete F1 bis F4 aus dem N-Terminal bis C-Terminal und wobei ferner:

    F1 YNWHLQR (SEQ ID NO:16) umfasst

    F2 RSDHLTT (SEQ ID NO:8) umfasst

    F3 HNYARDC (SEQ ID NO:9) umfasst; und

    F4 QNSTRIG (SEQ ID NO:15) umfasst; sowie eine Zinkfinger-bindende Domäne, umfassend vier Zinkfinger, geordnete F1 bis F4 aus dem N-Terminal, und wobei ferner;

    F1 QSSNLAR (SEQ ID NO:3) umfasst;

    F2 RTDYLVD (SEQ ID NO:11) umfasst;

    F3 YNTHLTR (SEQ ID NO:12) umfasst; und

    F4 QGYNLAG (SEQ ID NO:13) umfasst.
18. Technisiertes Fingerprotein, das sich an das PPP1R12C-Gen bindet, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, umfassend vier Zinkfinger und die Aminosäuresequenz der Erkennungsregion jeder der Zinkfinger wie folgt lautet:

    F1 umfasst YNWHLQR (SEQ ID NO:16)

    F2 umfasst RSDHLTT (SEQ ID NO:8)

    F3 umfasst HNYARDC (SEQ ID NO:9); und

    F4 umfasst QNSTRIG (SEQ ID NO:15); und

    ein Protein, umfassend vier Zinkfinger und die Aminosäuresequenz der Erkennungsregion jeder der Zinkfinger wie folgt lautet:

    F1 umfasst QSSNLAR (SEQ ID NO:3);

    F2 umfasst RTDYLVD (SEQ ID NO:11);

    F3 umfasst YNTHLTR (SEQ ID NO:12); und

    F4 umfasst QGYNLAG (SEQ ID NO:13).
19. Technisiertes Zinkfingerprotein nach Anspruch 18, ferner umfassend eine Spaltungsdomäne oder Spaltungs-Halbdomäne.
20. In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder Protein nach Anspruch 19, wobei die Spaltungs-Halbdomäne aus einer Restriktionsendonuklease des Typs IIS stammt.
21. In-vitro-Verfahren oder Protein nach Anspruch 20, wobei die Restriktionsendonuklease des Typs IIS ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus FokI und StsI.